Dosage du péroxyde d’hydrogène - Les analyses biochimiques

PARTIE II : MATERIELS ET METHODES

V. Les analyses biochimiques

V.3. Dosage du péroxyde d’hydrogène

Les niveaux en peroxyde d’hydrogène ont été déterminés par la méthode décrite par Murshed (2009) et Velikova et al. (2000). 250 mg de pulpe finement broyée à l’aide d’azote liquide ont été homogénéisés dans un bain de glace dans 5 mL d’acide trichloroacétique (TCA, Fisher (Waltham, USA)) à 0,1%. L’homogénat a été centrifugé à 12000 g pendant 5 min à 4°C.

A 500 µL de surnageant ont été ajoutés 500 µL de tampon potassium (VWR) à 10 mM à pH 7 et 1 mL d’iodure de potassium à 1M (VWR). Le mélange a été agité brièvement puis incubé à température ambiante à l’abri de la lumière pendant 30 minutes avant la lecture de l’absorbance à 390 nm au spectrophotomètre (Specord 205, Analytic Jena (Wembley, Angleterre)).

Une solution de peroxyde d’hydrogène commerciale (VWR) a été utilisée pour générer une courbe de calibrage afin de quantifier la concentration en peroxyde d’hydrogène dans la pulpe des agrumes. Les concentrations ont été exprimées en mM.g^-1 de matière fraîche.

Partie II : Matériels et méthodes

83 V.4. Dosage de l’ascorbate

Les concentrations en ascorbate total (AA et DHA) et en ascorbate réduit (AA) ont été mesurées en accord avec la méthode décrite par Gillepsie et Ainsworth (2007). 150 mg de pulpe finement broyée dans l’azote liquide ont été homogénéisées dans 3 mL d’une solution froide d’acide trichloroacétique (TCA, Fischer) à 6%. L’homogénat a été centrifugé à 13000 g pendant 5 min à 4°C. Le surnageant a été utilisé pour le dosage de l’ascorbate et de l’ascorbate total.

Pour mesurer l’ascorbate total, 500 µL d’extrait ont été ajoutés à 100 µL de tampon phosphate 75 mM (pH 7) (VWR), 200 µL de TCA 6% et 100 µL de DL-dithiothréitol (DTT, Sigma-Aldrich). Après une incubation de 10 min à température ambiante, 100 µL de N-éthylmaléimide (NEM, Sigma-Aldrich) à 0,5% (v:v) ont été ajoutés. Le mélange a été incubé pendant 30 s à température ambiante afin de supprimer l’excès de DTT. Ensuite 1,5 mL d’un mélange réactionnel contenant 500 µL de TCA 10%, 400 µL d’acide orthophosphorique (H3PO4, VWR) à 43% (v:v), 400 µL de 2,2-bipyridyl (Sigma-Aldrich) à 4% (w:v) dissous dans de l’éthanol 70%, et 200 µL de chlorure de fer (Sigma-Aldrich) à 3% (w:v) ont été ajoutés. Après 1 heure d’incubation à 37°C, l’absorbance a été mesurée à 525 nm au spectrophotomètre (Specord 205, Analytic Jena (Wembley, Angleterre)).

Pour la détermination de la concentration en ascorbate réduit, la même réaction a été utilisée mais 200 µL de tampon phosphate ont été utilisés à la place du DTT et du NEM.

Une solution de L-acide ascorbique commerciale (VWR) a été utilisée pour générer une courbe de calibrage afin de quantifier la concentration en ascorbate total et en ascorbate réduit dans la pulpe des agrumes. Les concentrations ont été exprimées en mM.g^-1 de matière fraîche.

La quantité de déshydroascorbate (DHA) a été estimée par la différence entre la concentration en ascorbate totale et celle en ascorbate réduit (AA).

84 VI. Les analyses statistiques

D’une manière générale, nous avons considéré que les traitements ont été distribués de manière aléatoire dans une population homogène de rameaux fructifères.

VI.1. Analyse de variance

Tous les résultats ont été exprimés en moyenne ± des erreurs standards (SE). Une analyse de variance, suivie par des comparaisons multiples des moyennes, a été effectuée à l’aide du logiciel statistique R (http.R-project.org). Les moyennes ont été comparées en utilisant le test de Kruskal-Wallis (α=0,05).

VI.2. Représentation Heatmap

La représentation Heatmap a été obtenue en utilisant le logiciel R. La matrice de données est constituée par les concentrations en métabolites (sucres, acides organiques et caroténoïdes) représentée dans les colonnes et les différents traitements représentés dans les lignes. Les concentrations en métabolites dont les valeurs ont été centrées réduites ont servi de base pour la construction des classifications hiérarchiques en utilisant les distances euclidiennes. A ces concentrations ont été associées des couleurs dont l’intensité varie en fonction de la valeur. Les valeurs augmentent de la couleur verte vers les couleurs orange-rouge.

