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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:
Dauby, N. (2015). Réponse des lymphocytes B lors de l'infection primaire au cytomégalovirus humain pendant la grossesse (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté de Médecine – Médecine, Bruxelles.
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UNIVERSITE LIBRE DE
BRUXELLES
Faculté de Médecine
Institut d'immunologie Médicale
Réponse des lymphocytes B lors de l'infection primaire au
cytomégalovirus humain pendant la grossesse
Dr Nicolas Dauby
Promoteur : Dr Arnaud Marchant
Thèse présentée en vue de l'obtention du titre académique de
Docteur en Sciences Médicales
Avril 2015
"Humanity has but three great enemies: fever, famine and war; of these by far the greatest, by far the most terrible, is fever."
Dr William Osler, 47th annual meeting of the American Medical Association, 1896.
"Il n’y a d’homme complet que celui qui a beaucoup voyagé, qui a changé vingt fois la forme de sa pensée et de sa vie. Les habitudes étroites et uniformes que l’homme prend dans sa vie régulière et dans la monotonie de sa patrie sont des moules qui rapetissent tout. Pensée, philosophie, religion, caractère, tout est plus grand, tout est plus juste, tout est plus vrai chez celui qui a vu la nature et la société de plusieurs points de vue. Si mon esprit s’est agrandi, si mon coup d’œil s’est étendu, si J’ai appris à tout tolérer en comprenant tout, je le dois uniquement à ce que j’ai souvent changé de scène et de point de vue."
Remerciements
Ce travail de thèse de doctorat s'est étalé sur plus de 5 ans. Durant ces années, j'ai pu bénéficier du soutien et de la confiance de plusieurs personnes qui m'ont permis de réaliser un travail significatif dont je peux être satisfait. Certaines personnes m'ont donné leur confiance avant de débuter ce travail, alors que j'étais étudiant, et m'ont donné envie de "faire de la recherche".
Tout d'abord, Olivier Vandenberg qui fut le premier, au décours d'une rencontre fortuite dans la cuisine des urgences pédiatriques de l'hôpital Saint Pierre, à me proposer un travail de recherche dans son labo de microbiologie.
Ensuite, Carine Truyens et le Pr Carlier m'ont fait découvrir le monde passionnant de l'immunologie et plus spécifiquement de l'immunité néonatale.
Merci au Pr Levy pour sa disponibilité et m'avoir efficacement guidé jusqu'à l'IMI.
Arnaud, tu m'as permis de construire cette thèse à ma manière en restant ouvert à l'exploration de nombreuses pistes, même si quelques une se sont révélées être des impasses...Sous ta supervision et guidance, j'ai appris à interpréter, confronter, critiquer, valoriser, retourner des résultats dans tous les sens. Tu a été (très) souvent disponible pour discuter des derniers data ou d'un nouveau papier. Ton enthousiasme associée à ta rigueur ainsi que ton empathie et ta bienveillance font de toi un promoteur de qualité.
Merci à tous les collègues de l'IMI pour leur gentillesse au quotidien. Merci à Sandra pour les premiers "FicoH" et marquage FACS. Merci à Pierre et à Ariane pour leur expertise en FACS, à Véro pour le suivi des échantillons, à Margreet "voor de goede sfeer in het kantoor en de nederlandse leesen". Merci à Mustapha & David pour votre intérêt dans mes travaux. Merci à Laurence pour la bonne humeur quotidienne et la disponibilité pour les commandes, impressions, réservations en dernière minute... Merci à Delphine et Anna pour leur confiance et leur collaboration efficace.
l'équipe de IH à La Louvière pour leur dynamisme et efficacité concernant le recrutement des sujets : Laurence, Laurent, Nicolas & Edwige.
Merci aux collègues de l'Hôpital Erasme pour leur collaboration ; Catherine Donner, Marie- Luce Delforge, Françoise Brancart, Corinne Liesnard.
Merci au FNRS, à l'ULB et à la Fondation Horlait-Dapsens pour le financement et m'avoir donné la possibilité de "chercher en toute liberté".
Un grand merci à mes parents qui m'ont toujours soutenu dans toutes mes entreprises personnelles ou professionnelles. Vous êtes formidables.
Merci à mon frère Gilles pour son aide avec Excel, R, Access...et les discussions décontextualisées sur la recherche ou l'évolution. Tu es un scientifique exemplaire.
Merci à mes grands-parents pour leur attention et leur intérêt. Depuis que j'ai débuté mes études de médecine jusqu'à aujourd'hui vous avez toujours été avec moi.
Antes de todo, gracias a mi esposa. Fer, eres una super mujer, esposa, madré. Gracias por tus consejos, tu vision pragmâtica de la vida, tu carino. Sin ti no podn'a avanzar en la vida como lo hago. Te amo mucho.
Table des matières
Composition du jury de thèse... 3
Liste des abréviations... 4
Résumé... 6
I. Introduction...8
1. Le cytomégalovirus humain... 8
A) Aspects virologiques...8
B) Evasion immune...17
C) Latence & réactivation : mécanismes... 18
D) Infection par HCMV : aspects clinico-épidémiologiques...19
E) Traitement anti-viral...24
F) Les immunoglobulines hyper immunes dans la prophylaxie et le traitement de l'infection par HCMV...25
G) La vaccination dans la prévention de l'infection à HCMV....i... 26
2. Les lymphocytes B... 28
A) Bases génétiques de la diversité du répertoire des lymphocytes B...28
B) Développement des lymphocytes B : de la moelle vers la périphérie...29
C) La réponse des lymphocytes B aux antigènes...31
D) La mémoire humorale...38
E) Caractérisation des lymphocytes B...40
F) Mécanismes d'évasion des pathogènes à la réponse humorale... 45
3. Réponse immune au CMV ; nature & rôle...47
A) Vue d'ensemble de la réponse immune au CMV... 47
B) Rôle des anticorps dans le contrôle de l'infection par CMV... 49
C) Réponse des Lymphocytes B lors de l'infection par CMV... 52
4. Immunité pendant la grossesse... 54
II. Objectifs du travail... 56
III. Résultats... 57
1. Primary Human Cytomégalovirus Infection Induces the Expansion of Virus-specific Activated and Atypical Memory B cells...57
2. Heterogeneity of memory B-cell responses to viral and vaccine antigens...71
3. Defective effector memory B cell response to envelope glycoprotein B during primary HCMV infection... 86
IV. Discussion & Perspectives... 108
1. Impact de l'infection par HCMV sur les sous-populations de LB... 108
B) L'épuisement fonctionnel des LB : rôle de la stimulation antigénique prolongée... 109
C) Impact de l’épuisement fonctionnel sur la réponse spécifique anti-HCMV...111
D) Absence d'altération au niveau des sous-populations de LB lors de l’infection chronique ? 112 2. La réponse humorale spécifique de HCMV est distincte selon la localisation de l'antigène ..112
A) Les anticorps neutralisants anti-gB apparaissent progressivement lors de l'infection primaire par HCMV... 112
B) Un phénotype différentiel pour les LB spécifiques du tégument et de gB...113
C) Des antigènes à la localisation différente induisent un phénotype distinct : hypothèses mécanistiques... 115
3. Compartimentalisation & spécialisation fonctionnelles des LB mémoires... 118
A) LB mémoires centraux et effecteurs...118
B) Implications pour l'immunité anti infectieuse : exemple de la malaria... 119
C) Implications pour le développement de vaccins... 120
V. Conclusions... 122
VI. Références... 123
Thèse Annexe ; le polymorphisme HLA et l'auto-immunité sont-ils impliqués dans le "Nodding Syndrome"?...141
Composition du jury de thèse
Président :
Dr Alain Le Moine, Service de Néphrologie, Hôpital Erasme et Institut d'immunologie Médicale (IMl), Université Libre de Bruxelles (ULB).
Secrétaire :
Dr Arnaud Marchant, IMI, ULB.
Membres :
Pr Dominique Bron, Service d'Hématologie, Institut Jules Bordet, Bruxelles.
Pr Philippe Lepage, Hôpital Universitaire des Enfants Reine Fabiola, ULB, Bruxelles. Dr Benoît Vokaer, Service de Médecine Interne, Hôpital Erasme et IMl, ULB, Bruxelles.
