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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:
Cabezón, T. (1975, December). Etude du ribosome bactérien. Caractérisation de mutants résistant à la néamine. Expression des gènes de protéines
ribosomiales (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.
Disponible à / Available at permalink : https://dipot.ulb.ac.be/dspace/bitstream/2013/214510/1/b46e17af-9fcb-4dcd-9b80-7ec309ee63f3.txt
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UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES .
Faculté des Sciences
Laboratoire de Génétique
ETUDE DU RIBOSOME BACTERIEN
CARACTERISATION DE MUTANTS RESISTANT A LA NEAMINE
EXPRESSION DES GENES DE PROTEINES RIBOSOMIALES
Thèse présentée pour I' obtention du grade scientifique de Docteur en Sciences chimiques
Teresa CABEZÔN
UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES
Faculté des Sciences
Laboratoire de Génétique
ETUDE DU RiBOSOME BACTERIEN
CARACTERISATION DE MUTANTS RESISTANT A LA NEAMINE
EXPRESSION DES GENES DE PROTEINES RIBOSOMIALES
Thèse présentée pour l'obtention du grade scientifique de Docteur en Sciences chimiques
Teresa CABEZÔN
a R.. Thomas, por la hermosa oportunidad que me brindô al aceptarme en. su laboratorio y por el tiempo y la atenciôn que dedicô
a mi trabajo. a mis companeros de unidad,
Alex, gran jefe, por guiarme siempre con entusismo y paciencia y por lograr un esbozo de rigor cientxfico de mi temperamen- to anârquico y brumoso.
Michel, por el placer de trabajar en la amistad. Robert y Nino, camarades apreciados,
a Michel Faelen, por sus juiciosos consejos, su disposiciân afable a la discusion, por ensenarme la genética bacteriana,
a Lude y Anne Marie, Joseph y François, Ariane, Cristine y aunque no los nombre , a todos los companeros del departamento de Genética con quienes convivi durante cuatro anos, gracias por el alegre "salut" matinal, por la palabra reconfortante cuando era nece- saria, por considerarme entre los suyos.
a Mc Yaguchi, al conocerlo sus cualidades humanas y cientxficas enriquecie- ron mi estadxa en Berlin,
a H.G. Wittmann, por acogerme en su laboratorio. a Hector G., por comunicarme su espiritu latino.
a mis amigas, Anita, Nubia, Silvia y Sonia, con quienes me formé en la Uni- versidad de Chile,
I - INTRODUCTION
1, Expression de l'information génétique 1
2, Le ribosome bactérien . B
3. Génétique du ribosome 26
4. Régulation de l'expression des gènes ribosomiaux 41
II - BUT DU TRAVAIL 45
III - RESULTATS
Partie I- Recherche et caractérisation de mutants affectés dans 47 les composants ribosomiaux
1. Isolement de mutants résistants à la néamine 48
2. Etude d'un mutant de type neaA : nea301 57
3. Etude des doubles mutants résistants à la néamine 90 4. Rôle de la protéine S5 dans la fidélité de la traduction 130
5. Conclusion et discussion 141
Partie II- Expression des gènes des protéines ribosomiales, 149
T, Données préliminaires
2, Inactivation des gènes ribosomiaux spcA et strA par insertion
du phage Mu-1. 153
3, Expression indépendante des gènes spcA et strA après transpo sition par le phage Mu-1 dans l'épisome F'iac. 160
IV - REFERENCES 165
1. Expression de la information génétique
1.1. Transcription 1
1.2. Traduction 2
1.3. Erreurs au cours de la traduction du message génétique. 3
2. Le ribosome bactérien
2.1, Structure et organisation 8
2.2, Fonctions: Le cycle du ribosome 13
2.3, Antibiotics et ribosomes: Mode d'action des aminoglycosides 20
3. Génétique du ribosome
3.1. Gènes de structure des rRNA ribosomiaux 26 3.2. Gènes de structure des protéines ribosomiales. 27 3.3. Mutations ribosomiales et fidélité de la traduction. 37
4. Régulation de l'expression des gènes ribosomiaux
4.1. Régulation des RNA ribosomiaux. 41
I - EXPRESSION DE L'INFORMATION GENETIQUE
Tout être vivant contient son information génétique sous forme de séquences de nucléotides (DNA). Celle-ci se perpétue grâce au mécanisme de réplication qui assure à chacun des descendents de l'organisme origi nal un génome identique.
L'information contenue dans le DNA sert essentiellement à la synthèse de protéines. Celles-ci constituent les éléments de base de la cellule; elles maintiennent sa structure, assurent son organisation et intervien-i nent dans tous les processus de biosynthèse et de régulation.
Le transfert de l'information génétique du DNA vers les protéines s'effectue en deux étapes, transcription et traduction.
1.1. Transcription
Au cours de cette phase une des deux fibres du DNA est transcrite par une enzyme, la RNApol>miérase en séquences de nucléotides constituant les acides ribonucléiques. Ceux-ci se répartissent en trois groupes, les RNAs messagers (mRNA], les RNAs ribosomiaux, (rRNA) et les RNAs.de trans fert (tRNA).
