3. Le plan du rapport
2.2. Le dispositif scientifique et technique : instrumentation, technologies, et
2.2.1. Hôtel Express, TAGC
La technologie de « puces à ADN » implantée à l’origine de TAGC est la plus ancienne (macroarrays, 1963). Elle a été développée à la fin des années 1980 dans l’équipe de Hans Lehrach (Imperial Cancer Research Fund à Londres) qui utilisait des clones d’ADNc ou leurs produits PCR disposés régulièrement par des robots (spotters) sur de grandes membranes de nylon à haute densité (marquage radioactif), hybridées par des sondes radioactives. L’ensemble des données est acquis de manière quantitative et mesure le niveau d’expression de chacun des gènes représentés. Des robots aptes à la confection des macroarrays sont disponibles commercialement, des systèmes de détection sont présents dans de nombreux laboratoires, et plusieurs fabricants (Clontech, Genome Systems, Research Genetics…) vendaient dans les années 1990 des
membranes prêtes à l’emploi, portant des centaines ou des milliers de gènes. Ces « puces » pouvaient donc facilement être produites dans les laboratoires. Cette méthode était employée par de nombreuses équipes académiques (TAGC, G. Piétu dans l’équipe Auffray, au Japon…) et certains industriels. Les avantages des supports nylon sont l’hypersensibilité et la large gamme d’applications de la détection radioactive, qui permet la mesure à partir de très petits échantillons (Bertucci, Bernard, Loriod, Hum. Mol. Genet., 1999) mais aussi la forte capacité de ces membranes pour des dépôts de quantités élevées d’ADN cibles qui abaisse ainsi le seuil de détection ; et le fait que, contrairement aux autres supports, ces puces ne sont pas à usage unique. Une évolution s’est ensuite faite vers la miniaturisation (microarrays) avec une détection radioactive par des systèmes de haute résolution. L’équipe TAGC a participé à cette avancée technologique, en spécifiant sa méthode en la miniaturisant pour arriver à produire des microarrays mi-longs détectables par un équipement d’amplification PCR à haut débit. L’inconvénient de l’utilisation des ADNc dans les années 1990 est que les clones provenaient, pour les équipes académiques, des collections du consortium IMAGE, fondé par Ch.Auffray avec trois collègues américains, qui comportaient de nombreuses erreurs par rapport à la banque dbEST, et pour bien faire contraignait à re-séquencer les clones. Pour mettre fin à l’artisanat du séquençage manuel, des tentatives ont été faites en 1995 pour localiser une entreprise de séquençage à façon sur Luminy, en contactant Génome Express, qui était à l’époque une petite structure implantée à Grenoble, mais Génome Express n’a pas fondé d’antenne sur Luminy, mais a récupéré cette clientèle locale en sous-traitance à Grenoble. En 1997-98, Amersham souhaitait nouer un partenariat avec TAGC, en raison de son expertise scientifique, pour tester la technique ADNc sur lames de verre, en échange du don de l’équipement. Pour des raisons de rachat et de fusion des groupes industriels (rachat de Molecular Dynamics, fusion avec Pharmacia, puis General Electric et Motorola), les interlocuteurs industriels ont constamment changé et le partenariat n’a pu être conclu. La tentative d’implantation de la technologie sur lames de verre, qui aurait alors été novatrice pour l’équipe, a donc été un échec ; a posteriori, B.Jordan a pensé qu’il aurait été préférable de débourser le coût de cet équipement (2 à 3 MF) pour faire cette avancée technologique. Pour innover en instrumentation, des approches ont également été menées auprès de l’IIRIAM (Institut International de Robotique et d’Intelligence Artificielle de Marseille) à Château Gombert, sans conclusion (entretiens B.Jordan, A.Branciard).