Experts extérieurs :
Pr Geert Leroux-Roels, Centrum voor Vaccinologie, UZ Gent, UGent, Gand.
Dr Cari De Trez, Laboratory of Cellular and Molecular Immunology, Vrije Universiteit Brussel, Bruxelles.
Liste des abréviations
AD Domaine antigènique dominant
AID Acitvation-induced deaminase
BAFF B-cell activating factor
BCR B-cell receptor
BTK Bruton Tyrosine Kinase
cART Traitement anti-rétroviraux combinés
CDV Cidofovir
CG Centre germinatif
CMV Cytomégalovirus
cmvIL-10 Interleukine-10 du cytomégalovirus
CPA Cellules productrices d'anticorps
CRP Protéine C réactive
DC Cellule dendritique
DT Toxoïde diphtérique
EBV Ebstein-barr virus
ELP Précurseurs lymphoïdes précoces
FACS Cytométrie en flux
FDC Cellules dendritiques folliculaires
gB Glycoprotéine B
GCV Ganciclovir
GPCMV Cytomégalovirus du cobaye
HCMV Cytomégalovirus humain
HIG Immunoglobulines hyper-immunes
IFN Interféron
IgG Immunoglobulines G
ISO Gênes stimulant l'interféron
LB Lymphocytes B
LCMV Lymphochoriomeningitis virus
LT Lymphocytes T
LTfh LT auxiliaires folliculaires
MCMV Cytomégalovirus murin
MHC Complexe majeur d'histocompatibilité
NK Natural killers
PBMC Cellules mononuclées du sang périphérique
PCR Polymerase-chai n reaction
PML-NB Corps nucléaires PML
RCMV Cytomégalovirus du rat
RhCMV Cytomégalovirus du rhésus macaque
SIDA Syndrome d'immunodéficience acquise
TT Toxoïde tétanique
vGCV Valganciclovir
VHB Virus de l'hépatite B
VIH Virus de l'immunodéficience humaine
VSV Vesicular stomatitis virus
Résumé
L'infection par le cytomégalovirus humain (HCMV) est une cause majeure de mortalité chez les patients immunodéprimés et représente la première cause d'infection congénitale. HCMV est un virus complexe qui s'est adapté au système immunitaire humain en développant de multiples mécanismes d'évasion. L'infection primaire à HCMV est associée à une réplication virale prolongée avant l'établissement de la latence. Il a été montré que cette intense réplication lors de la phase initiale de l'infection était associée à une épuisement fonctionnel des lymphocytes T CD4 spécifiques du virus. Alors que les anticorps Jouent un rôle dans la limitation de la dissémination virale et la prévention de l'infection à HCMV, les réponses des lymphocytes B sont peu caractérisées. Dans le présent travail, nous avons étudié l'impact de l'infection à HCMV sur le phénotype et la fonctionnalité des sous-populations de LB du sang circulant chez une cohorte de femme enceintes avec une primo-infection par HCMV en utilisant comme contrôles des sujets sains séropositifs et séronégatifs pour HCMV ainsi que des femmes enceintes séronégatives. Nous montrons que l'infection primaire par HCMV induit une expansion significative et prolongée de deux sous-populations de LB ; les LB mémoires activés (CD27-i-CD2l'°'^) et mémoires atypiques (CD27-CD2l'°'^), précédemment décrites lors d'infection chroniques. Les LB mémoires atypiques démontrent des signes d'épuisement fonctionnel comme en témoigne une expression élevée de récepteurs inhibant le BCR et une moindre réponse à la stimulation in vitro mesurée par la production de TNF-a. Les expansions de ces deux sous-populations sont corrélées entre elles et liées à la virémie. Ces résultats contribuent à la compréhension de la régulation des réponses des LB lors d'infections virales, en montrant que l'épuisement fonctionnel de LB, précédemment décrit lors d'infections chroniques, peut également survenir lors d'infections primaires.
sous-populations de LB mémoires présentent des différences phénotypiques, au niveau de l'expression de récepteurs liés au "trafflcking" cellulaire ainsi qu'au niveau de la fonctionnalité. Les LB mémoires CD2l'“'^, contrairement au LB mémoires CD2l'"®^, expriment des taux bas des récepteurs CXCR5 et CCR7, qui permettent la migration vers les centres germinatifs, mais des taux élevés de CDl le promouvant la migration vers les tissus périphériques. Après stimulation in vitro, les LB mémoires CD2l'°" vont avoir une capacité de production d'immunoglobulines immédiate mais une réponse proliférative plus faible comparée aux LB mémoires CD21+. Nous démontrons la relevance de cette division des LB mémoires sur base de l'expression du CD21 dans un modèle de vaccination de rappel contre la toxoïde tétanique (TT). Après rappel, nous observons une expansion significative de LB mémoires spécifiques de la TT exprimant un phénotype CD27+CD2l'°'^CXCR5'°'^CDl le'”®'’. Nous proposons ainsi un nouveau mécanisme de manipulation des réponses humorales par des pathogènes qui se traduit par une limitation de l'induction de réponses B effectrices. Nos travaux permettraient également une meilleure approche des réponses B mémoires physiologiques chez l'homme en proposant une classification des LB mémoires basées sur leur fonctionnalité et leur phénotype.
I. Introduction
1. Le cytomégalovirus humain
A) Aspects virologiques
1. La sous-famille des Betaherpesvirinae
Le cytomégalovirus humain (HCMV) fait partie de la sous-famille des betaherpesvirinae, qui appartient à la famille des Herpesviridae. Cette sous-famille a évolué depuis 180 millions d'années et est divisée en 4 genres {Cytomégalovirus, Muromegalovirus,
Proboscivirus et Roseolovirus, voir tableau 1). Les virus des rongeurs (Genre Muromegalovirus ; Murine CMV, Rat CMV) et du cochon d'inde (Non classifié : Guinea
Pig CMV) n'appartiennent pas au genre Cytomégalovirus mais sont également apparentés à des virus CMV. Mis à part HCMV, 3 autres virus de la sous-famille des
Betaherpesvirinae sont responsables d'infections chez l'Homme : HHV6A, HHV6B, agent
Nom de l'espèce Nom commun du virus Abréviation
Genre Cytomégalovirus
Aotine herpesvirus 1 Owl monkey CMV OMCMV
Cebine herpesvirus / Capuchin monkey CMV CMCMV
Cercopithecine herpesvirus 5 Green monkey CMV GMCMV
Human herpes virus 5 Human CMV HCMV
Macacine herpesvirus J Rhésus CMV RhCMV
Panine herpesvirus 2 Chimpanzee CMV CCMV
Papiine herpevirus J Baboon CMV BaCMV
Saimiriine herpesvirus 4 Squirrel monkey CMV SMCMV
Genre Muromegaiovirus
Murid herpesvirus I Mouse CMV MCMV
Murid herpesvirus 2 Rat CMV strain Maastricht RCMV
Murid herpesvirus 8 Rat CMV strain England RCMVE
Genre Proboscivirus
Elephantid herpesvirus 1 Eléphant endotheliotropic herpesvirus EEHV
Genre Roseoiovirus
Human herpesvirus 6A Human herpesvirus 6A HHV6A Human herpesvirus 6B Human herpesvirus 6B HHV6B Human herpesvirus 7 Human herpesvirus 7 HHV7
Virus non classinés
Caviid herpesvirus 2 Guinea pig CMV GPCMV
Suid herpesvirus 2 Pig CMV PCMV
Tupaiid herpesvirus I Tupaia herpesvirus 1 TuHVl
Tableau 1 ; Membres et membres proposés de la famille des Herpesvirinae (d'après Davison et al. '). Les virus infectant
l'Homme sont indiqués en caractères gras.
2. Structure
Le virion du HCMV est constitué de 3 éléments : la capside, le tégument et l'enveloppe. Il possède un diamètre compris en 200 et 300 nanomètres^ (Figure 1). La capside comprend l'ADN linéaire double brin. Le génome, le plus large des virus herpès humains, a une taille de 235 kpb et encode 165 gènes.
