Conclusion et discussion

Ces travaux ont tout d’abord mis en évidence que Polθ était l’ADN polymérase la plus largement surexprimée dans les cancers du sein. Cette pathologie s’ajoute donc aux cancers colorectaux, du poumon et de l’estomac pour lesquels Polθ a été également

que Polθ soit surexprimée dans des tumeurs d’origines si variées, suggère que cette dérégulation n’est pas liée à un carcinogène particulier, spécifique d’un organe. Nous avons également montré que les dérégulations des différentes ADN polymérases TLS (Polν, Polμ, Polκ, Polλ et Polι) étaient significativement corrélées entre elles dans les tumeurs du sein. Cette dérégulation concomitante des ADN polymérases TLS, observée également dans les tumeurs colorectales (Pillaire, et al., soumis à Oncogene), suggère que la transcription de ces enzymes est régulée par des facteurs communs. De façon intéressante, la dérégulation de l’expression de Polθ dans ces tumeurs est indépendante des dérégulations des autres ADN polymérases, suggérant une régulation transcriptionnelle particulière de Polθ, différente des autres ADN polymérases, ce qui renforce l’idée de la singularité de Polθ.

Ces travaux ont également révélé Polθ comme facteur de mauvais pronostic des cancers du sein. En effet, sa surexpression dans les tumeurs du sein est associée à une faible survie des patientes. Le potentiel pronostique de Polθ avait déjà été suggéré dans les cancers colorectaux, mais pas de manière aussi significative. En effet, une première étude avait

c d

pronostique s

m

intéressante, nos résultats ont montré que, parmi les patientes présentant un envahissement important des ganglions lymphatiques, celles dont les tumeurs présentent également une forte expression de Polθ ont un pronostic de survie faible, alors que les e survie significativement meilleures. montré sur peu de cas une corrélation entre la surexpression de Polθ dans les tumeurs du

olon et la faible survie des patients (Kawamura et al., 2004). Cependant, une étude menée ans notre équipe n’a pas mis en évidence la seule surexpression de Polθ comme facteur de ces cancers. Toutefois, lorsque cette surexpression de Polθ est associée à la urexpression de trois gènes de l’initiation, cette association constitue un facteur de

auvais pronostic des cancers colorectaux (Pillaire, et al., soumis à Oncogene). De façon

autres patientes présentent des chances d

Actuellement, l’évaluation du risque de récidive des patientes atteintes de cancer du sein est essentiellement basée sur la classification TMN (Annexe 1), un haut pourcentage d’envahissement ganglionnaire (N+) étant considéré comme un facteur de mauvais pronostic. Nos résultats apportent ici un nouvel élément permettant de discerner deux

sous-populations aux survies différentes parmi ce groupe de patientes N+. L’évaluation de l’expression de Polθ chez ces patientes pourrait permettre d’affiner d’avantage le choix de la stratégie thérapeutique à adopter et d’éviter ainsi des traitements inutiles et toxiques.

Nos résultats indiquent que la surexpression de Polθ conduit à un ralentissement significatif de la vitesse des fourches de réplication. Il est possible que ce ralentissement soit compensé par l’activation d’origines dormantes. L’étude des distances inter-origines par peignage moléculaire de l’ADN perm

Afin d’étudier le rôle potentiel de la surexpression de Polθ comme moteur d’instabilité génétique, nous avons généré et validé des clones surexprimant de manière stable Polθ.

