Ashveen PEERBAYE
EMERGENCE D’UN PROGRAMME DE RECHERCHES EN GENOMIQUE
FONCTIONNELLE ET INSTALLATION DU SGF SUR LE SITE D’EVRY
Pour comprendre la construction et l’activité de la plate-forme transcriptome du Service de Génomique Fonctionnelle (SGF) du CEA à Evry, il convient de remonter aux processus sociohistoriques qui, aux débuts des années 1990, aboutissent à l’implantation d’un programme dédié à la génomique fonctionnelle et à l’étude du transcriptome sur le site d’Evry. Ces processus sont directement liés aux activités de recherche menées par le laboratoire Généthon, et à la mise en œuvre du Projet Génome Humain en France.
Au moment de la mise en place du laboratoire Généthon à Evry en 1990, sous l’impulsion de Jean Weissenbach et Daniel Cohen (Rabeharisoa et Callon, 1999 ; Peerbaye, 2004), le biologiste Charles Auffray est intégré au laboratoire en tant que directeur scientifique, avec un programme visant à promouvoir la génomique fonctionnelle. Auffray propose en effet, dans le cadre du GIP Génome (qui se met en place en 1990) un projet baptisé « Genexpress », visant à exploiter la banque d’ADN installée à Evry afin d’étudier les mécanismes d’expression des gènes, en se basant sur la technologie des ADNc. Genexpress représente globalement le volet « génomique fonctionnelle » du Programme Génome Humain français.
Administrativement, Genexpress est localisé à Villejuif, dans une unité du CNRS (Unité de Génétique Moléculaire et Biologie du Développement, UPR CNRS 420) créée en 1991. Mais de 1990 à 1997, l’essentiel de ses activités se déroulera à Evry.
En 1993, Auffray crée avec trois collègues américains (du NIH, du Department of Energy et de l’Université de Columbia) un consortium international, baptisé IMAGE (Intégration Moléculaire de l’Analyse du Génome et de son Expression), destiné à produire une base de connaissances autour des données de séquences génomiques, et partager les ressources et les techniques liées à l’analyse fonctionnelle de ces séquences. La partie française d’IMAGE est hébergée par Genexpress.
Entre 1993 et 1997, les relations se dégradent progressivement entre Daniel Cohen et Charles Auffray. Ce dernier reproche à Cohen d’avoir perpétré une « OPA inamicale »43 sur son équipe et son savoir-faire au moment où Daniel Cohen fonde l’entreprise de biotechnologies Genset (Rabinow, 1999). Charles Auffray rapatrie alors les activités de génomique fonctionnelle à Villejuif, où il travaille essentiellement, avec une chercheuse de l’Inserm, Geneviève Piétu, à l’exploitation et à la coordination du consortium IMAGE. Cette époque de recompositions marque
42 Le cas présenté ici est issu d’un travail de terrain initié en 2002 dans le cadre d’une thèse de doctorat en sociologie portant
sur la construction de la génomique en France, et sur la place des dispositifs instrumentaux (dont les plates-formes) dans cette construction (Peerbaye, 2004). Des mises à jour des données ont été effectuées en 2003 et en 2005. Les personnes rencontrées pour ce cas sont :
- au SGF : Geneviève Piétu (INSERM, coordinatrice avec les équipes externes), et Xavier Gidrol (chef du service) ;
- à Genopole Evry : Hélène Pollard (chargée de mission « Recherche »), Pierre Tambourin (directeur général de Genopole Evry).
43 Entretien de N. Giverneaud et J.-F. Picard avec Charles Auffray, le 14 janvier 2001.
également la fin des activités de recherche fondamentale entreprises directement par Généthon44,
et l’aboutissement du projet Genopole Evry en 1998, organisme fédérateur par lequel s’effectue sur ce territoire le « passage de relais » des initiatives privées aux pouvoirs publics en matière de pilotage et de mise en œuvre de la recherche génomique fondamentale (Peerbaye, 2004).
Il est important de noter qu’avant 1999 – date à laquelle les recherches scientifiques autour du transcriptome et l’utilisation des puces à ADN s’accélèrent à l’échelle internationale45 – les compétences françaises en matière de génomique fonctionnelle et de maîtrise de la technologie des puces à ADN (indispensable aux recherches en transcriptomique) se concentrent essentiellement en 4 lieux :
− au sein de Genexpress (UPR CNRS 420), à Villejuif (équipe de Charles Auffray et
Geneviève Piétu) ;
− au laboratoire TAGC, à Marseille-Luminy (équipe de Bertrand Jordan et Catherine
Nguyen) ;
− aux laboratoires de l’ENS et de l’ESPCI, à Paris (équipes de Claude Jacq, Jean Rossier et
Marie-Claude Potier);
− et au sein du projet méthodologique « Biopuces » du laboratoire LETI au CEA, à
Grenoble.