Figure 1 : Morphologie d'un virion de HCMV. A : Apparence en microscopie électronique (adapté de Griffiths, 2009^) B:
Représentation schématique d’un virion de HCMV (reproduit de Crough et al, 2009^) i) Le tégument
cellules^. Elles sont les premières à être larguées dans le cytoplasme des cellules infectées^. Le principal constituant des particules infectieuses du HCMV est pp65 (produit du gène ppUL83) ou Lower Matrix protein. Il s'agit d’une des cibles principales des lymphocytes T (LT) CD8+ et CD4+^. pp65 joue un rôle critique dans l'évasion immune du virus à la réponse adaptative et innée^.
Après pp65, ppl50 (produit du gène UL32) est la protéine la plus abondante du tégument et a la particularité d'être hautement immunogénique, tant pour les LT que pour les lymphocytes B (LB). PP 150 interagit avec la capside néoformée qu'elle dirigerait vers les sites d'assemblage du virus afin de permettre leur incorporation au sein des virions^. Le tégument contient également diverses protéines dérivées de l'hôte telles que des enzymes, des protéines de transport, liant l'ATP ou le calcium, des protéines du cytosquelette, etc.'*
ii) L'enveloppe
L'enveloppe de HCMV est complexe et n'a pas encore été caractérisée entièrement. Elle est principalement composée de glycoprotéines structurelles impliquées dans l'entrée au niveau des cellules de l'hôte et l'activation des réponses immunitaires innées antivirales (Tableau 2). Plusieurs de ces glycoprotéines sont homologues à d'autres virus du groupe Herpes : glycoprotéine B (gB), gH, gL, gO, gM et gN*. Les glycoprotéines de l'enveloppe forment des complexes sous forme d'homotrimères (gB), d'hétérodimères (gM/gN), d'hétérotrimères gH/gL/gO et de pentamères (gH/gL/UL128/UL130/UL131a).
Deux de ces glycoprotéines (gB et gM) sont capables de lier les protéoglycans d'héparan sulfate^ '”, jouant probablement un rôle dans l'attachement initial des virus". Des travaux récents indiquent que gB lie également plusieurs intégrines grâce à un domaine spécifique localisé à l'extrémité N-terminale de la protéine .
ORF Nom Essentielle à la réplication
Protéine partenaire
Rôle dans l'entrée
UL4 gpUL4;
gp48 Non Inconnue
Inconnu
UL33 UL33 Non Inconnue Inconnu
UL55 gB Oui Forme des
homodimères
Liaison au récepteur, fusion, transduction des signaux, activation de la réponse innée
UL73 gN Inconnu gM Inconnu
UL74 go Non gH;gL
Augmente la diffusion inter cellulaire
UL75 gH Oui gO;gL
Fusion, liaison au récepteur, activation de la réponse innée
ULIOO gM Oui gN Liaison au HSPG
UL115 gL Oui gH;gO Nécessaire à l'activité de gH
UL128 UL128 Pour certains types cellulaires gH, gU UL130, UL131a
Nécessaire pour les cellules épithéliales, endothéliales, myéloïdes & monocytes
UL130 UL130 Pour certains types cellulaires gH, gL, UL128, UL131
Nécessaire pour les cellules épithéliales, endothéliales, myéloïdes & monocytes
UL131 UL131 Pour certains types cellulaires gH, gL, UL128, UL130
Nécessaire pour les cellules épithéliales, endothéliales, myéloïdes & monocytes
TRLIO gpTRLlO Inconnu Inconnu Inconnu
TRLI2 gpTRL12 Inconnu Inconnu Inconnu
US27 US27 Non Inconnu Inconnu
US28 US28 Non Inconnu Inconnu
Tableau 2 : Les protéines de l'enveloppe du HCMV (Adapté d'après Feire & Compton*)
3. Tropisme cellulaire
HCMV infecte un grand nombre de types cellulaires in vivo ce qui se traduit par un spectre de 20
Les principaux types cellulaires permettant la réplication du virus sont les cellules épithéliales, endothéliales, les fibroblastes et les cellules de muscles lisses. Les cellules lymphoïdes constituent un des seuls types cellulaires non permissifs au virus. Les polynucléaires neutrophiles peuvent être infectés mais ne permettent pas la réplication virale. Néanmoins, ils jouent probablement un rôle dans la dissémination du virus^°. En effet, le risque de transmission du HCMV par transfusion disparaît après élimination des leucocytes^' et la détection de l'antigène pp65 dans les neutrophiles est le signe d'une infection active chez les patients immunocompromis^^. L'infection des cellules épithéliales au niveau des glandes salivaires, des reins ou du tube digestif joue un rôle important dans la transmission inter individuelle du virus. Le virus est en effet excrété au niveau de la salive, de l'urine et des selles, et l'entrée du virus chez un nouvel hôte se fait probablement via l'épithélium muqueux^®. HCMV infecte également les cellules endothéliales de la paroi vasculaire et peut être détecté dans la microcirculation de plusieurs organes^^. Cette infection permet la dissémination hématogène du virus à partir de la circulation vers les tissus des organes cibles^®.
Les fibroblastes sont les principales cellules infectées in vivo, permettant au virus de se répliquer dans la majorité des organes^'’. Les fibroblastes sont historiquement le type cellulaire utilisé pour les cultures virales de HCMV. L'observation que des souches virales ayant été cultivées sur fibroblastes ne peuvent plus infecter des cellules endothéliales a permis de révéler les bases moléculaires du tropisme de HCMV. Ce tropisme dépend de deux complexes de glycoprotéines : gH/gL/gO et gH/gL/pUL128-pUL130-pUL13 P'* (Figure 2). Les souches de laboratoire n'infectant que les fibroblastes et les neurones expriment uniquement le complexe gH/gL/gO et ne peuvent infecter les cellules épithéliales et endothéliales. Le tropisme pour les cellules épithéliales et endothéliales, ainsi que pour les cellules dendritiques, requiert l'expression des gênes UL128, UL130 et UL131 qui forment un complexe pentamérique avec les glycoprotéines gH et gL^^'^^.
HCMV gH/gUgO gH / gL/gO ^ |/ receptors gH/gL/UL128-131 gH/gL/UL128-131 receptors
Fibroblasts Epithelial/Endothelial cells
Figure 2 : Représentation des 2 complexes de glycoprotéines responsables du tropisme différentiel de HCMV (reproduit de
Vanarsdall & Johnson*’)
Ces différences de tropisme selon la souche virale auraient un rôle dans la dissémination virale ; l'infection de fibroblastes induirait des populations virales hétérogènes exprimant des taux hauts ou bas du complexe gH/gL/pULl28-pULl30-pULl3la et capables d'infecter autant les cellules endothéliales que les fibroblastes. Au contraire, l'infection de cellules endothéliales produirait des populations virales exprimant des taux bas du complexe gH/gL/pUL128-pUL130-pUL131a, avec donc un faible pouvoir d'infection des fibroblastes .
4. Cycle viral
A)Tatharing B)Docfcbig q Poit^ttadimant Evsnti
Figure 3 : Etapes de l'entrée de HCMV dans les cellules cibles : A) Attachement via les héparan-sulfates de surface B)
Interaction avec des récepteurs tels que EGFR ou PDGFR puis avec les intégrines C) Interaction entre les complexes gH/gL et récepteurs membranaires promouvant la fusion (Reproduit de Feire & Compton*).