La transcription des différents gènes par la RNApolymérase, procède de façon complémentaire et antiparallèle au départ de sites bien définis sur le DNA, les promoteurs, et se poursuit jusqu'à l'apparition de signaux de terminaison, les sites terminateurs.
L'initiation de la transcription inclut tous les événements néces saires à la formation du premier lien phospho-diester du mRNA, après l'en trée et la fixation de la RNApolymérase au site promoteur. Plusieurs fac teurs de régulation interviennent au cours du processus d'initiation de la transcription, notamment l'AMP cyclique et la protéine CRP pour la trans cription des opérons cataboliques [Reznikoff, 19'72) et le facteur IjJ pour celle des opérons des RNAs ribosomiaux [Slumenthal et al,19'72; Haseltine,
1972}
L'arrêt de la transcription au niveau des sites terminateurs impli que la fin du processus d'élongation du mRNA et le départ de l'enzyme. II n'est pas clair à l'heure actuelle si les RNApolymérases reconnais sent elles-mêmes des séquences de terminaison ou si dans tous ou certains cas la présence d'un facteur,Rho,est nécessaire (chamberlin, 1974}
et définissent les unités de transcription ou opérons.
1.2. La traduction
Au cours de oette étape,■1'information génétique portée par le mRNA est traduite en séquences d'acides aminés. L'équivalence entre le mes sager et le polypeptide constitue le code génétique. Celui-ci définit des rapports précis entre triplets de nucléotides (codons) et acides
aminés.
En plus du message proprement dit, le code contient la ponctuation nécessaire à la lecture correcte: un codon signalant l'initiation de la traduction (AUG) et trois codons non sense qui indiquent la fin de la traduction (UAA, UAG, UGA).
Le RNA messager porte aussi d'autres signaux destinés à la régulation de la traduction, certaines séquences spécifiques au début et à la fin du RNA messager qui déterminent des structures tertiaires.
Le déchiffrement du code se fait par l'intermédiaire des RNAs de transfert (tRNA). Ces petites molécules (70 -90 nucléotides), au nombre de 40 - 60 (selon l'organisme), possèdent une structure secondaire com mune comprenant 4 régions en double hélice et 4 régions en simple brin sous forme de boucle ("loop") (Pig.l)
La région formée par les appariements des bouts 3' et 5' du tRNA constitue l'extrémité acceptrice d'acides aminés. Un séquence de trois nucléotides située dans la deuxième boucle (à partir de l'extrémité 5') forme l'anticodon; celui-ci s'apparie avec le codon correspondant à l'a cide aminé porté par le tRNA.
La fixation d'un acide aminé au tRNA qui lui est propre est catalysée par les enzymes d'activation, ou aminoacyl-tRNA-synthètases. Le mécanis me par lequel une enzyme donnée reconnaît son tRNA n'est pas encore clairement établi mais on pense que la structure du tRNA dans son ensem ble (anticodon, partie acceptrice, etc) participe à cette reconnaissance.
Sur ces faits, deux hypothèses extrêmqs étaient possibles: l'existence d'un code non dégénéré (20 codons sense et le restant non sense) ou
bien un code entièrement dégénéré.
Les données expérimentales ont révélé que le code est largement mais pas entièrement dégénéré: il y a 61 codons sense et 3 codons non sense. Plusieurs triplets de nucléotides peuvent donc correspondre à un même acide aminé [Fig.2a} et on s'attendrait à l'existence de 61 tRNA diffé rents; en réalité, il y a plus de codons que de tRNA connus actuelle ment, mais il a été montré expérimentalement que tous les codons sont utilisés (Fiers et al, 1975).
Dans un tel système, comment se préservent les appariements codon- anticodon requis par le code? D'une part, la théorie du Wooble postulée
par Crick (l966) a ajouté aux appariements classiques AU -GC, la pos sibilité d'autres appariements, grâce auxquels un même tRNA peut s'ap parier à deux ou même à trois codons différents (Fig.2b). Ce postulat repose sur l'idée que l'appariement entre la troisième base du codon et la première de l'anticodon (position 5') est soumis à une certaine distorsion.
La prédiction du"Wooble" a été confirmée par l'identification des codons interagissant avec l'anticodon des différents tRNAs isoaccep teurs purifiés (Tableau l). Cependant, dans certains cas, on a observé que la présence de bases modifiées dans l'anticodon détermine la spé cificité du tRNA pour l'un des deux codons qui autrement seraient lus selon le Wooble (ofengand, 1975),’ ce fait implique l'existence de deux tRNAs issoacepteurs.
La modification de la base adjacente à la position 5' de l'antico don semble être nécessaire à assurer le "reading frame". de la boucle anticodon (Riddle et Carbon,1973). Ceci indique que toute la conformation de la boucle II et pas seulement la structure de l'anticodon joue un rôle dans la reconnaissance codon-anticodon.
