CHAPITRE 3 : NIPBL et cohésine régulent des étapes précoces de la transcription dans les cellules
3.7 Matériel et méthodes 128
3.7.1 Culture cellulaire
La lignée de cellules souches embryonnaires de souris V6.5 a été cultivée sur gélatine dans du milieu 2i + LIF dont la composition est la suivante : milieux DMEM F12 (Invitrogen, #11320-082) et Neurobasal (Invitrogen, #21103-049) supplémentés en N2 (Invitrogen, #17502-048), B27 (Invitrogen, #12587-010), BSA (Invitrogen, #15260-037), 100 U/ml de pénicilline et 100 μg/ml de streptomycine (Invitrogen, #15070063) et 2mM de L-glutamine (Cellgro, #CA45000-676). Le LIF (1000 U/ml) (Millipore, #ESG1107), l’inhibiteur de GSK3β (3μM) (CHIR99021, Cederlane #4423/10) et l’inhibiteur de MEK1/2 (1μM) (PD0325901, Cederlane #13034-10) sont ajoutés extemporanément. Les cellules HEK293T ont été cultivées dans du milieu de DMEM (Invitrogen, #11965118) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (Invitrogen, qualified #12483020), 100 μM MEM d’acides aminés non-essentiels (Cellgro, #CA45000-700), 2 mM de L- glutamine (Cellgro, #CA45000-676), 100 U/ml de pénicilline et 100 μg/ml de streptomycine (Invitrogen, #15070063). Les V6.5 et les HEK293T ont été maintenues à 37°C sous une atmosphère humide contenant 5% de CO2.
3.7.2 Perte de fonction par transduction lentivirale
Des plasmides de transfert PLKO.1 de la librairie MISSION de SIGMA ciblant nos facteurs d’intérêt ont été fourni par le Dr Stéphane Gobeil. Les lentivirus ont été produits dans des HEK293T en co-transfectant un plasmide de transfert avec des plasmides d’enveloppe (pMD2.G, Addgene #12259) et de packaging (psPAX2, Addgene #12260) avec un ratio de 6 :3 :1 μg, respectivement, en utilisant le réactif X-tremeGENE 9 (SIGMA, #6365787001). L’ARN viral a été purifié en utilisant le kit NucleoSpin RNA virus (Macherey-Nagel, # 740856) puis titré par RT-qPCR avec le kit LentiX qRT-PCR Titration (Clontech, #631235). Une gamme de dilution de la préparation virale a été utilisée pour déterminer la quantité optimale de virus à utiliser pour les infections. Par la suite, les cellules ont été transduites avec la préparation lentivirale pendant 24h avant sélection par la puromycine (1μg/ml) pendant 48h. Différents shRNA ont été testé et leur effet sur leur cible a été validé par RT- qPCR. Deux constructions ont été gardées pour la suite des expériences. Le plus efficace des deux est utilisé dans les données présentées ici.
Numéro de séquences des shRNAs de la librairie MISSION de SIGMA utilisés : NIPBL, #124038 ;; SMC1A, #109034 ;; MED14, #96281 ;; Ctrl (Non mammalian), #SHC002.
3.7.3 Immunoprécipitation d’extraits nucléaires
Les cellules sont rincées au PBS puis récupérées par grattage. Après centrifugation (5 minutes à 1350 g à 4°C), le culot de cellules est resuspendu dans un tampon de lyse cytosplasmique (10mM HEPES pH 7.9, 10mM KCL, 0.1 mM EDTA, 0.1mM EGTA) puis mis sous rotation à 4°C pendant 10 min. Après l’ajout de NP-40 et d’une homogénéisation rapide, une centrifugation (5 minutes à 1350 g à 4°C) est réalisée afin d’éliminer la fraction cytoplasmique. Par la suite, le culot est resuspendu dans un tampon de lyse nucléaire (50mM Tris-HCL pH7.7, 250mM NaCl, 5mM EDTA, 0.1% NP-40), incubé sur glace au moins 30 minutes avec une homogénéisation toutes les 10 minutes, puis centrifugé à vitesse maximale à 4°C pendant 10 min. Le surnageant ainsi obtenu contient les protéines nucléaires et est mis en présence de billes pré-incubées avec l’anticorps d’intérêt (5μl d’anticorps pour 50μl de billes magnétiques (Dynabeads protein G, Invitrogen, #10004D)). Après rotation sur la nuit, les billes sont éluées avec du tampon Laemmli.
