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Étude des effets des facteurs de l’environnement sur la concentration en caroténoïdes dans la pulpe de
clémentines
Florine Gonord
To cite this version:
Florine Gonord. Étude des effets des facteurs de l’environnement sur la concentration en caroténoïdes dans la pulpe de clémentines. Sciences du Vivant [q-bio]. Université de Corse Pasquale Paoli, 2011.
Français. �tel-02810334�
ECOLE DOCTORALE ENVIRONNEMENT ET SOCIETE UMR CNRS 6134 (SPE)
Thèse présentée pour l’obtention du grade de DOCTEUR EN ASPECTS MOLECULAIRES ET
CELLULAIRES DE LA BIOLOGIE
Mention : Biochimie et Biologie Moléculaire
Soutenue publiquement par Florine Gonord
le 28 septembre 2011
__________________________________________________________
Etude des effets des facteurs de l’environnement sur la
concentration en caroténoïdes dans la pulpe de clémentines (Citrus clementina Hort. Ex Tan.)
__________________________________________________________
Directeurs:
Mr Laurent Urban, Professeur, Université d’Avignon Mme Liliane Berti, Professeur, Université de Corse Rapporteurs :
Mme Hélène Gautier, Dr-HDR, INRA d’Avignon Mr Pierre Baldet, Dr-HDR, INRA de Bordeaux
Jury
Mr Laurent Urban, Professeur, Université d’Avignon Mme Liliane Berti, Professeur, Université de Corse Mme Hélène Gautier, Dr-HDR, INRA d’Avignon Mr Pierre Baldet, Dr-HDR, INRA de Bordeaux Mr Félix Tomi, Professeur, Université de Corse
Mr Frédéric Bourgaud, Professeur, Université de Nancy
REMERCIEMENTS
Merci à l’INRA et à la Collectivité Territoriale de Corse d’avoir financé mon travail de thèse.
Merci à Mme Dominique Agostini, présidente du centre INRA de San Giuliano et à Mr Olivier Pailly, directeur de l’unité de recherche Génétique et Ecophysiologie de la Qualité des Agrumes de l’INRA de San Giuliano de m’avoir accueillie et permis de réaliser mes travaux de recherches au sein de l’unité.
Merci à Mr Laurent Urban, professeur au laboratoire de Physiologie des Fruits et Légumes à l’Université d’Avignon et des Pays du Vaucluse de m’avoir confié ce sujet de thèse et de m’avoir encadré au cours de ces 4 années. Merci d’avoir partagé tes idées, tes réflexions, de ton encadrement, de tes relectures et corrections et d’avoir su me remotiver quand cela était nécessaire.
Merci à Mme Liliane Berti, professeur et directrice du laboratoire de Biochimie et Biologie Moléculaire du Végétal à l’Université de Corse de m’avoir co-encadré. Merci.
Merci à Melle Anne-Laure Fanciullino, chargé de recherche au sein de l’unité GEQA de l’INRA de San Giuliano, pour son encadrement, son aide et ses encouragements infaillibles depuis son arrivée.
Merci à Mme Hélène Gautier, chargé de recherche au sein de l’unité Plantes et Systèmes de cultures Horticoles de l’INRA d’Avignon et à Mr Pierre Baldet, chargé de recherche au sein de l’unité à l’UMR 1332, Biologie du Fruit et Pathologie de l’INRA de Bordeaux, d’avoir accepté d’être rapporteur de cette thèse.
Merci à Mr Frédéric Bourgaud, directeur du laboratoire Agronomie et Environnement de l’UMR 1121 INRA-Université de Nancy et à Mr Félix Tomi, professeur et directeur du laboratoire de Chimie et Biomasse de l’Université de Corse d’avoir accepté de faire partie de mon jury de thèse également constitué de Mme Liliane Berti, et Mr Laurent Urban.
professeur et directrice du laboratoire Physiologie des Fruits et Légumes à l’Université d’Avignon et des Pays du Vaucluse, à Mme Hélène Gautier, à Mr Frédéric Bourgaud et à Mr Luc Bidel, professeur au laboratoire de biochimie et Physiologie Végétale à l’Université de Montpellier pour leur participation à mon comité de thèse, pour leurs conseils scientifiques, leurs aides sur les méthodes de dosages et leurs soutiens.
Merci à Melle Elodie Carcouët, technicienne au sein de l’unité GEQA de l’INRA de San Giuliano pour sa contribution aux analyses biochimiques et, à Mr Jérémie Santini, doctorant au sein de l’unité GEQA de l’INRA de San Giuliano pour sa contribution aux analyses des activités enzymatiques lors de son stage de master, à Mr Jérôme Barbaggio, technicien au sein de l’unité GEQA de l’INRA de San Giuliano et à Mme Isabelle POGGI, ingénieur à la DDTM pour leurs contributions à la mise en place des expérimentations.
Merci à l’équipe du domaine, Franck, Emmanuel, Maxime, Jean-Marc, Charles-Hugo, Jean-Jacques, Abel, Matthieu, Stéphane, Philippe 1, René, Philippe 2, Jean-François, Christian, Paul-Eric, Augustin, Victor et Josée pour tous les bons moments passés ensemble autour d’une tasse de thé, d’un gâteau ou d’un barbecue.
Merci à l’équipe du labo, Yann, François, Gilles, Albert, Jean, Isabelle, Sajjad, Jean- Baptiste, Matthieu, Sabrina et Emmanuel. Une tasse de thé, un gâteau, un ragot, des retours de vacances, … tous est prétexte pour faire une petite pause et oublier le quotidien du travail par quelques bons fous rires.
Merci à Jeanine et à Jean-Pierre. On se rappellera de ces discussions autour d’un sirop et de nos soirées jeux de société inoubliables.
Pour finir, un merci un peu spécial pour ma petite famille de corse : Sandrine, Jérôme, Mourad et Julien. Tellement de choses se sont passées au cours de ces 4 années, que quelques lignes ne suffiraient pas à exprimer toute ma reconnaissance, mon amitié et plus encore alors que dire de plus que merci.