ettrait d’accéder à cette information. Cette étude est actuellement en cours, mais nécessite encore des mises au point techniques afin d’obtenir des fibres d’ADN suffisamment longues. La modification des paramètres de la réplication que nous observons, témoigne de l’apparition d’un stress réplicatif dans ces cellules. Ce défaut de progression des fourches ne semble pas activer la voie ATR du point de contrôle de phase S, puisque nous n’avons pas pu mettre en évidence d’activation de Chk1 dans ces cellules par Western-blot. Cependant, des données issues de systèmes modèles indiquent que le point de contrôle réplicatif n’est activé que si la quantité d’ADN simple brin recouvert de RPA atteint un niveau critique (Byun et al., 2005). Il est alors possible que le ralentissement des fourches causé par l’excès de Polθ puisse générer des régions d’ADN simple-brin non répliquées, mais à un taux insuffisant pour activer ce point de contrôle. Dans le cadre de notre étude, il serait intéressant de le vérifier en comparant le taux de protéines RPA associées à la chromatine dans les cellules surexprimant Polθ par rapport aux cellules contrôles. De même que pour Polθ, il a été montré que la surexpression de Polκ ou de Polβ perturbe la cinétique de réplication sans pour autant activer le point de contrôle de phase S. Il a alors été proposé qu’un seuil d’activation du point de contrôle réplicatif existe également dans les cellules humaines et permette ainsi de tolérer de faibles niveaux de stress réplicatif comme ceux induits par l’expression ectopique de ces ADN polymérases (Pillaire et al., 2007).

La contrepartie de cette tolérance est que la faible quantité de fourches de réplication bloquées ou ralenties générées par la surexpression de Polθ n’est pas détectée et peut alors dégénérer en CDBs d’ADN. Nos résultats montrent en effet un taux anormalement élevé e CDBs endogènes dans les cellules surexprimant Polθ et ceci en absence de tout traitement. Les sites fragiles étant des régions du génome qui se réarrangent préférentiellement sous l’effet d’un stress réplicatif, il serait alors intéressant d’évaluer l’impact de la perturbation de la réplication du à un excès de Polθ sur ces régions de l’ADN

Nous avons également mis en évidence, dans les clones surexprimant Polθ, une activation endogène de la kinase Chk2, témoignant de l’activation du point de contrôle de réponse aux dommages de l’ADN. De façon intéressante, ces foyers P Chk2 colocalisent pour la plupart avec les foyers γ-H2AX, mais également avec les foyers BrdU en conditions non dénaturantes, indiquant que le point de contrôle de réponse aux dommages de l’ADN s’active en partie au niveau de fourches de réplication ralenties ou bloquées. L’activation de Chk2 au niveau des fourches de réplication bloquées pourrait alors inhiber l’activation des origines de réplication tardives en entraînant la dégradation de Cdc25A, conduisant ainsi à l’accumulation en phase S des cellules surexprimant Polθ. La kinase Chk2 activée est également capable de phosphoryler Cdc25C, conduisant ainsi à l’arrêt du cycle cellulaire à la transition G2/M, tel qu’observé dans les cellules présentant le taux de surexpression de Polθ le plus élevé (clone Q3). Dans ces dernières, le taux de phosphorylation de H2AX est largement plus élevé que dans les cellules des deux autres clones (Q1 et Q2). De plus, ces cellules surexprimant le plus fortement Polθ affichent un taux de CDBs endogènes comparable à celui de cellules traitées aux UV à 10J.m . Ceci suggèrent que le taux de dommages plus important du clone Q3 peut générer une activation plus importante du point de contrôle en réponse à ces dommages et provoquer un blocage plus important du cycle cellulaire, en phase et S et en G2/M. Il semble donc y avoir une corrélation entre le taux de surexpression de Polθ et l’intensité des phénotypes observés dans les cellules. Afin de valider totalement cette corrélation, il serait nécessaire d

très fréquemment réarrangées dans les cancers et dont implication dans la progression tumorale semble de mieux en mieux établie (Durkin and Glover, 2007).

T68

de confirmer ces résultats sur un deuxième clone Q+ affichant un taux de surexpression de Polθ comparable à celui du clone Q3. Nous avons pour cela sélectionné de nouveaux clones Q+ et leur validation est en cours.