La dégénérescence du code implique l'utilisation de plusieurs codons . pour spécifier un même acide aminé, mais dans des conditions normales
aucun codon ne spécifie plus d'un acide aminé. Des mutations dans les gènes des tRNA—ligases qui conduiraient à cette situation en provoquant la charge erronée d'un tRNA, n'ont pas été détectées jusqu'à présent.
est cependent relative au niveau des interactions codon-anticodon, où on observe une ambiguité intrinsèque au processus de traduction.
Deux cas illustrent cette ambiguité: on peut avoir erreur de lectu re d'un codon [misreading) lorsqu'une.mutation non sense n'est pas abso lue (leakiness) ou qu'un signal de terminaison n'est pas respecté ( read- through) (Werner et Weber, 19'73). Dans ces deux cas les codons non sense sont reconnus dans une certaine mesure par différents tRNAs, quoique la complémentarité entre le codon et l'anticodon soit incorrecte (Tableau 2), nous parlerons plus loin de ce phénomène d'ambiguité.
La suppression informationnelle constitue un autre exemple de phénomène altérant la fidélité de la traduction. Lorsqu'un gène codant; pour un tRNA est muté, sa structure peut être affectée par divers changements. Ainsi, si suite à la mutation, l'anticodon est modifié, le tRNA peut reconnaître un codon non sense, ou missense ou même une séquence de 4 bases [Gorini, 1974). En conséquence au lieu de transférer son acide aminé à la place correcte il l'introduira là ou normalement il devrait y avoir terminaison de la traduction (non sense) ou un autre acide aminé (missense).
La suppression des mutations non sense et missense par des tRNAs mutés dans l'anticodon provoque une erreur'de la traduction quoique dans ce cas l'appariement codon-anticodon soit correct (Tableau 2).
D'autre part, des erreurs se produisent ' aussi lorsque un tRNA muté dans une région autre que l'anticodon supprime des mutations non sense, c'est par exemple le cas du tRNA tryptophane, suppresseur d'UGA, qui pos sède l'anticodon CCA. Ici, la modification du tRNA en dehors de la boucle anticodon est capable d'altérer la reconnaissance codon-anticodon (Hirch, 1971, Hogenauer, 1974).
Le cas du mutant ayant le tRNA-glylII modifié est un exemple intéres- .sant. La mutation affecte l'anticodon du tRNA-glylII et conduit à l'ob tention d'un tRNA de structure glylll et anticodon glyll, ce tRNA insère gly au lieu de gly selon deux mécanismes: complémentarité exacte et Wooble Ici il n'y a pas violation du code mais il y a redondance: deux tRNAs dif- férénts peuvent lire un même codon et insérer le mêmé acide aminé.
Dans le tableau 2 sont présentées les possibilités de décodage selon la structure des tRNAs et leurs conséquences . Nous verrons plus loin, (génétique du ribosome), la participation du ribosome dans les différents
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TABŒAU 1 - Anticodons de quelques tRNA séquencés
Source tRNA Anticodon Codons reconnus
E. coli ' Levure Tyrl G*U A U A U, U A C MetI C*A U A U G Tyr-sup3 C U A U A G Phel G*A A U U U, U U C Tyrl G U*A U A U, U A C Serl IGA U C U, U C C, U C A Alal IGG G C U, G C C, G C A Vall I A C G U U, G U C, G U A
09 Hydropliobic E3 Ambivolent Basic hydropbilic —I Acidic liydrophilic
b) Première base de l'anticodon (position 5')
Troisième base du codon (position 3') U C A G I A,G G U U,C U,C,A
FIGURE 2 - a) Le code génétique
b) Schéma des prédictions issues de la théorie du Wooble; i èm6
TABLEAU 2 - Mécanismes de décodage et fidélité de la traduction Codon reconnu Type de tRNA qui réalise la lecture
Mécanismes possibles Conséquences Références Sense Normaux Complémentarité exacte
Wooble
Non complémentarité
Traduction normale:
Traduction normale : découle de la dégénérescence Erreur de traduction ; misreading
par la strep in vitro Respect du code Respect du code Violation du code Soi! et al. 1965 Dayhoff, 1969 Davies et al, 1966 Mutés dans l’anticodon Complémentarité exacte Wooble Non complémentarité
Erreur de traduction ; suppression de missense Traduction normale: redondance» Traduction normale: redondance»
? * Violation du code Respect du code Respect du code Smith, 1972 Carbon et al, 1970 Squire et Carbon,1971 Mutés ailleurs Complémentarité exacte Wooble Non complémentarité ^ • • ? * Non sense Normaux Complémentarité exacte
Wooble
Non complémentarité
■ • , - •
Erreur de traduction -phénomène de "leakiness" —phénomène de "read-through" -"misreading" par la strep Violation du code Violation du code Violation du code Gorini et Kataja, 1964 Squire et Carbon, 1971 Gorini, 1969 Mutés dans l'anticodon Complémentarité exacte Wooble Non complémentarité
Erreur de traduction :-suppression d'ambre
-suppression d'ochre Erreur de traduction :-suppression
d'ochre et d'ambre n JL l * Violation du code Violation du code Violation du code Goodmann et al, 1960 Goodmann et al, 1970 Altmann et al, 1971 Altmann et al, 1971 Mutés ailleurs Complémentarité exacte Wooble Non complémentarité ■ ^ •
Erreur de traduction :-suppression d’opal
Violation du code Hirsh, 1971 Hirsh et Gold, 1971
“ Qualifie la situation où deux tRNA différents reconnaissent le même codon et chargent le même acide aminé * Situation théoriquement possible mais pas encore détectée
2.1..Structure et organisation
Le ribosome 70S existe dans la cellule en équilibre avec les sous- unités SOS et SOS. La particule SOS se compose de 21 protéines diffé rentes et d'une molécule de rRNAISS (1600 nucléotidesl. La sous-unité SOS comprend deux molécules de rRNA différentes, le 2SS [S200 nucléoti-: des] et le SS (l20 nucléotidesl et S^ protéines différentes.
