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Para se estudar as alterações ao nível celular recorreu-se à técnica de espetroscopia de FTIR (Fourier-transform infrared spectroscopy). Esta técnica baseia-se na interação entre radiação infravermelha e ligações covalentes das moléculas [Mignolet et al., 2016], sendo possível obter informação quantitativa através da intensidade das bandas, e, informação sobre a natureza das ligações, devido a especificidade do sinal obtido de macromoléculas biológicas como proteínas, lípidos, hidratos de carbono, ácidos nucleicos e compostos fosforilados [Mignolet et al., 2016]. No Quadro 4.9 estão resumidas as bandas características de espetroscopia de FTIR que foram estudadas neste caso, estando descrito o tipo de ligação e a frequência (cm-1_{) característica.}

Quadro 4.9 – Bandas características de macromoléculas biológicas por espetroscopia de FTIR: tipo de ligação e frequência. [Lasch, Boese, Pacifico, & Diem, 2002].

Nº de onda (cm.1

) Tipo de ligação

2923 νas (CH2) – Estiramento assimétrico do CH2.

2956 νas (CH3) – Estiramento assimétrico do CH3.

1733 νas (C=O) – Estiramento do éster, C=O, dos fosfolípidos.

1652 Amida I - Estiramento C=O da proteína amida I.

1540 Amida II - Deformação da ligação N-H da proteína amida II.

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Estudou-se células HeLa expostas, durante 48h, a extrato aquoso completo 0,1 mg/mL (concentração correspondente ao IC30) e comparou-se a um controlo exposto a meio de cultura sem extrato. Para se saber se as alterações visíveis nos espetros, entre os 4000-900 cm-1_{, poderiam derivar} da sobreposição do espetro das células com o espetro do extrato aquoso completo, analisou-se, nas mesmas condições, apenas o extrato aquoso completo. Os resultados obtidos encontram-se no gráfico representado na Figura 4.14, onde é possível observar que, apesar de haver algumas sobreposições, o espetro das células tem uma intensidade muito maior do que o espetro do extrato aquoso completo uma vez que, o espetro do extrato corresponde à quantidade de extrato aquoso completo presente em 2 mL de meio. Mesmo que a concentração de extrato dentro e fora das células iguale, o volume máximo da cultura de células é de 3,5 µL (altura 20 µm, diâmetro 14 mm), como tal, se a concentração de extrato dentro das células for igual ao exterior, a quantidade de extrato presente origina um espetro que será 0,002 vezes menor o qual não tem influência no espetro das células.

Figura 4.14 – Resultados de espetroscopia de FTIR do extrato aquoso completo e das células HeLa expostas ao extrato aquoso completo. 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 900 1400 1900 2400 2900 3400 3900 A bs or vên cia Nº de onda (cm-_¹)

47 Os resultados obtidos para as células expostas ao extrato aquoso completo e para as células controlo encontram-se na Figura 4.15.

Uma vez que os espetros (Figura 4.15) parecem bastante semelhantes realizou-se a análise de razões entre intensidades correspondentes a determinados tipos de macromoléculas biológicas, baseadas no Quadro 4.9, estando os resultados apresentados na Figura 4.16.

A razão νas(CH2)/ νas(CH3) permite perceber se existem alterações ao nível do tamanho da cadeia hidrocarbonada dos lípidos, uma vez que as bandas que surgem a 2922 cm-1 _{e 2955 cm}-1 _são caracterizadas, essencialmente, pelo estiramento assimétrico dos grupos CH2 e CH3, respetivamente,

Figura 4.16 – Comparação das razões νas (CH2) / νas (CH3), νas(C=O) ̸ Amida II, νas(C=O) ̸ νas(CH2) e νs(PO2-) /Amida II das células controlo com as células expostas a 0,1 mg/mL de extrato aquoso completo de A. adenophora. Os ensaios foram realizados em triplicado e para cada razão letras diferentes correspondem a diferenças significativas a um nível de confiança de 95 %.

