Este estudo foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da FCAV-Unesp (protocolo nº 024833/12).
2.2.1 Grupo experimental
Foram utilizadas 57 pacientes caninas fêmeas, adultas, de diferentes raças, e idades, acometidas por neoplasia mamária e atendidas no setor de Oncologia do Hospital Veterinário “Governador Laudo Natel” da FCAV/UNESP, Câmpus de Jaboticabal, SP, bem como ao Instituto Veterinário Dr. Daleck, Ribeirão Preto, SP. A partir destas, obteve-se 69 lesões mamárias. O diagnóstico do câncer de mama foi obtido através dos achados clínicos, citologia não aspirativa, ou por capilaridade e, sobretudo através da análise histopatológica da lesão, segundo a classificação de Cassali et al., (2011).
2.2.2 Avaliação do grupo experimental 2.2.2.1 Pacientes
As pacientes foram submetidas a exame físico e de imagem para, dessa forma, possibilitar o estadiamento da enfermidade. Em todas se realizou o hemograma completo, as provas bioquímicas séricas (creatinina e ALT), bem como as radiografias torácicas em três projeções no momento da avaliação clínica.
Os estágios da doença foram definidos através do sistema TNM (tumor, linfonodo e metástase), modificado por Lana et al., 2007, conforme preconizado pela Organização Mundial de Saúde (OMS).
2.2.2.2 Questionário
Um questionário foi elaborado para avaliar os fatores de risco e caracterizar o perfil epidemiológico das cadelas com neoplasias mamárias atendidas nos Hospital Veterinário Governador Laudo Natel e no Instituto Veterinário Dr. Daleck. (ANEXO 1).
2.2.2.3 Exame Citológico
As amostras celulares das neoplasias mamárias foram obtidas através da CAF. A formação tumoral foi estabilizada em uma das mãos e, com a outra, introduziu-se uma agulha de insulina (0,45 X 13 mm). As amostras celulares foram obtidas pela técnica não aspirativa ou por capilaridade, como movimentos de “vai- vem” e em formato de leque, em quatro ou cinco áreas da mesma formação tumoral. Com o auxílio de uma seringa de 10 mL, a amostra obtida foi depositada na extremidade de uma lâmina de microscopia. O “squash” foi feito com a ajuda de outra lâmina, por meio da compressão leve e do deslocamento das células para a extremidade oposta. A secagem do material ocorreu em temperatura ambiente e, após cinco minutos, a preparação foi corada com May Grunwald Giemsa (MMG).
As amostras foram interpretadas por um patologista clínico do Laboratório HEMATOVET, Jaboticabal, SP. Critérios citomorfológicos gerais e nucleares foram estabelecidos para a classificação de lesões neoplásicas malignas citados por Santana et al. (2009). Os gerais fundamentaram-se na presença de anisocitose, hipercelularidade, pleomorfismo e grau de coesão intercelular. Já os nucleares basearam-se no aumento da relação núcleo citoplasma, anisocariose, multinucleação, aumento das figuras de mitose, mitoses anormais, deformações nucleares, padrão de cromatina grosseira, macronucléolo, angulação e variação no tamanho do nucléolo. Acima de três critérios nucleares diagnosticava-se neoplasia maligna.