3.7.4 ChIP-qPCR et ChIP-Seq
L’immunoprécipitation de la chromatine a été réalisée selon les protocoles décrits dans les articles récents du laboratoire598,649. Pour les expériences de ChIP-qPCR, les régions
enrichies ont été quantifiées avec le mix SYBR Select Master Mix (Invitrogen, #P1461019) à l’aide des séquences d’oligo suivantes :
Région cible
Amorce forward (5’-3’) Amorce reverse (5’-3’) Enhancer Nanog AGAGGACTCGCATGCATTTT TCCGGGAGAGGAATTGTAAG Site CTCF (Gnai 2) ACAGAGCGATACGGCTCAGCAA AAGTGGTAGCCGAAGGCAAGTGAA Région contrôle AATTAAGCACGGCTTGCACGGT ACAAGTGCTCGTTTGCAGCCT
Les librairies de ChIP-seq et le séquençage de l’ADN immunoprécipité ont été réalisés par le Centre Innovation Génome Québec et Université McGill (MUGQIC, McGill University and Génome Québec Innovation Centre).
3.7.5 Extraction d’ARN et RT-qPCR
L’ARN total des cellules a été extrait en utilisant le réactif TriPure (SIGMA, #11667165001) selon les recommandations du fabricant. La transcription réverse a été effectuée en utilisant 2,5ug d’ARN total selon le protocole standard du mix SuperScript VILO Master
Mix (Invitrogen, #11754). Par la suite l’ADNc a été utilisé au 1/12e dans une réaction de
PCR quantitative réalisée avec le mix SYBR Select Master Mix (Invitrogen, #P1461019). Les amorces suivantes ont été utilisées :
ARNm cible
Amorce forward (5’-3’) Amorce reverse (5’-3’)
Gapdh CACTCTTCCACCTTCGATGC CCCTGTTGCTGTAGCCGTAT
Nipbl CCCATGTCCCCATAACTACG GGAGGCTCTTTGTAGTTGTAGCA
Smc1a GTGCTGAGGACCGTACCTTT TCACTGTATTCATGTAGCTGGACA
Med14 GACGGACTTATTGCCAAGGA CGTCATTGGCCCATTTTACT
3.7.6 Analyses bio-informatiques
L’analyse des données de séquençage brutes a été réalisée en utilisant le pipeline de ChIP-Seq développé par le MUGQIC. Afin de générer les representations graphiques, des fichiers bigwig ont été générés à partir des fichiers d’alignement BAM avec les outils Samtools 1.2 bedtools 2.17.0650 et wigToBigWig (développés par ENCODE) avec des
comptes normalisés en reads par million et un paramètre de smoothing de 225pb. Les profils moyens de liaison de l’ARN Pol II ont été générés avec le package R metagene651
et le traveling ratio (TR) a été calculé selon la formule indiquée sur la figure 3.4.C.
3.7.7 Fractionnement cellulaire
Le fractionnement cellulaire a été réalisé selon une version modifiée du protocole décrit dans Aygun et al., 2008652. Brièvement, les cellules ont été rincées au PBS puis
récupérées par grattage et centrifugées (5 minutes à 150 g à 4°C). Par la suite, le culot a été homogénéisé dans un tampon de lyse cytoplasmique (10mM HEPES pH 7.9, 0.34M sucrose, 3mM CaCl2, 2mM MgCl2, 0.1mM EDTA, 1mM DTT, 0.1% NP-40) puis centrifugé (5 minutes à 2500 g à 4°C). À cette étape, le surnageant contient la fraction cytoplasmique. Par la suite, le culot a été repris dans du tampon cytoplasmique dépourvu de NP-40 et centrifugé à nouveau (5 minutes à 2500 g à 4°C), puis le culot est homogénéisé dans un tampon de lyse nucléaire (20mM HEPES pH 7.9, 1.5mM MgCl2, 3mM EDTA, 150mM KCl, 0.1% NP-40, 1mM DTT, 10% glycérol) et centrifugé (30 minutes à 15000 g à 4°C). Le surnageant contient alors la fraction nucléoplasmique. Enfin, ce dernier culot a été resuspendu dans un tampon d’incubation de nucléase (150mM HEPES pH 7.9,1.5mM MgCl2, 150mM KCl, 10% glycérol) contenant 0.15 unité/µl de benzonase et la digestion des acides nucléiques a été réalisée sur glace pendant 2h. Après centrifugation (30 minutes à 20000 g à 4°C), le surnageant contenant les protéines
chromatiniennes natives a été récupéré. Cet extrait chromatinien a été dosé et utilisé pour effectuer un Western blot en utilisant 2 μg de lysat pour quantifier l’histone H3 et 7 à 10,5 μg de lysat pour les autres protéines analysées.
