Deuxième étude : en fonction des différents stades de développement du

75 rameaux composés de pousses âgées de moins d’un an ont été sélectionnés sur la face est des clémentiniers et à hauteur d’homme (environ 1,50 m). Les rameaux sont répartis sur 3 arbres, ont un diamètre équivalent (environ 1 cm) et sont exposés de la même manière. L’annélation a été appliquée sur les rameaux possédant 40 feuilles le 23 juillet 2008 après la chute physiologique des fruits. Au moment de l’annélation, tous les fruits

69

Figure 26: Dispositif expérimental utilisé pour étudier l’effet sur les critères de qualité du fruit d’une réduction réversible ou non de l’alimentation en sucres en fonction du stade de développement. Les deux traitements, défoliation et ombrage, ont été appliqués à deux stades de développement du fruit (le 24 juillet et le 15 septembre). Durant la phase de maturation, seule un traitement défoliation a été réalisé (le 17 novembre). Le témoin correspond à la faible charge en fruits (30 feuilles par fruit).

70 ont un diamètre compris entre 23 et 27 mm. Aucune chute de fruits n’a été observée durant toute la durée de l’expérimentation. Tous les rameaux fructifères possèdent 40 feuilles au début de l’expérimentation. Avant chaque traitement, tous les rameaux ont été défoliés à 30 feuilles afin qu’ils soient dans les mêmes conditions. Ils ont tous été soumis au stress que peut provoquer une défoliation. La défoliation et l’ombrage des feuilles ont été utilisés pour obtenir trois niveaux de charge en fruits : élevée (5 feuilles par fruit), moyenne (15 feuilles par fruit), et faible (30 feuilles par fruit) (Figure 26). La défoliation (traitement permanent) et l’ombrage (traitement réversible) ont été réalisés sur 15 rameaux (5 rameaux par traitement x 3 niveaux de charge en fruits) le 24 juillet 2008, précocement après la chute physiologique des fruits, et le 15 septembre 2008, à un stade intermédiaire au moment du changement de couleur. Au stade de maturité correspondant à un stade tardif, seule une défoliation a été appliquée (le 17 novembre 2008). L’ombrage des feuilles a été réalisé en utilisant un filet d’ombrage totalement opaque, pour obtenir soit 5 ou 15 feuilles par fruit. Après 15 jours, les ombrages ont été retirés.

Durant l’expérimentation, les données climatiques ont été enregistrées : température, pluviométrie et rayonnement global (Tableau 6).

Tableau 6 : Données climatiques du mois de juillet 2008 au mois de décembre 2008 à San Giuliano.

T min (°C)* T max (°C)* T moy (°C)* Pluviométrie

journalière ; T moy : température mensuelle moyenne.

Tous les fruits ont été récoltés le 1^er décembre 2008. La maturité des fruits a été estimée en utilisant les indicateurs de maturité habituels : l’extrait sec soluble (ESS), l’acidité titrable (AT) et l’indice de maturité (ESS/AT).

71

Figure 27: Spectre de caractérisation de la transmission de l’énergie lumineuse pour les deux ombrières utilisées : l’ombrière transmettant 81,78% de la lumière source (A) et celle transmettant 9,15% de la lumière source (B). La lumière source correspondant au soleil est représenté par un trait plein de couleur bleu et la source agrémentée d’un filtre par un trait en pointillée de couleur rose.

72 II.2. Troisième étude : effet d’un stress photooxydatif imposé au niveau des

feuilles sur la concentration en caroténoïdes des fruits proches

Dans cette expérimentation, nous avons choisi de travailler sur des oranges et non sur des clémentines pour différentes raisons techniques. Pour cet essai, il était nécessaire de travailler sur des arbres bien orientés pour recevoir le plus de lumière naturelle possible.

