L’effet de la charge en fruits sur les caroténoïdes

La concentration en caroténoïdes totaux a augmenté globalement de la date I à la date III dans les trois traitements, à l’exception du témoin qui a atteint un plateau à la date III, ce qui est cohérent avec l’hypothèse formulée précédemment, c’est-à-dire qu’à la date II les fruits témoins ont déjà atteint leur maturité (Figure 31). La concentration en caroténoïdes totaux est plus élevée (106 % et 82% respectivement) chez les fruits soumis aux traitements correspondant à des charges en fruits moyenne et élevée par rapport au témoin. Au contraire, il n’y a pas de différence significative entre ces deux traitements à la date III.

Ces résultats suggèrent que la limitation de l’alimentation en sucres du fruit pourrait fortement améliorer ses qualités nutritionnelles, si ils sont exprimés en matière sèche.

Cependant, ces conclusions sont différentes si ces données sont exprimées en quantité de caroténoïdes par fruit.

La quantité de caroténoïdes par fruit la plus élevée a été obtenue avec le traitement correspondant à une charge en fruits moyenne par rapport au témoin (+26,7%) ou par rapport au traitement correspondant à une charge élevée en fruits (+43,8%) (Figure 32). Ce sont les fruits provenant du traitement correspondant à la charge en fruits moyenne qui contiennent la plus grande quantité de caroténoïdes et semblent donc posséder les meilleurs critères de qualité nutritionnels.

92 Nos résultats sur l’effet de la charge en fruits sur les critères de qualité organoleptique et nutritionnel ne soutiennent pas l’hypothèse selon laquelle les carbohydrates déterminent la synthèse des caroténoïdes dans les fruits.

La concentration en caroténoïdes totaux ne semble pas être corrélée avec la concentration totale en sucres (R²=0,04) ni d’ailleurs avec la concentration en sucres et en acides organiques (R²=0,02). Clairement, nos observations ne vont pas dans le sens de l’idée selon laquelle les carbohydrates influenceraient sur la synthèse des caroténoïdes en influençant la disponibilité des précurseurs.

L’hypothèse selon laquelle la disponibilité en carbohydrates déterminerait la synthèse des caroténoïdes en influençant la disponibilité des précurseurs a été exprimée à plusieurs reprises dans la littérature (revue de Cunningham (2002)) même si nous ne connaissons que peu de choses sur la manière dont les flux métaboliques sont orchestrés entre les métabolismes primaire et secondaire (Bouvier et al., 2005b).

Deux idées majeures sont à l’origine de cette hypothèse. La première est basée sur le fait que les caroténoïdes dérivent des métabolites primaires, et plus précisément du 3-phosphoglycérate et du pyruvate dans la voie du méthylérythritol phosphate (Rohmer et al., 1996) et qu’ils sont couteux à synthétiser. La seconde idée vient des écologues qui ont essayé de prédire comment les plantes allouaient leurs ressources entre les processus liés à la différenciation (incluant le métabolisme secondaire) et les processus liés à la croissance (Herms et Mattson, 1992; Lorio, 1986). Certains résultats indiquent que la disponibilité des ressources carbonées ne détermine pas nécessairement la biogénèse des métabolites secondaires dans les fruits. En effet, les caroténoïdes représentent seulement une très faible proportion des carbohydrates. Nos résultats montrent, par exemple, que les sucres sont environ 1000 fois plus concentrés que les caroténoïdes dans la pulpe des fruits de clémentines. De plus, les théories d’interaction ou de compétition entre les métabolismes primaire et secondaire s’appliquent à des plantes entières qui doivent arbitrer continuellement entre les fonctions de croissance et défense, mais elles ne sont probablement pas pertinentes pour des organes de réserve comme les fruits. L’observation faite par Bénard et al. (2009) selon laquelle les composés phénoliques s’accumulent dans les feuilles de tomate comme prévu par les théories écologistes mais pas dans les fruits est

Partie III : Résultats et discussion

93 cohérente avec l’idée selon laquelle les feuilles et les fruits ne se comportent pas de la même façon.