2.2.2.4 Exame histopatológico
As cadelas foram submetidas à exérese da neoplasia empregando a técnica de mastectomia unilateral. As pacientes que apresentavam comprometimento de ambas as cadeias mamárias foram submetidas a dois procedimentos cirúrgicos em diferentes tempos. Assim, para padronizar, o lado com maior número de mamas acometidas, bem como com tumores maiores e/ou ulcerados foram estabelecidos como critérios para selecionar a cadeia a ser removida no primeiro ato cirúrgico. Após a remoção, evitou-se a colheita dos fragmentos em regiões com presença de secreções e necrose do tecido glandular. Uma vez realizada a colheita, os fragmentos foram imediatamente fixados em formol tamponado a 10% por 24 a 48 horas. Após, houve a desidratação, o clareamento e a deposição dos tecidos neoplásicos em parafina para a confecção dos blocos. Os cortes histológicos foram corados com hematoxilina e eosina. A interpretação das amostras foi feita no Laboratório de Patologia do Hospital Veterinário “Governador Laudo Natel”, FCAV- UNESP, Câmpus de Jaboticabal, segundo a classificação de Cassali et al. (2011)
2.2.2.5 Análise estatística
A análise estatística foi realizada através da comparação entre os diagnósticos citológico e histopatológico das lesões mamárias em cadelas. O valor da citologia como um teste diagnóstico para a determinação de neoplasias mamárias foi realizado pela determinação da sensibilidade (S: probabilidade do teste dar positivo na presença de doença), da especificidade (E: probabilidade do teste dar negativo na ausência de doença), bem como dos valores preditivos positivo (VPP: proporção de verdadeiros positivos entre todos os indivíduos com teste positivo) e negativo (VPN: expressa a probabilidade de um paciente com teste negativo não ter a doença). A Tabela 1 mostra a relação entre os diagnósticos citológicos e histopatológicos dos tumores mamários e, a partir desta, a elaboração
das fórmulas para o cálculo da S, E, VPP, VPN. Considerou-se o diagnóstico histopatológico como o padrão ouro.
Tabela 1: Relação entre os diagnósticos citológicos e histopatológicos de tumores mamários de cadelas atendidas no setor de Oncologia Veterinária da FCAV/UNESP, Câmpus de Jaboticabal, e no Instituto Veterinário “Dr.Daleck”, no período de maio de 2011 a fevereiro de 2012.
Citologia Histopatologia Positiva Negativa Positiva a b Negativa c d Sensibilidade (= a/(a+c) Especificidade= d/(b+d)
Valor preditivo positvo= a/(a+b) Valor preditivo negativo= d/(c+d) Acurácia= (a+d)/(a+b+c+d)
Os diagnósticos provenientes dos exames citológicos podem concordar ou não com os exames histopatológicos. Assim, é possível obter resultados verdadeiros positivos e verdadeiros negativos (quando houve concordância entre os testes), bem como resultados falsos positivos e falsos negativos (quando não houve concordância entre os testes).
2.3 Resultados
Evidenciou-se que 24 animais do grupo experimental não possuía raça definida, seguida pelos pacientes das raças Poodles, Daschund, Cocker Spaniel, Boxer, Pinscher, Rottweiler, Bealge, Labrador, Pastor Alemão e Pastor Belga conforme identificados na Tabela 2.
Tabela 2: Incidência racial observada em cadelas com neoplasia mamária atendidas no setor de Oncologia Veterinária da FCAV/UNESP, Câmpus de Jaboticabal e no Instituto Veterinário “Dr.Daleck”, no período de maio de 2011 a fevereiro de 2012.
Raça Número de casos Porcentagem
SRD 24 42 % Poodle 13 22.9% Daschund 5 9% Cocker Spaniel 4 7% Boxer 3 5,3% Pinscher 2 3,5% Rottweiler 2 3,5% Beagle 1 1,7% Labrador 1 1,7% Pastor Alemão 1 1,7% Pastor Belga 1 1,7% Total 57 100%
A faixa etária compreendeu idades entre quatro a dezoito anos (média 11,07 anos). As pacientes idosas (acima de 7 anos) foram as mais acometidas, totalizando 54 casos. A Figura 1 mostra a relação dos casos de neoplasia mamária com a idade do diagnóstico.
0 2 4 6 8 10 12
Figura 1: Relação do número de casos de neoplasia mamária com a idade diagnosticada no setor de Oncologia Veterinária da FCAV/UNESP, Câmpus de Jaboticabal, e no Instituto Veterinário “Dr.Daleck”, no período de maio de 2011 a fevereiro de 2012.