Nos résultats indiquent également que les cellules surexprimant Polθ sont le siège d’une instabilité chromosomique spontanée. Les anomalies chromosomiques recensées étant essentiellement des cassures de chromatides, des chromosomes dicentriques et des fusions d’extrémités, il est probable qu’elles soient la conséquence de l’augmentation des CDBs observée. S’ajoute également à ces anomalies observées des problèmes dans la condensation des chromosomes en mitose. Ces anomalies de condensation peuvent résulter de zones d’ADN non répliquées au moment de la mitose et ayant échappé au point de contrôle réplicatif (Chang et al., 2007). Ceci est en accord avec notre modèle proposant que le ralentissement des fourches de réplication du à la surexpression de Polθ laisse des courtes zones d’ADN non répliquées et non détectées par le point de contrôle réplicatif. De plus, Chang et ses collaborateurs ont mis en évidence que les cellules qui contiennent des chromosomes présentant un retard de réplication et un retard de condensation en mitose sont souvent le siège d’une amplification de leurs centrosomes conduisant à un assemblage anormal du fuseau mitotique et à une augmentation significative de l’instabilité chromosomique (Chang et al., 2007). De façon intéressante, dans les cellules surexprimant plus fortement Polθ (clone Q3), nos données préliminaires indiquent un taux plus élevé de mitoses anormales présentant une amplification des centrosomes. Ces cellules affichent aussi un blocage en G2/M, suite à la présence importante de CDBs de l’ADN. Or, il a été montré que l’arrêt des cellules en G2 fournit l’opportunité aux centrosomes déjà dupliqués de se dupliquer à nouveau, conduisant ainsi à une amplification des centrosomes. Cependant, cette amplification des centrosomes dans les cellules n’est possible que lorsque la voie dépendante de p53 conduisant au blocage en G2/M est compromise (Fukasawa, 2007), ce qui est le cas dans notre modèle cellulaire (MRC5-SV). Dans ce cas, les cellules n’effectuent pas correctement leur cytokinèse et deviennent polyploïdes. La plupart d’entre elles meurent généralement par apoptose, ce

Néanmoins, quelques cellules arrivent parfois à terminer leur cytokinèse et à survivre, devenant aneuploïdes (Fukasawa, 2007). Ces anomalies du nombre de centrosomes dans les cellules surexprimant fortement Polθ pourraient donc conduire à des erreurs de

L’hypothèse d’une perturbation directe de la réplication par l’excès de Polθ nous semble alors la plus probable. Elle pourrait s’effectuer selon deux mécanismes. Premièrement, Polθ en excès pourrait perturber l’homéostasie de la réplication par la titration de protéines essentielles de la fourche de réplication telles que PCNA, par exemple. Deuxièmement, Polθ qui synthétise de l’ADN moins efficacement que Polδ et Polε, pourraient ralentir les fourches de réplication en prenant la place des polymérases réplicatives au cours de l’élongation. En effet, notre équipe a montré lors de précédents travaux, que Polβ pouvait directement entrer en compétition avec les ADN polymérases réplicatives dans un essai in vitro de réplication SV40 (Servant et al., 2002). De plus, dans un autre laboratoire, Polκ a été surexprimée de façon transitoire dans des cellules murines ce qui a conduit à une augmentation de la fréquence de mutations dont la nature signe ségrégation des chromosomes et engendrer un niveau d’instabilité chromosomique supplémentaire. Cependant, les cellules MRC5-SV étant déjà aneuploïdes, il est impossible de vérifier cette hypothèse dans ce modèle cellulaire.

La source de l’ensemble des phénotypes observés semblant résider dans la perturbation de la réplication par l’excès de Polθ, nous nous sommes intéressés aux causes moléculaires pouvant conduire à un tel stress réplicatif.

Nous nous sommes tout d’abord penchés sur l’hypothèse d’une perturbation des mécanismes de réparation des lésions endogènes par la surexpression de Polθ, qui pourrait générer une perturbation indirecte de la réplication par les dommages non réparés persistant sur l’ADN. En effet, des données de la littérature indiquent que Polθ serait impliquée dans la REB, voie principale de réparation des dommages oxydatifs, comme protéine de secours lorsque l’activité de Polβ est déficiente (Yoshimura et al., 2006). Cependant, nos données ne révèlent aucun impact de la surexpression de Polθ sur cette voie de réparation, sans doute parce que Polθ y joue un rôle mineur et que l’étape de synthèse réparatrice n’est pas limitante.

