CHAPITRE 5 : Discussion 151
5.4 Les boucles chromatiniennes et les TADs sont des structures dynamiques 158
Jusqu’ici nous avons considéré les TADs comme étant des structures plutôt stables formées par le complexe cohésine et restreintes au niveau de frontières occupées par CTCF. Toutefois, de récentes études révèlent que les boucles chromatiniennes et les TADs sont des structures de repliement dynamiques.
Les boucles et TADs sont absents en mitose, mais réapparaissent en phase G1334,378. En
manière stable à aucun moment de l’interphase. En effet, les auteurs observent un continuum de structures différentes tout au long du cycle cellulaire ponctué par des transitions marquées comme une condensation en préparation pour la mitose, une expansion rapide en phase G1 précoce et un remodelage important lors de la réplication378. Ainsi, les TADs pourraient se former et disparaître potentiellement plusieurs
fois au cours du cycle cellulaire des cellules de mammifères. En accord avec cela, des travaux portant sur l’étude de la dynamique de liaison de CTCF et cohésine sur la chromatine par imagerie de molécules uniques en temps réel698 a révélé que le temps de
résidence de CTCF n’est que de quelques minutes et que celui du complexe cohésine est de 20 à 25 min en phase G1. Puisque cohésine est nécessaire au maintien des TADs640,
cela suggère que les boucles chromatiniennes sont continuellement formées et détruites au cours du cycle cellulaire. De plus, l’étude de l’effet de la dégradation conditionnelle du complexe cohésine montre que les TADs sont perdus au bout de 40 min, puis rétablis en 1h suite à la restauration des niveaux de cohésine640. Ces données suggèrent que les
mécanismes par lesquels les TADs et les boucles se forment et se déforment sont plutôt rapides, ce qui est en faveur d’une structure dynamique des TADs.
Par ailleurs, les TADs sont définis comme des régions du génome formant plus d’interactions intra-domaines que d’interactions avec des séquences voisines, de telle façon à être visibles sous forme de carrés dans les matrices de contact de Hi-C. Une possibilité intéressante serait alors que les TADs définis dans des populations de cellules reflètent une collection polyclonale de boucles en formation entre deux sites CTCF et que le désassemblage suivi par leur reformation assure le maintien d’une dynamique des TADs473. Des travaux analysant la dynamique de formation des TADs dans des cellules ∆WAPL, WAPL étant un facteur qui retire le complexe cohésine de la chromatine, montre que le temps de résidence de cohésine est prolongé dans ces cellules478. En accord avec une structure dynamique des TADs, la taille moyenne d’un TAD augmente de manière considérable dans les cellules ∆WAPL et la taille médiane des boucles passe de 370kb à 575 kb. Les auteurs proposent alors un modèle où les boucles chromatiniennes sont formées à travers l’élargissement processif de petites boucles et présentent les TADs comme le reflet de populations polyclonales de boucles en formation entre deux sites CTCF donnés. De plus, ils suggèrent que le déchargement du complexe cohésine par l’intermédiaire de WAPL permet aux TADs de rester dynamiques478.
cellules à leur environnement. En accord avec cela, il a été montré que la co-expression de gènes appartenant à une communauté identifiée par une technique de conformation des chromosomes suite à une stimulation au TNF-α n’est détectable que dans une minorité de cellules544. Ainsi les communautés de gènes identifiées dans une population de cellules pourraient représenter la somme de l’ensemble des interactions en formation entre des régions occupées par l’ARN Pol II.
Comment est alors dictée la restructuration continuelle de l’architecture chromosomique tout au long du cycle cellulaire ? Une hypothèse attrayante serait que NIPBL soit présent sur la chromatine tout au long du cycle, tout particulièrement en mitose en tant que protéine de bookmarking, afin de correctement positionner le complexe cohésine.