Partie III : Résultats et

discussion

Figure 29: Diamètre (A) et poids frais de fruits de clémentine (B), au cours de la maturation, en fonction de la charge en fruits : élevée ( ), moyenne ( ) et faible ( ). Les points correspondent aux moyennes et les barres aux erreurs standard. Des lettres différentes (a, b, c) indiquent des différences significatives entre les traitements et entre les dates considérées (α=5%).

Partie III : Résultats et discussion

87 I. L’effet de l’alimentation en sucres sur la biosynthèse des caroténoïdes

I.1. En fonction des stades de maturité des fruits

Différentes études ont montré qu’il est possible d’augmenter substantiellement la concentration en caroténoïdes chez la carotte (+120%), l’épinard (30%) et la tomate (50%) (Abushita et al., 2000; Kidmose et al., 2000), à travers les approches purement agronomiques. Le levier environnemental peut être utilisé pour augmenter considérablement la concentration en caroténoïdes d’une large gamme de fruits et de légumes (Poiroux-Gonord et al., 2010).

L’objectif de cette étude est de déterminer l’effet de l’alimentation en sucres sur les critères de qualité des agrumes, cultivés en plein champ, et en particulier sur la concentration en caroténoïdes. Pour cela, nous avons imposé des défoliations contrôlées, juste après la chute physiologique des fruits. Les critères de qualité, et notamment la concentration en caroténoïdes, ont été étudiés à différents stades de développement du fruit.

I.1.1. L’effet de la charge en fruits sur les critères de qualité organoleptiques et nutritionnels

I.1.1.1. L’effet de la charge en fruits sur le calibre du fruit et sur les indicateurs de maturité

Les résultats présentés correspondent aux derniers stades de développement du fruit.

Aucune augmentation significative du diamètre ou du poids frais du fruit n’a été observée de la date I à la date III dans aucun des trois traitements considérés (Figures 29A et 29B). Il n’y a aucune différence sur le diamètre des fruits soumis à une charge en fruits moyenne, mais les fruits soumis à une charge en fruits élevée sont environ 23% plus petits que les témoins, et cela aux trois dates de prélèvements. Le poids frais des fruits le plus faible a été observé avec le traitement correspondant à une charge en fruits élevée et cela qu’on le compare avec le témoin (-50%) ou avec le traitement correspondant à une charge

Concentration en acides totaux (mg.g-1 MS)

Concentration en sucres (mg.g-1 MS)

Figure 30 : Concentrations en sucres totaux (A), en acide totaux (B) et du rapport matière sèche sur matière fraîche (MS/MF) des fruits de clémentine (C), au cours de la maturation, en fonction de la charge en fruits : élevée ( ), moyenne ( ) et faible ( ). Les points correspondent aux moyennes et les barres aux erreurs standard. Des lettres différentes (a, b, c) indiquent des différences significatives entre les traitements et entre les dates considérées (α=5%).

Partie III : Résultats et discussion

89 en fruits moyenne (-50%). Bien que non significatif, le poids frais des fruits soumis à une charge en fruits moyenne est inférieur de 22% par rapport au témoin. Si l’on considère l’indice de maturité (IM) (Tableau 9), les fruits témoins ont atteint leur maturité à la date II, alors que pour les fruits des deux autres traitements il a fallu un mois et demi en plus pour atteindre la maturité (IM≈13,6).

Tableau 9: Indice de maturité des fruits de clémentine en fonction des charges en fruits et des dates considérées. Les données sont des moyennes ± des erreurs standard. Des lettres différentes (a, b, c) indiquent des différences significatives entre les traitements et les dates (α=5%).

Charge en fruits caractérisée par une augmentation de la concentration en sucres totaux et une diminution concomitante de la concentration en acides organiques totaux (Figures 30A et 30B). Il n’y a eu cependant aucun changement supplémentaire de la concentration en sucres et en acides organiques de la date II à la date III, alors que l’indice de maturité a diminué légèrement pour atteindre la valeur de 13.

Pour les traitements ayant des charges en fruits moyenne et élevée, la concentration totale en sucres (Figure 30A) et l’indice de maturité ont continué d’augmenter de la date II à la date III. A la date III, les trois traitements ont un indice de maturité similaire (Tableau 9) (≈

13,6). De ce fait, nous avons décidé de comparer nos différents traitements à cette date.

