CHAPITRE 4 : NIPBL et cohésine régulent la réponse transcriptionnelle des récepteurs nucléaires
4.7 Matériel et méthodes 147
4.7.1 Culture cellulaire et traitements hormonaux
Les cellules MCF7 (ATCC, HTB-22) et HEK293T ont été cultivées dans du milieu DMEM (Invitrogen, #11965118) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (Invitrogen, qualified #12483020), 100 μM MEM d’acides aminés non-essentiels (Cellgro, #CA45000- 700), 2 mM de L- glutamine (Cellgro, #CA45000-676), 100 U/ml de pénicilline et 100 μg/ml de streptomycine (Invitrogen, #15070063). Pour les expériences impliquant un traitement hormonal, les MCF7 ont été amplifiées dans un milieu appauvri en estrogènes 72h avant traitement. La composition de ce milieu est la suivante : DMEM w/o phenol-red (Invitrogen, #31053-028) supplémenté avec 5% de Charcoal/Dextran treated FBS (Hyclone, #AVH78911), 100 μM MEM d’acides aminés non-essentiels (Cellgro, #CA45000-700), 2 mM de L-glutamine (Cellgro, #CA45000-676), 100 U/ml de pénicilline et 100 μg/ml de
streptomycine (Invitrogen, #15070063). Les MCF7 ont été traitées (ou non) avec 100nM de beta-estradiol (SIGMA, #E8875) pendant deux heures. Les cellules A549 (ATCC, CCL- 185) ont été cultivées dans du milieu F12K (Invitrogen, #21127022) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (Invitrogen, qualified #12483020), 100 μM MEM d’acides aminés non-essentiels (Cellgro, #CA45000-700), 2 mM de L- glutamine (Cellgro, #CA45000-676), 100 U/ml de pénicilline et 100 μg/ml de streptomycine (Invitrogen, #15070063). Les A549 ont été traitées (ou non) avec 100nM de dexamethasone (SIGMA, #D1756) pendant 1h. L’ensemble des lignées cellulaires ont été maintenues à 37°C sous une atmosphère humide contenant 5% de CO2.
4.7.2 Perte de fonction par transduction lentivirale
Des plasmides de transfert PLKO.1 de la librairie MISSION de SIGMA ciblant nos facteurs d’intérêt ont été fournis par le Dr Stéphane Gobeil. Les lentivirus ont été produits dans des HEK293T en co-transfectant un plasmide de transfert avec des plasmides d’enveloppe (pMD2.G, Addgene #12259) et de packaging (psPAX2, Addgene #12260) avec un ratio de 6 :3 :1 μg, respectivement, en utilisant le réactif X-tremeGENE 9 (SIGMA, #6365787001). Les cellules ont été transduites avec la préparation lentivirale pendant 24h avant sélection par la puromycine (2μg/ml) pendant 48h. Différents shRNA ont été testé et leur effet sur leur cible a été validé par RT-qPCR. Deux constructions ont été gardées pour la suite des expériences. Le plus efficace des deux est utilisé dans les données présentées ici.
Numéro de séquences des shRNAs de la librairie MISSION de SIGMA utilisés : NIPBL, #146423 ;; ESR1, #3229 ;; SMC1A, #62555 ;; TBLR1, #60743, Ctrl (Non mammalian), #SHC002.
