Conclusions du Chapitre 3

2.2.1. Arquitectura da parede

A parede celular é composta por diversos polissacáridos estruturalmente distintos, por proteínas, por compostos fenólicos e outros materiais que estão dispostos de forma complexa (Cosgrove, 1999). A parede celular vegetal dispõe-se por três tipos de camadas: a lamela média, a parede primária e a parede secundária (Gibeaut e Carpita, 1994). A primeira camada a ser formada aquando a divisão celular é a lamela média, que preenche os espaços entre as paredes primárias e as células adjacentes, sendo constituída principalmente por substâncias pécticas (Prade, 1999). Uma vez a lamela média formada, os hidratos de carbono começam a depositar-se em ambos os seus lados dando origem à parede primária, que é a mais externa das duas paredes. Os hidratos de carbono desta parede são sintetizados na superfície da membrana citoplasmática e são excretados para fora do plasmalema por exocitose. Possuindo características notáveis, a parede primária controla o crescimento da célula e forma a base estrutural da planta, pois combina propriedades aparentemente conflituantes, nomeadamente, resistência à tensão, elasticidade e estabilidade, mas também a plasticidade estrutural que é necessária para responder às condições do ambiente e às exigências de desenvolvimento da célula vegetal (Rose e Bennet, 1999).

De acordo com Cosgrove (1999) a parede celular primária possui duas fases: a fase constituída por microfibrilhas de celulose cristalina e a fase da matriz polissacárida, menos ordenada, contendo quantidades pequenas de proteína estrutural intercaladas (Figura 2.1). De acordo com Brett e Waldron (1996), a composição da matriz é heterogénea variando em diferentes partes da parede, em diferentes tipos celulares, em diferentes espécies e provavelmente em diferentes fases do ciclo celular. Num grupo numeroso de células a parede vegetal resume-se à lamela média e à parede primária. Contudo, outras células especializadas (vasculares, epidérmicas e de fibras lenhosas da madeira) desenvolvem uma parede celular secundária (Gibeaut e Carpita, 1994; Brett e Waldron, 1996), sendo que o seu aparecimento origina algumas modificações na lamela média e na parede primária, tais como a lenhificação.

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Caracteristicamente, a lenhificação começa na lamela média, espalha-se pela parede primária e finalmente estende-se à parede secundária (Heredia et al., 1995).

Figura 2.1: Estrutura da parede celular primária. Esquema simplificado da estrutura da parede celular evidenciando o arranjo e a forma como interactuam os seus componentes. As microfibrilhas de celulose são sintetizadas por complexos existentes na membrana plasmática, enquanto que a hemicelulose e as pectinas, que constituem a matriz de polissacáridos onde a celulose se encontra embebida, são sintetizadas no aparelho de Golgi e posteriormente depositadas na superfície da parede pelas vesículas. Para uma melhor clareza, a matriz de celulose e hemicelulose apresenta-se em destaque no lado direito da figura. O modelo pretende demonstrar as dificuldades encontradas pelos microrganismos para efectuarem a hidrólise da biomassa vegetal (Adaptado de Cosgrove, 2005).

2.2.2. Componentes da parede celular vegetal

No reino vegetal, a parede celular desempenha funções de suporte e de formato celular, apresentando uma estrutura rígida na qual as microfibrilhas de celulose são o elemento arquitectural principal e à volta das quais se encontra ligada, de forma entrelaçada, uma matriz complexa composta por hemiceluloses, pectinas, glicoproteínas e substâncias aromáticas com características cerosas (Ferreira e Fernandes, 1992). Na lamela média

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abundam fundamentalmente as pectinas, sendo muitas vezes designadas por cimento péptico, enquanto que na parede primária predominam as microfibrilhas de celulose e as hemiceluloses (e.g. xilanos, arabinoxilanos, arabinanos, galactanos, arabinogalactanos, galactoglucomananos, xiloglucanos, glucanos de ligações tipo β-1,3 e β-1,4). A parede secundária, desenvolvida apenas em alguns tipos de células, aparece logo após a parede primária, junto à superfície da célula (membrana plasmática), e contém, para além de celulose, lenhina, cutina e por vezes suberina (Brett e Waldron, 1996). Para além destes compostos, a matriz macromolecular da parede celular vegetal é ainda composta por proteínas (estruturais e enzimas), taninos (polifenóis) e calose (composto de cadeias de glucanos com ligações do tipo β-1,3 e β-1,4).

2.2.2.1. Celulose

A celulose constitui o material estrutural mais abundante em todas as plantas superiores terrestres, sendo formada por um composto linear de unidades de glucose unidas entre si por ligações glicosídicas β-1,4. A celulose pode ser representada pela fórmula geral (C6H10O5)n

em que cada unidade de glucose sofre uma rotação de 180º em relação à sua vizinha, conduzindo a que a unidade básica que se repete é, de facto, a celobiose (Figura 2.2) (Béguin e Aubert, 1994).