La création de la plate-forme Transcriptome Hôtel Express dans le cadre de la génopole, qui permet l’acquisition d’équipements lourds ou semi-lourds pour passer à la production et à l’analyse à grande échelle, est donc une opportunité pour l’équipe TAGC, qui a été pionnière à la fin des années 1980 dans les profils d’expression des gènes, de normaliser et systématiser l’étude conjointe, à l’aide de la bioinformatique, des séquences et du tissu dans lesquels s’expriment les gènes correspondants, et la comparaison de ces profils d’expression entre tissu normal et pathologique, pour mettre en évidence des « cibles », protéines jouant un rôle clef dans divers processus physiologiques ou pathologiques. Il s’agit donc de mettre en place un nouveau modèle de production de connaissances ouvert, en s’appuyant sur les compétences déjà accumulées sur le site (mise en commun de la rente d’apprentissage de la recherche), mais avec un déplacement sur les méthodes technologiques et les appareils, et un élargissement à du matériel biologique pangénomique sur de nouveaux organismes modèles ; donc un apprentissage à faire pour faire évoluer la technologie et s’approprier de nouvelles méthodes.
Les investissements de la génopole en équipements pour la plate-forme sont conçus de façon complémentaire entre les sites (sauf le site de La Timone qui utilise des puces Agilent) détaillés chronologiquement ci-dessous.
Instrumentations19
Hôtel Express
Robots pour Amplification des collections : Robot amplification PCR et purification BioRobot 8000 (Qiagen) 2001, Robot Pipeteur Genesis (Tecan) 2001, 12 Thermocycleurs à 4 blocs de plaque à 96 puits (MJ Research) 2002, 4 Thermocycleurs Gene Amp 9700 (Applied Biosystems) acquis avant MNG.
Robots de dépôts de sondes nucléotidiques Dépôts sur membranes de nylon :
1 BioGrid (BioRobotics) 1999 , 2 Micro-Grid II Pro (BioRobotics) 2000 et 2001, 1 GMS 427 (MWG Biotech-Affymetrix) 2000.
Dépôts sur membranes de nylon & sur lames de verre : Robot à dépôts de type piézoélectrique (Spot Array Entreprise, Packard BioSscience Perkin Elmer) 2001, qui n’a jamais fonctionné, ce qui a donc été un élément de retard de la production de microarrays verre pangénomiques Drosophile et C.Elegans.
Lecteurs de puces à ADN
3 Radio-Imageurs pour les analyses par mesure de la radioactivité : 2 BAS 5000 (Fuji). Résolutions 50-25 mm 2000 et 2001, 1 Micro Imager M40 (Biospace Mesures) Résolution 1mm 2001.
1 FLA 8000 (Fuji Japon) Résolutions 20-10-5 mm. (en 2002), à double fonctionnalité, donc également pour la fluorescence ; en « bêta test » via un accord avec l’entreprise Fuji, ce lecteur est repris fin 2002, et devait donc être remplacé par un lecteur type Scan array à fluorescence pour la mise en place et la lecture sur lames de verre.
Stations d’analyse des images
dont une station Silicon Graphics de traitement de l’image.
Les sites d’analyse utilisent des microarrays sur lames de verre et la technologie de détection par fluorescence. Cette technologie est la plus récente, elle a été mise au point dans le secteur académique par Pat Brown, à Stanford, et est utilisée à la fin des années 90’ par des industriels (Synteni, racheté par Biotech Incyte, Molecular Dynamics…). Elle a l’avantage de la compacité, les jeux sur lames de verre pouvant comporter de 50 à 100 000 cibles.
Site d’analyse CNRS (resp. F.Denizot)
Appareils de détection (pour les 2 technologies) : 1 détecteur de radioactivité de type phosphoimager (Storm 820 de Molecular Dynamics), 1 scanner de fluorescence ScanArray 5000 de GSI Lumonics (Packard Instrument) Financement Conseil régional et Marseille Génopole.
Quantification et analyse (BDD, logiciels d’analyse)
Vérification du taux d’expression des gènes : un appareil de détection pour PCR quantitative (LightCycler de Roche).