-0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 900 1400 1900 2400 2900 3400 3900 A bso rv ên cia Nº de onda (cm-_¹)

Células expostas ao extrato Células controlo

Figura 4.15 – Resultados de espetroscopia de FTIR das células HeLa controlo (expostas ao meio de cultura) e das células HeLa expostas ao extrato aquoso completo 0,1 mg/mL.

A B A B A B A B 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3

νas (CH2) / νas (CH3) νas(C=O) ̸ Amida II νas(C=O) ̸ νas(CH2) νs(PO2-) /amida II Controlo [Extrato] IC₃₀

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presentes, essencialmente, nos lípidos. [Gasper et al.,2009]. Pelos resultados presentes na Figura 4.16, é possível observar que quando as células são expostas ao extrato aquoso completo ocorre uma diminuição das cadeias hidrocarbonadas.

A segunda razão estudada, νas(C=O) ̸ Amida II, relaciona o estiramento do éster carboxílico (C=O), o qual deriva essencialmente dos fosfolípidos da membrana plasmática [Lasch et al., 2002], com a quantidade de proteína presente na amida II. Uma vez que a quantidade de proteína é constante, não sofrendo qualquer tipo de alteração, é possível inferir com esta razão sobre o estado da membrana celular e analisar se a quantidade de fosfolípidos está a alterar. Pelo ensaio realizado (Figura 4.16) observa-se que, após a exposição ao extrato aquoso completo, o número de fosfolípidos aumenta. É possível que este aumento seja um efeito do processo de apoptose desencadeado pelo extrato. Este processo de morte celular baseia-se na resposta a sinais intra e extracelulares, sem haver rutura da membrana, o que resulta assim no aumento dos número de fosfolípidos de membrana [Zhang et al., 2008]. Este resultado vem de acordo com estudos prévios que também comprovaram que a A. adenophora tem efeitos citotóxicos sobre células renais de cabras Saanem, ao induzir a morte celular por apoptose [He et al., 2015].

A banda correspondente ao estiramento do éster carboxílico (C=O) também permite saber o número de grupos acil, indicando o número de lípidos que contêm o grupo éster, ao analisar-se em função do grupo CH2 dos lípidos. Assim, pela análise dos resultados para a razão νas(C=O) ̸ νas(CH2) (Figura 4.16), observa-se que relativamente ao controlo, a presença do extrato aquoso completo na concentração correspondente ao IC30 leva a um elevado aumento do número de grupos éster por CH2. Esta razão também reflete o tamanho dos lípidos, tendo em consideração que o número de CH2 por CH3 diminuí e, observando-se um aumento deste razão, conclui-se que as cadeias dos lípidos serão mais pequenas após a exposição ao extrato.

A ultima razão estudada foi a νs(PO2-)/ amida II, a qual permite analisar as alterações ao nível dos fosfatos. A banda que surge aos 1085 cm-1 _{é caracterizada pela vibração simétrica dos grupos} fosfodiéster, νs(PO2-). Estes grupos provêm principalmente dos ácidos nucleicos do DNA e RNA [Lasch et al., 2002]. Pela Figura 4.16 observa-se que na presença de extrato aquoso completo há uma diminuição dos fosfatos. Vários estudos comprovam que as células cancerígenas têm um maior número de grupos fosfato devido as alterações na estrutura do DNA [ Lee et al., 2009]. A diminuição dos fosfatos na presença do extrato é, possivelmente, consequência do processo de apoptose induzido pelo extrato, o qual desencadeia a condensação da cromatina e por isso existem menos fosfatos expostos. Estes resultados vão ao encontro do estudo já referido [He et al., 2015], onde, por outras metodologias, comprovou que A. adenophora induz a apoptose das células resultando na redução do tamanho das células, na condensação da cromatina e na fragmentação do DNA.