Quanto ao estado reprodutivo, 16 (28%) pacientes eram castradas e 41 (72%) não eram esterilizadas até o momento do diagnóstico físico e citológico das neoplasias mamárias. Destas, seis (10,5%) foram submetidas à aplicação de progestágenos. A administração de anticoncepcionais não foi realizada em 46 (80,7%) cadelas e, em cinco (8,8%), os proprietários não souberam informar sobre o uso dessas medicações. Além disso, a falsa gravidez com galactorréia foi observada em 27 (47,4%) cadelas. Essa alteração não foi apresentada por 25 (43,8%) pacientes e, também em cinco (8,8%), os proprietários não souberam referir a ocorrência.
O tempo de evolução tumoral, compreendido desde o surgimento da neoplasia até o momento do diagnóstico, abrangeu um intervalo entre 15 a 2555 dias (média 265,72 dias).
1 2 18 8 17 16 15 14 8 13 8 10 8 118 128 9 8 7 6 5 4 3 Idade (anos) N º de caso s
A cadeia mamária direita apresentou maior ocorrência de lesões neoplásicas, com 40 (58%) tumores, assim como as mamas abdominais caudais (25 tumores - (36,2%) e inguinais (27- 39,1%), A tabela 3 documenta a localização dos neoplasmas em relação à cadeia e à glândula envolvida. Foi evidenciado, ainda, o acometimento de 1 (1,5%) mama torácica cranial, 8 (11,6%) torácicas caudais e 8 (11,6%) abdominais craniais (Figura 2).
Tabela 3: Localização das neoplasias mamárias quanto à cadeia e à glândula envolvida, em cadelas atendidas na FCAV/UNESP, Câmpus de Jaboticabal, e no Instituto Veterinário “Dr.Daleck”, no período de maio de 2011 a fevereiro de 2012. Cadeia Glândula Mamária (M) M1 M2 M3 M4 M5 Direita 0 5 6 17 12 Esquerda 1 3 2 8 15
M1: mama torácica cranial; M2: mama torácica caudal; M3: mama abdominal cranial; M4: mama abdominal caudal; M5: mama inguinal.
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 M1 M2 M3 M4 M5 Direita Esquerda
Figura 2: Relação entre as mamas acometidas e o lado da cadeia mamária em cadelas atendidas na FCAV/UNESP, Câmpus de Jaboticabal, e no Instituto Veterinário “Dr.Daleck”, no período de maio de 2011 a fevereiro de 2012. Glândula Mamária Fr equ ênci a
A realização do exame histopatológico proporcionou o resultado de 62 (90%) neoplasias malignas, 6 (9%) benignas e 1 (1%) hiperplasia da glândula mamária. A incidência de cada subtipo histológico está na Tabela 4.
Tabela 4: Incidência dos tipos histológicos das lesões mamárias em cadelas diagnosticadas na FCAV/UNESP, Câmpus de Jaboticabal, e no Instituto Veterinário “Dr.Daleck”, no período de maio de 2011 a fevereiro de 2012.
Subtipo Histológico Nº de casos Porcentagem Lesões não neoplásicas
Hiperplasia epitelial ductal
1 1,6%
Tumores Benignos
Adenoma 1 1,6%
Tumor misto benigno 4 6,0%
Condroma 1 1,6%
Tumores Malignos
Carcinoma in situ 3 4,4%
Carcinoma ductal in situ 1 1,6%
Carcinoma em tumor misto 14 20,3% Carcinoma complexo 8 11,6% Carcinoma papilar 5 7,3% Carcinoma tubular 14 20,3% Carcinoma sólido 6 8,7% Especiais Carcinoma micropapilar 1 1,6% Carcinoma mucinoso 3 4,4% Carcinoma rico em lipídios 1 1,6% Sarcomas Sarcoma indiferenciado 2 3,0% Carcinossarcoma 3 4,4% Total 69 100%
O diagnóstico da CAF coincidiu com a histopatologia em 53 casos. Os resultados verdadeiro-positivos e verdadeiro-negativos, bem como os falso-positivos e falso-negativos foram registrados na Tabela 5. Seis amostras (8,7%) citológicas foram inadequadas e excluídas da análise estatística. Os resultados falso-negativos ocorreram em 10 casos.