SOMMAIRE
PARTIE I : INTRODUCTION ...1
I. Les caroténoïdes et la santé humaine ... 1
II. Le modèle d’étude : les agrumes ... 4
II.1. Importance économique ... 4
II.2. Origine des agrumes ... 5
II.3. Classification des agrumes ... 6
II.4. Le fruit ... 7
II.4.1. Structure du fruit ... 7
II.4.2. Développement du fruit ... 9
II.5. Valeur nutritionnelle des fruits ... 9
III. La qualité des fruits ... 12
III.1. Le métabolisme des sucres et des acides organiques ... 12
III.2. Le métabolisme des caroténoïdes ... 13
III.2.1. Structure des caroténoïdes ... 14
III.2.2. Caractéristiques des caroténoïdes ... 16
III.2.3. Localisation et stockage des caroténoïdes ... 18
III.2.4. Rôles des caroténoïdes dans la plante ... 19
III.2.1. La voie de biosynthèse des précurseurs ... 23
III.2.1.1. La biosynthèse des précurseurs : le diméthyallyle et le pyrophosphate et l’isopentényle pyrophosphate ... 24
III.2.1.1.1. La voie du mévalonate ... 25
III.2.1.1.2. La voie du méthylérythritol phosphate ... 26
III.2.1.2. La biosynthèse du phytoène ... 28
III.2.2. La biosynthèse des caroténoïdes ... 28
III.2.2.1. Les réactions de déshydrogénation... 28
III.2.2.2. Les réactions de cyclisation ... 29
III.2.3.1. Formation de l’acide abscissique ... 31
III.2.3.2. Formation des autres apocaroténoïdes ... 32
III.2.4. La régulation de la voie de biosynthèse ... 34
III.2.4.1. Régulation transcriptionnelle ... 34
III.2.4.1.1. Régulation au niveau de la voie du méthylérythritol phosphate ... 34
III.2.4.1.2. Les étapes clés de la voie de biosynthèse des caroténoïdes ... 36
III.2.4.2. Rôle de la lumière ... 37
III.2.4.3. Rôle du statut redox des plastoquinones ... 37
III.2.4.4. Rôle des produits finaux ... 38
III.2.4.5. Rôle du stockage des caroténoïdes ... 39
IV. Influence des facteurs de l’environnement sur la biosynthèse et l’accumulation des caroténoïdes ... 41
IV.1. Les effets de l’environnement sur l’accumulation des caroténoïdes ... 41
IV.2. Statut carboné ou stress oxydatif ? ... 43
IV.2.1. L’influence du statut carboné sur la concentration en caroténoïdes ... 43
IV.2.1.1. Liens entre les métabolismes primaire et secondaire ... 43
IV.2.1.1.1. Théories déterministes ... 45
IV.2.1.1.2. Théories mécanistes ... 47
IV.2.2. L’influence du stress oxydatif sur la concentration en caroténoïdes ... 47
IV.2.2.1. Le stress oxydatif et les espèces réactives de l’oxygène ... 49
IV.2.2.2. La formation des espèces réactives de l’oxygène ... 52
IV.2.2.2.1. La production d’espèces réactives de l’oxygène au cours la photosynthèse ... 54
IV.2.2.2.2. La production d’espèces réactives de l’oxygène au cours de la photorespiration ... 57
IV.2.2.2.3. La production d’espèces réactives de l’oxygène au cours de la respiration ... 58
IV.2.2.3. Le statut redox cellulaire ... 59
IV.2.2.4. Rôles des espèces réactives de l’oxygène et des variations de statut redox
dans le contrôle de la biosynthèse des caroténoïdes ... 61
IV.2.3. Les interactions entre l’effet du statut carboné et l’effet du stress oxydatif .. 63
V. Problématique et objectifs ... 64
PARTIE II : MATERIELS ET METHODES ... 66
I. Le matériel végétal ... 67
II. Les dispositifs expérimentaux ... 67
II.1. Effet de l’alimentation en sucres sur les critères de qualité des fruits d’agrumes .. 67
II.1.1. Première étude : en fonction du stade de maturité des fruits ... 67
II.1.2. Deuxième étude : en fonction des différents stades de développement du fruit ... 68
II.2. Troisième étude : effet d’un stress photooxydatif imposé au niveau des feuilles sur la concentration en caroténoïdes des fruits proches ... 72
III. Conservation des échantillons ... 75
IV. Mesure de l’indice de maturité ... 75
V. Les analyses biochimiques ... 76
V.1. Dosage des sucres et des acides organiques ... 76
V.1.1. Préparation des échantillons ... 76
V.1.1.1. Extraction des sucres ... 76
V.1.1.2. Extraction des acides organiques ... 76
V.1.2. Analyse des sucres par HPLC ... 77
V.1.3. Analyse des acides organiques par HPLC ... 77
V.1.4. Identification et quantification des sucres et des acides organiques ... 78
V.2. Dosage des caroténoïdes ... 78
V.2.1. Préparation des standards ... 78
V.2.2. Identification et quantification des caroténoïdes ... 81
V.3. Dosage du péroxyde d’hydrogène ... 82
V.4. Dosage de l’ascorbate ... 83
VI. Les analyses statistiques ... 84
VI.1. Analyse de variance ... 84
VI.2. Représentation Heatmap ... 84
PARTIE III : RESULTATS ET DISCUSSION ... 85
I. L’effet de l’alimentation en sucres sur la biosynthèse des caroténoïdes ... 87
I.1. En fonction des stades de maturité des fruits ... 87
I.1.1. L’effet de la charge en fruits sur les critères de qualité organoleptiques et nutritionnels ... 87
I.1.1.1. L’effet de la charge en fruits sur le calibre du fruit et sur les indicateurs de maturité ... 87
I.1.1.2. L’effet de la charge en fruits sur les caroténoïdes ... 91
I.1.2. L’effet de la charge en fruits, à la date III, sur les concentrations et la composition en sucres, en acides organiques et en caroténoïdes ... 95
I.1.3. Conclusion ... 98
I.2. En fonction de différents stades de développement des fruits ... 98
I.2.1. Variations de calibre et d’indice de maturité du fruit ... 100
I.2.1. Concentration en sucres, en acides organiques et en caroténoïdes ... 102
I.2.2. Variations des concentrations et des proportions en sucres, en acides organiques et en caroténoïdes pour les deux traitements considérés ... 106
I.2.3. Conclusion ... 110
II. L’effet du stress oxydatif et du statut redox sur la biosynthèse des caroténoïdes .... 110
II.1. L’effet de fortes intensités lumineuse sur les indicateurs de stress des feuilles ... 112
II.2. Mise en évidence d’un signal entre les feuilles et le fruit ... 115
II.3. L’effet de fortes intensités lumineuses sur les différentes formes d’ascorbate et sur le statut redox ... 118
II.4. L’effet de fortes intensités lumineuses sur les critères de qualité du fruit ... 121
II.5. Conclusion ... 122
PARTIE IV : CONCLUSION ET PERSPECTIVES ... 123
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ... 130
ANNEXES ... 158
ANNEXE 1 : ARTICLE DE SYNTHESE ... 159
ANNEXE 2 : POSTERS ... 178
Partie I : Introduction bibliographique
Figure 1: Production d'agrumes ... 3
Figure 2: Origine et dispersion des agrumes ... 5
Figure 3: Classification des Aurantioideae. ... 6
Figure 4: Structure du fruit d'agrumes ... 7
Figure 5: Croissance et développement du fruit ... 8
Figure 6: Métabolisme des sucres et des acides organiques ... 11
Figure 7: Les caroténoïdes... 14
Figure 8: Structure fine des caroténoïdes d’après Britton (1995). ... 15
Figure 9: Représentation de la transition chloroplaste-chromoplaste). ... 17
Figure 10: Spectres d'absorption de la chlorophylle a, de la chlorophylle b, des carotènes et des xanthophylles pour les différentes longueurs d’onde. ... 20
Figure 11 : Cycle des xanthophylles (A) et répartition des xanthophylles au cours du cycle (B) ... 22
Figure 12: Biosynthèse des précurseurs ... 24
Figure 13: Voie du mévalonate ... 25
Figure 14: Voie du méthylérythritol phosphate ... 26
Figure 15: Voie de biosynthèse des caroténoïdes ... 27
Figure 16: Voie de biosynthèse de l'acide abscissique ... 31
Figure 17: La régulation de la voie de biosynthèse des précurseurs. ... 33
Figure 18: La régulation de la voie de biosynthèse des caroténoïdes. ... 35
Figure 19: Théorie de l’équilibre entre les mécanismes de différenciation et de croissance 44 Figure 20: Réseau de signalisation impliquant les interactions entre les hormones et les espèces réactives de l’oxygène ... 46
Figure 21: Déséquilibre de la balance entre les espèces réactives de l'oxygène (ROS) et les antioxydants ... 48
Figure 22: Formation des différentes espèces réactives de l'oxygène ... 50
Figure 23 : Formation d'espèces réactives de l'oxygène dans les chloroplastes ... 53
Figure 24: Formation de peroxyde d'hydrogène lors de la photorespiration ... 56
Figure 25: Production d’anion superoxyde dans la chaine de transport des électrons de la membrane mitochondriale interne ... 58
Partie II: Matériels et méthodes Figure 26: Dispositif expérimental utilisé pour étudier l’effet sur les critères de qualité du fruit d’une réduction réversible ou non de l’alimentation en sucres en fonction du stade de développement. ... 69
Figure 27: Spectre de caractérisation de la transmission de l’énergie lumineuse pour les deux ombrières utilisées ... 71
Figure 28: Dispositif expérimental utilisé pour étudier l’effet sur les fruits d’un stress photooxydatif appliqué au niveau des feuilles proches. ... 73
Partie III: Résultats et discussion Figure 29: Diamètre (A) et poids frais de fruits de clémentine (B), au cours de la maturation, en fonction de la charge en fruits ... 86
maturation, en fonction de la charge en fruit ... 88 Figure 31: Concentrations en caroténoïdes totaux de fruits de clémentine, au cours de la maturation, en fonction de la charge en fruits ... 90 Figure 32: Quantité de caroténoïdes totaux par fruit de, à la date III, pour les traitements