l’intervention de Polκ pendant la réplication (Ogi et al., 1999). Afin de vérifier ces hypothèses, il serait intéressant d’étudier si, dans les cellules surexprimant Polθ, cette dernière est plus exprimée également dans des extraits « chromatiniens ». De plus, nous sommes actuellement en train d’étudier la mutagenèse spontanée dans les clones Q+ et les clones contrôles. Si Polθ en excès intervient dans la réplication de l’ADN en se substituant aux ADN polymérases réplicatives, sa nature très mutagène (Arana et al., 2008) conduira à

u’ils nous renseigneraient sur l’importance de l’activité de polymérisation de l’ADN dans la perturbation de la réplication qui a été observée. La protéine Polθ ayant pour particularité de contenir un domaine hélicase, il serait très intéressant de réaliser un mutant catalytique de ce domaine afin d’analyser l’importance de cette activité hélicase dans les phénotypes engendrés par la surexpression de Polθ que nous avons observés. Certes, l’activité hélicase de Polθ n’a encore jamais pu être mise en évidence in vitro, mais la séquence protéique de Polθ partage 40% d’identité avec l’hélicase humaine Hel308, pour laquelle l’activité hélicase a été démontrée et dont les séquences consensus correspondant aux sites catalytiques sont particulièrement conservées chez Polθ (Marini and Wood, 2002). L’activité ATPase de Polθ ayant été mise en évidence, l’abolition de cette activité par la mutation du site conservé de Walker A

Comme développé en introduction, deux études majeures ont souligné l’implication du stress réplicatif dans le processus de développement tumoral (Bartkova et al., 2005; Gorgoulis et al., 2005). En effet, il a été décrit que l’activation d’oncogènes peut conduire à une prolifération aberrante des cellules et à l’apparition d’un stress réplicatif. Ce dernier conduit à la formation de cassures double-brin qui activent les voies de réponse aux dommages de l’ADN bloquant ainsi la progression tumorale dès les stades précancéreux en induisant un état de sénescence réplicative. La formation continuelle de CDBs appliquant l’augmentation du taux de mutations dans ces cellules. De plus, l’utilisation de mutants catalytiques apporterait définitivement la preuve de l’interférence directe de Polθ au niveau des fourches de réplication, puisq

pourrait être envisagée en nous basant sur la séquence de Hel308, pour laquelle cette mutation a été validée biochimiquement (Marini and Wood, 2002).

tumorale, celle-ci peut être abolie par l’apparition de mutations dans les protéines impliquées dans ces voies de signalisation, permettant ainsi au cancer de se développer. De même que dans ce modèle de développement tumoral proposé par Bartek et Halazonetis, nos données indiquent que la surexpression de Polθ génère un stress réplicatif associé à la formation endogène de CDBs d’ADN et à l’activation du point de contrôle de réponse aux dommages de l’ADN. Il semble alors que la surexpression de Polθ engage les cellules dans une situation similaire à celle des tissus précancéreux et pourrait être envisagée comme un événement précoce du développement tumoral.

Au regard de l’ensemble des résultats obtenus, nous proposons qu

Outre un rôle dans l’initiation de la tumorigenèse, Polθ en excès semble également jouer un rôle moteur dans le développement tumoral, car il génère une instabilité chromosomique importante, composante souvent corrélée à l’agressivité des tumeurs. De même, nous avons mis en évidence que les patientes qui présentaient des tumeurs surexprimant le plus fortement Polθ avaient un pronostic de survie plus faible, souvent sous-tendu par un risque plus important d’apparition de métastases et donc témoignant d’une agressivité plus forte de ces tumeurs. De manière encore plus frappante, parmi les tumeurs avec envahissement ganglionnaire considérées comme agressives, seules celles affichant une surexpression de Polθ le sont réellement, car les patientes présentant des tumeurs N+ avec une faible expression de Polθ ont un pronostic vital significativement meilleur.

e la surexpression de Polθ puisse mimer des effets oncogéniques et être un événement précoce dans le développement des cancers du sein, en générant un stress réplicatif et en activant continuellement le point de contrôle de réponse aux dommages de l’ADN, générant une pression de sélection sur ce dernier. L’abolition de ce point de contrôle permettrait l’échappement de cellules tumorales ayant sélectionné des événements propices à leur développement. Nous proposons que la surexpression de Polθ soit un de ces événements sélectionnés, car en générant de l’instabilité génétique et chromosomique il semble conférer aux tumeurs une certaine agressivité (Figure R13).