A la fin des années 1990, des négociations ont lieu entre le ministère de la Recherche et la direction de Genopole Evry pour que des compétences et des activités en génomique fonctionnelle soient relocalisées à Evry, suite au départ de l’équipe de Charles Auffray à Villejuif. Ces négociations aboutissent en 1999 à la décision de la Direction des Sciences du Vivant (DSV) du CEA d’installer un Service de Génomique Fonctionnelle sur le site de Genopole Evry. Cette décision correspond également au fait que les bibliothèques nationales d’ADNc nécessaires à la fabrication des puces à ADN se trouvent centralisées à Evry, au Centre National de Séquençage (Genoscope), créé en 1997. L’installation du SGF en 1999 est financée par le CEA, à hauteur de 30 MF pour l’infrastructure de base, le personnel de base, l’achat des premiers robots de dépôt, des lecteurs et des ressources.
Le SGF implante ainsi sur le territoire d’Evry une plate-forme technologique dédiée à la fabrication de puces à ADN (microarrays) et à leur utilisation dans l’étude du transcriptome. Localisé dans le même bâtiment que le Centre National de Génotypage (créé en 1997) et la direction de Genopole, le SGF occupe une surface de 1 000 m² dont 400 environ sont réservés à la plate-forme proprement dite.
3. DU SERVICE A LA PLATE-FORME
Administrativement, le SGF est un « service » du Département de Radiobiologie et de Radiopathologie de la Direction des Sciences du Vivant du CEA. L’activité de mise au point et de production de puces à ADN qui s’y déploie va être utilisée dans un premier temps de manière interne, afin de permettre aux équipes du laboratoire de poursuivre leurs thèmes de recherches propres : l’étude de l’effet des radiations ionisantes sur les cellules de mammifère (peau et tissu
44 A partir de 1999, le laboratoire Généthon se consacrera exclusivement à la mise au point et à la production de vecteurs
pour la thérapie génique.
45 Cf. Annexe 2. Cette période correspond également aux appels d’offres pour la mise en place des génopoles sur le territoire
formes de couplage science-innovation ?
hématopoïétique), et l’analyse de la programmation des cellules souches (kératinocytes, cellules hématopoïétiques et musculaires) en fonction de leur environnement46. Le SGF va également être
chargé de produire des puces à ADN à destination des autres laboratoires du CEA.
Très rapidement cependant, le SGF va être identifié comme un lieu stratégique disposant des ressources nécessaires à la production de puces à ADN en Ile-de-France. Le laboratoire va bénéficier de subventions du ministère de la Recherche (5 MF) et du Conseil régional d’Ile-de- France (2 MF) pour compléter l’équipement de la plate-forme existante (achat de deux robots supplémentaires et d’un scanner). Ces financements ministériels et régionaux vont surtout servir à ouvrir l’accès à la plate-forme à des équipes hors CEA, dans le cadre de la politique de mutualisation des équipements en génomique qui se met en place à la fin des années 199047. La plate-forme du SGF est ainsi identifiée par le ministère de la Recherche comme l’une des plates- formes franciliennes de production de puces ADN. A ce titre, elle est intégrée au réseau national de transcriptomique, qui regroupe différentes plates-formes technologiques françaises du Réseau National des Génopoles. En 2001, la plate-forme du SGF est identifiée par le groupe RIO comme l’une des 9 plates-formes transcriptome jugées « opérationnelles ». En 2003, elle est labellisée par RIO plate-forme nationale, bénéficiant à ce titre du soutien du ministère de la Recherche (via le Fonds National de la Science).
Entre 1999 et 2001, la plate-forme du SGF connaît une phase d’installation. De juin 2001 à septembre 2001, la période est qualifiée par les acteurs de « rodage » de la plate-forme, qui commence à « bien tourner » à partir de septembre 2001.
C’est à Xavier Gidrol qu’est confiée la gestion de la plate-forme. Titulaire d’un doctorat en Biologie cellulaire et moléculaire (obtenu en 1984 à l’Université d’Aix-Marseille), Gidrol a fait son post-doctorat à Harvard et s’est spécialisé dans la régulation transcriptionnelle de l’expression génétique. Il est recruté à l’INRA, et rejoint le SGF en 2000, qu’il dirige à partir de 2001.