Figura 2.2. Estrutura molecular da celulose, em que uma unidade de celobiose se encontra destacada (na parte central da cadeia).

Várias moléculas de celulose alinham-se paralelamente estabelecendo entre si pontes de hidrogénio ao nível inter e intramolecular entre os grupos OH (Figura 2.3), formando as microfibrilhas de celulose (Heredia et al., 1995; Lynd et al., 2002). Por sua vez, a íntima associação de microfibrilhas de celulose dá origem a uma macrofibrilha, e estas, quando organizadas em grupo, formam a fibra de celulose (Figura 2.3). As fibras de celulose são constituídas por regiões cristalinas, que são impermeáveis à água e mais resistentes à degradação química e biológica, e por regiões em que o grau de cristalização é muito reduzido, que se denominam de não cristalinas ou amorfas. As fortes ligações não covalentes

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(pontes de hidrogénio), existentes entre as macromoléculas de celulose conferem-lhe propriedades únicas, nomeadamente uma forte coesão e estabilidade química, tornando-as por isso insolúveis nas regiões cristalinas (Heredia et al., 1995). Dependendo da fonte onde a celulose é obtida, as propriedades físicas tais como, o estado cristalino, o grau de cristalinidade e o peso molecular são altamente variáveis (Saxena e Brown, 2005). Na natureza, grande parte da celulose é produzida como celulose cristalina e é definida como celulose do tipo I, em que as cadeias de celulose se apresentam organizadas de forma paralela ao longo do eixo da microfibrilha, estabelecendo entre si pontes de hidrogénio. Apenas alguns microrganismos produzem naturalmente celulose cristalina do tipo II (cadeias organizadas de forma anti-paralela), sendo também produzida por mutantes do Acetobacter xylinum, uma bactéria que normalmente produz celulose do tipo I (Saxena e Brown, 2005).

No estado nativo, as fibras de celulose estão associadas a outros polissacáridos, nomeadamente hemiceluloses, pectinas e lenhina. A cristalinidade do material nativo e a sua associação com a lenhina são factores condicionadores de uma eficiente hidrólise enzimática (Coughlan, 1985).

Microfibrilha Parede celular vegetal

Pontes de Hidrogénio

Monômero de glucose

Cadeia β-1,4)-glucano (Celulose)

Microfibrilha Parede celular vegetal

Pontes de Hidrogénio

Monômero de glucose

Cadeia β-1,4)-glucano (Celulose)

Figura 2.3. Elementos que compõem a microfibrilha de celulose da parede celular vegetal. Adaptado de Hjemmeside (2006).

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- 14 - 2.2.2.2. Hemiceluloses

As hemiceluloses são heteropolissacáridos, incluindo glucanos, mananos, arabinanos e xilanos, constituindo o segundo grupo de polissacáridos renováveis mais abundantes na natureza.As hemiceluloses apresentam-se na forma de homopolímeros (e.g. xilano, em que a cadeia principal da molécula é formada por unidades de xilose) ou heteropolímeros (e.g. glucomanano, com a cadeia principal formada por unidades de glucose e manose), estando intimamente associadas à celulose na parede da célula vegetal. As unidades constitutivas das hemiceluloses compreendem: hexoses (manose, glucose e galactose), pentoses (xilose e arabinose), podendo ainda apresentar quantidades variáveis de ácido D-glucurónico, ácido D- 4-O-metilglucurónico, ácido D-galacturónico e ainda os grupos O-acetil ou ésteres de ácido ferúlico e p-cumárico ligados através de unidades de L-arabinose à cadeia principal (Puls e Poutanen, 1989; Saha, 2003). As hemiceluloses não aparecem de uma forma organizada como a celulose (formando estruturas cristalinas) mas, posicionam-se de uma forma paralela às microfibrilhas de celulose e ligam-se a estas por pontes de hidrogénio, originando uma intrincada e complexa malha de polissacáridos (Hayashi, 1989). Além disso, as hemiceluloses possuem a propriedade de serem solúveis em soluções básicas diluídas e usualmente inserem- se nos seguintes grupos: os xilanos, os mananos, os galactoglucomananos, os arabinanos, os galactanos e os xiloglucanos.