Tabela 5: Relação entre os diagnósticos citológicos e histopatológicos para a determinação de neoplasias mamárias em cadelas atendidas na FCAV/UNESP, Câmpus de Jaboticabal, e no Instituto Veterinário “Dr.Daleck”, no período de maio de 2011 a fevereiro de 2012.
Citologia
Histopatologia
Positiva Negativa Total
Positiva 52 0 52
Negativa 10 1 11
Total 62 1 63
Os diagnósticos da CAF estão listados na Tabela 6 e a frequência dos resultados na Figura 3. A Figura 4 caracteriza as características citomorfológicas de um carcinoma mamário de cadela. A Figura 5 mostra o padrão de esfoliação das células neoplásicas epiteliais de um carcinoma mamário de cadela.
Nesse contexto, detectou-se 83,9% de sensibilidade (S), 100% de especificidade (E), 100% de valor preditivo positivo (VPP), 9,1 % de valor preditivo negativo (VPN) e 84,1% de acurácia da técnica citológica em detectar processos neoplásicos malignos nas mamas de cadelas. A análise estatística pelo teste exato de Fisher não mostrou diferença estatística entre a citologia e a histopatologia (p= 0,841), ou seja há concordância entre os diagnósticos citológico e histopatológico.
Tabela 6: Diagnósticos dos exames citológicos das lesões mamárias de cadelas atendidas na FCAV/UNESP, Câmpus de Jaboticabal, e no Instituto Veterinário “Dr.Daleck”, no período de maio de 2011 a fevereiro de 2012.
Diagnóstico Nº de casos Porcentagem
Carcinoma 30 43,5% Neoplasia* 22 31,9% Inflamação 8 11,6% Cisto 3 4,3% Inconclusiva 6 8,7% Total 69 100%
(*) Amostras com critérios de malignidade, os quais indicavam processo neoplásico em curso, mas que não apresentavam as características típicas dos carcinomas ou sarcomas mamários.
0% 5% 10% 15% 20% 25% 30% 35% 40% 45% Frequência Carcinoma Neoplasia Inflamação Cisto Inconclusiva
Figura 3: Frequência do diagnóstico citológico das lesões mamárias de cadelas atendidas na FCAV/UNESP, Câmpus de Jaboticabal, e no Instituto Veterinário “Dr.Daleck”, no período de maio de 2011 a fevereiro de 2012.
Figura 4: Fotomicrografia de células epiteliais de um carcinoma mamário canino (objetiva 40x). Observa-se relação núcleo (seta laranja)-citoplasma (seta verde) alta, macro e multi nucléolos (seta vermelha), anisocariose (seta laranja), cromatina densa (seta preta) e baixa coesão entre as células neoplásicas.
Figura 5: Fotomicrografia de um carcinoma mamário canino (objetiva 20x). Nota-se a presença de clusters (blocos) de células epiteliais neoplásicas coesas (seta preta).
2.4 Discussão
A neoplasia mamária é a afecção oncológica que mais acomete as cadelas (ALL-DISSI et al., 2010). No Brasil, a taxa de incidência varia entre 46,2% a 51,3% (RIBAS et al. 2012; DE NARDI et al., 2002). E, provavelmente, em virtude do tempo de evolução tumoral prolongado observado nessas pacientes, as formas malignas somam 70% a 90% (OLIVEIRA FILHO et al., 2010; VARALLO et al., 2012; FELICIANO et al. 2012). Os achados do presente estudo corroboram as estatísticas nacionais. Os tumores malignos representaram 90% das neoplasias diagnosticadas. Além disso, em relação à progressão tumoral, a média observada foi 265,72 dias, o que compreendeu um intervalo entre 15 a 2555 dias. Sorenmo et al. (2009) relataram que as neoplasias mamárias malignas podem surgir a partir de lesões neoplásicas benignas pré-existentes. Assim, esse fato pode explicar a alta incidência das neoplasias mamárias malignas nas cadelas.