Site d’analyse Faculté de Médecine Nord (resp. J.Gabert)
Analyse de l’expression génique en temps réel : 1 Taqman ABI 7700 (Applied Biosystem) Financement Région – IFR 2001
Appareils pour hybridation et lecture des biopuces : 1 Bioanalyseur Agilent Financement Conseil Général -IFR 2003, 1 Scan Array 4000 (auto-loader) 2001, Financement Conseil Général-Génopole (ne fonctionne pas faute de personnel dédié, est devenu obsolète trois ans plus tard).
19 Sources : A.Branciard, documents internes de MNG. Présentation de MNG du 27/06/02 à la Direction du RNG, Réponse
Site d’analyse Faculté de Médecine La Timone
Utilisation de puces commerciales (Agilent), 1 lecteur Scan Array (Packard) Financement Conseil Régional - Génopole, 1 BioAnalyseur (Agilent).
2.2.2. La plateforme microarrays/transcriptome de Nice/Sophia-Antipolis
Concernant les prestations offertes par la plate-forme en interne aux laboratoires des deux organismes (CNRS et INRA), et en accès externe aux chercheurs publics de toute la région, les puces mises en œuvre sont de type lames de verre, et sont analysées par hybridation différentielle de deux échantillons marqués avec des sondes fluorescentes distinctes. Alternativement, l'un des deux échantillons peut être remplacé par une solution d'ARN de référence, qui sert de contrôle unique au travers d'une grande série de quantifications.
La plate-forme utilise deux types de sondes distinctes pour son activité propre : des sondes PCR pan-mammifères et des sondes PCR classiques. Dans les deux cas, la production d'amplicons PCR, leur purification et le contrôle qualité (taille et quantification) sont annotés dans la base MedLab (Mise En œuvre et Développement de Logiciels pour l'Analyse des Biopuces).
Les spécificités de la plate-forme tiennent (i) au développement d’un projet informatique de grande envergure avec la création de deux bases de données, l’une (MedLab) pour un système de gestion informatique des expériences permettant un suivi des opérations effectuées sur les différents échantillons biologiques, l’autre (MEDIANTE) permettant à l’origine de gérer les séquences déposées sur la puce, et de recueillir auprès des utilisateurs de la plateforme un feedback sur les sondes les mieux adaptées à leurs projets ; (ii) au projet biologique de production de biopuces humaines contenant des sondes conservées entre l’homme et la plupart des mammifères, pour permettre l’utilisation d’une biopuce unique dans des études inter-espèces20.
La plate-forme fonctionne sous forme de projets collaboratifs, et elle est associée aux demandes de crédits formulées par les collaborateurs. Au moment de son intégration, un objectif pour 2003 est de créer un site web pour l’accueil des utilisateurs, permettant une gestion facilitée des demandes de lames, demandes de matériel…
Pour conclure, au-delà des équipements qui ont été acquis, les différentes équipes de recherche de la plate-forme MNG ont des thèmes scientifiques qui apparaissent très éloignés : Celles qui sont le support des deux sites de production (le TAGC et le LAPG) ont comme mission de construire des outils et des méthodes génomiques pour les biologistes, les équipes d’analyse21 ont des objets
scientifiques qui les ont amenés à développer des techniques qu’elles mettent, secondairement, à la disposition de leurs collègues. Elles vont du plus fondamental (IBSM) à de l’instrumental (TAGC, LAPG) et du biomédical (les unités hospitalières et TAGC)
Les différents dispositifs techniques installés sur chaque site sont indépendants l’un de l’autre ; certains ont été intégrés dans un dispositif avant la constitution de la plate-forme MNG, les sites CNRS et Nord sont équipés de façon complémentaire par rapport à l’Hôtel Express. La Timone a toujours fait cavalier seul avec Agilent. Il existe une spécialisation des équipes entre production et analyse, mais non une division des tâches, puisque les équipements pour les technologies différentes utilisées ne sont pas compatibles a priori.