La vision qui émerge chez les physiologistes est plutôt celle d’un rôle modulateur des carbohydrates sur la biogénèse des métabolites secondaires (Cazzonelli et Pogson, 2010;

Fraser et al., 2007; Telef et al., 2006). L’accumulation des sucres solubles dans les feuilles de tomate réprime des gènes codant les enzymes de la voie du méthylérythritol phosphate (Mortain-Bertrand et al., 2008). En effet, il est logique que les sucres solubles répriment la synthèse des caroténoïdes dans les feuilles en considérant que les synthèses des caroténoïdes et de la chlorophylle sont coordonnées et que l’accumulation des sucres solubles régule négativement l’expression des gènes photosynthétiques et mène à une perte de chlorophylle (Koch, 1996; Mortain-Bertrand et al., 2008). Ce raisonnement, cependant ne s’applique pas aux fruits qui perdent leur machinerie photosynthétique au moment où les chloroplastes sont transformés en chromoplastes. Il existe pourtant des observations d’effets positifs de l’approvisionnement en saccharose sur la synthèse des caroténoïdes dans les fruits (Iglesias et al., 2001; Telef et al., 2006).

On peut se demander pourquoi nos résultats sur l’effet du statut carboné sur la concentration en caroténoïdes et plus particulièrement l’absence de corrélation entre la concentration en sucres et la concentration en caroténoïdes ne sont pas en accord avec ces observations. Une explication possible est que notre expérimentation a été menée sur des fruits ayant atteint le même stade de maturité alors que dans les données rapportées dans la littérature ont été obtenu durant le processus de maturation (Iglesias et al., 2001). Ces observations ont montré que l’alimentation en saccharose accélère le changement de couleur à travers une voie dépendante de l’éthylène, ce qui suggère que l’effet positif du saccharose sur la synthèse des caroténoïdes est un effet indirect, qui est lié à la stimulation du processus de maturation.

94 faible (témoin) ( ). Les données représentées sont des moyennes et les barres correspondent aux erreurs standard.

Des lettres différentes (a, b) indiquent des différences significatives entre les traitements (α=5%).

Partie III : Résultats et discussion

95 I.1.2. L’effet de la charge en fruits, à la date III, sur les concentrations et

la composition en sucres, en acides organiques et en caroténoïdes

Le traitement correspondant à une charge en fruits élevée est caractérisé par une concentration plus faible en sucres et une concentration plus forte en acides organiques et en caroténoïdes par rapport au témoin (Figure 33). Les valeurs pour le traitement correspondant à une charge en fruits moyenne apparaissent intermédiaires par rapport aux deux autres traitements (Figure 33).

La concentration en sucres totaux dans les fruits soumis à un traitement correspondant à une charge en fruits élevée est 12,6% plus basse que dans le témoin. Cette différence apparaît comme la conséquence d’une concentration plus faible à la fois du fructose et du saccharose (-22,3 et -26,9%, respectivement), alors que la concentration en glucose est plus élevée chez le témoin (+58,3%) (Figure 33A).

La concentration en acides organiques totaux est plus élevée dans les traitements correspondant à des charges en fruits moyenne et élevée par rapport au témoin (+33,7% et +55,4%, respectivement) (Figure 33B). Ces différences sont dues à une concentration plus forte en acide succinique (+62,2 et +86,5%, respectivement). Les traitements ayant des charges moyenne et élevée en fruits ont des concentrations plus importantes en acide ascorbique et des concentrations plus faibles en acide malique par rapport au témoin.