avec une charge en fruits ... 90 Figure 33 : Concentrations en sucres (A), en acides organiques (B) et en caroténoïdes (C)
dans les fruits de clémentine, à la date III, pour tous les traitements correspondent à une charge en fruits ... 94 Figure 34: Concentration en caroténoïdes totaux, en fonction de la charge en fruits (élevée
et moyenne), du stade de développement auquel la charge été appliquée (précoce, intermédiaire et tardif) et la méthode utilisée (défoliation ou ombrage) par rapport au témoin ... 101 Figure 35: Heatmap représentant les concentrations en métabolites primaires (sucres et
acides organiques) et secondaires (caroténoïdes) dans la pulpe en fonction des différents traitements appliqués. ... 103 Figure 36: Concentrations en sucres, en acides organiques et en caroténoïdes, en fonction de
la méthode utilisée : défoliation ou ombrage pour une charge en fruits élevée appliquée précocement, après la chute physiologique du fruit par rapport au témoin ... 105 Figure 37: Evolution du rendement quantique maximal du photosystème II (Fv/Fm) (A), de la
fluorescence minimale (Fo) (B) et de la fluorescence maximale (Fm) (C), au cours du stress photooxydatif, en fonction de l’intensité lumineuse ... 111 Figure 38: Variation de l’indice de performance (PI) (A), et de ses composantes : la densité
des centres de réactions actifs exprimée en fonction de la chlorophylle (RC/ABS) (B), des réactions lumineuses pour la photochimie primaire (Fv/Fo) (C) et des réactions
sombres [(1-Vj)/Vj] (C), après exposition à un stress photooxydatif, en fonction de l’intensité lumineuse ... 113 Figure 39: Evolution du statut rédox de l’ascorbate dans la pulpe des fruits, au cours du stress photooxydatif, en fonction de l’intensité lumineuse ... 119 Figure 40: Concentrations en sucres (A), en acides organiques (B) et en caroténoïdes (C) dans
la pulpe des fruits, à t=99h après l’application du stress photooxydatif, en fonction de l’intensité lumineuse ... 120
Partie I : Introduction bibliographique
Tableau 1: Composition en caroténoïdes dans la pulpe des fruits d'agrumes exprimée en mg.L-1 ... 10 Tableau 2: Effets positifs des facteurs de l’environnement, la lumière, la température,
l’approvisionnement en carbone, la sécheresse, la salinité et la fertilisation azotée, sur la concentration en caroténoïdes par rapport à la matière fraîche dans différents fruits ... 40 Tableau 3: Effets négatifs des facteurs de l’environnement, la lumière, la température,
l’approvisionnement en carbone, la sécheresse, la salinité et la fertilisation azotée, sur la concentration en caroténoïdes par rapport à la matière fraîche dans différents fruits ... 42 Tableau 4 : Production des espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans une cellule végétale. 51
Partie II: Matériels et méthodes
Tableau 5: Données climatiques du mois de juillet 2007 au mois de janvier 2008 à San Giuliano. ... 68 Tableau 6 : Données climatiques du mois de juillet 2008 au mois de décembre 2008 à San
Giuliano. ... 70 Tableau 7: Données climatiques du 3 au 13 février 2009 à San Giuliano. ... 75 Tableau 8: Préparation des solutions standards. ... 78
Partie III: Résultats et discussion
Tableau 9: Indice de maturité des fruits de clémentine en fonction des charges en fruits et des dates considérées ... 89 Tableau 10: Pourcentages des différentes formes de caroténoïdes, de sucres et d’acides
organiques, en fonction de la charge en fruits, à la date III... 96 Tableau 11: Diamètre, poids du fruit frais et indice de maturité, en fonction de la charge en
fruits (élevée, moyenne), du stade de développement auquel la charge a été appliquée (précoce, intermédiaire et tardif) et la méthode utilisée (défoliation ou ombrage) par rapport au témoin (charge en fruits faible) ... 99 Tableau 12: Concentrations en sucres totaux et en acides organiques totaux, en fonction de
la charge en fruits (élevée, moyenne), du stade de développement auquel la charge a été appliquée (précoce, intermédiaire et tardif) et la méthode utilisée (défoliation ou ombrage) par rapport au témoin (charge en fruits faible). ... 101 Tableau 13: Pourcentages des différentes molécules de caroténoïdes, de sucres et d’acides
organiques, respectivement, en fonction de la méthode utilisée (défoliation ou ombrage) pour une charge en fruits élevée appliquée précocement, après la chute physiologique du fruit. ... 107 Tableau 14: Concentrations en peroxyde d’hydrogène, dans la pulpe des fruits, en fonction
de l’intensité du stress photooxydatif ... 116 Tableau 15 : Concentrations en ascorbate réduit, en déshydroascorbate, et en ascorbate
total, dans la pulpe du fruit, en fonction de l’intensité du stress photooxydatif. ... 117
A
A Anthéraxanthine
AA Ascorbate réduit ABA Acide abscissique Acétyl-CoA Acétyl-Coenzyme A
ADN Acide désoxyribonucléique ADP Adénosine diphosphate
ALD Aldolase
AOX Alternative oxydase APX Ascorbate peroxydase
ARNm Acide ribonucléique
messager AT Acidité titrable
ATP Adénosine triphosphate
B
BHT Ter-nutylhydroxytoluène
C
C Cytochrome c
CAT Catalase
CDD Dioxygénase clivant les caroténoïdes
CDP-Me 4-(cytidine-5’-diphospho)-2C- méthyl-D-érythritol
CDP-MEP 2-phospho-4-cytidine-5’- diphospho-2C-méthyl-D- érythritol
CMK 4-(cytidine-5’-diphospho)-2C- méthyl-D-érythritol kinase CMT 2-C-méthyl-D-xylulose-5-
phosphate synthase CoA-SH Coenzyme A
CRTISO Caroténoïde isomérase CS Citrate synthase
CTP 2-C-méthyl-D-xylulose-5- phosphate synthase
D
D Défoliation
DBMIB 2,5-dibromo-6-isopropyle-3- méthyle-1,4-benzoquinone DCMU 3-(3,4-dichlorophényle)-1,1
diméthylurée DHA Déshydroascorbate DHAR Déshydroascorbate
réductase DMAPP Diméthylallyle
pyrophosphate DTT DL-dithioéthréitol DXP 1-désoxy-D-xylulose-5-
phosphate
DXPS 1-désoxy-D-xylulose-5- phosphate synthase DXR 1-désoxy-D-xylulose-5-
phosphate réductase
E
E1/E2 NAD(P)H déshydrogénase externe
ESS Extrait soluble sec
F
FAD Flavine adénine diphosphate
Fd Ferrédoxine
FNR Ferrédoxine NADP-réductase FPP Farnésyle pyrophosphate Fo Fluorescence minimale Fm Fluorescence maximale Fv/Fo : Réactions lumineuses pour la
photochimie primaire
Fv/Fm Rendement quantique
maximal du photosystème II
G
GDBH Théorie de l’équilibre entre la différenciation et la croissance
GO Glycolate oxydase GPP Géranyle pyrophosphate
GGPP Géranyle géranyle
pyrophosphate
GGPPS Géranyle géranyle
pyrophosphate synthase GR Glutathion réductase GSH Glutathion réduit GSSG Glutathion disulfide
H
HDR 1-hydroxy-2-méthyl-2-(E)- butényl-4-phosphate réductase
HDS 1-hydroxy-2-méthyl-2-(E)- butényl-4-phosphate synthase
HK Hexokinase
HMBPP 1-hydroxy-2-méthyl-2-(E)- butényl-4-phosphate HMG-CoA 3-hydroxy-3-méthylglutaryl-
CoA
HMGR 3-hydroxy-3-méthylglutaryl- CoA réductase
HMGS 3-hydroxy-3-méthylglutaryl- CoA synthase
HPLC Chromatographie liquide haute performance
I
I1 NADH déshydrogénase
interne
IDH Isocitrate déshydrogénase IM Indice de maturité
INV Invertase
IPP Isopentényle pyrophosphate IPS Isopentényle diphosphate
isomérase
LOD Limite de détection LOQ Limite de quantification LCY-β Lycopène β cyclase LCY-ε Lycopène ε cyclase
M
MCS 2-C-méthyl-D-érythritol-2,4- cyclodiphosphate synthase MDHA Monodéshydroascorbate MDHAR Monodéshydroascorbate
réductase
Me-cPP 2-C-méthyl-D-érythritol-2,4- cyclodiphosphate
MEP 2-C-méthyl-D-érythritol-4- phosphate
MF Matière fraîche
MnSOD Superoxyde dismutase à manganèse
MS Matière sèche
MTBE Méthyl-tert-butyl éther
MVA Mévalonate
MVK Mévalonate kinase MVP Mévalonate-5-phosphate MVPP Mévalonate-5-diphosphate
N
NAD(P) Nicotinamide adénine dinucléotide (phosphate) NCED Dioxygénase clivant les 9-cis-
apocaroténoïdes
NPQ Non photochemical
quenching
NSY Néoxanthine synthase
O
O Ombrage
P
PDH Pyruvate déshydrogénase PDS Phytoène désaturase PFK Phosphofructokinase
PGP Phosphoglycolate phosphate Pi Phosphate inorganique PI Indice de performance PK Pyruvate kinase
PQ Plastoquinone
PQH2 Plastoquinone réduite PTOX Plastoquinone oxydase PSI Photosystème I
PSII Photosystème II PSY Phytoène synthase PMD Mévalonate diphosphate PMK Di-phospho-mévalonate
kinase
PPi Pyrophosphate inorganique PVP Polyvinyle pirrolidone
Q
Q Pool d’ubiquinone
R
RC/ABS Densité des centres réactionnels actifs exprimée en fonction de la chlorophylle
ROS Espèces réactives de
l’oxygène
S
SAA Acclimatation de systémique acquise
SE Stress d’intensité lumineuse élevé
SM Stress d’intensité lumineuse moyen
SOD Superoxyde dismutase SS Saccharose synthase
T
T Témoin
TPP Thiamine pyrophosphate TRX Thiorédoxine
U
UDP Uridine diphosphate UTP Uridine triphosphate UV Ultra-violet
V
V Violaxanthine
VDE Violaxanthine dé-époxydase
Z
Z Zéaxanthine
ZDS ζ-carotène désaturase ZEP Zéaxanthine époxydase
(1-Vj)/Vj Réactions en phase obscure 3-PGA Glycéraldéhyde-3-phosphate
β-HY β-carotène hydroxylase ε Coefficient d’extinction
molaire
ε-HY ε-carotène hydroxylase
Ce travail a été réalisé au sein de l’unité GEQA « Génétique et Ecophysiologie de la Qualité des Agrumes » à l’INRA de Corse. Une partie de ce travail a fait l’objet d’une valorisation sous forme d’articles, de communications orales, et de posters.