La liaison et l'entrée du virus induisent l'activation de voies de signalisation pro inflammatoires via les TLR stimulant ainsi la production de cytokines et d'interferon-a/p
O
impliqués dans l'immunité antivirale . La fusion avec la membrane plasmique entraine la décapsidation au niveau du cytoplasme. Une fois dans le cytoplasme, les capsides associées à des protéines du tégument utilisent le réseau de microtubules afin d'accéder au noyau^^'^^ au niveau duquel l'entrée se fait probablement par les pores. Au niveau du noyau, le génome viral s'associe avec des structures nucléaires : les PML-NB. Ces protéines vont initialement réprimer l'expression des gênes viraux mais vont ensuite être dégradées par une protéine du tégument, pp71, induisant secondairement l'expression des gênes très précoces ou « immédiate early » (lE)^^. Durant la phase précoce de l'infection, les enzymes et protéines nécessaires à la réplication de l'ADN viral seront exprimées. La réplication de l'ADN débute lors de la phase dite tardive, 24 heures après l'infection, et est sous contrôle de plusieurs protéines virales, dont UL54 qui code pour l'ADN polymérase virale^'*. L'ADN viral s'accumule au niveau du noyau où il va être encapsidé sous l'influence d'une série de protéines virales
Figure 4 : Représentation des méeanismes permettant à la capside virale d'atteindre le noyau : suite à la fusion avec la
membrane et la décapsidation, la capside s'associe avec des protéines du tégument et migre le long des microtubules jusqu'au noyau où elle pénètre via les pores pour y délivrer l'ADN viral. La protéine pp7l qui permettra d'activer l'expression des gênes précoces migre de manière indépendante dans le noyau (Reproduit de Kalejta, 2008’).
T^ENDS in UicmOiology
Figure 5 : Résumé du cycle viral. La réplication de l'ADN et l'encapsidation ont lieu au niveau du noyau. Après migration
vers le cytoplasme, les virions acquièrent les protéines du tégument et l'enveloppe avec les glycoprotéines de surface au niveau de l'appareil de Goigi (reproduit de Tandon, 2012^^).
B) Evasion immune
Au cours de sa co-évolution avec l'espèce humaine, HCMV a développé de multiples mécanismes de modulation des réponses immunes innées et adaptatives. Ces mécanismes permettent au virus d'éviter son éradication favorisant l'établissement de la latence.
HCMV va moduler l'expression des produits des gênes stimulant l'IFN (ISG) qui ont des effets antiviraux puissants. Comme décrit précédemment, dès les premières étapes de l'infection, HCMV active l'expression des ISG. Néanmoins, la délétion de certains gênes viraux, tel que pp65, induit une plus grande expression des gênes ISG et une production plus importante d'IFN^^.
Un des mécanismes majeurs d'évasion de la réponse adaptative est l'expression par HCMV, comme ses homologues MCMV ou RCMV, de multiples gênes qui vont interférer avec la
présentation des antigènes par les complexes majeurs d'histocompatibilité de classe (MHC) I et II aux cellules effectrices du système immunitaire. Ces gênes vont permettre au virus d'échapper aux réponses massives de LT CD4+ et CD8+ induites lors de l'infection. Plusieurs glycoprotéines virales (US2, US3, US6 & USI I) inhibent ainsi la présentation de peptides par les cellules infectées via le MHC de classe I, soit en redirigeant les chaînes du MCH-I du réticulum endoplasmique vers le cytosol, provoquant ainsi leur dégradation, soit en liant le MHC-1, soit en inhibant le transport des peptides vers le MHC-I . L'expression des molécules MHC-II est également diminuée par les glycoprotéines US2 et US3 réduisant ainsi secondairement l'activation des LT CD4+^^. Enfin, HCMV encode pour un homologue viral de l'ILIO (cmvIL-IO). Ce dernier va moduler également l'expression des MHC I et MHC II mais aussi interférer avec l'activation des cellules dendritiques et, in fine, inhiber les réponses des LT^*. Lors de l'infection par RhCMV, l'absence du gêne codant pour cmvIL-IO induit une réponse innée et adaptative de plus grande amplitude mais aussi de meilleure qualité, tant lors de la phase précoce de l'infection qu’au cours de la phase tardive^^.
En dehors de ces effets directs sur les cellules infectées, HCMV va par ailleurs moduler le milieu extracellulaire des cellules infectées en produisant des récepteurs aux chémokines, tel que US28, qui vont lier les molécules CCL5 et MIP-ip impliquées dans le recrutement des cellules immunitaires'^ '^.
C) Latence & réactivation : mécanismes
D) Infection par HCMV ; aspects clinico-épidémiologiques
Comme nous venons de le voir, HCMV est un virus qui s'est adapté à l'Homme et son système immunitaire. Le virus a co-évolué avec l'espèce humaine et est donc présent dans l'ensemble des populations humaines. Sa capacité à persister au sein de l'hôte et à se réactiver est associée à un potentiel de transmission élevé.
Les manifestations cliniques liées à l'infection par HCMV ainsi que l'amplitude et la durée de la réplication virale sont liées à l'état du système immunitaire de l'hôte.
On distingue trois types de populations particulièrement sensibles à l'infection par HCMV : les patients transplantés d'organes solides ou de moelle, qui vont bénéficier d'une immunosuppression iatrogène ; les patients co-infectés par le VIH, chez qui les manifestations sont directement liées au nombre de LT CD4+ ; et les fœtus infectés verticalement lors d'une infection maternelle. L'infection par HCMV est également associée à des manifestations chroniques, probablement liées à des épisodes récurrents de réplications virales de faibles amplitudes, qui seront discutées dans un deuxième temps'”.
La séroprévalence de l’infection par HCMV dans la population générale augmente avec l'âge pour atteindre plus de 60% chez les sujets de plus de 50 ans dans les pays industrialisés'*^. Les prévalences sont variables selon les zones géographiques. Ainsi, la séroprévalence au HCMV chez les femmes en âge de procréer suit un gradient Sud-Nord : elle est la plus élevée en Amérique du Sud, en Afrique et en Asie où elle peut atteindre plus de 90% de la population. Elle est la plus faible en Europe Occidentale et en Amérique du Nord (entre 40 et 60%). Dans une région donnée, l'ethnicité et le statut socio-économique sont des facteurs associés au risque d'infection par HCMV. Les sujets non Caucasiens ont ainsi en moyenne une séroprévalence plus élevée de 30 points de pourcentage et les sujets de niveau socio économique plus bas ont une séroprévalence plus élevée de 10 à 30 points'*^. Ces différences sont liées, entre autre, au mode de transmission du virus. HCMV est excrété dans les fluides corporels (urine, salive, sécrétions cervico-vaginales, sperme) et peut être transmis par voie sexuelle ou par contact avec des enfants en bas âge qui excrètent le virus pendant une plus longue durée. La promiscuité, les habitudes sexuelles et le nombre d'enfants vont donc influencer le risque d'être infecté par HCMV.
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Manifestations cliniques liées à l'Infection primaire &à la réactivationi] Infection primaire chez l'hôte immunocompétent
Chez les sujets possédant un système immunitaire intact, l'infection par HCMV est rarement symptomatique. La principale manifestation est un syndrome mononucléosique, ressemblant à la primo infection par EBV, associant fièvre prolongée, myalgies et adénopathies cervicales mais, contrairement à l'infection primaire à EBV, la primo-infection à HCMV est rarement associée à une pharyngite ou une splénomégalie"'^'^''.
Le virus est généralement acquis via les muqueuses soit par voie sexuelle (sécrétions cervicales, sperme) ou par voie orale (salive, urine, lait maternel)"'''. Après l'infection initiale, le virus va disséminer vers les organes cibles (foie, rein) où il va se répliquer. La réplication virale persiste en général pendant des mois lors de l'infection primaire. Une étude effectuée chez des adolescents présentant une infection primaire asymptomatique a montré qu'après 16 semaines suivant le diagnostic 80% des sujets excrétaient le virus dans les urines et présentaient une virémie détectable par PCR ; l'excrétion virale dans les urines était encore rencontrée chez plus de 80% des sujets après 24 semaines alors que le virus n'était plus détectable au niveau sanguin par PCR"'^. Dans deux autres études ayant suivi des donneurs de sang avec une séroconversion à HCMV et des femmes enceintes avec une primo infection à HCMV, l'ADN viral était détectable au niveau sanguin en moyenne jusque 3 mois après le diagnostic''^ ''^. L'infection congénitale ou de la petite enfance sont associées à une excrétion virale prolongée , reflétant des mécanismes de défenses anti virales différents de ceux des adultes"*^.