Le bookmarking est un processus qui permet la “mise en mémoire” des statuts transcriptionnels pendant la mitose. En effet, durant la mitose, la chromatine se condense, la majorité des facteurs de transcription se dissocient de leurs séquences cibles699 et la transcription des gènes, exceptés ceux nécessaires à la progression dans le cycle cellulaire, est arrêtée700. Ainsi, certains facteurs, dits de bookmarking, restent présents sur les chromosomes mitotiques afin de transmettre la mémoire des profils d’expression des gènes actifs aux cellules filles. Bien qu’il ait été décrit que NIPBL est majoritairement éliminé de la chromatine en prophase et rétabli en télophase490,493, il a également été
montré que son affinité pour la chromatine est augmentée en G2/M701, suggérant un
potentiel rôle au cours de la mitose. En effet, NIPBL étant retrouvé au niveau des promoteurs des gènes actifs en interphase432,433,506,629, son maintien sur la chromatine au cours de la mitose pourrait permettre le recrutement rapide du complexe cohésine, après son clivage mitotique443, au début de la phase G1 afin d’activer la transcription des gènes
et de rétablir une certaine architecture de la chromatine. De plus, la présence de NIPBL sur la chromatine en mitose apporterait également un mécanisme de recrutement pour le complexe condensine II qui est nécessaire à la formation des chromosomes mitotiques702,703. En effet, il a été suggéré que NIPBL promeut le recrutement du complexe
condensine sur la chromatine511,512. En accord avec cela, il a également été montré que la condensine est recrutée au niveau de régions déplétées en nucléosomes en mitose704 et il
a été proposé que NIPBL permet de maintenir ce type de régions ouvertes de la chromatine515. Par ailleurs, il a été montré que TBP est un facteur de bookmarking705 et
nous identifions une interaction entre NIPBL et TBP (Figures 3.2.A et 4.1.F). Ainsi, TBP pourrait coopérer avec NIPBL pour maintenir certaines régions du génome ouvertes
pendant la mitose afin de permettre le recrutement de condensine en mitose et celui de cohésine en G1.
5.5 Contribution de l’architecture chromatinienne contrôlée par le
complexe cohésine à la régulation de la transcription
En plus de son rôle dans la formation des TADs, le complexe cohésine permet de faciliter la mise en place d’interactions chromatiniennes à l’intérieur de ces structures afin de réguler l’expression des gènes de manière positive ou négative. Dans ce contexte, cohésine et NIPBL sont importants pour l’établissement de contacts enhancer-promoteur et cohésine forme des boucles entre des sites CTCF afin de rapprocher ou d’isoler des régions régulatrices du génome327,432,460,462,463,548,706. De plus, il a été proposé que les TADs permettent de réguler ces processus en empêchant les régions régulatrices de former des interactions ectopiques avec des cibles qui se trouvent dans un autre TAD550,556. Des études récentes nous permettent de préciser quelque peu la contribution topologique du complexe cohésine à la régulation de la transcription.
La mesure du niveau des transcrits naissants quelques heures après la déplétion du complexe cohésine dans des cellules humaines de carcinome colorectal (HCT-116)640
montre un effet modeste sur la transcription malgré l’élimination des TADs. En effet, 1607 gènes (sur 12222) exprimés avant déplétion voient un changement de plus de 30% de leur niveau d’expression et 216 gènes sont activés de manière ectopique. De plus, le profil de modifications post-traductionnelles des histones n’est pas modifié dans ces conditions640, suggérant un maintien du potentiel de régulation des séquences modulant l’expression des gènes. Par ailleurs, la perte de WAPL478 dans des fibroblastes humains et de NIPBL690 dans des hépatocytes de souris n’affecte significativement l’expression que d’environ 1000 gènes, à la fois positivement et négativement, tout comme c’est le cas pour la perte de cohésine640. Ces observations suggèrent que la structure topologique mise en place par la
cohésine ne régule l’expression que d’un nombre limité de gènes et que les boucles chromatiniennes associées au complexe cohésine peuvent à la fois faciliter et bloquer l’activation de certains promoteurs. De plus, le fait que la déplétion de cohésine n’induise pas de grandes variations d’expression suggère un rôle du complexe dans la régulation fine du niveau d’expression des gènes. Toutefois, ces études n’adressent pas les mécanismes par lesquels le complexe cohésine et ses facteurs régulateurs modulent la transcription.