ARTICLE PUBLIE :
Poiroux-Gonord F., Bidel L.P.R., Fanciullino A.L., Gautier H., Lauri-Lopez F., Urban L.
2010. Health benefits of vitamins and secondary metabolites of fruits and vegetables and prospects to increase their concentrations by agronomic approaches. Journal of Agricultural and Food Chemistry 58, 12065-12082.
ARTICLE SOUMIS :
Poiroux-Gonord F., Fanciullino A.L., Berti L., Urban L. Effect of fruit load on maturity and the concentration in carotenoids of Clementine fruits (Citrus clementina Hort. Ex Tan.).
Soumis à Journal of the Science of Food and Agriculture.
COMMUNICATION ORALE :
Gonord F., Fanciullino A.L., Berti L., Urban L. 2009. It is possible to increase the carotenoid concentrations of Citrus fruits by acting on environment factors. 3rd International Symposium on Human Health Effects of Fruits and Vegetables. Avignon, France.
POSTERS:
Gonord F., Berti L., Urban L. 2008. Effet des facteurs de l’environnement sur la teneur en caroténoïdes dans la pulpe de clémentine. Journée de l’école doctorale. Corte, France.
Urban L., Gonord F., Berti L., Sallanon H., Lauri F. 2008. Effet de l’agriculture biologique sur la valeur santé des fruits et légumes: réflexions et études en cours sur la clémentine et la tomate. DINABIO. Montpellier, France.
Gonord F., Fanciullino A.L., Berti L., Urban L. 2009. Sugars influence the biosynthesis of carotenoids in the pulp of clementine fruits (Citrus clementina). Les réserves végétales et leurs importances agronomiques et sylvicoles. Caen, France.
Gonord F., Fanciullino A.L., Berti L., Urban L. 2011. Effet de la charge en fruits sur la maturité et la concentration en caroténoïdes dans les fruits de la clémentine (Citrus clementina Hort. Ex Tan.). Journée de l’école doctorale. Corte, France.
Partie I : Introduction
Partie I : Introduction bibliographique
1 I. Les caroténoïdes et la santé humaine
Les plantes produisent une large diversité de molécules organiques. On appelle métabolites secondaires, celles qui ne sont pas impliquées directement dans les processus majeurs que sont la croissance et le développement. En accord avec la nomenclature adoptée par la Fondation Anglaise de Nutrition, les métabolites secondaires des plantes peuvent être divisés en trois groupes majeurs : les terpénoïdes (environ 25000 composés actuellement recensés), les alcaloïdes (environ 1200 composés) et les composés phénoliques (environ 8000 composés) (Goldberg, 2003). Contrairement aux métabolites primaires, les métabolites secondaires sont souvent inégalement répartis à travers les groupes taxonomiques du règne végétal. Parmi les métabolites secondaires, certains sont essentiels à la vie, les vitamines comme, par exemple les tocophérols. Cependant toutes les vitamines ne sont pas considérées comme des métabolites secondaires. C’est le cas de l’ascorbate, l’antioxydant principal chez les plantes et pour l’Homme. D’autres métabolites secondaires sont des provitamines. Ils sont convertis en vitamines dans l’intestin des animaux. Ainsi, la β- cryptoxanthine et le β-carotène, présents chez plusieurs fruits et légumes, sont des précurseurs de la vitamine A (Fraser et Bramley, 2004; Fraser et al., 2007; Krinsky, 1989).
Les fruits et légumes représentent la principale source de vitamines, et de métabolites secondaires (Kaur et Kapoor, 2001). Les bénéfices nutritionnels des fruits et des légumes sont partiellement attribuables à leurs fortes teneurs en vitamines et en composés secondaires (UNESCO, 2008). En 2008, l’Organisation Mondiale pour la Santé (OMS) a estimé que 63% des décès dans le monde sont dus aux maladies non transmissibles. Parmi ces maladies non transmissibles, 80% des décès sont dus aux maladies cardiovasculaires, aux cancers, aux maladies respiratoires et au diabète. Dans un rapport publié conjointement par l’Organisation Mondiale pour la Santé (OMS) et la FAO en 2003, il est recommandé de consommer au moins 400g, de fruits et légumes journellement (FAO, 2003). Bien que les bénéfices nutritionnels des fruits et des légumes frais aient été établis depuis longtemps, leur consommation demeure insuffisante. Dans certains pays, comme la France, malgré le nombre de campagnes d’informations organisées par le ministère de la santé et les associations, les quantités de fruits et légumes frais consommées restent inférieures aux recommandations de la FAO. Dans les pays développés, il peut être intéressant pour les
2 filières de proposer des fruits et des légumes avec des quantités augmentées ou garanties en micronutriments pour que les consommateurs n’aient pas besoin d’augmenter leur consommation journalière de fruits et de légumes. De même, les fruits et légumes enrichis en micronutriments permettraient aux populations des pays en voie de développement d’avoir une alimentation de meilleure qualité.
Contrairement aux glucides, aux lipides et aux protéines, qui sont hydrolysés en petites molécules assimilables lors de l’ingestion par l’Homme, les caroténoïdes précurseurs de la vitamine A (β-carotène, α-carotène et β-cryptoxanthine) sont convertis dans l’intestin en vitamine A. Les caroténoïdes précurseurs de la vitamine A (β-carotène, α-carotène et β- cryptoxanthine) sont des composants essentiels au régime alimentaire humain (Fraser et Bramley, 2004; Fraser et al., 2007; Krinsky, 1989). La vitamine A est impliquée dans la synthèse d’hormones, les réponses immunitaires, la régulation de la croissance et la différenciation cellulaire (Bender, 2003; Combs, 1995). La consommation accrue de fruits et légumes et un apport supplémentaire en caroténoïdes joueraient un rôle important dans la prévention de certaines formes de cancers, des maladies cardiovasculaires et de la dégénérescence maculaire. Par exemple, Miller et al. (2004) ont montré une association inverse entre la consommation de fruits et le risque de cancer du poumon chez les sujets non-fumeurs. Un effet protecteur des fruits et légumes sur les cancers des voies aéro- digestives supérieures (pharynx, larynx, œsophage,…) a également été observé par Boeing et al. (2006). De même, les teneurs en lycopène et en caroténoïdes totaux présentes dans le plasma et le risque de cancer de la prostate ont été corrélés négativement (Key et al., 2004).