Toutes les protéines ribosomiales ont été purifiées et leurs carac téristiques physico-chimiques ont été établies. Chacune d'entre elles constitue une espèce unique si l'on en juge par les tests immunologiques
(Stoffler et Wittmann,19711, la composition en acides aminés, les cartes peptidiques et dans de nombreux cas par la séquence d'acides aminés
(wittmann,197d1.
La structure primaire du rRNASS est entièrement connue (Monter,19741, et celle du rRNA16S à plus de 95P/o (pellner, 19741. La séquence de nucléo tides du rRNA23S n'est connue que très partiellement à l'heure actuelle, mais devrait être complétée à relativement brève échéance. Au départ.des structures primaires des rRNA on a proposé des structures secondaires basées sur la formation de régions appariées.
Interaction protéines-rRNA. Chez E. coli, un tiers des 54 protéines qui constituent le ribosome"70S se lie indépendemment l'une de l'autre aux rRNA16S 23S et 55. Plusieurs groupes de chercheurs ont montré que les protéines S4'j 57, 58, 513, 515, 517 et 520 du ribosome 305 sont capables de se lier spécifiquement au rRNA165 (Held; 1974], Dix à onze
protéines du 505 se fixent spécifiquement et indépendamment au rRNA235 et trois autres au rRNA55 (Zimmermann.1974).
Les sites de fixation de ces protéines sur les rRNA ont été caracté risés par l'isolement de fragments de rRNA capables de fixer l'une ou l'autre de ces protéines. Une des techniques employées consiste à frag menter les complexes rRNA—protéines, à séparer les fragments et à ana lyser les finger prints (Muto,1974).
Les sites sont indépendents et aucune des protéines capables de se fixer au rRNA n'entre en compétition avec les autres pour un site donné.
Un site est défini par une séquence de nucléotides et par une structure tertiaire. Le cas de la protéine 54 présente des caractéristiques parti culièrement intéressantes. Elle couvre une grande portion du rRNA165 à 1'extrémité 5' de la molécule. Il est possible que la protéine organise le reploiement du rRNA au cours de l'assemblage du ribosome.
L'étude de la distribution des sites de fixation des protéines tout au long du rRNA a été réalisée principalement par Zimmermann; (l974)
(Fig.3a).
Assemblage. Le développement des techniques de reconstitution in vi tro des sous-unités ribosomiales 305 (iraut et Nomura.1960) à partir du rRNA165 et des protéines isolées, a eu une importance fondamentale dans la connaissance du rôle structurel et ou fonctionnel de chacun des cons tituants.
Ces expériences ont conduit à la conclusion que toute l'information nécessaire à l'assemblage du ribosome est contenue dans la structure de chaque composant et les études sur la séquence d'addition de chaque proté ine au cours de l'assemblage in vitro ont abouti à la construction d'une carte d'assemblage de la sous-unité 305 (pig.3c).
inter-a)
5' -| I H" GH 1^ r ’ ! ] 400 ' [ C C,'KC; D Q- 800 1200 A }3' I6S RNA b) RNA SEGMENTS CONTAINING PROTEIN BINDING SITES 0_____^ AOO ^ ^ eoo 1200 ^ 1600 5-- L H-H-HQ'FQRGM B I' rr r C CTkWÔ'~~0 0' 0 f K P~ 'r~l A J ^ 3' 16S RNA I II m PROTEIN OROUPSt.SI6.SI7.SZ0 S8,SI5.S6,SI8 S7,S9.SI3,SI9 RNA SEGMENT ASSOCIATED WITH PROTEIN GROUP
FIGURE 3-ASSEMBLAGE DU RIBOSOME 30S
a) RNA16S : Sites de fixation des protéines précoces. b) RNA16S : Sites de formation et protéines qui cons
tituent les trois nuclei d'assemblage.
mediaire RI, qui contient 15 protéines, parmi lesquelles on retrouve les S protéines qui se fixent spécifiquement et indépendemment au rRNA 16S (Fig.3a).