Donc nous avons choisi des arbres bien exposés, n’étant ombrés ni par des rangs de bordure ni par des haies brise-vent. De plus, afin de pouvoir réaliser toutes les analyses souhaitées pour notre étude, une plus grande quantité de matière était nécessaire. Les oranges

« Navelate » possédaient toutes ses caractéristiques.

48 rameaux composés de pousses âgées de moins d’un an ont été sélectionnés parmi 4 orangers de façon à avoir la même exposition à la lumière, et le même diamètre initial (environ 1 cm). Tous les rameaux ont la même orientation à l’est et sont à la même hauteur (environ 1,5 m du sol). Les rameaux ont été annelés à 40 feuilles avant le début de l’expérimentation le 3 février 2009 durant la phase III du développement du fruit, c’est-à-dire lorsque le fruit est en cours de maturation. Les traitements ont été répartis aléatoirement sur les arbres sélectionnés.

Nous avons utilisé deux types de filet d’ombrage permettant de diminuer l’énergie de la lumière transmise. Leurs spectres de transmissions ont été comparés à une lumière source, qui est le soleil et ont été caractérisées par spectrométrie Li-Cor-Li-1800. L’énergie (300-1100 nm) transmise par le soleil est de 693,30 W/m² tandis que celle transmise lorsque la lumière du soleil est additionnée d’un filtre est de 564,22 W/m² pour le filet d’ombrage de couleur verte et de 63,46 W/m² pour le filet d’ombrage de couleur noir. Nos deux filets d’ombrages permettent donc la transmission de 9,15% (filet d’ombrage de couleur noir bloquant la transmission de 91,75% de l’énergie lumineuse) et de 81,78% (filet d’ombrage de couleur noir bloquant la transmission de 18,22% de l’énergie lumineuse). La quantité de lumière a été modifiée à l’aide de ces ombrages mais pas la qualité. En effet, aucune longueur d’onde n’a été filtrée spécifiquement (Figure 27).

73

Figure 28: Dispositif expérimental utilisé pour étudier l’effet sur les fruits d’un stress photooxydatif appliqué au niveau des feuilles proches.

74 Sur chacun des rameaux, les 10 feuilles les plus proches du fruit, en position terminale, et les plus exposées à la lumière, ont été ombrées individuellement à l’aide du filet d’ombrage 91,75% (Figure 28).

Après 6 jours d’adaptation à une faible quantité de lumière, un stress photooxydatif a été testé, le 9 février 2009. 16 rameaux, correspondant au témoin (T), ont conservé leurs filets d’ombrage à 91,75% jusqu’à la fin de l’expérimentation. 16 rameaux, correspondant au traitement d’intensité lumineuse élevé, ont été soumis brutalement à une forte intensité lumineuse par l’élimination des filets d’ombrage des feuilles. Pour finir, 16 rameaux, correspondant au traitement d’intensité lumineuse moyenne, ont reçu une intensité lumineuse intermédiaire : les filets d’ombrage à 91,75% ont été remplacés par des filets d’ombrage à 18,22%. Les feuilles ont reçu ainsi 81,78% de l’intensité lumineuse.

Pendant l’expérience, de mesures écophysiologiques ont été réalisées sur une quinzaine de feuilles afin de déterminer si les feuilles ont été exposées à un stress photooxydatif.

Les paramètres mesurés sur ces feuilles sont le rendement quantique maximum du photosystème II (Fv/Fm), le rendement minimal de la fluorescence (Fo), le rendement maximal de la fluorescence (Fm), la variation de la fluorescence (Fv), et l’indice de performance (PI) en utilisant le système portable handyPEA (Hansateck, Norfalk, Angleterre).

L’indice de performance est composé de trois composantes indépendantes contribuant à la photosynthèse : RC/ABS , Fv/Fo et (1-Vj)/Vj. Les trois composantes représentent respectivement la contribution au PI de la densité des centres réactionnels actifs, des réactions lumineuses pour la photochimie primaire et les réactions de la phase sombre.