La β-cryptoxanthine et la zéaxanthine seraient impliquées en association avec la vitamine C, le rétinol et l’α-tocophérol, dans la prévention des cancers gastriques et du cancer colorectal (Jenab et al., 2006). Des études récentes ont montré que le lycopène pourrait avoir des effets bénéfiques sur certaines lésions malignes dans la cavité buccale et pourrait donc contribuer à la prévention et au traitement des cancers (Lu et al., 2011). Des études épidémiologiques ont mis en évidence l’existence d’une corrélation négative entre le taux de caroténoïdes et l’augmentation du risque de maladies cardiovasculaires (Gaziano et al., 1995). Une forte concentration en caroténoïdes, et en particulier en zéaxanthine et en lutéine, est corrélée avec un moindre risque de dégénérescence sénile maculaire (Tavani et al., 1996).
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Figure 1: Production d'agrumes (Source FAO).
A : Principales cultures fruitières mondiales ; B : Principales zones de productions des agrumes dans le monde ; C : Principaux pays producteurs d’agrumes dans le Bassin Méditerranéen.
4 Du fait de leur concentration et de leur composition en caroténoïdes, les agrumes sont un modèle d’étude idéal. En effet, les agrumes contiennent de forte concentrations en caroténoïdes et une grande diversité de caroténoïdes (Gross et al., 1987), dont la β- cryptoxanthine qui est une provitamine A. La β-cryptoxanthine et la violaxanthine sont les principaux caroténoïdes respectivement chez la clémentine et chez l’orange.
II. Le modèle d’étude : les agrumes
II.1. Importance économique
En 2009, la production mondiale a été de 124,4 millions de tonnes (Mt). La production d’agrumes est au 1er rang des productions fruitières devant la banane (95.6 Mt), la pomme (71,7 Mt), et le raisin (66,9 Mt) (Figure 1A). Cette production est composée à 60% d’oranges, à 22% de petits agrumes (clémentines et mandarines), à 12% de citrons et à 4% de pomelos.
Le reste de la production correspond à des cultures marginales comme le cédrat et le kumquat. Plus de la moitié de la production mondiale est destinée à la consommation de fruits frais, le reste étant transformé (Source FAO).
Les principales zones de production d’agrumes sont la Chine (25 Mt), le Brésil (20,5 Mt), le Bassin Méditerranéen (20 Mt) et les Etats-Unis (10,7 Mt), suivis par le Mexique (7,5 Mt) et l’Inde (7,2 Mt) (Figure 1B). Les productions issues du Brésil et des Etats-Unis sont principalement destinées à la transformation, tandis que les productions issues de la Chine et du Bassin Méditerranéen sont avant tout destinées à la consommation de fruits frais.
Au sein du Bassin Méditerranéen, les principaux pays producteurs sont l’Espagne (5,5 Mt), l’Italie (3,6 Mt), la Turquie (2,8 Mt), l’Egypte (2,6 Mt) et le Maroc (1,3 Mt) (Figure 1C) (Source FAO).
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5 II.2. Origine des agrumes
Les agrumes ont une origine asiatique. Ils sont issus des régions tropicales et subtropicales du nord-est asiatique, du nord-est de l’Inde, de la péninsule indochinoise et de l’archipel malais (Nicolosi, 2007). La diffusion des agrumes a eu lieu à travers le monde. Les conquêtes grecques et romaines en Asie Mineure et au Moyen-Orient ont permis la dispersion du cédrat. Les croisades et l’expansion de la civilisation islamique, quant à eux, ont permis de propager les agrumes acides, les échanges commerciaux et la découverte des nouveaux mondes ont permis l’introduction des orangers (Figure 2). La seule espèce non originaire d’Asie est le pomelo (Citrus paradisi Macf.) découvert par C. Colomb lorsqu’il est arrivé dans les Caraïbes. De nos jours, les agrumes sont cultivés dans le monde entier entre le 40ème parallèle nord et le 40ème parallèle sud.
La première espèce d’agrumes introduite et cultivée dans le Bassin Méditerranéen en 300 av. J.C. est le cédratier (C. medica L.). Le bigaradier (C. aurantium L.) a été introduit par les Arabes en Afrique depuis l’Inde puis diffusé en Méditerranée. La clémentine est une espèce récente, caractérisée au XXème siècle, originaire d’Afrique du Nord et issue d’un
Figure 2: Origine et dispersion des agrumes d'après Ollitrault et al. (2003).
6 croisement entre l’oranger doux et le mandarinier. Le bassin méditerranéen est une zone importante de diversification secondaire pour les orangers (C. sinensis (L.) Osbeck), les petits fruits d’agrumes: mandariniers et clémentiniers (C. reticulata Blanco et C. clementina Hort.
Ex Tan.), et les citronniers (C. Limon (L.) Burm.).
II.3. Classification des agrumes
Les agrumes appartiennent à la famille des Rutaceae, l’une des 21 familles composant l’ordre des Géréniales. Les Rutaceae comprennent 1600 espèces et 150 groupes regroupés en 7 sous-familles et 12 tribus. Les « agrumes vrais » regroupent 6 genres sexuellement compatibles de la famille des Rutaceae, de la sous-famille des Aurantioideae, et de la tribu des Citreae (Figure 3) (Swingle et Reece, 1967).
La majorité des espèces dont les fruits sont consommés appartiennent au genre Citrus.
Le genre Fortunella rassemble deux à sept espèces communément appelées kumquat. Le genre Poncirus, mono-spécifique, est utilisé comme porte-greffe du fait de ses résistances aux contraintes biotiques (Praloran, 1971). La classification des agrumes diverge selon les taxonomistes. Swingle et Reece (1967) ont identifié 16 espèces dont 8 comestibles alors que Tanaka (1961) a décrit 162 espèces.
Figure 3: Classification des Aurantioideae d’après Swingle et Reece (1967).
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7 II.4. Le fruit
Le fruit d’agrumes est un type spécial de baie appelé « hespéridium ». C’est un fruit
« vrai » né de la croissance et du développement d’un ovaire, composé d’un nombre variable d’unités, arrangées radialement en carpelles. Un petit fruit secondaire, appelé
« navel », est présent chez certaines espèces (Spiegel-Roy et Goldschmidt, 1996).
II.4.1. Structure du fruit
Les fruits d’agrumes sont composés de deux régions morphologiques distinctes, le péricarpe communément appelé la peau, et l’endocarpe, qui est la partie comestible du fruit connue sous le nom de pulpe (Figure 4).
La peau est composée de l’épicarpe ou flavedo qui est la couche externe colorée, et du mésocarpe ou albédo qui est la couche interne blanche riche en glandes à huiles essentielles.
Durant les premiers stades du développement du fruit, le flavedo est un tissu vert photosynthétique (Spiegel-Roy et Goldschmidt, 1996). Au cours de la maturation, la chlorophylle est dégradée et les chloroplastes sont transformés en chromoplastes riches en caroténoïdes. La pulpe qui est la partie comestible du fruit, est composée de segments qui sont entourés d’une membrane et remplis de sacs à jus (Spiegel-Roy et Goldschmidt, 1996).
Figure 4: Structure du fruit d'agrumes d'après Praloran (1971).
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Figure 5: Croissance et développement du fruit d'après Spiegel-Roy et Goldschmidt (1996) et Tadeo et al. (2008).
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9 II.4.2. Développement du fruit
La croissance et le développement des fruits suivent une courbe de croissance sigmoïde typique, divisée en trois phases : la division cellulaire (phase I), le grossissement cellulaire (phase II) et la maturation des fruits (phase III) (Figure 5A) (Bain, 1958).