Geneviève Piétu quitte quant à elle Genexpress à Villejuif en 2000 pour s’installer au SGF à Evry, où elle poursuit ses recherches sur les cellules souches, et assure la fonction de « coordinatrice avec les équipes externes ».
En 2003, l’organigramme de la plate-forme du SGF s’établit donc comme suit :
46 Les laboratoires du SGF sont le Laboratoire d’Exploration Fonctionnelle des Génomes (LEFG) dirigé par Xavier Gidrol, le
Laboratoire de Génomique et Radiobiologie de l’Hématopoïèse (LGRH) dirigé par Diana Tronik-Le Roux, et le Laboratoire de génomique et radiobiologie de la kératinopoïèse (LGRK) dirigé par Michèle Martin. A cela il faut ajouter des projets mêlant chercheurs universitaires et membres du SGF : le projet « Analyse du phénotype de la cellule souche des kératinocytes par le transcriptome et le protéome », dirigé par Gilles Waksman, professeur à l’Université d’Evry ; le projet « Dynamique du transcriptome des kératinocytes de la peau humaine après un stress génotoxique » dirigé par Michèle Martin ; le projet « Etude du transcriptome de la cellule souche musculaire », dirigé par Geneviève Piétu.
47 Voir partie 1 sur l'analyse institutionnelle des plates-formes. Chef du service
(X. Gidrol, chercheur INRA)
Coordinatrice avec équipes externes
(G. Piétu, chercheur INSERM) (Franck Amiot, ingénieur CEA) Responsable Production 3 Bioinformaticiens (CEA)
2 stagiaires en DESS 2 techniciens production (CDD
de Genopole) 2 techniciennes en
La plate-forme transcriptome du SGF est de type « microarrays ». Tous les équipements sont localisés au SGF, sur le site de Genopole Evry. La liste des équipements est la suivante :
Robots de dépôt 2 robots spotteurs (Microgrid II de Biorobotics) Lecteurs de puces à
ADN 3 scanners (4000b Axon, Agilent, ScanArray5000 de Packard)
Analyse des images
Logiciels d’analyse d’images commerciaux (Genepix Pro 3.0 et GeneSpring 6.0)
1 logiciel d’analyse « maison » développé au CEA48
Autres
1 robot manipulateur de liquides (CyberlabC250 de Gilson) 1 appareil de RT-PCR quantitative ABI Prism (Perkin-Elmer) 1 BioAnalyser Agilent49
1 trieur de cellules de type Moflow
2 serveurs informatiques Sun Microsystem
Ces équipements n’ont pratiquement pas évolué depuis 2002, sauf pour les mises à jour des logiciels : il n’y a pas eu d’achat d’appareils nouveaux ou de remplacement des machines depuis l’achat des robots et du scanner.
La plate-forme produit des puces homme, souris, levure et Arabidopsis, qui sont fabriquées sur lames de verre, avec dépôt de sondes pré-synthétisées. Les puces proviennent de différentes sources (dont un transfert des banques ADN du Centre National de Séquençage), et ont connu au fil du temps des améliorations notables, qui sont liées à la fois aux progrès techniques accomplis dans le domaine (on peut déposer davantage de sondes sur une puce), à l’obtention de nouveaux clones, et à l’organisation au niveau du Consortium National de Recherche en Génomique (en particulier via le projet « oligos longs »50) et à la multiplication des collaborations internationales.
La comparaison entre les situations en 2002 et en 2005 illustrent bien ces évolutions : Situation en 2002 (puces disponibles)
Puce Homme
5 800 clones d’ADNc d’une banque normalisée de cerveau d’enfant 2 300 sondes amplifiées par PCR à l’aide d’amorces de gènes sélectionnés par mots clés
1 500 clones humains sous forme de plasmide caractérisés par le Centre National de Séquençage (CNS)
Puce Souris
2 000 clones d’ADNc provenant de Research Genetics
2 000 sondes amplifiées par PCR à l’aide d’amorces de gènes sélectionnés par mots clés
48 A usage exclusif des équipes CEA.
49 Appareil qui permet de voir la qualité des ARN et des ADN. 50 Pour une présentation du « projet oligos longs », cf. Annexe 1.