FIGURE R13. Modèle du rôle de Polθ dans le développement tumoral des cancers du sein.

La surexpression de Polθ peut conduire à un stress réplicatif. Ce stress réplicatif conduit à la formation de progression tumorale dès les stades précancéreux en induisant un état de sénescence réplicative. La formation continuelle de CDBs dues à la surexpression de Polθ appliquant une forte pression de sélection sur les protéines qui constituent cette barrière anti-tumorale, celle-ci peut être abolie par l’apparition de mutations d

développer.

cassures double-brin de l’ADN qui activent les voies de réponse aux dommages de l’ADN bloquant ainsi la

ans les protéines impliquées dans ces voies de signalisation, permettant ainsi au cancer de se La surexpression de Polθ, en générant des CDBs de l’ADN entraine conjointement une

éveloppement tumoral de ces

instabilité génétique (anomalies chromosomiques) favorisant le développement tumoral et l’agressivité des tumeurs. Adapté de T. Halazonetis (Halazonetis et al., 2008).

Il serait très intéressant d’étudier l’expression de Polθ dans des tissus précancéreux afin de déterminer si cette ADN polymérase est réellement dérégulée dès les stades précoces et pourrait donc jouer un rôle dans l’initiation du processus tumoral.

Enfin, nous testons actuellement les conséquences in vivo d’un excès de Polθ, en termes d’initiation et de progression des cancers. Dans ce but, nous avons injecté des cellules du clone Q3 à des souris « nude » afin d’analyser la prise et le d

Ernesto Bockamp (Université de Mainz, Allemagne), nous développons des modèles animaux (souris) surexprimant Polθ dans tout l’organisme ou de manière ciblée dans certains tissus tels que la glande mammaire. Ces modèles animaux nous permettront de transposer nos observations obtenues in cellulo, à l’échelle d’un organisme entier.

En accord avec le modèle du phénotype mutateur, la dérégulation de l’expression de rotéines impliquées dans la réplication du génome est souvent associée à des phénomènes d’instabilité génétique et a été mise en évidence dans divers cancers. C’est le cas des ADN polymérases TLS, dont l’expression des transcrits est retrouvée dérégulée dans des tumeurs ’origines histologiques variées. Les travaux de cette thèse ont d’ailleurs mis en évidence ne sous-expression de Polκ, ADN polymérase TLS de la famille Y, dans des biopsies de meurs colorectales par rapport au tissu sain adjacent, ainsi qu’une surexpression de Polθ dans des tumeurs du sein en comparaison de tissus mammaires normaux. Cependant, les mécanismes de dérégulation des ADN polymérases TLS dans les tumeurs ne sont pas onnus. La connaissance de facteurs régulant l’expression des ADN polymérases pourrait tre utile à la fois à la compréhension des mécanismes cellulaires dans lesquels elles sont pliquées et à la détection de tumeurs présentant un fort risque d’instabilité. Nous avons alors caractérisé les promoteurs de POLH et POLK par une stratégie de mutants de

délétion en ux une région

activatr tion, précédée

d’une région contenant des éléments répresseurs. Nous avons étudié l’influence de facteurs épigénétiques sur leur régulation et montré que l’expression de POLK n’était pas régulée par l’état de méthylation de l’ADN, mais semblait être modulée par l’état d’acétylation des histones. Des expériences de mutagenèse dirigée sur les promoteurs de POLH et POLK ainsi que l’expression ectopique de facteurs de transcription putatifs, ont permis de mettre en lumière Sp1 comme un élément trans-activateur de l’expression de POLH, et Sp1, Sp3 et CREB comme des facteurs activateurs de l’expression de POLK.

Ces facteurs de transcription sont dérégulés dans certains cancers et la modification de l’expression des gènes sous leur contrôle est alors une conséquence de cette dérégulation antérieure. De façon très intéressante, nous montrons une corrélation entre la sous- expression de Polκ dans les tumeurs colorectales et la sous-expression des facteurs de transcription activateurs identifiés Sp1 et CREB dans ces mêmes tumeurs. Nous proposons