L'intermédiaire RI peut être activé par la température et se trans forme en RI* qui peut alors s'associer spontanément au reste des pro téines. La réaction RI —►RI* constitue l'étape limitante de l'assemblage et représente un changement de structure de la particule (21S —►24S).
ün a constaté que les protéines qui constituent l'intermédiaire RI s'organisent en trois groupes indépendents chacun à partir d'un site différent sur le rRNAISS (Fig.3b), ce qui suggère que les premières
étapes de l'assemblage se font par la formation de trois nucléi distincts. L'assemblage du ribosome 505 semble être plus complexe ; plusieurs tentatives pour reconstituer la sous-unité 505 de E.coli à partir de ses composants n'ont pas eu de succès. Le procédé de Marutta et al,(l97l) n'a pas été reproduit mais Nierhaus et Dohme (1974) semblent avoir ré ussi; leurs résultats attendent cependant confirmation.
Les ribosomes 505 de Bacillus stearothermophilus peuvent être recons titués à haute température dans de conditions semblables à celles du ribo some 305 de E.coli (Nomura et Erdmann,1970).
Identité de l'assemblage du ribosome 305 in vivo et in vitro. Diffé rents types d'informations répondent à cette question. D'une part, la composition protéique de certain précurseurs du 305 est en accord avec la carte d'assemblage (Nierhaus et al,1973; Homann et Nierhaus,1971). Quelques mutants cryosensibles accumulent des précurseurs 215 dont l'ana lyse révèle la même composition protéique que les RI (Nashimoto et al, 1971). D'autre part, l'obtention des mutants qui portent un RNA165 sous méthylé (résistants à la Kasugamycine) a conduit à l'étude de la méthy lation in vitro. On a ainsi observé que les protéines qui interviennent têt dans l'assemblage empêchent cette méthylation (protéines du groupe III Fig.3bll est donc évident que in vivo les enzymes de méthylation agis
sent sur des particules intermédiaires.
de particules intermédiaires.
Cette idée a été aussi suggérée par des expériences génétiques lors de la caractérisation d'un mutant affecté dans la protéine S4 et por tant un rRNA16S à l'état de précurseur. Le fait que les rRNA16S et 23S se forment à partir d'un précurseur commun (Nicolaev et al 1973} renforce l'hypothèse d'un couplage possible entre la transcription et l'assemblage du 3QS et du 5GS.
Topographie. L'application des techniques immunologiques par les quelles on mesure la réactivité des ribosomes intacts avec les anti corps dressés contre chacune des protéines ribosomiales, a montré que’ chaque protéine possède au moins un déterminant antigénique accessible à l'anticorps fStoffler et al;1973}.
La méthode la moins ambiguë pour déterminer les rapports de proximité entre les protéines qui constituent le ribosome consiste à isoler et caractériser les dimères formés de deux protéines différentes après réaction du ribosome intact avec un réactif bifonctionnel spéci fique pour les protéines. Lutter et al [1974} ont employé une série d'imidoesters qui ne différent que par la longueur de chaîne séparant les groupes réactifs avec lesquels ils couvrent des distances entre 5 et 9A°. Dans le ribosome 30S on a identifié ainsi plusieurs paires de protéines et ces résultats sont concordants avec la disposition des pro téines suggérée par la carte d'assemblage.
D'autre part l'utilisation de méthodes de fragmentation des riboso mes 30S par la ribonucléase, a conduit à l'obtention de plusieurs frag ments ribonucleoprotéiques de tailles différentes.La composition en pro téines de ces fragments correspond au rapport de coopérativité entre ces protéines pendant l'assemblage in vitro; par exemple, les trois groupes d'assemblage de la carte se retrouvent dans les clusters de ribonucleo— protéines (Fig.3b;c}.
Tous les résultats réunis sur la topographie des protéines ont con duit à l'observation que les protéines se trouvent dispersées plutôt que concentrées sur les différentes régions du rRNA (Kurland,1974}. L'en semble des données expérimentales relatives à la structure et la fonction du ribosome a été résumé dans différénts modèles tridimentionnels.
des proteines au sein du ribosome essentiellement sur les données rela tives à la composition de ribonucléoprotéines et sur qu.elques expériern ces de pontage chimique.
Traut et al (1974), ont présenté des modèles du ribosome 30S et SOS basés sur la carte d'assemblage, sur les résultats des pontages
entre protéines par réactifs bifonctionnels et l'analyse de fragments ribonucléoprotéiques. Enfin, Bollen et al (l974) ont présenté un modèle du ribosome 30S basé sur l'analyse des données expérimentales par compu tation. La sélection des données inclut quatorze approches différentes. Le principe consiste à évaluer en terme de distances les relations de voisinage dérivées dœ différentes approches.