15 000 clones d’ADNc caractérisés par le CNS prévus pour 2002
Puce Levure Destinées à l’usage exclusif des équipes du CEA
Puce Arabidopsis
Situation en 2005 (puces disponibles)
Puce Homme Puce « pangénomique » développée sous l’égide du Réseau national des génopoles contenant 26 400 oligonucléotides (Projet oligos longs)
Puce Souris
15 000 clones d’ADNc provenant de Research Genetics
Lame « pangénomique » contenant 26 400 oligonucléotides (Projet oligos longs)
15 000 clones d’ADNc fournis par le National Institute of Aging (NIH), correspondant à 11 000 gènes
Puce Levure Destinées à l’usage exclusif des équipes du CEA
Puce Arabidopsis
L’organisation technique de l’activité de la plate-forme se compose de cinq étapes :
Le SGF fabrique et fournit les puces. Les sondes d’ADN sont préparées par PCR, puis les sondes sont déposées par les robots. Des contrôles qualité déterminent si les puces sont bonnes. Ces procédures se passent en interne, puisque les utilisateurs « extérieurs » n’ont pas le droit de manipuler au SGF (ceci est dû au fait que la plate-forme est hébergée par le CEA, qui dispose de réglementations très contraignantes en termes d’accès aux personnes hors CEA). Les utilisateurs reçoivent cependant les protocoles expérimentaux (système de marquage des cibles et traitement des données) et ceux qui le désirent peuvent venir assister à la fabrication des puces.
Les étapes complémentaires, qui concernent l’hybridation (préparation des cibles, marquage, hybridation, lavages) doivent être réalisées dans le laboratoire de l’équipe demandeuse51.
Le SGF peut procéder sur demande à l’acquisition et à l’analyse des images pour les équipes ne disposant pas de scanner.
L’étape suivante concerne le traitement et l’analyse des images : localisation des spots et positionnement sur une grille ; segmentation du signal, quantification de l'intensité de fluorescence et calcul du bruit de fond ; étapes de correction et de normalisation (pour effectuer des comparaisons d’une expérience à l’autre) ; calcul des ratios entre les intensités des fluorochromes et recherche des facteurs de modulation d'expression entre les échantillons étudiés. Le SGF réalise ces opérations pour les équipes ne disposant pas de logiciel d’analyse. L’équipe de bioinformatique a développé des logiciels « maison » de gestion de ressources, d’analyse d’images et d’analyse de données. La plate-forme du SGF dispose ainsi de deux chaînes d'analyse, la première développée au laboratoire (et dont l’usage tend à être réservée aux labos CEA et aux partenaires privilégiés) et la seconde à partir des logiciels commerciaux Genepix et GeneSpring. Des incertitudes demeurent sur le plan du perfectionnement des analyses statistiques. En ce qui concerne l’exploitation des résultats sur le plan biologique, l’équipe demandeuse peut valider les résultats obtenus sur la puce par d’autres méthodes. L’exploitation des résultats et l’élaboration des conclusions restent à sa charge.
51 La plate-forme étant installée au CEA, l’accès aux équipements permettant de procéder à ces manipulations est lui aussi
La plate-forme suit une démarche qualité depuis 2001, avec quatre tests qualité, pratiqués selon des procédures standard, réalisés sur chaque lame tout au long de la chaîne de production. Cette assurance qualité fait encore l’objet d’améliorations, surtout en ce qui concerne la définition des seuils de rejet.
Les différentes missions qui sont progressivement confiées à la plate-forme du SGF se traduisent par un « feuilletage » de son statut. La plate-forme transcriptome du SGF est en effet chargée de :
− produire et fournir des puces aux équipes académiques et aux partenaires industriels à
l’échelle nationale ;
− produire des puces pour l’ensemble des départements de la DSV ;
− développer de nouveaux concepts de puces
52;
− et de produire en interne des puces pour les programmes de recherche propres au SGF.
Il a été nécessaire aux acteurs de mettre en place des procédures de fonctionnement et d’accès permettant de réguler l’activité de l’entité, et de lui permettre de remplir ces différentes missions.
4. LA PERIODE 2001-2004 : UNE ORGANISATION TECHNIQUE DE L’ACTIVITE
ET UNE REGULATION DE L’ACCES TYPIQUES D’UNE PLATE-FORME
« RIO »
Entre 2001 et 2004, l’organisation technique de l’activité et la régulation de l’accès à la plate- forme transcriptome (ouverture aux utilisateurs extérieurs) qui se mettent en place au SGF sont typiques des « bonnes pratiques » que les organismes publics de recherche, le ministère et les génopoles essaient de mettre en place à travers la coordination RIO53.
