Bilan de l’étude bibliographique

O potencial citotóxico das fibras PLGA-DNR foi avaliado in vitro por ensaios de viabilidade celular utilizando o método de metabolização do brometo de 3-(4,5-dimetiazol-2- il)-2,5(difeniltetrazol), MTT. A Figura 5.7 apresenta as porcentagens de viabilidade celular para a DNR livre e incorporada na matriz de PLGA em células tumorais A431 e em células normais de fibroblastos humanos. Uma vez que, o perfil de liberação in vitro para as fibras PLGA-DNR demonstrou que 70 % do fármaco é liberado em 48 horas, optou-se por avaliar a citotoxicidade do sistema neste mesmo período. Assim, ambas as células foram incubadas por 48 horas e expostas a diferentes concentrações de fármaco livre e de fibras contendo quantidade equivalente de fármaco.

Figura 5.7 - Porcentagem de viabilidade celular para as fibras de PLGA, PLGA-DNR, DNR livre PLGA puro: (a) células tumarais A431 e (b) células normais de fibroblastos humanos.

114 Analisando os resultados obtidos para as células tumorais A431, pode-se dizer que a citotoxidade da DNR livre e das fibras PLGA-DNR aumenta de uma maneira dose-dependente, demonstrando que a matriz polimérica não impede a liberação do fármaco. Comparando quantidades equivalentes de fármaco livre e incorporado nas fibras, tem-se que o sistema PLGA-DNR apresenta maior citotoxicidade em todas as concentrações avalidadas (diferença estatísticamente significativa). Este aumento de citotoxicidade da DNR incorporada em fibras de PLGA pode estar associado ao ambiente ácido gerado pela degradação do PLGA, com respectiva produção de ácido lático e glicólico.

Já é reportado na literatura que fármacos antitumorais fracamente básicos, tais como a DNR, tendem a concentrar-se em regiões mais ácidas, gerando um aumento da citotoxicidade dos mesmos [151]. Resultados semelhantes foram reportados por Jingyuan e colaboradores, (2011) nos quais foram demonstrados que nanofibras de PLA contendo partículas de ouro e DNR (PLA/Au + DNR) são capazes de facilitar a captação do fármaco por células tumorais, aumentando, assim, sua citotoxicidade [152]. Dessa forma, pode-se dizer que as fibras de PLGA-DNR produzidas demostram ser um sistema que atua de forma mais eficiente contra células A431 do que a DNR livre. Os resultados obtidos para os fibroblastos demonstram uma citotoxicidade similar para a DNR livre e para as fibras PLGA-DNR em todas as concentrações avaliadas.

Os possíveis efeitos inflamatórios dos tecidos fibrovasculares, bem como os efeitos anti-angiogênicos causados pelas fibras de PLGA-DNR foram avaliados in vivo após inserção das fibras em discos de poliéter-poliuretano e sequencial implantação em camundongos. Considerando, inicialmente os efeitos inflamatórios, foram monitorados dois marcadores de inflamação. O primeiro foi a N-acetil-β-D-glucosaminidase (NAG), a qual é utilizada para detectar o acúmulo e/ou ativação de macrófagos nos tecidos. O segundo marcador foi a mieloperoxidase (MPO) que é considerado um indicador do acúmulo e/ou ativação de neutrófilos. Tumores sólidos causam alterações nos tecido adjacentes, e alguns marcadores podem medir a resposta do organismo ao câncer. É importante mencionar que, diversas evidências conectam o processo inflamatório ao surgimento de doenças neoplásicas [153]. Assim, a determinação dos marcadores de inflamação constitui uma importante estratégia para a avaliação do desenvolvimento do processo canceroso.

A Figura 5.8 apresenta as atividades de MPO e de NAG para as fibras de PLGA, PLGA- DNR, bem como para a DNR livre e para o grupo controle (discos de poliéter-poliuretano). Pode-se perceber que após 7 dias de implantação a atividade de MPO para as fibras de PLGA- DNR, bem como para a DNR livre não foram estatisticamente diferentes quando comparadas

Capítulo 5: Resultados e Discussão

115 com o grupo controle. Estes resultados indicam que não houve recrutamento/ativação de neutrófilos e consequentemente resposta inflamatória aguda. As fibras de PLGA apresentaram a menor atividade de MPO entre todos os grupos avaliados, o que pode ser atribuído à sua alta biocompatibilidade.

Com relação à atividade de NAG para os mesmos grupos mencionados, pode-se dizer que não ocorreram mudanças significativas para as fibras de PLGA-DNR, PLGA e DNR livre quando comparadas ao grupo controle. Tal fato indica que todos os materiais não induziram o recrutamento/ativação de macrófagos e consequentemente resposta inflamatória crônica. Os resultados obtidos para as atividades de MOP e NAG indicam que os materiais avaliados são promissores para utilização como sistemas implantáveis para tratamento do câncer.

Figura 5.8 - Níveis de acumulação de neutrófilos e macrófagos para as fibras de PLGA-DNR, PLGA e DNR livre mensurados através de atividade de: (a) MPO e (b) NAG

Para avaliar os efeitos de neovascularização dos materiais implantados foi utilizado o método de quantificação de hemoglobina (Hb), bem como a avaliação dos níveis do fator de crescimento vascular endotelial (VEGF). A angiogênese é um processo fundamental e complexo no qual ocorre a formação de novos vasos sanguíneos a partir de outros já existentes. É reconhecida como elemento chave em diversos eventos fisiológicos e patológicos que envolvem neovascularização, como por exemplo, a embriogênese, cicatrização e crescimento tumoral. Assim, quanto maior for a vascularização, maior a quantidadede sangue no local e, por conseguinte maior a concentração de hemoglobina. O VEGF é um potente estimulador do crescimento de vasos, responsável pela indução da angiogênese em doenças como o câncer [154]. Assim, o monitoramento deste indicador é de fundamental importância e o desenvolvimento de inibidores específicos de VEGF tem proporcionado benefícios substanciais aos pacientes com câncer.

116 A Figura 5.9 apresenta os níveis de Hb e VEGF para as fibras de PLGA, PLGA-DNR, bem como para a DNR livre e para o grupo controle (discos de poliéter-poliuretano). Pode-se perceber que houve diminuição dos níveis de Hb e VEGF para todos os grupos quando comparados ao controle. Os níveis de Hb são uma medida indireta da formação de novos vasos. Como os mesmos foram reduzidos em relação ao grupo controle, pode-se dizer que houve redução na formação de vasos. Os níveis baixos de VEGF corroboram os resultados para os níveis de Hb, demonstrando que os materais não induzem a angiogênese.

Estes resultados podem estar associados às dimensões nanométricas das fibras, as quais resultam no aumento da área superficial e da razão de degradação/hidrólise do polímero. Assim, tem-se consequentemente o aumento da liberação de DNR devido a maior exposição ao meio. Dessa forma, pode-se demonstrar a propriedade anti-angiogênica das fibras de PLGA-DNR. Os resultados apresentados estão de acordo com estudos prévios reportados por Iwase e colaboradores e Lee e colaboradores, nos quais são relatados que a daunorubicina é capaz de suprimir a expressão de múltiplos fatores angiogênicos [155, 156].

Figura 5.9 - Níveis de acumulação: (a) Hb e (b) VEGF para as fibras de PLGA, PLGA-DNR e DNR livre.

CAPÍTULO