Les concentrations en caroténoïdes totaux sont supérieures dans les traitements correspondant à des charges en fruits moyenne et élevée par rapport au témoin (+69,5% et +93%, respectivement) (Figure 33C). Presque tous les caroténoïdes ont suivi ce modèle, le principal contributeur étant la β-cryptoxanthine, le caroténoïde le plus important dans les fruits de clémentine (85,7%). Les concentrations en phytoène, phytofluène, ζ-carotène, zéaxanthine, cis-β-cryptoxanthine, cis-anthéraxanthine et β-carotène sont de 5,4 à 211%

plus élevées dans les traitements correspondant aux charges en fruits moyenne et élevée par rapport au témoin.

96 La charge en fruits a également nettement influencé la composition en caroténoïdes, en sucres et en acides organiques des fruits (Tableau 10).

Tableau 10: Pourcentages des différentes formes de caroténoïdes, de sucres et d’acides organiques, en fonction de la charge en fruits, à la date III. Les données sont des moyennes ± des erreurs standard. Des lettres différentes (a, b, c) indiquent des différences significatives entre les

Ainsi, dans le traitement correspondant à une charge élevée en fruits, la proportion de fructose et de saccharose apparaît plus faible et celle du glucose est plus élevée, tandis que la proportion d’acide malique apparaît plus faible et celle d’acide succinique plus élevée par rapport au témoin. Toujours dans le traitement correspondant à une charge en fruits élevée, les caroténoïdes en amont de la voie de biosynthèse, le phytoène, le phytofluène et le ζ-carotène se sont accumulés aux dépens du β-ζ-carotène. Dans le traitement correspondant à une charge en fruits moyenne, les pourcentages des différentes formes de caroténoïdes,

Partie III : Résultats et discussion

97 sucres et acides organiques apparaissent globalement entre les deux traitements extrêmes (charge en fruits élevée et faible).

Alors que les caroténoïdes totaux apparaissent plus concentrés en conséquence d’un faible rapport feuilles/fruit, les proportions des différents formes de caroténoïdes d’amont (phytoène, phytofluène et ζ-carotène) et d’aval (β-carotène) de la voie de biosynthèse augmentent et diminuent, respectivement. Cette observation confirme que l’effet des carbohydrates sur le métabolisme des caroténoïdes ne peut pas être réduit à leur seul rôle de substrat.

Dans un travail précédent, Dhuique-Mayer et al. (2009), ont déjà observé que les conditions environnementales peuvent influencer le profil des caroténoïdes des agrumes.

Les clémentines et les mandarines de la zone méditerranéenne possèdent des proportions de phytoène, de phytofluène et de β-carotène plus élevées que celles des fruits des zones tropicales et subtropicales. Chez la tomate, Gautier et al. (2008) ont observé qu’une augmentation de la température de 21 à 26°C modifie la composition en caroténoïdes en réduisant les carotènes à l’exception du lycopène. Ces observations pourraient être interprétées en fonction du rôle joué par les facteurs environnementaux dans le contrôle des flux de la voie de biosynthèse des caroténoïdes et de la production d’acide abscissique.

Plusieurs mécanismes ont été suggérés par différents auteurs. La biosynthèse du phytoène est une étape déterminante dans la biosynthèse des caroténoïdes, et est fortement influencée par les facteurs environnementaux. Les stress influençent positivement l’abondance des ARNm de la PSY chez le riz ou le maïs et qu’elle est positivement corrélée à une augmentation du flux des caroténoïdes et de l’acide abscissique (Li et al., 2008a; Li et al., 2008b; Welsch et al., 2008). Donc l’augmentation relative des caroténoïdes de fin de chaine, pourrait être expliquée par une augmentation concomitante de l’expression de la 9-cis-époxycaroténoïde dioxygénase (NCED) et une régulation à la baisse de la cis-violaxanthine qui est associée à la production d’ABA. Bien sûr, d’autres mécanismes de régulation pourraient être impliqués, par exemple un transfert du rôle de contrôle de la PSY à une autre étape de la voie de biosynthèse des caroténoïdes (Fraser et al., 2002).