La phase initiale, ou phase I, est caractérisée par la division cellulaire et un faible grossissement cellulaire. Cette phase dure entre cinq et dix semaines après la floraison (Spiegel-Roy et Goldschmidt, 1996). Par la suite, pendant la période de croissance rapide (phase II), les fruits subissent une très forte augmentation de la taille par grossissement cellulaire et accumulent des réserves et de l’eau. Cette période dure de 4 à 6 mois (Mehouachi et al., 1995). La phase III, également définie comme la période de maturation, où la croissance ralentit très fortement. L’accumulation des sucres dans les fruits commence lors de la phase II pour atteindre un maximum au stade de maturité tandis que l’accumulation des acides organiques atteint son maximum au milieu de la phase II (Figure 5B). Ensuite, une diminution de la quantité d’acide est observée. Les fruits mûrs, sont caractérisés par une faible acidité (Iglesias et al., 2007). L’accumulation massive de caroténoïdes est concomitante à la dégradation de la chlorophylle (Figure 5C) (Kato et al., 2004).
La quantité de caroténoïdes est faible au début du développement des fruits. Au cours du changement de couleur des fruits (passage de la couleur verte à la couleur orange), on observe une diminution en carotènes (β-, α-, δ-, et ζ-carotènes) et en β,ε-xanthophylles (lutéine) et une augmentation de β,β-xanthophylles (β-cryptoxanthine, zéaxanthine et violaxanthine) (Kato et al., 2004; Rodrigo et al., 2004). A maturité, les petits fruits tels que la mandarine accumulent préférentiellement de la β-cryptoxanthine (Goodner et al., 2001;
Ikoma et al., 2001) tandis que les oranges accumulent de la violaxanthine (Lee, 2001).
II.5. Valeur nutritionnelle des fruits
La pulpe des fruits d’agrumes est composée à 85-90% d’eau (Erickson, 1968). A côté des sucres solubles, des acides organiques dont la vitamine C, des acides aminés, et de la
10 pectine, on trouve des composés secondaires (flavonoïdes, anthocyanes, et caroténoïdes) et des minéraux (Spiegel-Roy et Goldschmidt, 1996).
Il existe une grande diversité de caroténoïdes chez les agrumes. Leurs concentrations sont spécifiques des espèces (Tableau 1).
Tableau 1: Composition en caroténoïdes dans la pulpe des fruits d'agrumes exprimée en mg.L-1 d'après Fanciullino et al. (2006).
Citron Euréka
Pomelo Star Ruby
Mandarine Willowleaf
Orange
Shamouti Clémentine
lutéine 2,389 1,155 0,733
cis-violaxanthine 0,670 10,581 3,261
zéaxanthine 0,682 0,853 0,830
phytoène 2,130 1,126 0,758 0,946
β-cryptoxanthine 0,165 10,287 2,694 9,087
phytofluène 1,711 1,267 0,703 1,265
ζ-carotène 0,126 0,369 0,465 0,957 1,098
α-carotène 0,133 0,091 0,147
β-carotène 2,826 1,781 0,587 2,434
lycopène 10,072
caroténoïdes
totaux 0,291 17,566 22,481 17,790 24,962
La pulpe des agrumes a une composition complexe en caroténoïdes, elle peut contenir jusqu’à 40 molécules différentes (Rouseff et al., 1996). Les agrumes peuvent être classés en trois groupes. Le groupe des mandarines, clémentines et oranges, est caractérisé par une forte concentration en caroténoïdes totaux et notamment en xanthophylles. La β- cryptoxanthine est le composant majeur des clémentines et des mandarines tandis que la cis-violaxanthine s’accumule préférentiellement chez l’orange. Le groupe des citrons et des limes est caractérisé par une faible concentration en caroténoïdes, tandis que le groupe des pomelos est riche en lycopène (Fanciullino et al., 2006).
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Figure 6: Métabolisme des sucres et des acides organiques d’après Buchanan et Balmer (2005) et Taiz et Zieger (2006).
ALD : aldolase ; ATP-PFK: phosphofructokinase dépendante de l’ATP; CoA-SH : coenzyme A ; CS : citrate synthase ; HK : hexokinase ; IDH : isocitrate déshydrogénase ; INV : invertase ; PPi : pyrophosphate ; PPi-PFK: phosphofructokinase dépendante du PPi ; PDH : pyruvate déshydrogénase ; PK : pyruvate kinase ; SS : saccharose synthase.
12 III. La qualité des fruits
Chez les agrumes, la qualité des fruits est liée à plusieurs propriétés physiques incluant la taille, la forme, la couleur, la texture, le nombre de graines, la facilité d’épluchage,… et à des composés chimiques : sucres, acides, composés aromatiques volatils, vitamine C et caroténoïdes (Iglesias et al., 2007). Même si l'aspect extérieur des fruits n'est pas déterminant dans la qualité du fruit, une belle couleur orange est habituellement exigée sauf chez le pomelo et le citron. Les caroténoïdes, intervenant dans la coloration des fruits, et le rapport sucres/acidité, essentiel pour le goût représentent les plus importants indicateurs de la qualité des agrumes. La teneur de ces composés est variable d’une variété à une autre et selon le stade de développement du fruit (Iglesias et al., 2007). La qualité du fruit est déterminée pour une grande partie par leur croissance et la charge en fruits, mais également par les conditions environnementales, l’intensité lumineuse, la température, l’humidité du sol et les conditions biotiques et abiotiques (Davies et Albrigo, 1994; Iglesias et al., 2008;
Spiegel-Roy et Goldschmidt, 1996). Les caractéristiques les plus appréciées des agrumes destinés à la transformation sont liés à la qualité interne du fruit qui est une fonction de la saveur et du goût (Tadeo et al., 2008). La qualité des fruits est propre aux préférences des consommateurs qui varient considérablement selon les pays.
III.1. Le métabolisme des sucres et des acides organiques
Les sucres et les acides sont les principaux facteurs déterminants du goût des fruits.
Ainsi, le rapport sucres/acidité est généralement utilisé pour la détermination du stade optimal de récolte de la plupart des fruits d’agrumes (Loussert, 1989).
La variation des concentrations en sucres et en acides organiques dépend de l’équilibre entre la synthèse, la dégradation et le stockage des métabolites (Figure 6) (Ruffner, 1982; Tucker et al., 1993).
Le métabolisme des sucres débute par la formation du saccharose. Le saccharose est produit dans les cellules du mésophylle des feuilles et exporté vers le phloème pour être
Partie I : Introduction bibliographique
13 transporté dans les organes non photosynthétiques, tels que les sacs à jus présents dans les fruits d’agrumes (Taiz et Zeiger, 2006).
Dans le cytoplasme des cellules des sacs à jus, le saccharose est hydrolysé en glucose et fructose via l’action de l’invertase et/ou de la saccharose synthase (une réaction réversible qui permet également la synthèse dans le cytoplasme du saccharose à partir du fructose et du glucose). L’hexokinase phosphoryle le glucose et le fructose en glucose-6- phosphate et fructose-6-phosphate. Le fructose-6-phosphate sert de substrat aux phosphofructokinases (ATP et PPi dépendantes) pour former le fructose-1,6-bisphosphate.
Ce dernier est converti en dihydroxyacétone phosphate et en glyceraldehyde-3-phosphate, le précurseur du phosphoénolpyruvate et du pyruvate. Au niveau du cytoplasme, le saccharose peut également être re-synthétisé à partir du glucose et du fructose via la saccharose phosphate synthase, la saccharose phosphatase ou la saccharose synthase (Kubo et al., 2001; Richardson et al., 1997). Les acides organiques sont synthétisés directement dans les mitochondries des cellules des sacs à jus (Tucker et al., 1993; Varma et Ramakrishnan, 1956), dans le cycle de Krebs (acide citrique, malique et succinique) ou directement dans le cytoplasme (acide ascorbique) (Bogin et Wallace, 1966; Sinclair, 1984;
Tucker et al., 1993).
Le pyruvate et le phosphoénolpyruvate servent de précurseurs à la synthèse des acides organiques. L’acétyl-CoA est produit à partir du pyruvate via la pyruvate déshydrogénase. La condensation de l’acétyl-CoA avec l’oxaloacétate permet la formation du citrate. Cette réaction de condensation est catalysée par la citrate synthase. En fonction des besoins énergétique de la cellule, le citrate est soit converti dans la mitochondrie en isocitrate, soit exporté vers le cytoplasme puis, éventuellement vers la vacuole pour y être stocké (Chen et Gadal, 1990).
III.2. Le métabolisme des caroténoïdes
Les caroténoïdes forment l’une des plus importantes classe de pigments des plantes et jouent un rôle crucial dans la définition des paramètres de la qualité des fruits et des légumes (Van den Berg et al., 2000).