ü) Infection primaire & réactivation chez les hôtes immunocompromis
disséminée sévère pouvant associer pneumonie, entéro-colite, hépatite voire invasion du système nerveux central'*^’La manifestation clinique la plus fréquente et la plus sévère chez les greffés de moelle est la pneumonie à HCMV grevée d'une mortalité de 50%^'. L'instauration de prophylaxie par valganciclovir a démontré son efficacité dans la prévention de l'infection par HCMV après transplantation d'organe solide^®. L'infection par HCMV a également des effets indirects chez les patients transplantés d'organe solide ou de moelle, et a ainsi été associé à une incidence plus élevée d'infections bactériennes, fongiques ou virales^^' 54
La co-infection par le HCMV et le VIH est extrêmement fréquente vu les modes de transmissions communs. Avant l'introduction des traitements antirétroviraux combinés (cART), la rétinite à HCMV était la première cause de cécité chez les patients infectés par le VIH et une infection à HCMV était détectée jusqu'à 80% des cas à l'autopsie, notamment au niveau pulmonaire^^'^^. La rétinite à HCMV survenait chez environ 30% des patients, principalement ceux avec un taux de LT CD4+ inférieur à 50/mm^. Actuellement, la rétinite à HCMV reste une cause majeure de cécité chez les patients co-infectés par le VIH dans les pays aux ressources limitées, surtout en Asie du Sud-Est^^.
iii) Infection maternelle & Infection congénitale
Les inclusions intranucléaires typiques de l'infection par HCMV ont été initialement décrites chez un fœtus malade et en 1957 le virus HCMV était isolé pour la première fois chez des nouveau-nés présentant des manifestations cliniques ressemblant à la toxoplasmose congénitale^*.
L'infection congénitale par HCMV est une des causes de malformation congénitale les plus fréquentes. Une méta-analyse a estimé la prévalence de l'infection congénitale à 0,64% des grossesse avec néanmoins de grandes variations selon les zones géographiques étudiées. Ainsi, en Afrique de l'ouest, la prévalence peut atteindre 5% des grossesses*^. Aux Etats-Unis uniquement, ce sont plus de 40000 enfants qui naissent chaque année avec une infection à HCMV. Les femmes enceintes peuvent être contaminées par voie sexuelle ou après contact avec des enfants moins de 2 ans, particulièrement ceux fréquentant des centres d'accueil, qui excrètent le virus au niveau des urines et de la salive de manière prolongée^*^.
La transmission de la mère à l'enfant se fait pendant la grossesse, probablement après infection du placenta, et peut être la conséquence soit d'une primo-infection maternelle (séroconversion pendant la grossesse) soit d'une réactivation ou une réinfection par une souche différente (infection récurrente). Le risque de transmission est plus important lors d'une primo infection (30-40%) que lors d'une infection récurrente (1%), reflétant le rôle de l'immunité dans le contrôle de la transmission^'.
Les symptômes sont présents ehez environ 10% des nouveau-nés infectés in utero^^. Les atteintes neurologiques peuvent eomprendre une microcéphalie, des calcifications périventriculaires, un retard mental, une surdité neurosensitive, des troubles visuels. Les autres manifestations cliniques fréquentes incluent hépatosplénomégalie et thrombopénie^®. Environ 10% des nouveau-nés infectés mais asymptomatiques à la naissance développent des séquelles tardives, principalement une surdité neurosensitive®'’
Aux Etats-Unis, l'infection congénitale à HCMV coneeme un plus grand nombre d'enfants comparé à d'autres causes de malformations congénitales telle que la trisomie 21, le spina bifida ou le syndrome d'alcoolisation foetale®'*. Les conséquences de l'infection congénitale à HCMV en terme de santé publique sont importantes : on estime que les soins apportés à un enfant infecté pendant la grossesse représentent une coût annuel de 300,000 $®®. Le développement d'un vaccin permettant la prévention de l'infeetion congénitale a ainsi été reconnu comme prioritaire par l'Institute of Medicine au début du siècle®®.
iv) Manifestations liées à l'infection chronique : effets indirects de HCMV
- Effets chez les sujets infectés par le VIH
chez les patients infectés avec le VIH permet de réduire la mortalité, au prix d'effets secondaires sévères fréquents^^'^’.
- Effets chez les sujets transplantés
L'infection par HCMV a des effets au long terme chez les sujets ayant bénéficié d'une greffe d'organe solide et est associée à une augmentation de la mortalité. L'infection par HCMV Jouerait un rôle dans le rejet chronique lors de greffe rénale mais également dans le développement de la vasculopathie post greffe cardiaque, dans la thrombose de l'artère hépatique après greffe hépatique ou dans la bronchiolite oblitérante après greffe pulmonaire^*.
- Immunosenescence & mortalité
La séropositivité à HCMV ainsi que les taux d'IgG totale HCMV-spécifique ont été associés dans plusieurs études à une augmentation de la mortalité chez les sujets âgés^^'**. On suspecte que cette augmentation de la mortalité pourrait être la conséquence des effets néfastes de HCMV sur le système immunitaire de l'hôte. L'infection chronique par HCMV a un impact marqué sur le répertoire des LT CD8+ induisant une accumulation de LT CD8+ différenciés CD27-CD28-. Ces altérations dans le répertoire des LT CD8+ font partie du "phénotype immun à risque" qui comprend un ensemble de paramètres immuns associés de manière prospective à une mortalité plus élevée dans une cohorte de sujets âgés. HCMV jouerait un rôle dans la fragilité du sujet âgé. Celle-ci est la conséquence du déclin des fonctions physiologiques et comprend un ensemble de manifestations incluant perte de poids, faiblesse, épuisement, troubles de la marche et impossibilité d'accomplir les tâches quotidiennes. Cette fragilité du sujet âgé est associée à une inflammation périphérique (taux sériques plus élevés d'lL-6 et CRP). L'accumulation de LT différenciés spécifiques de HCMV contribuerait à un moindre contrôle d'infections, non liées à HCMV, et donc à une augmentation de l'inflammation périphérique . Une étude récente a ainsi montré que les sujets âgés infectés par HCMV avaient des réponses CD4+ spécifiques de la grippe de moindre amplitude**.
Glioblastome
Une littérature émergente suggère que HCMV pourrait contribuer à la pathogénèse du glioblastome, tumeur cérébrale à la mortalité élevée. Plusieurs études indiquent que des protéines de HCMV ainsi que du matériel génétique du virus sont retrouvés dans une majorité des tumeurs. On suspecte que HCMV pourrait avoir un rôle oncomodulateur, promouvant la croissance tumorale grâce à des effets sur le microenvironnement tumoral, notamment via la sécrétion d'lL-6 ou IL-10 viral . Une étude in vitro récente a montré que l'expression de gB par les cellules de glioblastome avait comme conséquence d'activer les voies du PDGFRa, promouvant ainsi la croissance et l'invasion des cellules néoplasiques^^. Une étude non randomisée sur un nombre limité de patients ayant reçu du valganciclovir en adjuvant a montré une survie significativement plus grande, suggérant également un rôle de la réplication virale dans la croissance tumorale**.
E) Traitement anti-viral
L'utilisation de traitement anti-viral, soit en prophylaxie, soit en traitement préemptif, a permis de diminuer drastiquement l'incidence et la mortalité lié au HCMV après greffe d'organe solide ou de moelle^'’ *^. L'ensemble des molécules actuellement disponibles cible la polymérisation de l'ADN viral.
Les autres molécules disponibles sont le Cidofovir (CDV), analogue de la cytosine, et le Foscamet, analogue des pyrophosphates. Ces molécules ne dépendent pas de la phosphorylation par pUL97 et sont donc actives sur les formes résistantes au GCV. Néanmoins, leur utilisation est restreinte à cause de leur néphrotoxicité fréquente^®.
Le CMXOOl ou brincidofovir est un conjugué lipidique du CDV qui a une bonne biodisponibilité orale et des effets indésirables moins fréquents et moins sévères^^. Il a été montré comme efficace dans la prévention de la maladie à HCMV chez les patients bénéficiant d'une greffe de moelle allogénique^^.
Le letermovir est un nouvel agent antiviral qui cible la terminase virale, pUL56, impliquée dans les dernières étapes de clivage de l'ADN et de son intégration dans les virions néoformés^”’ Dans une étude de phase 11 chez des patients ayant bénéficié d'une greffe de moelle allogénique, l'incidence des infections sévères à HCMV diminuait proportionnellement à l'augmentation des doses. Le letermovir a l'avantage de présenter peu d'effets secondaires significatifs, contrairement au GCV^^.
