Dosage des caroténoïdes

V.2.1. Préparation des standards

Les concentrations des solutions standard ont été calculées par des mesures au spectrophotomètre en les dissolvant dans un solvant approprié dans un bain à ultrasons, et en utilisant leur coefficient d’extinction molaire (ε) (Tableau 8).

Tableau 8: Préparation des solutions standards.

Standard Solvant de dissolution Coefficient d’extinction (L.mol^-1.cm^-1)

lutéine Ethanol 144 800

zéaxanthine Ethanol 140 900

β-cryptoxanthine Dichlorométhane 135 700

β-carotène Dichlorométhane 138 900

lycopène Dichlorométhane 184 900

Partie II : Matériels et méthodes

79 La solution de lycopène servant de standard interne a été diluée afin d’obtenir une concentration finale de 120 mg.L^-1.

V.2.2. Extraction et saponification des caroténoïdes

Les caroténoïdes ont été extraits selon la méthode décrite par Fanciullino et al. (2006).

Les caroténoïdes étant des molécules sensibles à la lumière et à l’oxygène, toutes les étapes ont été conduites en lumière inactinique et les extraits transférés dans des flacons de verre ambré sous atmosphère d’azote.

Les caroténoïdes de la pulpe des agrumes ont été extraits à partir de 2,5 g de matière fraîche broyée en une fine poudre à laquelle ont été ajoutés 120 mg d’hydroxyde de carbonate de magnésium (MgCO3, Sigma-Aldrich) et 35 mL du mélange d’extraction (éthanol/hexane (VWR), 4:3, v:v, contenant 0,1% de ter-butylhydroxytoluène (BHT, Sigma-Aldrich)). 300 µL, équivalents à 30 µg d’une solution de lycopène ont été ajoutés comme standard interne. Le mélange a été agité pendant 5 min. Les résidus ont été séparés de la phase liquide par filtration avec un entonnoir filtrant de porosité n°2, puis ré-extraits avec 35 mL d’éthanol/hexane (4:3, v:v). Les résidus ont ensuite été rincés avec successivement 30 mL d’éthanol et 30 mL d’hexane jusqu’à leur décoloration. Les phases organiques ont été transférées dans une ampoule à décanter et lavées successivement avec 2 X 50 mL de chlorure de sodium à 10% (NaCl, VWR) et 3 X 50 mL d’eau bi-distillée. La phase aqueuse a été éliminée. La phase hexanique a été séchée à l’aide du sulfate de sodium anhydre (NaSO4, VWR), filtrée et évaporée à 40°C dans un évaporateur rotatif.

L’extrait sec a ensuite été dissout dans 20 mL d’hexane puis placé dans un flacon ambré dans lequel 10 mL d’hydroxyde de potassium 20% (KOH, VWR) méthanolique ont été ajoutés. La saponification a été effectuée durant toute une nuit à température ambiante sous agitation et sous atmosphère d’azote. L’échantillon a ensuite été transféré dans une ampoule à décanter pour séparer la phase hexanique de la phase méthanolique. La phase hexanique a été lavée à l’eau bi-distillée jusqu’à la neutralité. Les caroténoïdes présents dans la phase méthanolique ont été extraits par ajout de 3 X 10 mL de dichlorométhane (VWR).

Ces extraits ont également été lavés à l’eau distillée jusqu’à neutralité. Les extraits issus des deux phases ont été regroupés, séchés à l’aide de NaSO4, filtrés et évaporés à 40°C au

80

Tableau 9: Caractéristiques spectrales des caroténoïdes présent dans la pulpe des agrumes

N°

Temps de rétention

(min)

