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TUAMOTU)

2. PROTOCOLE PROPOSE

Suivent ici la description détaillée du protocole de test insecticide mis au point ainsi que les justifications des options adoptées.

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L'espèce de Copépode utilisée ici est Mesocyclops aspericomis Daday, 1906, qui fait par ailleurs l'objet dans le présent travail d'études concernant sa biologie et son application à la lutte biologique en tant que prédateur de larves de premier stade des moustiques du genreAedes. Les femelles adultes ont été retenues pour la réalisation des tests compte tenu d'une part de leur taille relativement importante (1,5 mm environ), qui les rend plus aisées à déterminer et à compter que les mâles ou les stades immatures, et d'autre part de leur importance stratégique dans la dynamique de la transmission de la maladie. Les travaux de MULLER (1970) et de BIRCHER et RUBER (1988), respectivement avec Cyclops vemalis etApocyclops spartinus ont montré de plus que les stades âgés sont les moins sensibles à divers insecticides. Le fait de tuer les stades âgés assure donc l'élimination des stades jeunes. Les insecticides utilisés ont été fournis par l'O.M.S. sous forme de kits destinés aux tests de sensibilité des larves de Culicides.

2.1 Elevage deMesocyclops aspericomis

L'élevage de Mesocyclops aspericomis est réalisé dans des aquariums d'une contenance d'environ 20 litres, contenant des objets ou des végétaux susceptibles de fournir le maximum d'abris et de surfaces de repos (les adultes du Copépode sont benthiques). Pour ce qui nous concerne, l'alimentation des jeunes stades du Copépode est constituée de protozoaires, eux même sustentés par l'enrichissement du milieu en poudre de foie (2 g/l). la nutrition des adultes est assurée par un apport bi- hebdomadaire d'oeufs de moustiques du genreAedes.

2.2 Mise au point du protocole

La mise au point du protocole a été effectuée de manière essentiellement empirique, les techniques utilisées relevant de l'expérience courante de la manipulation du Copépode. Les principes de base retenus pour la mise au point des tests reposent sur les recommandations de L'O.M.S. pour la réalisation des tests de larvicides utilisés contre les Culicides.

2.3 Protocole

2.3.1. Collecte des Copépodes

La collecte des Copépodes nécessaires à la mise en oeuvre du test est effectuée à l'aide d'un filet de nylon de type Blutex à mailles de 300 micromètres d'ouverture. Ce filet est réalisé à l'aide d'une toile Blutex montée sur un récipient en plastique d'un volume d'environ un litre dont le couvercle a été percé et le fond découpé (figure 1 chapitre 3). La toile est posée sur l'ouverture du récipient, et le couvercle est vissé par dessus la toile. Lacollecte doit permettre de recueillir au moins 600 femelles adultes de

Copépodes afin d'assurer une densité suffisante dans le récipient de prélèvement. Pour éviter en partie la collecte d'autres espèces susceptibles d'être présentes dans le milieu (larves de libellules, notonectes par exemple) il est possible de filtrer l'eau au préalable à l'aide d'un tamis de nylon ou métallique de maille approchant 2 mm. Les Copépodes collectés sont stockés dans un bol (plastique ou métal émaillé), de couleur blanche ou noire suivant une densité de l'ordre de 15 femelles adultes par millilitre.

2.3.2. Dilution de l'insecticide

L'insecticide est dilué directement dans des boîtes en plastique d'une contenance d'environ 150mlde type "boîte àcoproculture" couramment utilisé dans les laboratoires d'analyses médicales. Les boîtes utilisées sont complétées tout d'abord de 100 ml d'eau du gîte (filtrée avec une maille inférieure à 100 micromètres, ou décantée), ou d'eau d'une autre provenance selon le but du test, puis 0,4 mld'insecticide de type O.M.S. sont ajoutés par boîte pour obtenir la concentration désirée. Le témoin est réalisé à partir de la même eau complétée de 0,4 ml d'éthanol absolu, ou du solvant de l'insecticide si celui-ci n'est pas l'alcool. Les dilutions intermédiaires éventuellement nécessaires pour la détermination de la dose létale à 50%par exemple sont effectuées en fractionnant la dose initiale d'insecticide et en la complétant d'éthanol absolu ou d'un autre solvant si nécessaire pour obtenir un volume de 0,4 ml.