L'utilisation des anti-viraux afin de prévenir ou limiter les conséquences de l'infection congénitale est limitée. Le profil de sécurité des anti-viraux actuellement disponibles n'est pas favorable à une utilisation pendant la grossesse. L'utilisation de GCV a démontré une efficacité au niveau de l'audition et du développement psychomoteur chez les nouveau-nés congénitalement infectés^®.
F) Les immunoglobulines hyper immunes dans la prophylaxie et le traitement de l'infection par HCMV
De nombreuses études, dans le domaine de la transplantation, ont investigué le rôle des immunoglobulines anti-CMV (HIG) dans la prévention des infections à CMV endéans les 6 mois post-transplantation. Une revue systématique de la Cochrane Library n’a démontré aucun bénéfice à associer les HIG anti-HCMV aux anti-viraux^^. En ce qui concerne le traitement des infections à HCMV, une étude non randomisée suggère un effet bénéfique des HIG sur la mortalité dans les pneumonies à HCMV lorsque combinées au traitement anti- viral^^.
L'administration de HIG a également été investiguée comme moyen de prévention de l'infection congénitale lors d'une infection maternelle. Une première étude suggérait un effet bénéfique de l'administration des HIG anti-HCMV^*. Néanmoins cette étude n'était pas randomisée ni contrôlée de manière appropriée. Une étude récente randomisée et contrôlée par placebo n'a pas montré d'effet statistiquement significatif des HIG anti-HCMV dans la prévention de l'infection congénitale^^. L'analyse des placenta des mères ayant reçu un traitement par HIG anti-HCMV indiquent cependant une absence de signe d'infection et de remodelage inflammatoiressuggérant que les HIG pourraient prévenir la dysfonction placentaire induite par l'infection congénitale.
G) La vaccination dans la prévention de l'infection à HCMV
La fréquence de l'infection à HCMV, ses conséquences cliniques graves chez les nouveau-nés congénitalement infectés ou chez les patients ayant bénéficié d'une transplantation d'organe solide ou de moelle ainsi que la toxicité des traitements actuels font du développement d'un vaccin prévenant l'infection à HCMV une priorité. Plusieurs approches ont été développées et étudiées avec des succès variables.
1. Vaccin vivant atténué
Un vaccin vivant atténué a été particulièrement étudié. Il s'agit de la souche Towne, isolée chez un nourrisson congénitalement infecté et atténuée après plus de 125 passages sur culture de fibroblastes'^'. Le vaccin Towne induit des réponses CD8+ cytotoxiques ainsi que des anticorps neutralisants. Néanmoins, ces réponses ont tendance à décliner avec le temps'®'. Ce vaccin a montré une efficacité dans plusieurs études chez des patients transplantés rénaux en terme de réduction de la sévérité de la maladie mais pas de prévention de l'infection'®' '®^.
2. Vaccin sous unitaire
Un vaccin basé sur l'administration de gB recombinante couplée à un adjuvant a montré des résultats prometteurs dans 2 études de phase 11. La gB est hautement immunogénique et constitue une cible majeure des anticorps neutralisants'®"'. Une première étude randomisée contrôlée par placebo a été réalisée chez des femmes séronégatives en âge de procréer et a démontré une efficacité de 50% dans la prévention de la primo infection à HCMV. Le nombre d'infections congénitales était trop faible pour pouvoir conclure à l'efficacité du vaccin sur ce point'®^. Une deuxième étude randomisée et contrôlée par placebo a été réalisée chez des patients transplantés rénaux ou hépatiques. Chez les patients D+R-, le vaccin était associé à une durée de virémie et de traitement par GCV significativement plus basse'®^. Cette étude a également montré que le principal corrélât de protection du vaccin était l'induction d'anticorps neutralisants, les réponses des LT CD4+ spécifiques de HCMV étant identiques entre placebo et vaccinés. Enfin, ce vaccin aurait également un intérêt chez les sujets séropositifs pour HCMV au vu de sa capacité à booster les réponses humorales et LT CD4+'®^
3. Vaccin ADN
Un vaccin à ADN contenant 2 plasmides codant pour la gB et pp65 a été évalué comme vaccin thérapeutique chez patients séropositifs pour HCMV et ayant bénéficié d'une greffe de moelle. Les sujets vaccinés présentaient moins d'épisodes de virémies, bien que l'utilisation d'antiviraux ne fut pas différente comparée au groupe placebo'®*.
2.
Les lymphocytes B
Ce travail porte sur l'étude des LB lors de l’infection primaire par HCMV. Nous exposerons dans les paragraphes suivants les concepts importants relatifs au développement ainsi qu'à la fonction des LB.
Les LB sont, avec les LT CD4+ et CD8+, des acteurs cruciaux de l'immunité adaptative. Les LB se caractérisent par l'expression au niveau de leur membrane d'une immunoglobuline de surface à la spécificité unique : le BCR (B-cell receptor). C'est grâce au BCR que les LB vont pouvoir jouer leur rôle dans l'immunité adaptative, à savoir la constitution de plasmatocytes et de LB mémoires produisant des anticorps spécifiques d'un antigène. L'importance des LB dans la réponse aux pathogènes est illustrée par des situations cliniques où leur nombre ou leur fonction sont anormaux. Ainsi, des défauts d'origine génétique dans le développement des LB, du BCR ou des enzymes contrôlant la production des immunoglobulines ou le réarrangement des gênes des immunoglobulines sont associés à un risque accru d'infections principalement bactériennes'Les patients ayant bénéficié d'un traitement par rituximab, un anticorps monoclonal induisant une déplétion sélective des LB CD20+ utilisé dans certains lymphomes et maladies auto immunes, ont par ailleurs une réponse à la vaccination altérée"^' et un risque accru de réactivation de virus latent, tel que le virus JC associé à la leucoencéphalopathie multifocale progressive ou le virus de l'hépatite B'
A) Bases génétiques de la diversité du répertoire des lymphocytes B
La constitution d'un répertoire diversifié de LB, c'est à dire d'un large nombre de LB exprimant des BCR différents, est nécessaire afin d'assurer une réponse humorale spécifique de nombreux antigènes. Ainsi, la restriction du répertoire des LB avec l'âge pourrait être un des facteurs contribuant à l'immunosénescence et à la susceptibilité accrue des personnes âgées à certaines infections' '^.
site de liaison à l'antigène. La variabilité du site de liaison de l'antigène va dépendre de la recombinaison de 3 segments de gènes : V, D et J pour les chaînes lourdes et V, J pour les chaînes légères"^. La recombinaison des différents segments permet d'atteindre une diversité théorique de lO''* antigènes différents, qui est supérieure au nombre total de LB présents dans l'organisme d'un être humain"*. Le réarrangement des gènes des immunoglobulines, qui est à la base de la diversité du répertoire, est initié lors du développement des LB.
b Genn&ne V„(-39) D„(27) J,, (6) C)i D1-( 01-06 07(0052) E^ S|j C„1 Loadw FH1 Ffl2 FR3 FFU CDH-Ht CDFI-H2 C0fl-H3 N-0„-N
Figure 6 : A) Structure d'une immunoglobuline. Les régions variables sont le site de liaison à l'antigène et sont le produit de
recombinaison de différent segments des gênes des immunoglobulines dont le mécanisme est illustré en B) (Reproduit de Georgiou et al, 20I4‘'*)
B) Développement des lymphocytes B : de la moelle vers la périphérie
Durant la vie fœtale, les sites de lymphopoïèse B sont le foie et la rate. Chez l'adulte, les étapes majeures du développement des LB se déroulent au niveau de la moelle osseuse et vont se terminer dans les organes lymphoïdes périphériques et le sang circulant.