Identification

λ max (nm) observée λ max (nm) dans la littérature

Pic I Pic II Pic III % III/II Pic I Pic II Pic III % III/II

1 22.06 Cis-violaxanthine Cis328 413 436 465 86 Cis328 412 436 464 81

2 23.77 Lutéine^a 419 444 470 33.3 422 444 472 48

3 25.30 Zéaxanthine^a 426 449 473 6 426 450 476 17

4 26.62 Cis-anthéraxanthine Cis330 421 442 469 55.5 Cis330 417 440 468 47

5 29.02 15-cis-β-cryptoxanthine Cis335 421 441 470 Cis338 420 444 470

6 29.45 Zéinoxanthine 421 444 474 421 445 472

7 30.84 Phytoène 276 286 297 276 286 298

8 31.72 β-cryptoxanthine^a 428 452 478 25 427 450 477 20

9 34.51 Phytofluène 332 348 367 84 331 348 368 68

10 39.00 β-carotène^a 452 479 13 452 477 12

11 40.14 ζ-carotène 381 401 427 379 400 420 90

12 50.98 Cis-lycopène Cis360 440 466 496 52.7 Cis355 441 466 490 45

13 60.74 Lycopène^a 447 473 502 62.5 446 472 502 71

aIdentifiés en utilisant les standards authentiques, par comparaison avec leur temps de rétention et le spectre UV-visible. Nous avons tenté d’identifier les autres pigments en utilisant les caractéristiques des spectres rapportés dans la littérature. Les solvants et le programme d’élution en gradient sont les mêmes que dans la littérature (Fanciullino et al., 2008).

Partie II : Matériels et méthodes

81 moyen d’un évaporateur rotatif. Les résidus ont été dissous dans 500 µL d’un mélange méthyl-tert-butyl-éther (MTBE,Sigma-Aldrich)/méthanol (VWR) (80:20, v:v). Les échantillons ont ensuite été placés dans un flacon ambré pour l’analyse par HPLC.

V.2.1. Analyse des caroténoïdes par HPLC

Les caroténoïdes ont été analysés par HPLC en utilisant un détecteur à barrettes de diodes (L-2455 Hitashi, Tokyo, Japon) selon la méthode décrite par Fanciullino et al. (2006).

Les caroténoïdes ont été séparés par une colonne en C30 (250 x 4,6 mm, d. 5 µm, YMC (EUROP GmbH)). Les phases mobiles sont l’eau bi-distillée comme éluant A, le méthanol comme éluant B et le MTBE comme éluant C. Le débit est fixé à 1 mL.min^-1, la température de la colonne est de 25°C et le volume d’injection est de 20 µL. L’élution des caroténoïdes est réalisée en mode gradient en plusieurs étapes : I) 0-5 min, 40%A 60%B ; II) 5-10 min, 20%A 80%B ; III) 10-60 min, 4%A 81% B 15%C ; IV) 60-71 min, 4%A 11%B 85%C ; et V) 71-72 min, 100%B.

Le détecteur à barrettes de diodes a permis de mesurer l’absorbance à différentes longueurs d’onde : 290, 350, 400, 450, et 470 nm.

V.2.2. Identification et quantification des caroténoïdes

Les données chromatographiques et les spectres UV-visibles ont été collectés, stockés et intégrés par le logiciel EZChrome version 6,8 (VWR).

Les caroténoïdes ont été identifiés en comparant leurs caractéristiques chromatographiques et spectrales à celles des standards disponibles ou aux données détaillées dans la bibliographie et obtenues dans les mêmes conditions chromatographiques et sur le même matériel végétal (Tableau 9).

Les composés ont été quantifiés en utilisant une courbe de calibrage du β-carotène.

Les concentrations en caroténoïdes ont été exprimées en µg (β-carotène équivalent).g^-1 de matière fraîche. Chaque caroténoïde a été quantifié en utilisant les aires collectées à la

82 longueur d’onde maximale de son spectre. Le rendement a été déterminé par l’ajout d’un étalon interne, le lycopène, dans chaque échantillon avant l’extraction. Le rendement a été utilisé pour corriger les concentrations obtenues. La concentration en caroténoïdes totaux a été calculée par addition des concentrations de chacun des composés.

Les limites de détection (LOD) et de quantification (LOQ) ont été déterminées pour le β-carotène à partir d’une série de dilution d’un standard (concentrations comprises entre 1 et 10 mg.L^-1) et de plusieurs injections de chaque point de dilution. Les LOQ et LOD ont été calculées selon les équations suivantes : LOD = 3 X S/a et LOQ = 10 / S/a où « S » est l’écart type de l’ordonnée à l’origine et « a » le coefficient de la droite de calibrage obtenue avec les points de dilution (Melendez-Martinez et al., 2003).