2.3.3. Distribution des Copépodes dans les récipients d'épreuve

Les Copépodes sont prélevés dans le bol de stockage à l'aide d'une pipette Pasteur fixée sur une poire en caoutchouc du type de celles qui sont fournies pour les tests insecticides par l'O.M.S.. L'extrémité la plus grosse de la pipette pasteur est utilisée, compte tenu de la taille et de la mobilité des Copépodes, l'extrémité fine étant cassée ou coupée pour permettre son introduction dans la poire en caoutchouc. Les prélèvements sont effectués promptement sur les bords du bol et non au fond pour éviter l'introduction de spécimens morts dans les boîtes de test. Ce problème est notamment rencontré par MULLER (1970) et KAMAL et al. (1988) qui trient les spécimens blessés ou morts avant la distribution dans les récipients d'expérience à l'aide d'une loupe binoculaire. Cette possibilité justifie l'utilisation d'un bol et non d'un plateau par exemple. L'efficacité de cette technique est confirmée par la quasi absence d'individus morts dans les récipients témoins. L'utilisation d'un bol opaque de couleur blanche ou noire est motivée par la coloration des Copépodes (beige-orangée) qui ressort particulièrement sur ces teintes.

Les Copépodes ne sont pas dénombrés avant le test, la valeur de 3 pipettes environ est transférée dans chaque boîte, en essayant d'effectuer des prélèvements les plus standardisés possible. Les essais effectués montrent une très faible dispersion du

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nombre de Copépodes prélevés en utilisant cette technique (tableau 1). De plus, l'utilisation de cette technique autorise un travail beaucoup plus aisé, les Copépodes étant très mobiles et de taille réduite sont comptés beaucoup plus facilement une fois morts et donc immobiles. Le problème du comptage des individus vivant est soulevé par MANONMANI et al. (1989) qui proposent un protocole standard de test vis à vis de Mesocyclops.

Tableau 1: exemples de série de prélèvements à l'aide d'une pipette dans un bol contenant des femelles de M aspericomis en forte densité.

essaI 1 2 3 4

52 95 147 33

nombres 76 56 132 25

d'individus 62 91 153 25

par 56 69 125 30

récipient 56 71 127 30

d'expérience 71 53 124 24

moyenne 62,17 72,50 134,67 27,83

vanance 89,77 303,10 152,27 13,37

2.3.4. Incubation

La mise en présence des Copépodes avec l'insecticide a lieu durant 24 heures dans les conditions souhaitées. Pour ce qui concerne les essais réalisés à température fixe, une chambre climatisée a été utilisée, l'éclairement étant maintenu constamment.

Les boîtes de coproculture ont été mises à incuber avec le couvercle fermé afin de limiter l'évaporation.

2.3.5. Lecture des résultats

Après la mise en contact de 24 heures, les Copépodes sont dénombrés dans chaque boîte selon la séquence suivante:

- prélèvement des Copépodes morts dans le fond de la boîte àl'aide de l'extrémité fine d'une pipette pasteur reliée à une poire en caoutchouc. Les Copépodes sont considérés comme morts si ils ne réagissent pas àl'approche de la pipette.

- transfert dans une boîte de Pétri en verre ou en plastique posée sur un fond noir.

-les Copépodes vivant restant dans la boîte d'essai sont tués àl'aide de formol (un tube à hémolyse contenant 5 ml de formaldéhyde suffit pour une boîte d'essai, ces tubes

peuvent être préparés à l'avance) ou d'éthanol, en vue de faciliter leur dénombrement.

- comptage des Copépodes morts à l'aide d'un compteur à main, le fond noir peut éventuellement être quadrillé afin de faciliter le comptage. Seules les femelles adultes doivent être dénombrées (les plus gros Copépodes visibles). Les femelles adultes de Cyclopoides comportent 4 segments abdominaux, le premier segment (segment génital) en partant du thorax étant nettement plus large et long que les trois suivants.

- passage à la boîte suivante jusqu'à ce que tous les Copépodes morts aient été comptés dans toutes les boîtes.

- comptage des Copépodes vivants (désormais tués) lorsque les morts de toute les boîtes ont été comptés.

- calcul de la dose létale pour 50 % des individus (DL50) ou d'un autre indice suivant une des méthodes habituelles.