Le développement des LB au niveau de la moelle osseuse a été particulièrement étudié chez la souris et se fait à partir des cellules souches hématopoïétiques et de progéniteurs communs aux autres lignées lymphoïdes. Dans un premier temps, les cellules souches hématopoïétiques se différencient en précurseurs lymphoïdes précoces ("early lymphoid precursors" ou ELP) qui initient la transcription de gênes spécifiques de la lignée lymphoïde : l'ADN polymérase TdT (transferase deoxynucléotidyl terminale) et RAGl. Le processus de différenciation vers les ELP est concomitant à une perte du potentiel de régénération qui caractérise les cellules souches hématopoïétiques. L’expression de VCAM-1 qui permet l’adhésion aux cellules
stromales est également progressivement perdue. Les ELP vont acquérir le récepteur à l’lL-7 pour constituer les progéniteurs lymphoïdes communs. L’engagement définitif vers la lignée lymphoïde B est assurée par l’expression de différents facteurs de transcription dont PAX5 qui va notamment activer l'expression du CD 19, un des marqueurs de la lignée B"^.
Par la suite, le développement des LB est divisé en 3 étapes successives, concomitantes au réarrangement des gênes des immunoglobulines'^” et qui permettent la constitution d'un pool de LB immatures exprimant un BCR unique. Le premier stade est celui de pro-LB au cours duquel va intervenir le réarrangement des segments D et J des chaînes lourdes suivi du réarrangement du segment V au niveau du segment DJ réarrangé. La chaîne pH ainsi constituée est alors exprimée dans le cytoplasme puis va être exprimée au niveau de la membrane pour former le pré-BCR en association avec des chaînes légères de substitution, constituant ainsi le pré-LB. Lors de l'étape du pré-LB, les enzymes favorisant le réarrangement des chaînes lourdes vont être inhibées par le pré-BCR prévenant l'expression de 2 chaînes de 2 spécificités différentes par une même cellule : c'est le phénomène d'exclusion allélique. Les pré-LB vont subir une intense prolifération, via des voies de signalisation en amont du 1L7-R et du pré-BCR, dépendant notamment des P13K, de la Bruton Tyrosine Kinase (BTK) et de la protéine BLNK et réarranger leurs chaînes légères'^” '^^. La recombinaison des chaînes légères permet aux LB d'exprimer un BCR complet et de constituer les LB immatures ou transitionnels. 11 s'agit du troisième stade de développement médullaire des LB. Par la suite, les LB immatures vont migrer hors de la moelle osseuse pour se rediriger vers la périphérie, notamment la rate.
Caractéristique Pro-LB Pre-LB LB immatures LB matures
Localisation Moelle osseuse Moelle osseuse Rate Ganglions, rate
Réarrangement Chaîne |i Chaînes légères BCR complet
Interaction avec Non Non Délétion des clones Oui
l'antigène autoréactifs
Ig membranaire Aucun g + chaînes légères IgM IgM, IgD de substitution
Tableau 3 : Développemenl de la lignée des lymphocytes B (adapté de Marcus'"’).
C) La réponse des lymphocytes B aux antigènes
Les LB jouent un rôle important dans les phases précoces de l'immunité adaptative dirigée contre les pathogènes en produisant rapidement des anticorps de type IgM. Les LB vont par la suite constituer la mémoire humorale en formant un pool de plasmatocytes qui secrétent des anticorps hautement spécifiques du pathogène et, en parallèle, un pool de LB mémoires hautement réactifs, qui vont proliférer et se différencier en plasmatocytes en cas de nouvelle rencontre avec le même pathogène'^^.
Selon la nécessité ou non une aide des LT, les réponses anticorps sont classifiées en réponses T-dépendantes ou T-indépendantes. La reconnaissance des antigènes protéiques requiert une aide des LT alors que les antigènes non protéiques, tels que les polysaccharides ou les lipides sont capables d'induire une réponse anticorps en l'absence de LT en activant directement les LB.
IgM memory cells
B cells T helper cells
Follicular Deedritic cells Plasma cells
Secreted antibodies
>-VY
Class switched memory cells
Currenl Opinion irrvnuoology
Figure 7 : Illustration des différentes voies de différenciation des LB après rencontre avec un antigène. La voie T-
indépendante permet la différenciation de LB mémoire lgM+ alors que la voie T-dépendante va induire la différenciation de LB mémoire et de plasmatocytes après formation de centre germinatif (Reproduit de Dunn-Walters & Ademokun, 2010“^’)
1. Les antigènes T indépendants
Les antigènes T-indépendants sont capables d'induire la production d'anticorps en l'absence d'aide des LT CD4+. Ces antigènes possèdent généralement des épitopes répétitifs induisant un cross-linking intensif des molécules de BCR. Les polysaccharides capsulaires de
Streptococcus pneumoniae représentent un exemple d'antigène T-indépendant'^^. Chez la
étude suggère que l'équivalent des LB B1 murins exprime le phénotype CD20+CD27+CD23+CD70-. Cette population serait présente in utero et également impliquée dans l'immunité anti polysaccharidique'^®. Néanmoins, ces observations restent hautement controversées dans la littérature : certains auteurs proposent que cette population représente en fait des cellules en voie de différenciation plasmatocytaire'’” alors que d'autres auteurs remettent en cause la stratégie d'identification par cytométrie'
Des travaux de plusieurs groupes ont apporté la preuve qu'une sous population de LB identifiée comme CD27+IgM+lgD+ et provenant de la zone marginale de la rate jouerait un rôle dans la protection contre les antigènes T indépendants chez l'humain. Cette population est en effet présente chez des sujets avec une mutation du CD40L, incapables de monter une réponse T-dépendante. Les LB de la zone marginale vont également subir une expansion et une diversification de leur répertoire après vaccination anti pneumoccoccique'^'' '^^. Cette sous population de LB de la zone marginale aurait la particularité de présenter une diversification de leur BCR'^"* lors de leur développement et représenterait donc une arme anti infectieuse innée ou préprogrammée
2. La réponse aux antigènes T-dépendants
La réponse humorale dépendant des LT va permettre la genèse de réponses immunes effectrices et mémoires spécifiques du pathogène. Ce processus comprend différentes étapes propres à l'immunité adaptative sélection clonale, expansion, différenciation et persistance'^^"'^*. Les LT et les LB spécifiques de l'antigène vont devoir être activés et interagir ensemble afin d'assurer la prolifération et la différenciation des LB. Ces interactions entre LT et LB vont conduire à la formation de structures dynamiques localisées au sein des organes lymphoïdes secondaires, appelées centres germinatifs, où auront lieu la commutation isotypique et la maturation d'affinité'
i) Présentation des antigènes & activation des LT CD4+
recirculer dans la périphérie, soit en LT "follicular helper" (LTfh) dont le rôle est de réguler la
réponse des LB spécifiques d'un antigène''**^. En vaccinologie, l'utilisation d'adjuvants visant spécifiquement les DC permet d'augmenter la qualité et l'amplitude de la réponse anticorps Les LTfh sont caractérisés par l'expression du récepteur aux chémokines CXCR5 et l'absence d'expression de CCR?''^^. Le ligand du CXCR5, CXCL13, va promouvoir la migration vers les follicules des organes lymphoïdes''*^. Les LTfh expriment également un facteur de
transcription qui les distingue des autres sous populations de LT (BCL-6) ainsi qu'une série de molécules qui Jouent un rôle critique dans leurs interactions avec les LB (ICOS, CD40L, 0X40, PD-1, BTLA, SAP)''*l
ii) Présentation des antigènes & activation des LB
Les LB naïfs circulent constamment au sein des organes lymphoïdes secondaires (ganglions et rate) qui sont les sites de rencontre avec les antigènes. La liaison de l'antigène au BCR correspondant va induire l'activation des LB. La présentation de l'antigène au sein des organes lymphoïdes peut se faire de plusieurs manières. Les antigènes de petite taille vont diffuser à partir des sinus sous capsulaires. Les antigènes de plus grande taille vont être présentés par une population de macrophages sous capsulaire qui peuvent retenir l'antigène sous forme de complexes immuns pendant plusieurs heures''*'*. Les cellules dendritiques folliculaires (FDC) sont des cellules présentatrices d'antigènes hautement spécialisées dérivant des cellules stromales et localisées au niveau des follicules des organes lymphoïdes. Les FDC sont capables de lier les complexes immuns pendant de longue durée grâce à leur expression des récepteurs au complément CRI et CR2 (CD35 et CD21) et de récepteurs liant le segment Fc des IgG (CD32)''*^. Ils vont ainsi constituer une source majeure d'antigènes pour les LB folliculaires naïfs et promouvoir leur activation et leur différenciation''*^.