14 III.2.1. Structure des caroténoïdes
La structure basique des caroténoïdes est un squelette terpénique symétrique formé par la conjugaison de deux unités composées de 20 atomes de carbone (Van den Berg et al., 2000).
Tous les caroténoïdes dérivent d’une molécule acyclique, C40H56. Ils contiennent un système de double liaisons qui influence leurs propriétés physiques, biochimiques et chimiques (Van den Berg et al., 2000). Les caroténoïdes sont sous-divisés en deux groupes du fait de leur composition (Figure 7). Les carotènes, tels que le β-carotène, l’α-carotène ou encore le lycopène, sont composés d’atomes de carbone et d’hydrogène. Les xanthophylles, telles que la β-cryptoxanthine, la violaxanthine ou la lutéine contiennent au moins un groupement hydroxyle (Van den Berg et al., 2000). Les doubles liaisons peuvent exister sous Figure 7: Les caroténoïdes
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Figure 8: Structure fine des caroténoïdes d’après Britton (1995).
%III/II : rapport de la hauteur des pics III et II.
16 deux configurations, cis ou trans (E/Z). Dans leur état naturel, les caroténoïdes se trouvent sous la forme trans (Van den Berg et al., 2000). Les caroténoïdes avec un système étendu de doubles liaisons en configuration trans sont des molécules linéaires, contrairement aux caroténoïdes en configuration cis qui ne sont pas linéaires, ce qui affecte leur positionnement dans les structures cellulaires (Van den Berg et al., 2000). Les caroténoïdes sont des composés lipophiles. Les carotènes sont solubles dans l’hexane, l’éther de pétrole et le toluène. Les xanthophylles sont solubles dans l’éthanol et le méthanol (Britton, 1995).
Les xanthophylles sont souvent estérifiés ce qui les rend plus hydrophobes.
III.2.2. Caractéristiques des caroténoïdes
Du fait de leurs longues chaines de doubles liaisons polyinsaturés, le spectre d’absorption des caroténoïdes se situe dans le visible et l’UV (Britton, 1995). Ils ont une couleur perceptible (jaune, orange et rouge) lorsqu’ils possèdent au moins sept doubles liaisons conjuguées et qu’ils absorbent dans le visible (Rodriguez-Amaya, 1999). Les caroténoïdes absorbent l’énergie à trois longueurs d’onde différentes et le maximum d’absorption dépend du nombre de doubles liaisons conjuguées. Il se situe entre 290 nm pour le phytoène et 470 nm pour le lycopène. Le spectre des caroténoïdes est caractéristique pour chacun des caroténoïdes et peut être utilisé pour une identification spécifique. La longueur d’onde maximale d’absorption et la structure fine du spectre fournissent des informations structurales sur le chromophore de la molécule (Britton, 1995).
La structure fine du spectre est exprimée comme un rapport de la hauteur des pics III et II (%III/II). Le pic III représente la longueur d’onde maximale et le pic II représente l’absorbance maximale (Figure 8).
L’intensité de l’absorption est l’indicateur de la structure et de la concentration des caroténoïdes dans l’échantillon (Britton, 1995). Les isomères cis montrent une bande d’absorption additionnelle autour de 320-360 nm. L’intensité de cette bande dépend de la localisation de la liaison cis avec la molécule (Van den Berg et al., 2000).
Du fait de la présence de doubles liaisons, les caroténoïdes contiennent un système réactif riche en électrons qui est susceptible de réagir avec des composés électrophiles. En
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Figure 9: Représentation de la transition chloroplaste-chromoplaste d'après Egea et al. (2010).
Le schéma montre la rupture des granules d’amidon (1) et celle des thylakoïdes et des grana (2) ; la synthèse de nouvelles structures membranaires depuis la membrane interne de l’enveloppe (3) menant à la formation de sacs membraneux riches en caroténoïdes (4) ; l’augmentation du nombre et de la taille des plastoglobules (5) ; l’aspect des cristalloïdes contenant des caroténoïdes (6) ; et l’augmentation du nombre de saillies émanant de l’enveloppe des plastes appelées stromule (7).
18 présence d’oxygène, les caroténoïdes ont tendance à s’auto-oxyder. La réaction des caroténoïdes avec des agents oxydants ou des radicaux libres dépend de la longueur de la chaine carbonée polyinsaturée et de la nature du groupe terminal (groupement hydroxyle, cycle β, cycle ε,…) (Van den Berg et al., 2000).
III.2.3. Localisation et stockage des caroténoïdes
Les caroténoïdes s’accumulent dans les plastes, et plus particulièrement dans les plastoglobules. Les plastoglobules sont des structures lipidiques (Ytterberg et al., 2006) contenant des protéines spécifiques (Austin et al., 2006). Bien que tous les plastes contiennent des caroténoïdes, les caroténoïdes se retrouvent principalement dans les chloroplastes et les chromoplastes (Giuliano et al., 2003; Vishnevetsky et al., 1999).
Dans les chloroplastes, la plupart des plastoglobules (95%) sont couplés à la membrane des thylakoïdes. Le reste des plastoglobules (5%) est organisé en petits groupes de 2 ou 3 plastoglobules interconnectés. En condition de stress photooxydatif, le nombre de plastoglobules augmente et ils s’organisent en amas plus grands, contenant au moins 7 plastoglobules liés ensemble. Il y a formation d’agrégats linéaires et de structures ramifiées (Austin et al., 2006). Les plastoglobules des chloroplastes contiennent une faible quantité de chlorophylles et de caroténoïdes (Ytterberg et al., 2006). Leurs concentrations augmentent en conditions de stress (Deruere et al., 1994). Dans les tissus verts, en conditions normales, les caroténoïdes se retrouvent principalement dans les membranes photosynthétiques en association avec les antennes collectrices et les complexes réactionnels des photosystèmes I et II (Cunningham et Gantt, 1998). Les xanthophylles sont les caroténoïdes qui dominent dans les antennes collectrices (Croce et al., 2002; Kuhlbrandt, 1994; Lee et Thornber, 1995).
Durant le processus impliquant la conversion des chloroplastes en chromoplastes, les membranes des thylakoïdes se désintègrent, la chlorophylle et la plupart des composants de la machinerie photosynthétique disparaissent, et il y a une accumulation massive de plastoglobules et de caroténoïdes (Figure 9) (Egea et al., 2010).
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19 Dans les chromoplastes, en l’absence de chlorophylles, les caroténoïdes sont responsables des couleurs jaune, orange et rouge, des fleurs et des fruits (Vishnevetsky et al., 1999). Dans les chromoplastes, les caroténoïdes peuvent se situer dans les membranes, dans les plastoglobules ou d’autres structures lipoprotéiques du stroma (Cunningham et Gantt, 1998). Quand les caroténoïdes sont produits en excès, ils s’accumulent et sont stockés dans des structures lipoprotéiques spécifiques (Deruere et al., 1994; Vishnevetsky et al., 1999). Ces structures peuvent être de type fibrillaire, globulaire, réticulo-tubulaire, membranaire ou cristalloïde en fonction des caroténoïdes contenus dans les infrastructures (Deruere et al., 1994). Par exemple, les structures globulaires ou plastoglobules, présentes chez la mangue et le poivron, contiennent des teneurs importantes en cis-β-carotène contrairement aux structures cristalloïdes, présentes chez la tomate et la carotte, qui contiennent de grandes quantités en caroténoïdes sous forme trans (carotènes et lycopène).
Plusieurs types de chromoplastes peuvent coexister dans le même organe (Egea et al., 2010). Dans les chromoplastes fibrillaires, la protéine fibrilline est nécessaire pour l’assemblage et le stockage des caroténoïdes (Deruere et al., 1994). Chez les agrumes, lors de la transformation des chloroplastes en chromoplastes, un changement dans le profil des caroténoïdes est observé, avec une augmentation massive de xanthophylles et une accumulation de plastoglobules (Huyskens et al., 1985).
III.2.4. Rôles des caroténoïdes dans la plante
Dans les chloroplastes, les pigments caroténoïdes sont présents dans tous les organes photosynthétiques où leur couleur est généralement masquée par celle de la chlorophylle (Granado et al., 1992).