Le rapport MS/MF ne semble pas être affecté ni par les traitements ni par les dates (Figure 30C). Nous avons conclu de cette observation que toutes les comparaisons de concentrations réalisées sur la base de la matière sèche sont également valables pour une expression en fonction de la matière fraîche.

Figure 31: Concentrations en caroténoïdes totaux des fruits de clémentine, au cours de la maturation, en fonction de la charge en fruits : élevée ( ), moyenne ( ) et faible (témoin) ( ). Les points correspondent aux moyennes et les barres aux erreurs standard. Des lettres différentes (a, b, c, d) indiquent des différences significatives entre les traitements et entre les dates considérées (α=5%).

Figure 32: Quantité de caroténoïdes totaux par fruit, à la date III, pour les traitements avec une charge en fruits élevée ( ), moyenne ( ) et faible (témoin) ( ).

Les données représentées sont des moyennes et les barres correspondent aux erreurs standard. Des lettres différentes (a, b) indiquent des différences significatives entre les traitements (α=5%).

Partie III : Résultats et discussion

91 Ces observations sont cohérentes avec les observations réalisées sur la vigne, la pêche, la tomate et la mangue (Gautier et al., 2008; Genard et al., 1998; Lechaudel et al., 2002, 2005; Lescourret et al., 1998). Globalement les acides organiques ont suivi une tendance inverse, leurs concentrations sont les plus basses dans les fruit témoin, ce qui correspond à ce que nous savons de la dynamique des sucres et des acides organiques dans les fruits d’agrumes (Tadeo et al., 2008). Nos résultats ont confirmé que la charge en fruits élevée a un effet négatif sur les critères de qualité organoleptique du fruit.

I.1.1.2. L’effet de la charge en fruits sur les caroténoïdes

La concentration en caroténoïdes totaux a augmenté globalement de la date I à la date III dans les trois traitements, à l’exception du témoin qui a atteint un plateau à la date III, ce qui est cohérent avec l’hypothèse formulée précédemment, c’est-à-dire qu’à la date II les fruits témoins ont déjà atteint leur maturité (Figure 31). La concentration en caroténoïdes totaux est plus élevée (106 % et 82% respectivement) chez les fruits soumis aux traitements correspondant à des charges en fruits moyenne et élevée par rapport au témoin. Au contraire, il n’y a pas de différence significative entre ces deux traitements à la date III.

Ces résultats suggèrent que la limitation de l’alimentation en sucres du fruit pourrait fortement améliorer ses qualités nutritionnelles, si ils sont exprimés en matière sèche.

Cependant, ces conclusions sont différentes si ces données sont exprimées en quantité de caroténoïdes par fruit.

La quantité de caroténoïdes par fruit la plus élevée a été obtenue avec le traitement correspondant à une charge en fruits moyenne par rapport au témoin (+26,7%) ou par rapport au traitement correspondant à une charge élevée en fruits (+43,8%) (Figure 32). Ce sont les fruits provenant du traitement correspondant à la charge en fruits moyenne qui contiennent la plus grande quantité de caroténoïdes et semblent donc posséder les meilleurs critères de qualité nutritionnels.

92 Nos résultats sur l’effet de la charge en fruits sur les critères de qualité organoleptique et nutritionnel ne soutiennent pas l’hypothèse selon laquelle les carbohydrates déterminent la synthèse des caroténoïdes dans les fruits.

La concentration en caroténoïdes totaux ne semble pas être corrélée avec la concentration totale en sucres (R²=0,04) ni d’ailleurs avec la concentration en sucres et en acides organiques (R²=0,02). Clairement, nos observations ne vont pas dans le sens de l’idée selon laquelle les carbohydrates influenceraient sur la synthèse des caroténoïdes en influençant la disponibilité des précurseurs.

L’hypothèse selon laquelle la disponibilité en carbohydrates déterminerait la synthèse des caroténoïdes en influençant la disponibilité des précurseurs a été exprimée à plusieurs reprises dans la littérature (revue de Cunningham (2002)) même si nous ne connaissons que peu de choses sur la manière dont les flux métaboliques sont orchestrés entre les métabolismes primaire et secondaire (Bouvier et al., 2005b).