Dans le Chapitre 3 de cette thèse, nous présentons un projet visant à identifier la ou les étape(s) de la transcription régulée(s) par le complexe cohésine et son facteur de charge NIPBL. Nous identifions de nouvelles interactions entre ces facteurs et la machinerie transcriptionnelle dans les ESCs et avons procédé à une perte de fonction de NIPBL et de la sous-unité SMC1A du complexe cohésine suivie d’une analyse de la liaison génomique de l’ARN Pol II par ChIP-Seq. Nos données révèlent des effets différents de la déplétion de cohésine et NIPBL, bien que la fonction de NIPBL soit nécessaire pour stimuler l’association de cohésine avec l’ADN429. Toutefois, il a été montré que cohésine est
capable de lier l’ADN de manière passive in vitro, bien que moins efficacement429,475. De
plus, NIPBL ne stimule pas l’activité de chargement du complexe seul. En effet, il forme un hétérodimère avec la protéine MAU2483,485,486 et ce facteur pourrait alors partiellement compenser pour une réduction de NIPBL. Il va être indispensable d’effectuer une expérience de ChIP-Seq ciblant des sous-unités de cohésine suite à une déplétion de NIPBL afin de compléter l’interprétation de nos résultats. Cependant, le fait que nous n’observions pas d’effet flagrant de la perte de fonction de NIPBL sur la liaison globale du complexe cohésine permet de découpler leurs fonctions et de les étudier séparément. Nous proposons ainsi un rôle général du complexe cohésine dans la régulation de l’initiation de la transcription ainsi qu’un rôle de NIPBL, indépendant de celui de cohésine, dans la relâche de la pause. Malgré les limites de l’étude, discutées dans cette partie ainsi qu’à la fin du Chapitre 3, nous proposons ici un modèle de la régulation de la transcription des gènes directement liés par NIPBL. Dans un premier temps, NIPBL serait recruté au niveau des promoteurs de gènes actifs par l’intermédiaire de facteurs de transcription et/ou de coactivateurs. Au niveau de ces régions, il permettrait le recrutement du complexe cohésine qui stabiliserait les interactions enhancer-promoteur et stimulerait la formation du PIC pour efficacement activer la transcription. Une fois l’ARN Pol II en transcription active, le complexe cohésine pourrait être déplacé alors que NIPBL resterait au promoteur. Il permettrait alors de réguler une étape post-initiation, comme la relâche de la pause, et recruterait un nouveau complexe cohésine afin de ré-initier la transcription. Il est important de noter que l’enrichissement de l’ARN Pol II n’est pas une mesure de l’activité transcriptionnelle et qu’une évaluation des niveaux d’ARN naissants serait nécessaire afin de tester ce modèle.
Dans le Chapitre 4, nous présentons un rôle du complexe cohésine et de NIPBL dans la régulation de la transcription par les récepteurs nucléaires. En effet, NIPBL et cohésine semblent nécessaires pour permettre une activation appropriée des gènes activés par les
récepteurs aux estrogènes et aux glucocorticoides. De plus, nos données suggèrent qu’ils sont également requis en absence de stimulation. Nous proposons alors deux hypothèses afin d’expliquer comment NIPBL et cohésine "préparent" les gènes qui doivent être activés en réponse à une stimulation hormonale, les deux modèles reposant sur le fait que NIPBL et cohésine soient recrutés en amont des RNs et en absence de stimulation. D’une part, NIPBL et cohésine pourraient permettre le recrutement de corépresseurs, comme les complexes N-CoR/SMRT, afin de maintenir le niveau d’expression basal des gènes. Lorsque la transcription doit être activée en réponse à une stimulation hormonale, les corépresseurs pourraient être envoyés à la dégradation et le recrutement de NIPBL, cohésine ainsi que de coactivateurs par les RNs serait stimulé, permettant ainsi la formation du PIC et l’activation de la transcription. Cela impliquerait donc un rôle de NIPBL et cohésine en tant que balance entre des corépresseurs et des coactivateurs. Toutefois, la présence des cofacteurs sur la chromatine étant dynamique166,707, le mécanisme de régulation pourrait être bien plus complexe que la présence ou l’absence d’un cofacteur donné avant et après stimulation. D’autre part, la machinerie transcriptionnelle ainsi que NIPBL et cohésine pourraient être recrutés au niveau des TSS avant stimulation, mais l’ARN Pol II pourrait être maintenue dans un état de pause. Lorsque le RN se lie à ses régions cibles suite à une stimulation hormonale, NIPBL et cohésine pourraient être recrutés au niveau de régions distales, stimuler la formation de boucles enhancer- promoteur et induire la transition vers une élongation productive. L’intégration des résultats présentés dans les chapitres 3 et 4 avec des données de conformation des chromosomes permettrait de déterminer comment cette régulation de la transcription est liée à l’architecture chromatinienne.
Dans le contexte de la réponse hormonale, il serait particulièrement intéressant d’analyser la structure des communautés de gènes avant et après stimulation hormonale afin de déterminer comment ces interactions chromatiniennes sont modulées en réponse à un stimulus. Selon notre modèle, les gènes activés par les estrogènes ou les glucocorticoïdes, par exemple, devraient être préférentiellement retrouvés organisés en communautés et leur transcription devrait être coordonnée en réponse à un stimulus hormonal. Il serait également intéressant d’évaluer comment cette structure est affectée par une perte de NIPBL ou du complexe cohésine.
régulation de l’expression génique. Ainsi, dans le contexte du repliement du génome, les domaines topologiquement associés constitueraient des frontières apportant une contrainte physique qui limite les interactions chromosomiques à l’intérieur de ces structures et où l’ARN Pol II, et donc potentiellement la transcription, apporterait une organisation fonctionnelle au sein de cette architecture.
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