2.2. Fonctions: le cycle du ribosome
Au cours de ce cycle, les ribosomes se trouvent alternativement sous trois formes : polysome, ribosome 70S, sousunité 30S et SOS. A l'état de polysome un ribosome est engagé dans la synthèse protéique et réalise les trois étapes de la traduction d'un RNA messager: l'initiation, l'élongation et la termination de la chaîne polypeptidique. Le ribosome abandonne le messager sous forme de ribosome 70S puis se dissocie en sousunités 30S et SOS. Les différentes activités des ribosomes à un moment donné
du cycle, sont contrôlées par une classe particulière de protéines: les "facteurs". Ces protéines s'associent au ribosome uniquement lors d'une pha
se particulière du processus de la traduction.
L'initiation. L'initiation de la synthèse protéique chez E. coli, néces site la participation des éléménts suivants: le tRNA initiateur f-met-tRNA, le messager, le GTP, les ribosomes 30S et SOS et trois facteurs protéiques IF1,IF2,IF3. Ces composants s'assemblent sous la direction des signaux d'initiation présents dans le messager, constituent le complexe intermé
1973). Le facteur IF2, stimule la fixation dj ribosome au mRNA, reconnaît spécifiquement le f-met-tRNA et assure sa fixation au complexe.
Une des séquences possibles pour arriver à la formation du complexe d'initiation 308 est présentée dans la figure 3, étapes 2 — 5. A l'heure actuelle, on ne sait pas si le f-met-tRNA se fixe au ribosome et, en com binaison avec les facteurs, dirige la sélection du messager, ou si le ribo some reconnaît une séquence de bases ou une structure secondaire dans le
mRNA préalablement à la fixation du tRNA. Les facteurs IF3 et IF1 sont libérés ensuite et la sous-unité 508 se joint pour constituer le complexe d'initiation
708. Cet événement s'accompagne de l'hydrolyse du GTP et de la libération du facteur IF2. Le complexe est prêt pour l'élongation.
La participation active du ribosome 308 à la phase d'initiation dépend de l'action préférentielle de certains des constituents:
Positionnement du f-met-tRNA. Lelong et al (l974), en utilisant des fragments d'anticorps spécifiques des protéines du ribosome 308, ont observé que les anticorps dressés contre les protéines 83, 814, 819, et 821 inhibent fortement l'initiation. D'autre part, l'addition des protéines 82, 83, 84 stimulent la fixation de f-met-tRNA dépendente des IF, ^ “ La protéine 821, quant à elle, pourrait contrôler la fixation du f-met-tRNA au ribosome 308 car son addition en présence du ribosome 508 inhibe la fixation du tRNA ( Van Duin et al, ,1972 ).
Contrôle de l'initiation correcte de la lecture du message génétique. Les protéines 812, 81 et le RNA168 semblent essentiels au maintien de la spécificité de la traduction. On a observé d'une part, que les ribosomes reconstitués en absence de la protéine 812, restent actifs pour l'élongation mais deviennent déficients pour 1'initiation.(Nomura et al,1969). D'autre part, l'utilisation des systèmes de reconstitution hétérologues des ribo somes de E. coli et de B. stearothermophilus, révèle que la substitution de 812 et du rRNA168 de E. coli par les composants correspondants de B. stea- rothermophilus, inhibe spécifiquement l'initiation de la protéine de coque- du phage RI7 sans inhiber les autres messagers du phage (Held et al,1974 b).
Ces expériences ont conduit à l'hypothèse que certaines séquences spé
protéine SI sert à mantenir accesible la séquence du RNA16S, qui est complémentaire à la séquence détectée dans la région d'initiation de plusieurs messagers.
Chez E. coli, une série, des facteurs ont été identifiés comme inhi biteurs de la traduction de certains signaux d'initiation; parmi ceux-ci, le facteur ia, s'est révélé identique à la sous-unité I de la réplicase du phage Q(3 et identique à la protéine SI (Croner et al, 1972; Inouye et al, 1974). Dans la messure où SI est conside'ré comme une vraie protéine ribosomiale, elle constitue un exemple de participation active du riboso me dans la spécificité et le contrôle de la traduction.
L'élongation. Pendant la phase d'élongation le ribosome se déplace tout au long du mRNA vers le signal de terminaison. Ce mouvement se réa lise par étapes, à chaque étape un résidu d'acide aminé s'ajoute au pep tide en croissance.
Les éléments qui interviennent dans l'élongation sont les facteurs G, Tu, Ts, le GTP, les aminoacyl-tRNAs et les ribosomes 70S.
Dans cette étape, toutes les interprétations relatives à la fonction des facteurs d'élongation et les sites ribosomiaux qui sont impliqués, reposent sur le modèle qui postule l'existence de deux sites A et P. Ils ont été définis opérationnellement comme suit: le site A constitue le site auquel se lie 1'aminoacyl-tRNA. Dans cet état il ne réagit pas avec la puromycine (analogue des aminoacyl-tRNAs); le site P est le site auquel se lie le peptidyl-tRNA qui lui réagit avec la puromycine.