Pour chacun des rameaux fructifères traités, quatre récoltes ont été effectuées : I) le 9 février, 3 heures après l’application du stress ; II) le 10 février, 27 heures après ; III) le 11 février, 51 heures après ; et IV) le 13 février, 99 heures après. Les récoltes ont porté sur 4 fruits par traitement.

Partie II : Matériels et méthodes

75 Tableau 7: Données climatiques du 3 au 13 février 2009 à San Giuliano.

Tmin (°c)* Tmax (°C)* Tmoyenne

journalière ; T moy : température mensuelle moyenne.

Durant l’expérimentation, les données climatiques ont été enregistrées : température, pluviométrie et rayonnement global (Tableau 7).

III. Conservation des échantillons

Après la récolte, les fruits ont été pelés et l’échantillon de pulpe du fruit a été broyé en une fine poudre à l’aide d’azote liquide. Cette dernière a été placé dans un contenant en verre ambré sous atmosphère d’azote et conservée au congélateur à -80°C. Une partie de cette poudre a été pesée puis lyophilisée afin d’obtenir la matière sèche et la matière de départ pour le dosage des sucres et des acides organiques. Les feuilles récoltées ont été plongées dans un bain d’azote liquide puis placées directement au congélateur à -80°C.

IV. Mesure de l’indice de maturité

La mesure de l’acidité titrable a été déterminée par titrage de la soude (0.1 mol.L^-1, pH=8.2) grâce à un titrateur automatique Mettler, DL 25 (Mettler-Toledo, France). Elle a

76 neutralisé les protons libres à l’aide d’une base forte et a été exprimée en milliéquivalent d’acide citrique/g de matière fraîche (Boland, 1990). Les mesures d’extrait sec soluble (°

Bricks) contenu dans la pulpe ont été réalisées à l’aide d’un réfractomètre (modèle Atago, 0-32%, VWR). Les degrés Brix ont été exprimés en pourcentage (Bassene et al., 2009). L’indice de maturité a été déterminé en utilisant le rapport ESS (Extrait Sec Soluble) / AT (Acidité titrable). Pour les fruits de clémentines mûrs, l’indice de maturité est situé aux alentours de 12.

V. Les analyses biochimiques

V.1. Dosage des sucres et des acides organiques

V.1.1. Préparation des échantillons

V.1.1.1. Extraction des sucres

Les sucres ont été extraits selon la méthode décrite par Gomez et al. (2002) : 100 mg de poudre lyophilisées de pulpe d’agrumes ont été homogénéisées dans 10 mL d’un mélange méthanol/eau (50:50, v:v, VWR (West Chester, USA)) et 5 mL de chloroforme (VWR). Cette suspension a été agitée pendant 30 min puis centrifugée à 5500 g pendant 15 min. Le surnageant a été séché pendant une nuit à l’aide d’un évaporateur rotatif à température ambiante puis dissous dans un mélange de 3 mL d’eau et de 1 mL de polyvinyle pirrolidone (PVP) à 5% (Sigma-Aldrich, Steinheim, Allemagne). Après agitation, le mélange a été placé 30 min à température ambiante avant de le centrifuger à 5500 g pendant 10 min.

Le surnageant a été filtré sur une membrane d’acétate de cellulose de diamètre 25 mm et de porosité 22 µm (VWR) puis placé dans un flacon pour l’analyse par HPLC.

V.1.1.2. Extraction des acides organiques

Les acides organiques ont été extraits selon la méthode décrite par Albertini et al.

(2006). 100 mg de poudre ont été lyophilisés, puis solubilisés dans 5 mL d’eau bi-distillée, et homogénéisées au vortex puis au Dounce pendant 1 min. La suspension a été centrifugée à

Partie II : Matériels et méthodes

77 4000 g pendant 10 min à température ambiante. Le surnageant a été filtré sur une membrane d’acétate de cellulose de diamètre 25 mm et de porosité 22 µm (VWR), puis placé dans un flacon pour l’analyse par HPLC.