98 I.1.3. Conclusion

Nos résultats ne confirment pas l’idée selon laquelle un statut carboné élevé serait favorable à la synthèse des caroténoïdes dans les fruits à travers son influence positive sur la disponibilité des précurseurs. L’effet de l’alimentation en sucres, le cas échéant, au même stade de maturité, pourrait même être négatif, suggérant que les sucres pourraient réprimer les gènes codant pour les enzymes de la voie des caroténoïdes ou de la voie du méthylérythritol phosphate, comme il a été précédemment observé dans les feuilles, mais pas encore chez les fruits. Nos observations plaident en faveur de nouvelles études, sur la manière dont les carbohydrates régulent la biosynthèse des caroténoïdes mais également leur dégradation et leur stockage dans les fruits.

I.2. En fonction de différents stades de développement des fruits

L’étude précédente a permis de mettre en évidence l’effet d’une charge en fruits élevée sur les critères de qualité de la clémentine. Certains de ces effets sont positifs puisque nous avons pu observer une augmentation de la concentration en caroténoïdes et du nombre de composés présents selon les traitements. Cependant, l’application de charges en fruits élevée ou moyenne (5 et 15 feuilles par fruit) induit également un retard de la maturité, une diminution significative du calibre du fruit et des concentrations en sucres solubles qui restent inférieures par rapport au témoin pour un stade de maturité équivalant.

Tout comme dans d’autres études visant à déterminer l’effet des sucres et/ou de l’alimentation carbonée sur la synthèse des caroténoïdes, les traitements ont été appliqués de manière précoce au cours du développement du fruit. Il n’existe à notre connaissance aucune étude de l’interaction entre le stade de développement du fruit et l’alimentation carbonée sur les critères de qualité, et en particulier la concentration en caroténoïdes.

L’objectif de cet essai est d’étudier la manière dont l’alimentation en sucres influence le programme qui conduit à l’accumulation de caroténoïdes au cours du développement des fruits de clémentine.

99

Tableau 11: Diamètre, poids du fruit frais et indice de maturité, en fonction de la charge en fruits (élevée, moyenne), du stade de développement auquel la charge a été appliquée (précoce, intermédiaire et tardif) et la méthode utilisée (défoliation ou ombrage) par rapport au témoin (charge en fruits faible). Les données sont des moyennes ± des erreurs standard. Des lettres différentes (a, b, c, d, e) indiquent des différences significatives entre les traitements (α=5%).

Précoce Intermédiaire Tardif Témoin

(Charge en fruits faible) Défoliation Ombrage Défoliation Ombrage Défoliation

Diamètre (mm)

Elevée 37,1±1,9 a 38,7±2,4 abc 44,0±1,9 abcd 45,5±1,4 cd 47,9±2,3 cd

47,0±1,15 d Moyenne 37,6±2,3 ab 48,6±1,6 d 44,8±1,2 bcd 45,1±1,9 cd 45,2±2,6 cd

Poids du fruit (g)

Elevée 18,9±1,2 a 20,3±3,4 a 30,1±3,4 bc 33,8±3,9 ab 40,5±5,9 bc

35,4±3,6 bc Moyenne 20,2±2,3 ab 40,4±3,5 c 34,2±3,3 bc 34,1±2,6 b 34,4±6,1 c

Indice de maturité

Elevée 6,3±0,08 ab 10,5±0,3 cde 9,6±0,3 bc 10,5±0,3 cde 11,5±0,9 c

11,0±0±3 de Moyenne 7,3±0,3 a 10,9±0,3 de 9,9±0,1 cd 10,6±0,6 cde 9,6±0,4 cd

100 Le travail dont les résultats sont présentés ici a pour objectif de déterminer le stade le plus propice pour l’application d’un traitement modulant la disponibilité en carbone et la qualité des fruits. De plus, nous souhaitions définir si la durée d’application de la modification de la charge en fruits est un élément déterminant. Pour cela, nous avons travaillé sur des rameaux fructifères de clémentine sur lesquels nous avons appliqué, à trois stades de développement du fruit, différents niveaux de charge en fruits obtenus par défoliation ou par ombrage des feuilles. La défoliation est un traitement permettant d’appliquer des niveaux de charge en fruits de manière permanente. L’ombrage est un traitement permettant d’appliquer des niveaux de charge en fruits de façon temporaire. De cette façon, l’apport en carbone dans les fruits est non limitant à l’exception de la période durant laquelle on souhaite modifier leur statut carboné.