Deux idées majeures sont à l’origine de cette hypothèse. La première est basée sur le fait que les caroténoïdes dérivent des métabolites primaires, et plus précisément du 3-phosphoglycérate et du pyruvate dans la voie du méthylérythritol phosphate (Rohmer et al., 1996) et qu’ils sont couteux à synthétiser. La seconde idée vient des écologues qui ont essayé de prédire comment les plantes allouaient leurs ressources entre les processus liés à la différenciation (incluant le métabolisme secondaire) et les processus liés à la croissance (Herms et Mattson, 1992; Lorio, 1986). Certains résultats indiquent que la disponibilité des ressources carbonées ne détermine pas nécessairement la biogénèse des métabolites secondaires dans les fruits. En effet, les caroténoïdes représentent seulement une très faible proportion des carbohydrates. Nos résultats montrent, par exemple, que les sucres sont environ 1000 fois plus concentrés que les caroténoïdes dans la pulpe des fruits de clémentines. De plus, les théories d’interaction ou de compétition entre les métabolismes primaire et secondaire s’appliquent à des plantes entières qui doivent arbitrer continuellement entre les fonctions de croissance et défense, mais elles ne sont probablement pas pertinentes pour des organes de réserve comme les fruits. L’observation faite par Bénard et al. (2009) selon laquelle les composés phénoliques s’accumulent dans les feuilles de tomate comme prévu par les théories écologistes mais pas dans les fruits est

Partie III : Résultats et discussion

93 cohérente avec l’idée selon laquelle les feuilles et les fruits ne se comportent pas de la même façon.

La vision qui émerge chez les physiologistes est plutôt celle d’un rôle modulateur des carbohydrates sur la biogénèse des métabolites secondaires (Cazzonelli et Pogson, 2010;

Fraser et al., 2007; Telef et al., 2006). L’accumulation des sucres solubles dans les feuilles de tomate réprime des gènes codant les enzymes de la voie du méthylérythritol phosphate (Mortain-Bertrand et al., 2008). En effet, il est logique que les sucres solubles répriment la synthèse des caroténoïdes dans les feuilles en considérant que les synthèses des caroténoïdes et de la chlorophylle sont coordonnées et que l’accumulation des sucres solubles régule négativement l’expression des gènes photosynthétiques et mène à une perte de chlorophylle (Koch, 1996; Mortain-Bertrand et al., 2008). Ce raisonnement, cependant ne s’applique pas aux fruits qui perdent leur machinerie photosynthétique au moment où les chloroplastes sont transformés en chromoplastes. Il existe pourtant des observations d’effets positifs de l’approvisionnement en saccharose sur la synthèse des caroténoïdes dans les fruits (Iglesias et al., 2001; Telef et al., 2006).

On peut se demander pourquoi nos résultats sur l’effet du statut carboné sur la concentration en caroténoïdes et plus particulièrement l’absence de corrélation entre la concentration en sucres et la concentration en caroténoïdes ne sont pas en accord avec ces observations. Une explication possible est que notre expérimentation a été menée sur des fruits ayant atteint le même stade de maturité alors que dans les données rapportées dans la littérature ont été obtenu durant le processus de maturation (Iglesias et al., 2001). Ces observations ont montré que l’alimentation en saccharose accélère le changement de couleur à travers une voie dépendante de l’éthylène, ce qui suggère que l’effet positif du saccharose sur la synthèse des caroténoïdes est un effet indirect, qui est lié à la stimulation du processus de maturation.

94 faible (témoin) ( ). Les données représentées sont des moyennes et les barres correspondent aux erreurs standard.

Des lettres différentes (a, b) indiquent des différences significatives entre les traitements (α=5%).

Partie III : Résultats et discussion

95 I.1.2. L’effet de la charge en fruits, à la date III, sur les concentrations et

la composition en sucres, en acides organiques et en caroténoïdes

Le traitement correspondant à une charge en fruits élevée est caractérisé par une concentration plus faible en sucres et une concentration plus forte en acides organiques et en caroténoïdes par rapport au témoin (Figure 33). Les valeurs pour le traitement correspondant à une charge en fruits moyenne apparaissent intermédiaires par rapport aux deux autres traitements (Figure 33).

La concentration en sucres totaux dans les fruits soumis à un traitement correspondant à une charge en fruits élevée est 12,6% plus basse que dans le témoin. Cette différence apparaît comme la conséquence d’une concentration plus faible à la fois du fructose et du saccharose (-22,3 et -26,9%, respectivement), alors que la concentration en glucose est plus élevée chez le témoin (+58,3%) (Figure 33A).

La concentration en acides organiques totaux est plus élevée dans les traitements correspondant à des charges en fruits moyenne et élevée par rapport au témoin (+33,7% et +55,4%, respectivement) (Figure 33B). Ces différences sont dues à une concentration plus forte en acide succinique (+62,2 et +86,5%, respectivement). Les traitements ayant des charges moyenne et élevée en fruits ont des concentrations plus importantes en acide ascorbique et des concentrations plus faibles en acide malique par rapport au témoin.