2.2.2.2.1. Xilano

O principal constituinte da hemicelulose descrito nos cereais e nas madeiras duras é o xilano (Coughlan e Hazlewood, 1993), que consiste num cadeia de unidades de D- xilopiranose unidas por ligações β-1,4 e possui uma estrutura ramificada, apresentando regularmente o C2 substituído por uma unidade de ácido α-4-O-metilglucurónico ou por α-L- arabinofuranose nas posições C2 ou C3 (Heredia et al., 1995). O ácido glucurónico e o éter 4- O-metil estão ligados à cadeia do xilano por ligações tipo α-1,2. Igualmente, é possível encontrar acetilação nas posições C2 e/ou C3 (Coughlan e Hazlewood, 1993), além de se encontrar, também, alguns componentes fenólicos, tais como os anéis aromáticos dos ácidos ferúlico e p-cumárico, a substituir o C5 nas cadeias de α-L-arabinofuranose (Singh et al., 2003). Os grupos acetil podem ligar-se aos grupos O-2 e O-3 das unidades de xilose constituintes da cadeia principal do xilano, mas o grau de acetilação difere grandemente entre xilanos de origens diferentes.

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Os xilanos com ligações β-1,3 estão presentes em algumas algas marinhas (Dekker e Richards, 1976), enquanto que os que possuem ligações β-1,3 e β-1,4 são característicos das algas vermelhas como a Rhodymenia palmata (Lahaye et al., 2003). Os xilanos com ligações β-1,4 existem na parede celular vegetal dos arbustos e das plantas herbáceas (Coughlan e Hazlewood, 1993). Os xilanos dos cereais contem grandes quantidades de L-arabinose e são referidos normalmente como arabinoxilanos, ao passo que os xilanos das madeiras duras são normalmente referidos como glucuronoxilanos, devido à grande quantidade de ácido D- glucurónico ligado à cadeia. Como consequência de todas estas características, os xilanos formam um grupo de polissacáridos muito heterogéneo.

2.2.2.2.2. Manano, glucomanano e galactomanano

Os mananos podem apresentar-se como uma estrutura linear de unidades de manose unidas entre si por ligações glicosídicas β-1,4, ou podem apresentar-se como uma estrutura heteropolímera com unidades de manose associada a unidades de glucose por ligações β-1,4, formando o glucomanano. Tanto a cadeia de manano puro com ligações β-1,4 como o glucomanano são frequentemente decorados por unidades de galactose unidas à cadeia principal por ligações α-1,6, assumindo assim a designação de galactomananos ou galactoglucomananos, respectivamente (Hogg et al., 2003). Aproximadamente 20 a 30 % dos resíduos da cadeia de glucose e de manose sofrem esterificação com grupos acetil no carbono C2 e C3 (Vries e Visser, 2001). Os galactomananos constituem a maior fracção das gimnospérmicas (madeiras macias) e representam, neste caso, 12 a 15 % da biomassa da parede celular vegetal (Vries e Visser, 2001). Embora sejam os polissacáridos de reserva mais característicos do endosperma de plantas pertencentes à família Leguminosae, podem também, estar presentes em sementes de espécies de outras famílias como a Compositae e a Concolvulaceae (Dea e Morrison, 1975). Os galactomananos são solúveis em água e formam soluções viscosas e estáveis (Vries e Visser, 2001). A razão manose:galactose e a distribuição das unidades de galactose ao longo da cadeia de manose variam, nos galactomananos, de espécie para espécie, sendo importante para estudos quimiotaxonómicos e evolutivos (Buckeridge et al., 1995).

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- 16 - 2.2.2.2.3. Xiloglucano

Os xiloglucanos encontram-se presentes nas paredes primárias de várias dicotiledóneas e em algumas monocotiledóneas. O xiloglucano consiste numa cadeia principal de moléculas de glucose semelhante à celulose. Porém, este hidrato de carbono encontra-se ramificado em vários pontos com moléculas de xilose por ligações do tipo α-1,6. Foram identificados dois grandes grupos de xiloglucanos na parede celular das plantas: os XXXG e XXGG (Gibeaut e Carpita, 1994). Os xiloglucanos tipo XXXG consistem numa cadeia do tipo β-1,4-D- glucopiranose, na qual três unidades de D-glucose estão decoradas por D-xilopiranose (xilose) por ligações do tipo α-1,6, separadas por uma unidade D-glucose não ramificada. Nos xiloglucanos tipo XXGG, duas unidades de D-xilose substituem duas unidades de D-glucose, seguindo-se duas unidades de D-glucose não ramificadas. As unidades de xilose no xiloglucano podem ainda ser ramificadas com os dissacáridos α-1,2-L-fucopiranose-β-1,2-D- galactopiranose e α-1,2-L-galactopiranose-β-1,2-D-galactopiranose. Por sua vez, a L- arabinofuranose pode ligar-se à cadeia principal de D-glucose ou aos grupos laterais de xilose por ligações α-1,2 (Fry, 1995). Estudos realizados por Hayashi et al. (1987) e Hayashi (1989) demonstraram que o xiloglucano não se liga apenas à superfície da microfibrilha, mas também se intercala fisicamente com ela durante a sua formação. Os xiloglucanos interagem com as microfibrilhas de celulose através da formação de pontes de hidrogénio, contribuindo assim para a integridade da estrutura da matriz da celulose (Gibeaut e Carpita, 1994).