I.2.1. Variations de calibre et d’indice de maturité du fruit

Les données présentées dans le tableau 11 montrent que seuls les traitements appliqués précocement, après la chute physiologique des fruits, ont induit une modification du calibre des fruits.

En effet, lorsque le traitement a été appliqué précocement, des diminutions significatives du diamètre ont été observées chez les fruits soumis à des charges en fruits élevée et moyenne obtenues par défoliation et chez les fruits soumis à une charge élevée par ombrage. En ce qui concerne les diminutions du poids frais, elles ont été observées chez les fruits soumis à une charge en fruits élevée obtenue par défoliation et chez les fruits soumis à des charges élevée et moyenne obtenues par ombrage. Pour ces traitements, la diminution du diamètre du poids frais est d’environ 19,6% et de 44%, respectivement par rapport au témoin, qui correspond à une charge en fruits faible. Les autres traitements n’ont induit aucune modification. Si l’on considère l’indice de maturité (IM), nous avons observé que les traitements correspondant à une forte charge en fruits, et à une charge moyenne appliquée précocement par défoliation, et le traitement correspondant à une forte charge en fruits appliquée au stade de développement intermédiaire par défoliation, ont induit un retard dans le processus de maturation du fruit. Les indices de maturité obtenus sont

101

Tableau 12: Concentrations en sucres totaux et en acides organiques totaux, en fonction de la charge en fruits (élevée, moyenne), du stade de développement auquel la charge a été appliquée (précoce, intermédiaire et tardif) et la méthode utilisée (défoliation ou ombrage) par rapport au témoin (charge en fruits faible). Les données sont des moyennes ± des erreurs standard. Des lettres différentes (a, b, c, d) indiquent des différences significatives entre les traitements (α=5%).

Précoce Intermédiaire Tardif Témoin

(Charge en fruits faible)

Défoliation Ombrage Défoliation Ombrage Défoliation

Sucres totaux (mg.g^-1 MS))

Elevée 345,2±2,9 a 412,7±8,9 bc 420,2±24,5 bc 414,6±7,2 bc 422,9±25,7 c

421,8±6,9 bc Moyenne 298,3±14,8 a 423,6±9,6 bc 398,6±3,5 b 402,4±18,1 bc 381,2±15,2 b

Acides organiques totaux (mg.g^-1 MS)

Elevée 265,3±2,6 c 232,2±16,9 d 226,7±16,5 cd 186,3±10,4 abc 201,9±15,9 abcd 181,2±4,8

élevée moyenne élevée moyenne élevée moyenne élevée moyenne élevée moyenne faible

Défoliation Ombrage Défoliation Ombrage Défoliation Témoin

Concentration en caroténoïdes totaux (µg.g-1 MS)

Précoce Intermédiaire Tardif

Figure 34: Concentration en caroténoïdes totaux, en fonction de la charge en fruits : élevée ( ), moyenne ( ), du stade de développement auquel la charge été appliquée (précoce, intermédiaire et tardif) et la méthode utilisée (défoliation ou ombrage) par rapport au témoin ( ). Les données représentées sont des moyennes et les barres correspondent aux erreurs standard. Des lettres différentes (a, b, c, d) indiquent des différences significatives entre les traitements, le stade de développement et la méthodologie (α=5%).

. Les données sont des moyennes et les barres correspondent aux erreurs standards. Des lettres

102 compris entre 7,29 et 9,63 pour les fruits des rameaux correspondant, alors que les fruits témoins ont un indice supérieur (IM=11,02).