L'élongation constitue elle-même un processus cyclique dont les phases comprennent:
a) La fixation séquentielle des aminoacyl-tRNAs au site A.
b) La formation du lien peptidique et le transfert du polypeptide ou du f-met-tRNA ( porté par le tRNA présent au site P) au tRNA placé au site A (réaction catalysée par la peptidyl-transférase).
c) La translocation du peptidyl-tRNA du site A au site P et l'exposi
tion, due au mouvement du ribosome sur le messager, d'un nouveau codon capable d'accepter un nouvel aminoacyl-tRNA ( Fig.4, 2tapes 9 — 11).
Participation des..facteurs
(Tu- aminoacyl-tRNA-GTP).
Le facteur Ts catalyse la régénération de Tu-GTP à partir de Tu- GDP, au travers d'un complexe intermédiaire Tu-Ts; ce comple><Eaurait pour but de maintenir le taux de GTP nécessaire à la formation de Tu-ami-
noacyl-tRNA-GTP.
Après la formation du lien peptidique et le transfert du peptide au
site A, le facter G intervient pour assurer la translocation du pepti- dyl-tRNA du site A au site P. Ce facteur détermine l'hydrolyse d'une molécule de GTP à chaque translocation.
Participation du ribosome.
Au cours de l'élongation, le ribosome présente plusieurs sites ou centres d'activité constitués par des protéines différentes. L'ensemble des données sur cet aspect est résumé par Pongs et al (l974), nous ci terons brièvement le rôle des composants qui paraissent les plus im portants.
Protéines impliquées dans le positionnement de 1'aminoacyl-tRNA au site A et après translocation du peptidyl-tRNA au site P.
Ces fonctions du ribosome ont été étudiées par diverses méthodes, telles que la protection vis à vis de la digestion trypsique par le tRNA-PHE; la stimulation de la fixation du tRNA chargé au ribosome par l'addition de certaines protéines, ou l'emploi de techniques immunolo giques.
Les résultats obtenus ne représentent pas nécessairement les intei>- actions directes entre les diverses protéines et les tRNAs. Cependant elles révèlent, que presque la moitié des protéines du 305 constribuent à ces fonctions ou sont en rapport avec les complexes de tRNA au moment du décodage.
Ainsi, selon les techniques immunologiques (stoffler,1974), 52, 53, 56, 512 et 513 semblent être spécifiques du site P, tandis que 59, 511 et 518 le sont pour la fixation d'aminoacyl-tRNA dépendente du facteur Tu au site A. Les protéines 53, 510, 514, 520 et 521 font partie semble- t-il, d'une région commune aux deux sites. Ces résultats sont corroborés par les autres méthodes.
Bien que la protéine L11, responsable de 1'activité peptidyl-trans- férase, ne soit pas détectée au site A et P on suppose qu'elle doit faire partie (ou être très proche) des deux sites, pour que la formation du
lien peptidique ait lieu.
Le rRNA5S semble jouer un rôle dans la fixation des aminoacyl-tRNA au site A. Certaines expériences montrent que le fragment T 1^ C G dont la séquence est présente dans tous les tRNA, inhibe spécifiquement la fixation enzymatique des aminoacyl-tRNA au site A (Richter et al 1973).
Protéines localisées au site de l'hydrolyse du GTP et qui interagis sent avec les facteurs d'élongation.
La fixation au ribosome du complexe Tu-GTP-aminoacyl-tRNA et du fac teur G, sont des activités dépendantes de l'hydrolyse du GTP. Les pro téines L7 et L12 sont essentielles à leur fonction (iWoller 1974).
La fixation du facteur G au ribosome empêche la fixation subséquen te du complexe Tu-GTP-aminoacyl-tRNA (Modolell et al,1973). Ceci indique que les deux sites se chevauchent. Actuellement on sait que le même site sert à la fixation d'autres facteurs solubles, IF2 qui intervient dans l'initiation et RFs qui interviennent dans la termination (Lockwood et al 1974 ; Brot et al,1974).
Le centre responsable de l'activité GTPapique serait constitué par L7 et L12. Il y a d'autre part des indications qu'un complexe formé du RNA- 23S, RNA5S et des protéines L5, LIS, L20, L25 et L30 possède une activité
GTPasique ou ATPasique.
Composants intervenant dans la fidélité de la reconnaissance codon- anticodon.
L'exactitude de l'association codon-anticodon est contrôlée preféréntiel- lement par des protéines du ribosome 30S. Les protéines S3 et S5 sont im pliquées dans la fixation de la streptomycine (antibiotique qui altère les interactions codon-anticodon). Les protéines S12 et S11 ont des rôles op posés: des ribosomes reconstitués en absence de SI 2 montrent une fréquence très basse d'erreurs de traduction, par contre les ribosomes dépourvus de S11, montrent une fre^^quence accrue du taux d'erreurs (Nomura et al, 1969). Nous verrons plus loin lors de l'exposé des résultats que d'autres pro téines sont impliquées dans cette fonction.