20 Source : MedLab sur le site de l’IPMC.
Thématique scientifique Technologies utilisées Instruments Spécialisation dans le process Hôtel Express Développement et application des outils de la génomique à l’immunologie et au cancer Microarrays Nylon associée à la détection Radio Active ; initiation à la fluorescence sur lames de verres 22 Production et analyse de puces : modèles : homme, souris, rat, truite « arc-en-ciel », drosophile, C. Elegans,
Arabidopsis thaliana. cibles cDNA, bactéries
ou oligonucléotides longs
Production et analyse de bio-puce dédiées, le plus souvent dans le cadre de partenariat de recherche Plate-forme niçoise Développement d’outils de biologie quantitative utilisant les données acquises lors des séquençages de génomes. Fluorescence sur lames de verres 23 Production et analyse d’oligonucléotides longs, puces pangénomiques, et puces inter-espèces Base de données relationnelles MedLab ; Production dédiée lorsque dans le cadre de partenariat de recherche Plate-forme
IBSM Bactéries
Fluorescence sur
lames de verres 24 analyse
UMAGT Santé : interactions cellulaires (neurosciences, cancer) Fluorescence sur lames de verres 25 analyse PCR quantitative en temps réel
22 Les congélateurs pour conserver le matériel biologique, en particulier les banques de clones. Les robots : pour
Amplification de collections c’est-à-dire les pipetteurs et les amplificateurs PCR, de dépôts selon le nombre d’aiguilles et le nombre d’arrays.
Les lecteurs de puces ADN à partir de la radio-activité ou de la fluorescence. Différents appareils spécifiques : Bioanalyseur, appareil d’analyse de la luminosité et de la fluorescence et de radioactivité etc.
23 Deux robots spotters (Virtek/ Biorad) de fabrication de puces ADN, un robot Biomek 2000 (équipé de logiciels « maison »
de gestion) pour la purification des ADN, deux robots de transfert GenMap (Applied BioSystems), trois scanners (lecteurs de fluorescence sur lames de verre) dont un Scan Array Express (Perkin Elmer) et deux scanners GenePix Axon (IPMC, INRA, IFR 50), 1 Bioanalyzer (Agilent) pour contrôle de qualité des ARN, deux serveurs LINUX biprocesseurs pour le stockage des données(à un serveur de calcul unique).
24 Ce plateau IBSM possède les appareils nécessaires à la détection de matériel radioactif (Storm 820 de Molecular
Dynamics) et de matériel fluorescent (ScanArray 5000 de GSI lumonics Inc.) ainsi que les logiciels de traitement des données (VisionArray de Imaging research Inc., QuantArray de GSI lumonics Inc. et Genepix de Axon Instruments Inc.). Elle dispose d'un parc informatique comprenant un serveur sous Unix et quatre PC sous Windows NT et permet la gestion des projets et le développement d'outils (logiciels) d'analyse d'un appareil de détection pour PCR quantitatives (LightCycler de Roche) afin de valider si nécessaire les résultats.. Le développement d’une base de données assurant le stockage des informations recueillies et leur mise en relation avec d'autres bases est actuellement en cours.
25 Un lecteur de lames de verre « scan array » ; une PCR quantitative type « Taq Man » ; un appareil ABI 7700 1er appareil
qui est sorti (Apply Bio system), un bioanalyseur « Agilent » ; une station d’hybridation automatisée, différents lasers et un autologing. Par ailleurs, elle dispose du logiciel ELOGE fournit en partenariat par la société de biotechnologie IPSOGEN.
Au moment de leur installation et de leur labellisation, chaque plate-forme de production était à la pointe de l’innovation, l’Hôtel Express en 1999, Nice/Sophia en 2003 etc. ensuite à partir des choix technologiques faits à cette période et de leurs possibilités financières, elles tentent de se moderniser pour être compétitives. Les plateaux d’analyse ont toujours été des suiveurs en terme de technologies, mais ils peuvent avoir une utilisation de leurs appareillages originale et novatrice sur un segment d’activités précis (Meidia).