Notre objectif est d’évaluer les possibilités pour augmenter la concentration en caroténoïdes dans la pulpe des fruits tout en conservant son calibre et son indice de maturité. Les résultats obtenus apparaissent donc intéressants au regard de notre objectif puisque plusieurs traitements correspondant à une charge élevée en fruits n’ont montré ni diminution du calibre du fruit, ni retard dans la maturité.

Il n’y a pas de variations observées dans le rapport matière sèche/matière fraîche (MS/MF). Ce dernier ne semble affecté ni par la charge en fruits, ni par la durée d’application du traitement (défoliation ou ombrage), ni par le stade de développement auquel la charge en fruits a été appliquée. De ce fait, toutes les comparaisons effectuées sur la base de la matière sèche sont également valables si on exprime les résultats par rapport à la matière fraîche.

I.2.1. Concentration en sucres, en acides organiques et en caroténoïdes

Les fruits soumis à des charges en fruits élevée et moyenne présentent une concentration en sucres totaux inférieure de 18,2% et de 29,3%, respectivement dans le cas où le traitement a été appliqué par défoliation précoce par rapport au témoin (Tableau 12).

Au contraire, la concentration en acides organiques est plus élevée de 46,3% et de 28,4%

pour les fruits soumis à une charge en fruits élevée appliquée respectivement par défoliation et par ombrage précoce (Tableau 12).

Certains traitements ont induit une augmentation de la concentration en caroténoïdes totaux alors que d’autres ont conduit à une diminution par rapport au témoin (Figure 34). La concentration en caroténoïdes augmente de 50,2% et de 17.8%, respectivement dans les traitements correspondant à une charge en fruits élevée lorsqu’elle a été appliquée par défoliation et ombrage précoce. Elle diminue de 29,4% lorsque le traitement par défoliation a été appliqué au stade de changement de couleur et ne varie pas quand le traitement a été appliqué tardivement (Figure 34).

103

Figure 35: Heatmap représentant les concentrations en métabolites primaires (sucres et acides organiques) et secondaires (caroténoïdes) dans la pulpe de clémentine en fonction des différents traitements appliqués. Chaque ligne représente un fruit moyen (n=5) soumis à un traitement rassemblant plusieurs conditions : la charge en fruits (élevée, moyenne et faible), le stade auquel le traitement a été appliqué (précoce, intermédiaire : au changement de couleur et tardif), et le type de traitement (défoliation (D.) ou ombrage (O.)) Chaque colonne représente un composé. Les concentrations en métabolites (données centrées réduites) ont servi de base pour la construction des classifications hiérarchiques en utilisant les distances Euclidiennes. A chaque teneur a été associée une couleur. Les valeurs augmentent du vert au rouge.

104 Pour analyser l’ensemble des données, nous avons réalisé une cartographie des profils en métabolites primaires et secondaires de la pulpe de la clémentine en fonction des traitements de charge en fruits (Figure 35). Les profils obtenus présentent un effet positif d’une forte charge en fruits sur la concentration en caroténoïdes lorsque ce traitement est appliqué de façon précoce dans le développement du fruit. Cependant, l’intensité de la réponse dépend à la fois du type de traitement (défoliation ou ombrage) qui permet de jouer sur la durée d’application du traitement et du stade de développement auquel la charge en fruits a été appliquée. Tous les résultats obtenus par des traitements d’ombrage, à

104 Pour analyser l’ensemble des données, nous avons réalisé une cartographie des profils en métabolites primaires et secondaires de la pulpe de la clémentine en fonction des traitements de charge en fruits (Figure 35). Les profils obtenus présentent un effet positif d’une forte charge en fruits sur la concentration en caroténoïdes lorsque ce traitement est appliqué de façon précoce dans le développement du fruit. Cependant, l’intensité de la réponse dépend à la fois du type de traitement (défoliation ou ombrage) qui permet de jouer sur la durée d’application du traitement et du stade de développement auquel la charge en fruits a été appliquée. Tous les résultats obtenus par des traitements d’ombrage, à