2.2.2.2.4. Arabinogalactanos

Os galactanos são polímeros de unidades de galactopiranose, unidos por ligações β-1,4. Nas leguminosas, estes polímeros encontram-se decorados com cadeias laterais de arabinose constituindo os arabinogalactanos (Gibeaut e Carpita, 1994).

2.2.2.3. Substâncias pécticas

Este termo é utilizado de uma maneira geral, para nos referirmos a um grupo complexo de polissacáridos que surgem em menor abundância nas paredes celulares, e que contêm um elevado número de unidades de ácido galacturónico. Várias funções são atribuídas às pectinas, nomeadamente: determinação da porosidade da parede celular e controlo do trânsito de macromoléculas, adesão celular, hidratação através da formação de géis, plasticidade e

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flexibilidade da parede durante o crescimento e participação em mecanismos de defesa da planta ao ataque de organismos patogénicos (Jarvis, 1984). A característica dominante das pectinas resulta da existência de uma cadeia linear de unidades de ácido D-galacturónico no qual proporções variáveis de grupos ácidos (40 a 60%) estão presentes como ésteres metílicos (podendo também conter L-arabinose, D-galactose, L-ramnose, L-fucose, D-glucose e D- xilose) (Prade, 1999). As pectinas são os polissacáridos mais solúveis da parede celular, podendo ser isolados com água quente ou na presença de agentes quelantes de cálcio. A estrutura química da pectina está basicamente representada por dois tipos de polímeros: os galacturonanos, cujo cadeia principal é formado por resíduos de ácido galacturónico unidos entre si por ligações α-1,4 e os ramnogalacturonanos, formados por resíduos alternados de ácido galacturónico e ramnose. Entre os galacturonanos mais característicos encontram-se o homogalacturonano, o xilogalacturonano, o apiogalacturonano e o denominado ramnogalacturonano II. O homogalacturano é um polímero linear de unidades de ácido D- galacturónico com ligações α-1,4, podendo as unidades estarem acetiladas ou metiladas. Mas se o polímero se encontrar decorado com unidades D-xilose, passa a ter a designação de xilogalacturonano (Vries e Visser, 2001). O galacturonano denominado ramnogalacturonano II é um polímero de baixo peso molecular e a sua estrutura é altamente complexa. Embora o seu nome sugira uma estrutura similar ao do ramnogalacturonano I, que será descrito no próximo parágrafo, apresenta, na realidade, uma cadeia constituída por 7 a 12 resíduos de ácido galacturónico com ligações α-1,4, ramificada em quatro locais diferentes com oligossacáridos que se caracterizam por apresentar, além dos resíduos comuns de ramnose, galactose, fucose e arabinose, açúcares simples tais como: 2-O-metil-fucose, 2-O-metil-xilose, apiose, ácido 2-ceto-3-deoxi-D-manano-octulosónico (KDO), entre outros (Ridley et al., 2001).

O segundo grupo de polímeros constituintes da pectina corresponde aos ramnogalacturonanos, alguns dos quais contem muitas cadeias laterais, pelos quais esta região da pectina se denomina de “região pilosa” Um dos ramnogalacturonanos mais estudados é o ramnogalacturonano I (RGI), que é constituído por unidades repetidas do dissacárido[ (1
2)- α-L-ramnosil-(1
4)-α-D- ácido galactosilurónico]. Os resíduos do ácido galacturónico encontram-se geralmente acetilados. As ramificações do polímero ocorrem na sua maior parte no O-4 dos resíduos de ramnose com ligações do tipo α-1-4 e são formadas por resíduos ricos em açúcares neutros: arabinose, galactose e em quantidades menores fucopiranose (Willats et al., 2001).

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- 18 - 2.2.2.4. Outros constituintes

A lenhina é o terceiro maior componente da parede celular vegetal. É um composto polifenólico com uma estrutura complexa, constituída por unidades fenilpropanóicas, essencialmente dos álcoois p-hidroxinamílico, coniferílico e sinapílico (Minic e Jouanin, 2006). Durante o processo digestivo em animais, a lenhina protege a celulose e as hemiceluloses da hidrólise enzimática, pois é muito resistente à degradação biológica influenciando, assim, de forma adversa, as disponibilidades nutricionais dos compostos da parede celular vegetal de natureza glucídica a ela associados (Béguin e Aubert, 1994).

As ceras vegetais e as cutinas são outros dos compostos presentes na parede celular vegetal e possuem uma função predominantemente protectora, formando uma cutícula à superfície das folhas, frutos e sementes. São essencialmente ésteres de monoálcoois de elevado peso molecular com ácidos gordos saturados. A parede celular vegetal também apresenta diversos minerais dos quais se pode destacar a sílica (Ferreira e Fernandes, 1993).