Etude de la régulation transcriptionnelle du gène POLH

4.1

Caractérisation du promoteur de POLH

Suivant la même stratégie que l’étude du promoteur de POLK, onze promoteurs tronqués en 5’ du gène POLH ont été clonés dans le vecteur d’expression pGL3 control (Promega), en amont du gène rapporteur de la luciférase Firefly. Tous les promoteurs tronqués ont pour extrémité 3’ le nucléotide en position +260 (le +1 correspondant au Site d’Initiation de la Transcription ou SIT). Chacune de ces constructions a été introduite par transfection transitoire dans des cellules RKO et MRC5-SV et l’activité promotrice de ces différents fragments est évaluée au travers de l’activité luciférase (Figure R3). L’étude de l’activité transcriptionnelle des différents fragments de délétion en 5’ de la région promotrice de POLH a été réalisée dans des cellules RKO (Figure R3A). Lorsque la région en amont du SIT (+1) est étendue du nucléotide en position –33 à celui en position -183, l’activité transcriptionnelle augmente, révélant la présence de séquences activatrices au sein de cette région. De plus, cette analyse met en évidence l’existence de séquences répressives entre les nucléotides en position –183 et -402, l’activité promotrice diminuant pour des fragments de délétion relatifs à cette région. Cette activité augmente à nouveau, bien que de manière moins nette, lorsque le nucléotide en position –504 est inclus dans l’analyse et diminue légèrement à nouveau lorsqu’on y rajoute des séquences plus en amont. Cela semble indiquer la présence de séquences activatrices entre les nucléotides -402 et –504 et des séquences répressives à partir du nucléotide –504. Ces mêmes résultats sont retrouvés lorsque l’analyse est réalisée dans des cellules MRC5-SV (Figure R3B), montrant que cette cartographie fonctionnelle du promoteur est indépendante du contexte cellulaire.

FIGURE R3. Représentation des différents fragments de délétion du promoteur du gène POLH et de leur activité promotrice dans les cellules MRC5-SV et RKO. Les cellules RKO et MRC-SV ont été transfectées de manière transitoire avec les constructions indiquées et leur activité luciférase est déterminée 24h après transfection. Les résultats sont exprimés en activité luciférase normalisée par rapport à l’efficacité de transfection grâce à la co-transfection d’un vecteur d’expression de la Renilla. Les moyennes et écart-types ont été calculés à partir de 3 expériences indépendantes.

Le promoteur du gène POLH, tout comme celui de POLK, comporte donc une région activatrice forte, proche du SIT (+1), s’étendant sur 200pb environ. L’effet de la présence d’éléments répresseurs de la transcription est toutefois important. En effet, l’activité transcriptionnelle du plus grand fragment du promoteur de POLH (de –1034 à +260) ne représente que 18% (dans les RKO) et 33% (dans les MRC5-SV) de celle issue du fragment de plus haute activité (+260 à -183).

4.2

Identification de séquences régulatrices de l’expression de

POLH

Ayant défini sur le promoteur de POLH des zones activatrices et inhibitrices de la transcription, il apparaît désormais intéressant d’identifier plus précisément quelles séquences confèrent ces effets sur l’expression.

Une recherche assistée par ordinateur grâce au logiciel MatInspector a révélé de nombreux sites putatifs de fixation pour des facteurs de transcription dans la région en

position –33 et deux sites de fixation de Sp1 en position –73 et –69. Le choix de ces sites présumés s’est basé sur leur localisation au niveau de régions promotrices fortement activatrices ou inhibitrices de la transcription, mais aussi sur leur forte homologie (supérieure à 80%) avec les sites consensus de fixation de ces facteurs.

Afin de déterminer si ces sites putatifs de fixation pour des facteurs de transcription sont nécessaires à l’expression basale du gène POLH, nous avons procédé à la mutation dirigée de chacun de ces sites potentiels sur le vecteur pGL3pPOLH-99. Afin d’obtenir une sensibilité maximale pour l’analyse quantitative, nous avons en effet choisi de modifier le segment de promoteur le plus court contenant les sites à étudier (Schéma des promoteurs,

Figure R4). Des cellules RKO sont transfectées transitoirement par les vecteurs pGL3

contenant les segments de promoteurs sauvages ou mutés sur ces sites présumés et leurs activités luciférase sont mesurées et comparées (Figure R4).