V.1.2. Analyse des sucres par HPLC

Les sucres ont été analysés par HPLC en utilisant un réfractomètre (Perkin-Elmer, série 200, Waltham, USA). Les sucres ont été séparés par une colonne en C16 de silice avec des groupements amines (High Performance Carbohydrates, 250 x 4,6 mm, d. 4 µm (Waters, Mulfort, USA)) selon la méthode décrite par Albertini et al. (2006). Les phases mobiles sont l’acétonitrile (VWR) comme éluant A et l’eau bi-distillée comme éluant B. Le débit a été fixé à 1 mL.min^-1, la température de la colonne est à 35°C et le volume d’injection est de 10 µL.

L’élution des sucres a été réalisée en mode isocratique en plusieurs étapes : I) l’étape d’équilibrage, 0-15 min, 70%A 30%B ; II) l’étape d’élution, 15-25 min, 70%A 30%B ; III) l’étape de rinçage, 25-27 min, 100% A.

V.1.3. Analyse des acides organiques par HPLC

Les acides organiques ont été analysés par HPLC en utilisant un détecteur UV (Perkin-Elmer, série 200, Waltham, USA) selon la méthode décrite par Albertini et al. (2006). Les acides organiques ont été séparés en phase interne par une colonne en C18, échangeuse de cations (Sphéri-5 RP 18, 220 x 4,6 mm, d. 5 µm, Perkin-Elmer). Les phases mobiles sont le tampon phosphate 25 mM à pH 2,4 (VWR) comme éluant A, l’acétonitrile (VWR) comme éluant B, et l’eau comme éluant C. Le débit a été fixé à 1 mL.min^-1, la température de la colonne est de 20°C et le volume d’injection est de 20 µL. L’élution des acides organiques a été réalisée en mode isocratique en plusieurs étapes : I) l’étape d’équilibrage, 0-15 min, 100%A ; II) l’étape d’élution, 15-30 min, 100%A ; III) l’étape de rinçage, 30-31 min, 30%B 70%C. Les acides organiques ont été détectés à une longueur d’onde de 210 nm.

78 V.1.4. Identification et quantification des sucres et des acides organiques

Les sucres ont été identifiés par leur indice de réfraction et leur temps de rétention en comparaison avec l’injection de trois standards : glucose, fructose et saccharose (Sigma Aldrich). Les acides organiques ont été identifiés par leur temps de rétention en comparaison avec l’injection de cinq standards : acide oxalique, acide malique, acide ascorbique, acide citrique et acide succinique (Sigma Aldrich).

Les données ont été collectées, stockées et intégrées en utilisant le logiciel TotalChrom^TM version 6,2 (Perkin-Elmer).

Les sucres et les acides organiques ont été quantifiés en utilisant des courbes de calibrage pour les différents composés identifiés. Les concentrations ont été exprimées en mg.g^-1 de matière sèche. Les concentrations totales de sucres et d’acides organiques ont été calculées par addition des concentrations de tous les composés identifiés.

V.2. Dosage des caroténoïdes

V.2.1. Préparation des standards

Les concentrations des solutions standard ont été calculées par des mesures au spectrophotomètre en les dissolvant dans un solvant approprié dans un bain à ultrasons, et en utilisant leur coefficient d’extinction molaire (ε) (Tableau 8).

Tableau 8: Préparation des solutions standards.

Standard Solvant de dissolution Coefficient d’extinction (L.mol^-1.cm^-1)

lutéine Ethanol 144 800

zéaxanthine Ethanol 140 900

β-cryptoxanthine Dichlorométhane 135 700

β-carotène Dichlorométhane 138 900

lycopène Dichlorométhane 184 900

Partie II : Matériels et méthodes

79 La solution de lycopène servant de standard interne a été diluée afin d’obtenir une concentration finale de 120 mg.L^-1.