Pacientes acima de sete anos (91,5%), não castradas (72%) e sem raça definida (42%) caracterizaram o perfil do grupo experimental no estudo. Os levantamentos epidemiológicos brasileiros constatam tais achados ao caracterizarem que as fêmeas geriátricas, com raça indeterminada e não castradas, ou castradas tardiamente, são as mais suscetíveis para o desenvolvimento da doença (VARALLO et al., 2012; FELICIANO et al., 2012; DE NARDI et al., 2009 OLIVEIRA FILHO et al., 2010).
Constatou-se ainda que as mamas abdominais caudais e as inguinais foram as mais acometidas respectivamente com 27 (39,1%) e 25 (36,2%) neoplasias. Este resultado pode ser explicado pelo fato destas glândulas apresentarem maior quantidade de pararênquima o que favorece o surgimento de tumores (LANA; RUTTEMAN; WITHROW, 2007).
A citologia com agulha fina (CAF) é um método diagnóstico considerado barato, rápido, pouco invasivo, pouco traumático e bem tolerado pelas pacientes (NASSAR, 2010). Além disso, a morbidez é muito baixa, cerca de 0,003-0,009% (ROCHA, 1998). Também é uma alternativa eficaz para a triagem de pacientes, para
a avaliação da recorrência de tumores e para a detecção de metástases em linfonodos (MASSOD, 2005).
Na literatura veterinária há poucos relatos que avaliam a acurácia da CAAF no diagnóstico de neoplasias de mamas em cadelas (CASSALI et al. 2007; SONTAS et al., 2012). Na medicina, várias pesquisas atestaram o procedimento como um exame preciso e confiável, notadamente em neoformações mamárias pequenas (SMITH et al, 2012). Todavia, no que se concerne à técnica por capilaridade com agulha de insulina não existe relato na literatura médica.
No presente estudo, foram detectados 83,9% de sensibilidade, 100% de especificidade e 84,1% de acurácia da técnica citológica por capilaridade com agulha de insulina em acertar o diagnóstico. Em 78% (55/69) dos tumores estudados houve concordância nos diagnósticos citológicos e histopatológicos. Trabalhos nessa área, com a técnica aspirativa, mostram que a citologia é uma ferramenta precisa e segura para a identificação das neoplasias mamárias em cadelas (ZUCCARI; SANTANA; ROCHA, 2001; HATAKA, 2004; CASSALI et al., 2007, SIMON et al., 2009, SONTAS et al., 2012). Em relação à interpretação da histogênese da neoplasia mamária, não se determinou o subtipo e a graduação do tumor pelo exame citológico, pois a variedade histológica, até mesmo em partes diferentes do mesmo nódulo, inviabiliza tal diagnóstico, uma vez que se avalia a morfologia celular e não a arquitetura tecidual.
Os resultados falso-negativos, neste experimento foram diagnosticados como processos inflamatórios e císticos. As dificuldades de interpretação dos exames citológicos nas neoplasias mamárias, em mulheres, frequentemente, são maiores que em outros tecidos, pois a mama é um órgão responsivo a hormônios, as lesões benignas de baixo grau apresentam atipias celulares tênues e sutis, além da possibilidade da variação histológica no mesmo tumor (ORELL; MILIAUSKAS, 2005). Tais dificuldades de interpretação também podem ser atribuídas para as cadelas, visto que é possível determinar a influência hormonal em eventos fisiológicos (puberdade, gestação e lactação) e patológicos (falsa gravidez, tumores); neoplasias benignas com baixos critérios de atipias celular, a ampla variedade de subtipos histológicos e um mesmo nódulo com áreas histológicas diferentes (POLTON, 2009; CASSALI et al., 2011; SORENMO et al., 2011).