FIGURE R4. Caractérisation des sites consensus de fixation de facteurs de transcription sur le promoteur de POLH. Les représentations schématiques des différents promoteurs tronqués, sauvage et mutés sur un site consensus de fixation de facteurs de transcription, ainsi que leurs activités luciférases dans les cellules RKO sont représentées. L’activité de la construction sauvage est fixée à 100%. Les résultats sont exprimés en pourcentage moyen par rapport à l’activité du promoteur sauvage +/- écart-type. (n = 4). * signifie que p<0,05. Les sites potentiels de fixation de facteurs de transcription analysés sont représentés par différentes formes (légendes en bas). Les sites sauvages de fixation de facteurs de transcription sont représentés en blanc, les sites mutés en bleu.

La mutation du site CRE (position –33) ainsi que celle du site Sp1 (–73) ne modifie pas l’activité du promoteur de POLH tronqué en -99. En revanche, la mutation du site Sp1 (-69) diminue l’activité transcriptionnelle de pGL3pPolH-99 de manière significative

(p<0.02). Le site Sp1 (–69) semble être important pour l’activité promotrice basale du gène POLH humain.

4.3

Identification de facteurs de transcription régulant

l’expression de POLH

Les expériences de mutagenèse dirigée ayant montré que le site potentiel de fixation de Sp1 (en position -69) du promoteur de POLH semblait impliqué dans la transcription de ce gène, nous avons voulu vérifier que les facteurs de transcription Sp1 et Sp3, capables de reconnaître ce site, étaient responsables d’une activation de la transcription de POLH. La co-transfection d’un vecteur d’expression de Sp1 (pCMV-Sp1) avec la construction pGL3pPOLH-99 augmente en effet de 80% l’activité transcriptionnelle du promoteur, alors que celle d’un vecteur d’expression de Sp3 (pCMV-Sp3) ne la modifie pas (Figure R5A, expérience réalisée 2 fois). A l’inverse, la Mithramycine A (MTA), qui inhibe l’interaction des facteurs de transcription de la famille Sp avec des régions promotrices riches en GC, diminue l’activité du promoteur sauvage, mais ne semble pas avoir d’effet sur l’activité transcriptionnelle du promoteur muté sur le site Sp1(-69) (Figure R5B, expérience réalisée une fois).

FIGURE R5. Effet des facteurs de transcription Sp1 et Sp3 sur l’activité transcriptionnelle de POLH. (A) Effets de la surexpression de Sp1 ou Sp3 sur l’activité du promoteur de POLH sauvage tronqué en –99. Les cellules RKO sont co-transfectées avec la construction pGL3pPOLH-99, contenant le promoteur de POLH sauvage tronqué en –99, et un vecteur d’expression de Sp1, ou Sp3, ou un vecteur vide. Les résultats sont exprimés en pourcentage moyen par rapport à l’activité du promoteur dans des RKO co-transfectées avec le vecteur vide +/- écart-type (n=2). (B) Effet de la Mithramycine A (MTA) sur l’activité du promoteur de POLH tronqué en –99 sauvage ou muté sur le site consensus Sp1 en position –69. Des cellules RKO transfectées par la construction pGL3pPOLH-99 ou pGL3pPOLH-99DSp1(-69) sont incubées durant 12h en présence de 100nM de MTA. Les résultats sont exprimés en pourcentage par rapport à l’activité du promoteur tronqué sauvage dans les RKO traitées au DMSO (n=1).

Ces résultats, qui doivent être confirmés, suggèrent que le facteur de transcription Sp1, mais pas Sp3, active la transcription de POLH principalement par le biais du site Sp1 en position –69, mais l’implication d’autres sites Sp1 en amont de la position –99 n’est pas à exclure.