V.2.2. Extraction et saponification des caroténoïdes

Les caroténoïdes ont été extraits selon la méthode décrite par Fanciullino et al. (2006).

Les caroténoïdes étant des molécules sensibles à la lumière et à l’oxygène, toutes les étapes ont été conduites en lumière inactinique et les extraits transférés dans des flacons de verre ambré sous atmosphère d’azote.

Les caroténoïdes de la pulpe des agrumes ont été extraits à partir de 2,5 g de matière fraîche broyée en une fine poudre à laquelle ont été ajoutés 120 mg d’hydroxyde de carbonate de magnésium (MgCO3, Sigma-Aldrich) et 35 mL du mélange d’extraction (éthanol/hexane (VWR), 4:3, v:v, contenant 0,1% de ter-butylhydroxytoluène (BHT, Sigma-Aldrich)). 300 µL, équivalents à 30 µg d’une solution de lycopène ont été ajoutés comme standard interne. Le mélange a été agité pendant 5 min. Les résidus ont été séparés de la phase liquide par filtration avec un entonnoir filtrant de porosité n°2, puis ré-extraits avec 35 mL d’éthanol/hexane (4:3, v:v). Les résidus ont ensuite été rincés avec successivement 30 mL d’éthanol et 30 mL d’hexane jusqu’à leur décoloration. Les phases organiques ont été transférées dans une ampoule à décanter et lavées successivement avec 2 X 50 mL de chlorure de sodium à 10% (NaCl, VWR) et 3 X 50 mL d’eau bi-distillée. La phase aqueuse a été éliminée. La phase hexanique a été séchée à l’aide du sulfate de sodium anhydre (NaSO4, VWR), filtrée et évaporée à 40°C dans un évaporateur rotatif.

L’extrait sec a ensuite été dissout dans 20 mL d’hexane puis placé dans un flacon ambré dans lequel 10 mL d’hydroxyde de potassium 20% (KOH, VWR) méthanolique ont été ajoutés. La saponification a été effectuée durant toute une nuit à température ambiante sous agitation et sous atmosphère d’azote. L’échantillon a ensuite été transféré dans une ampoule à décanter pour séparer la phase hexanique de la phase méthanolique. La phase hexanique a été lavée à l’eau bi-distillée jusqu’à la neutralité. Les caroténoïdes présents dans la phase méthanolique ont été extraits par ajout de 3 X 10 mL de dichlorométhane (VWR).

Ces extraits ont également été lavés à l’eau distillée jusqu’à neutralité. Les extraits issus des deux phases ont été regroupés, séchés à l’aide de NaSO4, filtrés et évaporés à 40°C au

80

Tableau 9: Caractéristiques spectrales des caroténoïdes présent dans la pulpe des agrumes

N°

Temps de rétention

(min)