Les caroténoïdes des plantes, tels que l’α-carotène, le β-carotène, le lycopène, les xanthophylles, sont des pigments solubles de couleur jaune, orange et rouge (Van den Berg et al., 2000). Certains caroténoïdes, comme le lycopène et les β-carotènes, confèrent leur couleur aux fleurs et aux fruits dans lesquels ils s’accumulent (Bartley et Scolnik, 1995). Leur principale fonction au sein des chromoplastes est d’être attractif pour les animaux et ainsi aider à la pollinisation et à la dispersion des graines (Chen et al., 1998).
20 Les caroténoïdes sont également des composants essentiels de la membrane photosynthétique (Cunningham et Gantt, 1998). Ils jouent un rôle important dans l’assemblement des photosystèmes, dans la collecte de la lumière et dans la photoprotection des photosystèmes (Havaux, 1998).
Dans les antennes collectrices de lumière, ils absorbent la lumière bleue-verte et transfèrent l’énergie aux chlorophylles, étendant ainsi la gamme de longueurs d’onde absorbées et l’efficience photosynthétique (Frank et Cogdell, 1996). Leur maximum d’absorption dépend du nombre de doubles liaisons. Il est compris en 400 et 500 nm (Figure 10) (Van den Berg et al., 2000).
La lumière est nécessaire à la photosynthèse mais les plantes ont besoin de protection contre la lumière lorsque cette dernière est en excès. La photosynthèse génère inévitablement des intermédiaires hautement réactifs qui peuvent provoquer des dommages oxydatifs à l’appareil photosynthétique. Si les dommages photooxydatifs ne sont
Figure 10: Spectres d'absorption de la chlorophylle a, de la chlorophylle b, des carotènes et des xanthophylles pour les différentes longueurs d’onde.
Partie I : Introduction bibliographique
21 pas réparés, une diminution de l’efficacité et/ou du taux maximum de photosynthèse, appelé photo-inhibition est observée (Niyogi, 1999).
La première façon d’évacuer l’énergie est de la transférer pour la photosynthèse. Ce processus est appelé « Quenching photochimique ». Quand l’énergie emmagasinée dans les molécules de chlorophylles excitées est rapidement dissipée à travers le transfert de l’excitation, le statut excité est dit atténué (Demmig-Adams et Adams, 1996).
Si ce n’est pas le cas, les molécules de chlorophylles excitées peuvent réagir avec des molécules d’oxygène et former une forme excitée de l’oxygène appelée l’oxygène singulet
1O2 (Demmig-Adams et Adams, 1996).
Les caroténoïdes, comme le β-carotène, peuvent exercer une action photo-protective par atténuation des molécules de chlorophylles excitées. Les caroténoïdes excités n’ont pas assez d’énergie pour former de l’oxygène singulet. Ils reviennent à leur état de base en perdant progressivement leur excitation sous forme de chaleur.
Les caroténoïdes jouent également un rôle vital de photo-protection de la machinerie photosynthétique par élimination directe de l’oxygène singulet (Collins, 2001; Griffith et al., 1955).
Plus récemment, il a été démontré que les xanthophylles atténuent l’état excité de la chlorophylle singulet dans le photosystème II lorsque ce dernier est soumis à des radiations excessives (Muller et al., 2001; Robert et al., 2004). Ce processus appelé « Non Photochemical Quenching » (NPQ), permet aux plantes de s’acclimater à des niveaux variables de lumière tout en empêchant les dommages dus à la lumière (Demmig-Adams et
22 Adams, 1996; Horton et al., 1996; Kulheim et al., 2002). L’activation et la régulation du NPQ sont liées à un processus enzymatique rapide et réversible, connu sous le nom de cycle des xanthophylles. Le cycle des xanthophylles est localisé dans les chloroplastes, et plus précisément dans l’espace transmembranaire des thylakoïdes (Hieber et al., 2000). En présence de forte lumière, d’une diminution du pH dans le lumen des thylakoïdes, et en présence d’ascorbate, la violaxanthine dé-époxydase (VDE) est activée (Hieber et al., 2000).
La VDE convertit la violaxanthine en anthéraxanthine, et ensuite en zéaxanthine (Kulheim et al., 2002) (Figure 11A). Dans les feuilles de la pervenche (Vinca minor L.), cultivées à la lumière, par rapport à celle de feuilles de plantes cultivées à l’ombre, la concentration en violaxanthine diminue de 77% et les concentrations en anthéraxanthine et zéaxanthine augmentent respectivement de 56% et 22% (Figure 11B) (Demmig-Adams et Adams, 1996).
Figure 11 : Cycle des xanthophylles (A) et répartition des xanthophylles au cours du cycle (B) d’après Demmig-Adams et Adams (1996).
DHA : déshydroascrobate ; ZEP : zéaxanthine époxydase ; VDE : violaxanthine dé-époxydase ; A : anthéraxanthine ; V : violaxanthine ; Z : zéaxanthine.
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23 La zéaxanthine permet la dissipation de l’énergie accumulée en excès par les chlorophylles.
L’énergie accumulée par la zéaxanthine est ensuite dissipée sous forme de chaleur (Demmig- Adams et al., 1996).
Quand l’intensité lumineuse diminue, le procédé est inversé. La présence de NADPH, d’oxygène et l’alcalinisation du lumen activent la zéaxanthine époxydase. La zéaxanthine est convertie en violaxanthine via l’anthéraxanthine (Gilmore et al., 1994).
Chez les plantes, les xanthophylles sont également les précurseurs de l’acide abscissique, une phytohormone, qui module les processus de développement et la réponse aux stress abiotiques (Chernys et Zeevaart, 2000; Nambara et Marion-Poll, 2005).
III.2.1. La voie de biosynthèse des précurseurs
La voie de biosynthèse des caroténoïdes peut être divisée en trois phases. La phase I inclut la formation de l’isopentényle pyrophosphate (IPP) et du diméthyallyle pyrophosphate (DMAPP). Chez les plantes, deux voies distinctes sont utilisées pour la synthèse de ces intermédiaires en C5 : la voie cytosolique du mévalonate (MVA) et la voie plastidiale du méthylérythritol phosphate (MEP). Les deux voies métaboliques sont séparées par leur localisation et fournissent de l’IPP et du DMAPP pour la biosynthèse de leurs propres isoprénoïdes. Cependant des échanges d’une faible fraction de ces précurseurs entre les deux voies ont été observées (Laule et al., 2003). Seule la voie plastidiale du MEP permet la biosynthèse des caroténoïdes. La phase II commence avec l’isomérisation de l’IPP en DMAPP. Les deux composés, IPP et DMAPP, serviront de précurseurs pour les réactions de condensation afin de former le géranyle pyrophosphate (GPP, C10), le géranyle-géranyle pyrophosphate (GGPP, C20), puis le phytoène (C40). Dans la phase III, le phytoène subit une série de réactions afin de produire différents caroténoïdes.
24 III.2.1.1. La biosynthèse des précurseurs : le diméthyallyle et le
pyrophosphate et l’isopentényle pyrophosphate
La voie cytosolique du mévalonate (MVA) fournit les précurseurs pour la synthèse de certains séquisterpènes, des stérols et pour la chaine latérale de l’ubiquinone (Cheng et al., 2007; Enfissi et al., 2005; Laule et al., 2003) (Figure 12). La voie plastidiale du méthylérythritol phosphate (MEP) est utilisée pour la synthèse des précurseurs de la biosynthèse des isoprènes, des mono-terpènes, de certains séquisterpènes, des di-terpènes, des caroténoïdes, et de la chaine latérale des tocophérols, des phylloquinones et des chlorophylles (Cheng et al., 2007; Lange et Ghassemian, 2003) (Figure 12).
Figure 12: Biosynthèse des précurseurs d'après Cheng et al. (2007), Enfissi et al. (2005), et Rodriguez-Concepcion et Boronat (2002).
DMAPP : diméthyallyle pyrophosphate ; DX5P : 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate ; FPP : farnésyle pyrophosphate ; IPP : isopentényle pyrophosphate ; GPP : géranyle pyrophosphate ; GGPP : géranyle- géranyle pyrophosphate ; HMG-CoA : 3-hydroxy-3-méthylglutaryl-CoA ; 3-PGA : glycéraldéhyde-3- phosphate. La flèche orange représente une possibilité d’échanges entre les précurseurs des deux voies.