3.7.8 Extraction des protéines totales
Les cellules ont été rincées au PBS puis récupérées par grattage. Après centrifugation (5 minutes à 150 g à 4°C), le culot de cellules a été resuspendu dans une solution de RIPA (50mM tris pH 7.5, 1% NP-40, 0,5% sodium deoxycholate, 150mM NaCL, 2mM EDTA, 0,1% SDS) froide contenant des inhibiteurs de protéases (Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets, SIGMA, #11836145001) et a été incubé sur glace pendant 30 min, avec une homogénéisation toutes les 10 minutes. Par la suite, les extraits ont été repris dans une seringue puis centrifugés (15 minutes à 4°C à 14000 g). Le surnageant a été dosé et utilisé pour effectuer un Western blot en utilisant 50 à 70 μg de lysat. La quantification du signal de Western blot de la figure 3.2.C a été faite sur le logiciel ImageJ.
3.7.9 Liste des anticorps utilisés
Cible Source
NIPBL Bethyl, #A301-779A (immunoprécipitation)
Pierce, #PIMA172534 (Western blot)
SMC1A Bethyl, #A300-055A
SMC3 Bethyl, #A300-060A
RAD21 Bethyl, #A300-080A
CDK9 Santa Cruz, #sc-484
TBP Abcam, #ab818
MED23 Bethyl, #A300-425A
MED1 Bethyl, #A300-793A
MED12 Bethyl, #A300-774A
MED14 Bethyl, #A301-044A
OCT4 Santa Cruz, #sc5279X
NANOG Bethyl, #A300-397A
ARN Pol II total (N20) Santa Cruz, #sc899X
ARN Pol II PSer5 Millipore, #041572
ARN Pol II PSer2 Millipore, #04-1571
TUBULINE Pierce, #PIMA516208
HISTONE H3 Abcam, #ab1791
3.7.10 Différenciation à l’acide rétinoïque
Pour induire la différenciation des mESCs, les cellules sont ensemencées à une confluence de 1x104 cellules/cm2 dans le milieu de croissance 2i + LIF décrit
précédemment. Le lendemain, le milieu de culture est changé pour un milieu favorisant la différentiation des cellules de composition identique au milieu de croissance mais où le LIF et les inhibiteurs de kinase sont remplacés par de l’acide rétinoïque (SIGMA, #R2625) à 1μM. Le milieu de différenciation est changé quotidiennement. Au bout de 5 jours, les cellules perdent la coloration de l’activité de la phosphatase alcaline. Ce protocole a été inspiré de deux publications653,654.
3.7.11 Coloration de l'activité de la phosphatase alcaline
Les cellules sont rincées au PBS, puis fixées au paraformaldéhyde 4% (VWR, #CAAA43368-9L) pendant 2 minutes. Après rinçage au PBS puis à l’eau, la solution de coloration préparée extemporanément (pour 10 ml de solution : 500μl de Tris 2M pH 9.2, 400 μl de Fast Red (SIGMA, #F8764) à 25mg/ml, 40μl de Naphthol (SIGMA, #N4875) à 50mg/ml et compléter avec de l’eau milliQ) est ajoutée et incubée pendant 10 à 20 min à l’abri de la lumière. Par la suite la solution de coloration est rincée à l’eau.