Identification

λ max (nm) observée λ max (nm) dans la littérature

Pic I Pic II Pic III % III/II Pic I Pic II Pic III % III/II

1 22.06 Cis-violaxanthine Cis328 413 436 465 86 Cis328 412 436 464 81

2 23.77 Lutéine^a 419 444 470 33.3 422 444 472 48

3 25.30 Zéaxanthine^a 426 449 473 6 426 450 476 17

4 26.62 Cis-anthéraxanthine Cis330 421 442 469 55.5 Cis330 417 440 468 47

5 29.02 15-cis-β-cryptoxanthine Cis335 421 441 470 Cis338 420 444 470

6 29.45 Zéinoxanthine 421 444 474 421 445 472

7 30.84 Phytoène 276 286 297 276 286 298

8 31.72 β-cryptoxanthine^a 428 452 478 25 427 450 477 20

9 34.51 Phytofluène 332 348 367 84 331 348 368 68

10 39.00 β-carotène^a 452 479 13 452 477 12

11 40.14 ζ-carotène 381 401 427 379 400 420 90

12 50.98 Cis-lycopène Cis360 440 466 496 52.7 Cis355 441 466 490 45

13 60.74 Lycopène^a 447 473 502 62.5 446 472 502 71

aIdentifiés en utilisant les standards authentiques, par comparaison avec leur temps de rétention et le spectre UV-visible. Nous avons tenté d’identifier les autres pigments en utilisant les caractéristiques des spectres rapportés dans la littérature. Les solvants et le programme d’élution en gradient sont les mêmes que dans la littérature (Fanciullino et al., 2008).

Partie II : Matériels et méthodes

81 moyen d’un évaporateur rotatif. Les résidus ont été dissous dans 500 µL d’un mélange méthyl-tert-butyl-éther (MTBE,Sigma-Aldrich)/méthanol (VWR) (80:20, v:v). Les échantillons ont ensuite été placés dans un flacon ambré pour l’analyse par HPLC.

V.2.1. Analyse des caroténoïdes par HPLC

Les caroténoïdes ont été analysés par HPLC en utilisant un détecteur à barrettes de diodes (L-2455 Hitashi, Tokyo, Japon) selon la méthode décrite par Fanciullino et al. (2006).

Les caroténoïdes ont été séparés par une colonne en C30 (250 x 4,6 mm, d. 5 µm, YMC (EUROP GmbH)). Les phases mobiles sont l’eau bi-distillée comme éluant A, le méthanol comme éluant B et le MTBE comme éluant C. Le débit est fixé à 1 mL.min^-1, la température de la colonne est de 25°C et le volume d’injection est de 20 µL. L’élution des caroténoïdes est réalisée en mode gradient en plusieurs étapes : I) 0-5 min, 40%A 60%B ; II) 5-10 min, 20%A 80%B ; III) 10-60 min, 4%A 81% B 15%C ; IV) 60-71 min, 4%A 11%B 85%C ; et V) 71-72 min, 100%B.

Le détecteur à barrettes de diodes a permis de mesurer l’absorbance à différentes longueurs d’onde : 290, 350, 400, 450, et 470 nm.

V.2.2. Identification et quantification des caroténoïdes

Les données chromatographiques et les spectres UV-visibles ont été collectés, stockés et intégrés par le logiciel EZChrome version 6,8 (VWR).

Les caroténoïdes ont été identifiés en comparant leurs caractéristiques chromatographiques et spectrales à celles des standards disponibles ou aux données détaillées dans la bibliographie et obtenues dans les mêmes conditions chromatographiques et sur le même matériel végétal (Tableau 9).

Les composés ont été quantifiés en utilisant une courbe de calibrage du β-carotène.

Les concentrations en caroténoïdes ont été exprimées en µg (β-carotène équivalent).g^-1 de matière fraîche. Chaque caroténoïde a été quantifié en utilisant les aires collectées à la

82 longueur d’onde maximale de son spectre. Le rendement a été déterminé par l’ajout d’un étalon interne, le lycopène, dans chaque échantillon avant l’extraction. Le rendement a été utilisé pour corriger les concentrations obtenues. La concentration en caroténoïdes totaux a été calculée par addition des concentrations de chacun des composés.

Les limites de détection (LOD) et de quantification (LOQ) ont été déterminées pour le β-carotène à partir d’une série de dilution d’un standard (concentrations comprises entre 1 et 10 mg.L^-1) et de plusieurs injections de chaque point de dilution. Les LOQ et LOD ont été calculées selon les équations suivantes : LOD = 3 X S/a et LOQ = 10 / S/a où « S » est l’écart type de l’ordonnée à l’origine et « a » le coefficient de la droite de calibrage obtenue avec les points de dilution (Melendez-Martinez et al., 2003).