Prlmary foUlde
Figure 8 : Illustration des différents modes de présentation des antigènes au sein des ganglions lymphatiques : diffusion passive, via les macrophages sous-capsulaires et les cellules dendritiques folliculaires (Reproduit de Batista & Harwood'“'■*).
iii) Interactions LB-LT
Après leur activation respective, LT et LB vont migrer aux limites de leur zone de résidence initiale pour se rencontrer aux limites des follicules lymphoïdes. La présentation par les LB de l'antigène sous forme de peptides via le CHM de classe II aux LT spécifiques de l'antigène va induire la formation d'une synapse immunologique. Des interactions entre molécules de surface des LB et des LT spécifiques de l'antigène vont jouer un rôle critique dans leur activation, leur différenciation et leur survie respective'"^^’ L'interaction CD40-CD40L va favoriser la commutation isotopique et la prolifération des LB. Des mutations, soit au niveau du CD40, soit au niveau du CD40L, sont associées à un syndrome caractérisé par une production abondante d'IgM et l'absence de commutation isotypique (syndrome d'hyper IgM). La molécule SAP (SLAM-associated protein) Joue un rôle critique dans l'adhésion entre LTfh
et LB et est indispensable à la formation des centres germinatifs''*^ '^”. Les interactions ICOS- ICOSL vont permettre la maintenance de la différenciation des LTfh- L'interleukine 21 (IL-
21) est une cytokine clé produite par les LTfh qui va induire la prolifération des LB ainsi que la différenciation en plasmatocytes''*^.
iv) Conséquences de l'activation des LB-LT : la réaction du centre germinatif & la voie extra folliculaire
Les LB activés par les LT peuvent soit participer aux réactions du centre germinatif, soit se différencier en plasmatocytes via la voie dite extra-folliculaire. Cette voie est assurée par l'expression du facteur de transcription BLIMPl et va permettre la synthèse rapide d'immunoglobulines spécifiques''*®.
La réaction du centre germinatif va permettre de diversifier le BCR des LB et de procéder à la sélection des clones de meilleure affinité. Le centre germinatif est une structure dynamique que l'on peut diviser morphologiquement en 2 ensembles : la zone sombre et la zone claire'^'. La zone sombre est le lieu où les LB spécifiques de l'antigène, IgD négatifs, vont proliférer, diversifier leur BCR et procéder à la commutation isotypique. La diversification du BCR se fait par hypermutation somatique. Ce processus dépend d'une enzyme : l'Activation-induced deaminase (AID) qui convertit les cytidine en uridine, enclenchant des cycles de réparation de l'ADN qui vont introduire des mutations ponctuelles au niveau des régions variables. L'AID va également promouvoir la commutation isotypiquepermettant la production d'IgG, IgE et IgA. La commutation isotypique et les hypermutations somatiques dépendent de la réplication de l'ADN et nécessitent donc une prolifération des LB. La fin du cycle cellulaire des LB coïncide avec le début de la zone claire du centre germinatif. Ce dernier consiste en un réseau dense de FDC qui va constituer un réservoir d'antigènes, qui sont présentés sous forme de complexes immuns via les récepteurs au complément 1 (CD35) et 2 (CD21) mais aussi via les récepteurs liant la région Fc des anticorps, CD32 et CD23. C'est à ce niveau que les LB exprimant différents variants du BCR, spécifiques d'un antigène et émergeant du centre germinatif, vont tester leur capacité à lier l'antigène. Les LB dont le BCR lie l'antigène avec succès seront sélectionnés positivement alors que les LB avec un BCR liant peu ou pas l'antigène mourront par apoptose.
La circulation des LB entre les zones sombres et claires dépend d'un gradient de chemokines, CXCL12 et CXCL13, et de l'expression différentielle de leurs récepteurs, CXCR4 et CXCR5 respectivement'^®. Les FDC produisent du CXCL13 qui va attirer les LB en provenance de la zone sombre, mais aussi retenir les LTfh'^'.
Figure 9 : Représentation schématique du centre germinatif. La zone sombre est le lieu de prolifération des LB où ont lieu
l'expansion, la diversification et la commutation isotypique des LB spécifiques d'un antigène. La zone claire est lieu où sont sélectionnés les LB sur la base de leur capacité à lier l'antigène. Par Gatto & Brink'^'^.
L'ensemble de la réaction du CG ainsi que la différenciation en LB mémoire dépend de l'expression du facteur de transcription BCL-6‘^^. La durée de la réaction du centre germinatif va dépendre de la nature de l'antigène. Lors d'une vaccination avec un antigène protéique, on observe des CG à partir de 4-5 jours après vaccination qui vont durer entre 2 et 3 semaines. Des infections persistantes sont associées avec des réactions de CG pendant des mois après l'infection primaire'^^. In fine, la réaction du centre germinatif va générer des LB mémoires antigène-spécifiques mais aussi des plasmatocytes à longue durée de vie produisant des anticorps de haute affinité. LB mémoires et plasmatocytes à longue durée de vie sont à la base de la mémoire humorale
D) La mémoire humorale
1. Leçons de la vaccination
La production à long terme d'anticorps neutralisants en l'absence d'antigène assurant une protection contre des pathogènes est une des caractéristiques de la mémoire humorale et est à la base du succès de la vaccination. Le tableau 4 reprend la durée de vie estimée des réponses anticorps après vaccination par des antigènes protéiques (Tétanos, diphtérie) ou infection naturelle (Varicelle, variole, rubéole, rougeole, oreillons et EBV). Ces estimations résultent de dosages successifs d'anticorps réalisés prospectivement pendant 26 ans'^''. De manière remarquable, l'analyse longitudinale des taux d'anticorps indique que la réponse humorale est relativement stable au cours du temps (Figure 10). Des pics d'anticorps sont observés lors de revaccination, par exemple contre la diphtérie ou le tétanos. La vaccination contre la variole a permis d'éradiquer en 1978 cette infection virale qui était responsable d'une grande mortalité. L'étude des réponses immunes chez des sujets vaccinés contre la variole est unique et sert de modèle afin d'estimer la durée de la mémoire humorale en l'absence d'exposition à l'antigène, la maladie étant éradiquée et la vaccination uniquement réalisée dans des cas spécifiques. Il a ainsi été montré que les réponses anticorps peuvent rester stables Jusqu'à 75 ans après vaccination alors que les réponses des LT CD4+ diminuent lentement'^^.
Vaccin - Infection virale Demi-vie des réponses anticorps (années)
Tétanos 11 (10-14) Diphtérie 19(14-33) Varicelle 50 (30-153) Variole 92 (46- œ) Rubéole 114 (48-00) Rougeole 3014 (104-00) Oreillons 542 (90-OO) EBV 11552 (63-00)
- Vaccinja - Measies - Mumps - Rubella - VZV -EBV Teianus ■ Diphlheria A Subject 1 8 Subject 2 C Subject 3 D Subject 4
Figure 10 : Analyse longitudinale des taux d'anticorps dirigés contre différents antigènes vaccinaux & viraux chez quatre
sujets pendant plus de 25 ans. Les 4 sujets ont reçu un rappel de vaccin contre la variole (Reproduit d'Amanna et al.'^'’).
2. Mécanismes de la mémoire humorale : rôle des plasmatocytes à longue durée de
vie
La mémoire humorale est maintenue grâce à la production continue d'anticorps par les plasmatocytes à longue durée de vie qui occupent des niches au niveau de la moelle où ils bénéficient de signaux de survies (BAFF, lL-6, CXCL12) fournis par les cellules stromales 156
Les mécanismes qui dirigent la durée de vie différentielle des plasmatocytes selon l'antigène ne sont pas connus. Une hypothèse serait que leur durée de vie serait déterminée lors de la rencontre initiale avec l'antigène : sa nature, la présence ou non d'une aide des LT et le contexte inflammatoire seraient des éléments clefs dans la durée de vie des plasmatocytes antigène spécifiques'^^.