A baixa taxa de amostras inconclusivas aqui obtidas (8,7%) difere dos trabalhos citados na literatura veterinária (14% a 26%). A escolha apropriada da agulha usada para o procedimento interfere na qualidade dos espécimes (SANTANA et al., 2009). Observou-se, nesse ensaio, que as agulhas muito calibrosas (25X7, 25X8), possibilitavam maior quantidade de material, mas, também aumentavam a contaminação com sangue. Além disso, no momento da deposição da amostra colhida para a lâmina de microscopia, a gota ficava grande e dificultava a confecção do esfregaço, o qual ficava espesso. Outra complicação enfrentada foi, muitas vezes, a falta de controle para a transferência do material da agulha para a lâmina. Pequenos coágulos, tumores com alta capacidade esfoliativa obstruíam parcialmente o lúmen dessas agulhas e, assim, a aplicação de uma pressão maior era necessária para a eliminação do conteúdo, o qual, então, era despejado de forma abrupta. Em algumas situações, ocorria a perda material, ou os esfregaços ficavam de péssima qualidade. Dessa forma, a agulha de insulina (13X4,5) mostrou- se a mais apropriada para o procedimento da CAF nesse ensaio. Além de reduzir a diluição das amostras com sangue, favoreceu a expulsão destas com mais delicadeza, preservando, assim, a integridade celular. Ainda, ao proporcionar esse controle, foi possível gerar gotas de tamanhos apropriados para a confecção do esfregaço considerado ideal para a leitura. Além disso, associado com o uso adequado do calibre da agulha, a técnica não aspirativa também contribuiu para o baixo índice de diagnósticos inconclusivos, visto que ao se eliminar a pressão negativa exercida para aspirar as células do tecido, houve redução do risco da ruptura de vasos sanguíneos, o qual é comum acontecer se a força da pressão for grande e o tempo de aplicação prolongado (MEINKOTH et al., 2009).
Ademais, não foram observadas complicações relacionadas à CAF em nenhuma paciente. Em alguns casos houve discreta hemorragia no local da punção, facilmente contida com pressão digital, e formação de hematomas. Rocha et al. (1998) descreveu as mesmas situações e, salientou, ainda, que o procedimento provoca muito baixa ou nenhuma morbidez (0,003-0,009%). Dessa forma, trata-se de um exame seguro para a paciente e preciso para o diagnóstico de neoplasias malignas da glândula mamária de cadelas.
Isso é comprovado pelos valores de S, E, VPP e VPN obtidos no referido estudo. A citologia por capilaridade com agulha de insulina foi uma ferramenta diagnóstica precisa para o diagnóstico de processos neoplásicos malignos provenientes das mamas de cadelas. Todavia, não deve ser usada como método único, visto que, no presente ensaio, o procedimento não foi hábil em classificar as lesões conforme os subtipos histológicos classificados por Cassali et al. (2011).
2.5 Conclusão
Conclui-se que a citologia por capilaridade com agulha de insulina (26 G) é um método preciso, rápido, seguro e barato para o diagnóstico dos tumores mamários malignos em cadelas. Ainda, mostrou ser uma técnica superior à padrão, ou seja, a aspirativa com agulhas entre calibres de 22 a 25 G, fato comprovado pela menor frequência de laudos inconclusivos observados. Sobretudo, constatou-se que tal procedimento não apresenta limitações para a aplicação no universo estudado, uma vez que foi possível a obtenção de amostras citológicas em todas as pacientes e em todos os tumores. Portanto, é uma ferramenta diagnóstica precisa e segura. Mas, o diagnóstico histopatológico é fundamental para a caracterização e graduação da neoplasia de mama.
2.6 Referências bibliográficas
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