V.3. Dosage du péroxyde d’hydrogène

Les niveaux en peroxyde d’hydrogène ont été déterminés par la méthode décrite par Murshed (2009) et Velikova et al. (2000). 250 mg de pulpe finement broyée à l’aide d’azote liquide ont été homogénéisés dans un bain de glace dans 5 mL d’acide trichloroacétique (TCA, Fisher (Waltham, USA)) à 0,1%. L’homogénat a été centrifugé à 12000 g pendant 5 min à 4°C.

A 500 µL de surnageant ont été ajoutés 500 µL de tampon potassium (VWR) à 10 mM à pH 7 et 1 mL d’iodure de potassium à 1M (VWR). Le mélange a été agité brièvement puis incubé à température ambiante à l’abri de la lumière pendant 30 minutes avant la lecture de l’absorbance à 390 nm au spectrophotomètre (Specord 205, Analytic Jena (Wembley, Angleterre)).

Une solution de peroxyde d’hydrogène commerciale (VWR) a été utilisée pour générer une courbe de calibrage afin de quantifier la concentration en peroxyde d’hydrogène dans la pulpe des agrumes. Les concentrations ont été exprimées en mM.g^-1 de matière fraîche.

Partie II : Matériels et méthodes

83 V.4. Dosage de l’ascorbate

Les concentrations en ascorbate total (AA et DHA) et en ascorbate réduit (AA) ont été mesurées en accord avec la méthode décrite par Gillepsie et Ainsworth (2007). 150 mg de pulpe finement broyée dans l’azote liquide ont été homogénéisées dans 3 mL d’une solution froide d’acide trichloroacétique (TCA, Fischer) à 6%. L’homogénat a été centrifugé à 13000 g pendant 5 min à 4°C. Le surnageant a été utilisé pour le dosage de l’ascorbate et de l’ascorbate total.

Pour mesurer l’ascorbate total, 500 µL d’extrait ont été ajoutés à 100 µL de tampon phosphate 75 mM (pH 7) (VWR), 200 µL de TCA 6% et 100 µL de DL-dithiothréitol (DTT, Sigma-Aldrich). Après une incubation de 10 min à température ambiante, 100 µL de N-éthylmaléimide (NEM, Sigma-Aldrich) à 0,5% (v:v) ont été ajoutés. Le mélange a été incubé pendant 30 s à température ambiante afin de supprimer l’excès de DTT. Ensuite 1,5 mL d’un mélange réactionnel contenant 500 µL de TCA 10%, 400 µL d’acide orthophosphorique (H3PO4, VWR) à 43% (v:v), 400 µL de 2,2-bipyridyl (Sigma-Aldrich) à 4% (w:v) dissous dans de l’éthanol 70%, et 200 µL de chlorure de fer (Sigma-Aldrich) à 3% (w:v) ont été ajoutés. Après 1 heure d’incubation à 37°C, l’absorbance a été mesurée à 525 nm au spectrophotomètre (Specord 205, Analytic Jena (Wembley, Angleterre)).

Pour la détermination de la concentration en ascorbate réduit, la même réaction a été utilisée mais 200 µL de tampon phosphate ont été utilisés à la place du DTT et du NEM.

Une solution de L-acide ascorbique commerciale (VWR) a été utilisée pour générer une courbe de calibrage afin de quantifier la concentration en ascorbate total et en ascorbate réduit dans la pulpe des agrumes. Les concentrations ont été exprimées en mM.g^-1 de matière fraîche.

La quantité de déshydroascorbate (DHA) a été estimée par la différence entre la concentration en ascorbate totale et celle en ascorbate réduit (AA).

84 VI. Les analyses statistiques

D’une manière générale, nous avons considéré que les traitements ont été distribués de manière aléatoire dans une population homogène de rameaux fructifères.

VI.1. Analyse de variance

Tous les résultats ont été exprimés en moyenne ± des erreurs standards (SE). Une

Tous les résultats ont été exprimés en moyenne ± des erreurs standards (SE). Une

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