Les concentrations en caroténoïdes totaux sont supérieures dans les traitements correspondant à des charges en fruits moyenne et élevée par rapport au témoin (+69,5% et +93%, respectivement) (Figure 33C). Presque tous les caroténoïdes ont suivi ce modèle, le principal contributeur étant la β-cryptoxanthine, le caroténoïde le plus important dans les fruits de clémentine (85,7%). Les concentrations en phytoène, phytofluène, ζ-carotène, zéaxanthine, cis-β-cryptoxanthine, cis-anthéraxanthine et β-carotène sont de 5,4 à 211%

plus élevées dans les traitements correspondant aux charges en fruits moyenne et élevée par rapport au témoin.

96 La charge en fruits a également nettement influencé la composition en caroténoïdes, en sucres et en acides organiques des fruits (Tableau 10).

Tableau 10: Pourcentages des différentes formes de caroténoïdes, de sucres et d’acides organiques, en fonction de la charge en fruits, à la date III. Les données sont des moyennes ± des erreurs standard. Des lettres différentes (a, b, c) indiquent des différences significatives entre les

Ainsi, dans le traitement correspondant à une charge élevée en fruits, la proportion de fructose et de saccharose apparaît plus faible et celle du glucose est plus élevée, tandis que la proportion d’acide malique apparaît plus faible et celle d’acide succinique plus élevée par rapport au témoin. Toujours dans le traitement correspondant à une charge en fruits élevée, les caroténoïdes en amont de la voie de biosynthèse, le phytoène, le phytofluène et le ζ-carotène se sont accumulés aux dépens du β-ζ-carotène. Dans le traitement correspondant à une charge en fruits moyenne, les pourcentages des différentes formes de caroténoïdes,

Partie III : Résultats et discussion

97 sucres et acides organiques apparaissent globalement entre les deux traitements extrêmes (charge en fruits élevée et faible).

Alors que les caroténoïdes totaux apparaissent plus concentrés en conséquence d’un faible rapport feuilles/fruit, les proportions des différents formes de caroténoïdes d’amont (phytoène, phytofluène et ζ-carotène) et d’aval (β-carotène) de la voie de biosynthèse augmentent et diminuent, respectivement. Cette observation confirme que l’effet des carbohydrates sur le métabolisme des caroténoïdes ne peut pas être réduit à leur seul rôle de substrat.

Dans un travail précédent, Dhuique-Mayer et al. (2009), ont déjà observé que les conditions environnementales peuvent influencer le profil des caroténoïdes des agrumes.

Les clémentines et les mandarines de la zone méditerranéenne possèdent des proportions de phytoène, de phytofluène et de β-carotène plus élevées que celles des fruits des zones tropicales et subtropicales. Chez la tomate, Gautier et al. (2008) ont observé qu’une augmentation de la température de 21 à 26°C modifie la composition en caroténoïdes en réduisant les carotènes à l’exception du lycopène. Ces observations pourraient être interprétées en fonction du rôle joué par les facteurs environnementaux dans le contrôle des flux de la voie de biosynthèse des caroténoïdes et de la production d’acide abscissique.

Plusieurs mécanismes ont été suggérés par différents auteurs. La biosynthèse du phytoène est une étape déterminante dans la biosynthèse des caroténoïdes, et est fortement influencée par les facteurs environnementaux. Les stress influençent positivement l’abondance des ARNm de la PSY chez le riz ou le maïs et qu’elle est positivement corrélée à une augmentation du flux des caroténoïdes et de l’acide abscissique (Li et al., 2008a; Li et al., 2008b; Welsch et al., 2008). Donc l’augmentation relative des caroténoïdes de fin de chaine, pourrait être expliquée par une augmentation concomitante de l’expression de la 9-cis-époxycaroténoïde dioxygénase (NCED) et une régulation à la baisse de la cis-violaxanthine qui est associée à la production d’ABA. Bien sûr, d’autres mécanismes de régulation pourraient être impliqués, par exemple un transfert du rôle de contrôle de la PSY à une autre étape de la voie de biosynthèse des caroténoïdes (Fraser et al., 2002).

98 I.1.3. Conclusion

Nos résultats ne confirment pas l’idée selon laquelle un statut carboné élevé serait favorable à la synthèse des caroténoïdes dans les fruits à travers son influence positive sur la disponibilité des précurseurs. L’effet de l’alimentation en sucres, le cas échéant, au même stade de maturité, pourrait même être négatif, suggérant que les sucres pourraient réprimer les gènes codant pour les enzymes de la voie des caroténoïdes ou de la voie du

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