4.7.3 Extraction d’ARN, RT-qPCR et RNA-Seq
L’ARN total des cellules a été extrait en utilisant le réactif TriPure (SIGMA, #11667165001) selon les recommandations du fabricant, puis a été concentré sur une colonne de purification d’ARN (GeneJET RNA Cleanup and Concentration Micro kit, Thermo Scientific #K0842). Pour les expériences de RNA-Seq, l’ARN total purifié a été envoyé au Centre d’Innovation Génome Québec et Université McGill, MUGQIC, où les librairies et le séquençage ont été réalisés. Pour les expériences de RT-qPCR, la transcription réverse a été effectuée en utilisant 2,5ug d’ARN total selon le protocole standard du mix SuperScript VILO Master Mix (Invitrogen, #11754). De plus, 1µl d’ARNs synthétiques (ERCC RNA Spike-in Mix, Fisher, #FERK0841) diluées au 1/5000e ont été ajoutés à chaque réaction de
transcription réverse. Par la suite l’ADNc a été utilisé au 1/12e dans une réaction de PCR
quantitative réalisée avec le mix SYBR Select Master Mix (Invitrogen, #P1461019). Les amorces suivantes ont été utilisées :
ARNm cible
Amorce forward (5’-3’) Amorce reverse (5’-3’)
ERCC- 00096
CAAACATGCACAGCGGTCAA
ATGTCCCCAATTCGCGTCAT
NIPBL CCTACACATGGTGCACAGGCTAA GGAAAAGATGCAGCATTCCTCA
SMC1A GGGCAGAGATTTGACGTTGGA GGCCAGGGTAGCTGCTCTCTT
ESR1 AGCTCCTCCTCATCCTCTCC ATAGAGGGGCACCACGTTCT
GREB1 CCCATCTTTTCCCAGCTGTA ATTTGTTTCCAGCCCTCCTT
TFF1 GTCCCCTGGTGCTTCTATCC CGTCAGGATGCAGGCAGAT
4.7.4 ChIP-Seq
L’immunoprécipitation de la chromatine a été réalisée selon un protocole décrit précédémment598,649. Les librairies de ChIP-seq et le séquençage de l’ADN immunoprécipité ont été réalisés par le Centre d’Innovation Génome Québec et Université McGill, MUGQIC.
4.7.5 Analyses bioinformatiques
L’analyse des données de séquençage brutes de ChIP-Seq a été réalisée en utilisant le pipeline de ChIP-Seq développé par le MUGQIC. Afin de générer les representations graphiques, des fichiers bigwig ont été générés à partir des fichiers d’alignement BAM avec les outils Samtools 1.2 bedtools 2.17.0650 et wigToBigWig (développés par ENCODE)
avec des comptes normalisés en reads par million et un paramètre de smoothing de 225pb. Les données de ChIP-Seq de GR proviennent d’ENCODE et ont été réanalysées de la même façon. L’analyse des données de séquençage brutes de RNA-Seq a été réalisée en utilisant le pipeline de RNA-Seq développé par MUGQIC.
4.7.6 Fractionnement cellulaire et immunoprécipitation
Le fractionnement cellulaire a été réalisé selon une version modifiée du protocole décrit dans Aygun et al., 2008652. Brièvement, les cellules ont été rincées au PBS puis
récupérées par grattage et centrifugées (5 minutes à 150 g à 4°C). Par la suite, le culot a été homogénéisé dans un tampon de lyse cytoplasmique (10mM HEPES pH 7.9, 0.34M sucrose, 3mM CaCl2, 2mM MgCl2, 0.1mM EDTA, 1mM DTT, 0.1% NP-40) puis centrifugé
le culot a été repris dans du tampon cytoplasmique dépourvu de NP-40 et centrifugé à nouveau (5 minutes à 2500 g à 4°C), puis le culot est homogénéisé dans du tampon de lyse nucléaire (20mM HEPES pH 7.9, 1.5mM MgCl2, 3mM EDTA, 150mM KCl, 0.1% NP- 40, 1mM DTT, 10% glycérol) et centrifugé (30 minutes à 15000 g à 4°C). Le surnageant contient alors la fraction nucléoplasmique. Enfin, ce dernier culot a été resuspendu dans un tampon d’incubation de la nucléase (150mM HEPES pH 7.9,1.5mM MgCl2, 150mM KCl, 10% glycérol) contenant 0.15 unité/µl de benzonase et la digestion des acides nucléiques a été réalisée sur glace pendant 2h. Après centrifugation (30 minutes à 20000 g à 4°C), le surnageant contenant les protéines chromatiniennes natives a été récupéré. L’extrait chromatinien ainsi obtenu a été mis en présence de billes pré-incubées avec l’anticorps d’intérêt (5μl d’anticorps pour 50μl de billes magnétiques (Dynabeads protein G, Invitrogen, #10004D)). Après rotation sur la nuit, les billes sont éluées avec du tampon Laemmli.
4.7.7 Liste des anticorps utilisés
Cible Source
NIPBL Bethyl, #A301-779A (immunoprécipitation)
Pierce, #PIMA172534 (Western blot)
SMC1A Bethyl, #A300-055A
ERa Santa Cruz, #sc543X
GR Santa Cruz, #sc1003
TBLR1 Novus, #H00079718-M01
CDK9 Santa Cruz, #sc-484
TBP Abcam, #ab818
HISTONE H3 Abcam, #ab1791
FOXA1 Abnova, #98-000-720