L’accès aux équipements est différencié selon que l’utilisateur appartient ou non au CEA. Pour les équipes de recherche internes au SGF ainsi que celles issues des différents départements de la DSV, il y a accès direct. Pour les utilisateurs extérieurs (non CEA), il n’existe pas de différence a priori dans les modalités d’accès entre usagers académiques et usagers industriels, et les projets sont soumis à acceptation par un comité de pilotage, mis en place en mars 2001, et qui définit les modalités d’accès et de fonctionnement de la plate-forme pour les utilisateurs extérieurs, ainsi que la gestion scientifique de l’activité. La composition et le fonctionnement de ce comité de pilotage sont similaires à ce qui peut s’observer dans la plupart des plates-formes génomiques labellisées RIO qui se mettent progressivement en place à cette même époque :
Le comité est mixte, afin de représenter tous les organismes, et est composé de huit membres (2 membres du SGF, 2 membres de l’ENS, 1 CNRS, 1 INRA, 1 Inserm, ainsi qu’une chargée de mission Genopole Recherche54). Ce comité de pilotage procède à une sélection sur dossier des projets. Les postulants doivent envoyer un document de deux ou trois pages décrivant le projet de recherche nécessitant les puces à ADN (la coordinatrice fournit un modèle de projet-type). Le comité ne juge pas la qualité scientifique de ce projet, mais en évalue la méthodologie, sur la base de critères tels que : l’adéquation entre la demande et l’intérêt d’utiliser la technologie biopuces ;
52 Une partie des recherches sur les biopuces menées à Grenoble par le CEA s’est donc trouvée relocalisée à Evry du fait de
la création du SGF.
53 Rappelons que la plate-forme transcriptome du SGF est identifiée par RIO comme plate-forme opérationnelle dès 2001, et
voit cette identification confirmée en 2003. Le ministère de la Recherche la labellise quant à lui plate-forme à vocation nationale. Voir partie 1.
54 Christian Auclair (IGR, ENS) ; Francis Galibert (CNRS) ; Xavier Gidrol (SGF/CEA) ; Claude Jacq (ENS) ; Geneviève
la faisabilité du projet ; l’expérience préalable d’utilisation de techniques similaires ; l’environnement scientifique et matériel… Il y a également une évaluation informelle de la « motivation » des demandeurs.
Le nombre de rejets de demandes est faible, notamment parce que la plate-forme n’est pas saturée. Au départ il était prévu que la plate-forme soit ouverte uniquement aux équipes franciliennes, mais entre 2001 et 2003 plusieurs demandes parviennent au SGF en provenance de laboratoires de province (par exemple Lyon, mais aussi des demandes jugées « plus surprenantes », venant des génopoles de Strasbourg et de Montpellier, qui sont pourtant censées disposer de leur propre plate-forme transcriptome…) Les demandes acceptées proviennent donc de la France entière55.
Quelques projets jugés trop flous (« on ne voyait pas ce qu’ils voulaient faire ») ou manquant de motivation sont tout de même refusés.
L’activité de production des puces par le SGF a toujours été irrégulière, avec des « pics » de production, notamment au moment où le SGF a proposé de nouvelles lames à 30 000 clones (les équipes ayant travaillé avec les anciennes lames ont voulu refaire les expériences avec les nouvelles puces). Le SGF a produit 2 557 puces en 2001, et 3 900 puces en 2002. La capacité de production actuelle de la plate-forme est de 10 000 puces par an. Entre 2002 et 2004, l’activité de la plate-forme s’est plus ou moins stabilisée. La répartition des puces produites se fait à environ 30% en interne pour le SGF (qui vont sur des thématiques cellules souches et différenciation), 40% pour d’autres labos du CEA (Fontenay-aux-Roses, Saclay…) et 25% pour les équipes extérieures. Il y a des surplus de production qui correspondent à environ 30% de l’activité de production de puces pour l’extérieur.
Durant cette période, le SGF essaie également de réfléchir à des modalités de « facturation » de ses prestations, et décide de « facturer » ses services au coût de revient. En fait, aucune véritable procédure de tarification ne se met en place : les demandeurs participent aux frais de fonctionnement de la plate-forme, et une simple « convention de collaboration » est établie entre le SGF et l’équipe demandeuse.
Deux types de puces sont proposés : une puce à 5 000 dépôts, estimée à 100 € pièce, et dans un deuxième temps une puce à 11 000 dépôts, estimée à 150 €. Ce prix est calculé en tenant compte de l’ARN-polymérase pour faire les PCR, du gel d’agarose, des aiguilles de robots, de la fabrication de la lame, des contrôles qualité, des supports pour l’archivage des données, de l’amortissement des appareils et de la maintenance. N’entrent pas en ligne de compte les frais de personnel. La lecture des lames et l’analyse d’image sont effectuées à titre gracieux par le SGF