UAA, UAG, ou UGA au site A, se produit l'hydrolyse du peptidyl-tRNA et la libération de la protéine synthétisée.
Les éléments solubles requis pour la terminaison sont les facteurs de terminaison. Le facteur RFI est spécifique pour UAA et UAG, RF2 pour UAA et UGA. Il existe un troisième facteur dont l'identité est contro versé ( un groupe l'aurait identifié au facteur Tu).Il semble que ce fac teur RF3, stimule les activités respectives de RFI et RF2 (Lengyel,1974].
Participation de composants ribosomiaux.
La réaction de terminaison a été mesurée in vitro par la libération de f-met-tRNA, d'un complexe f-met-tRNA-codon terminateur-ribosome. Cette libération dépend de la présence des protéines L7 et L12 ( en présence de facteurs de terminaison) [Srot et al 1974); cependant, elle n'est pas cou-, plée à l'hydrolyse de GTP, et l'action de L7 L12 peut être attribuée à la fixation de facteurs.
Le mécanisme d'hydrolyse du peptidyl-tRNA au site P n'est pas bien compris; une hypothèse suggère que ce rôle serait joué par la peptidyl- transférase. Quelques arguments appuient cette idée. D'une part, on sait que l'activité de la peptidyl-transférase inclut l'hydrolyse du peptide de son tRNA au site P, avant la translocation. Cette même activité serait réalisée au cours de la terminaison et ainsi on explique le fait que les antibiotiques qui inhibent la formation du lien peptidique inhibent aussi la terminaison.
Enfin, par l'emploi d'anticorps dressés contre les protéines riboso- miales, il fut montré que l'anti L6 et l'anti L11 inhibent la terminaison apparemment par blocage de la peptidyl-transférase.(late et al,1974).
Signaux de terminaison et terminaison in vivo.
Dans certains cas, la terminaison naturelle n'est pas respectée. Ce phénomène a été détecté au cours de la traduction de la protéine de coque du phage Q(3 dont le signal de terminaison est UAG et ou l'on obtient une protéine plus longue que la normale.
D'autre part il est possible que les vrais signaux de terminaison d'un
messager soient constitués de deux codons non sense (Nicholds,1970), ou bien l'appareil de terminaison devrait reconnaitre une séquence plus longue que le codon terminateur.
2.3. Antibiotique et ribosome: mode d'action des aminoglycosides
Une série d'antibiotiques bloquent la synthèse protéique à différents niveaux. Ils ont constribué à la connaissance du ribosome par la compré hension de leur mécanisme d'action et par leur utilité dans la recherche des mutants.
Citons deux groupes importants, d'une part les antibiotiques qui affec tent l'initiation, d'autre part ceux qui affectent 1'élongation.[ Tableau 4).
Parmi les antibiotiques qui agissent sur l'initiation, la plupart ap partiennent au groupe des aminoglycosides, ceux-ci agissent sur la sous- unité 30S .D'après leur structure et leur effet particulier sur la syn thèse protéique, ils peuvent être séparés en deux sous-groupes:
1 - Ceux qui provoquent des erreurs de lecture du code génétique (mis- reading),lié à la présence dans leur structure d'un résidu déoxystreptami- ne ou streptamine [pig.5 a] .
2 - Ceux qui ne possédant pas le groupe cité n'induisent pas d'erreurs de lecture, spectinomycine et kasugamycine, (pig.Sb].
A titre d'illustration, nous détaillerons ici le mode d'action de la streptomycine.
Mécanisme d'action de la streptomycine
On sait depuis longtemps que la streptomycine inhibe la synthèse pro téique d'une bactérie sensible. L'étude approffondie des mutants résistants à l'antibiotique a montré que le ribosome 30S constitue le site d'action de la streptomycine et plus particulièrement que la protéine SI2 détermi ne la sensibilité à l'antibiotique (Osaki et al,1969].
Initialement, Luzzato et al [l969] ont observé que dans un système codé par un mRNA viral, la streptomycine inhibe complètement l'initiation de la synthèse protéique.
V TABLEAU 4 - Quelques antibiotiques qui agissent sur le ribosome bactérien
INHIBITEURS DE L'INITIATION
Inhibiteurs agissant au niveau du 305 et déstabilisant le complexe d'initia tion lors de la jonction du SOS.
Inhibiteurs de l'interaction codon anticodon au site A et P de la sous- unité 30S. Dihydrostreptomycine Gentamycine Kanamycine paramomycine Streptomycine INHIBITEURS DE L'ELONGATION
Inhibiteurs de la fixation de l'amino- acyl-tRNA
Inhibiteurs de la formation du lien peptidique Analogue de l'ami- noacyl-tRNA, forme un lien peptidique avec le sustrat au site P Inhibiteurs de la peptidyl transférase Tétracycline Acide fusidique Thiostreptone Puromycine Chloramphenicol Lincomycine Quelques macroli- des INHIBITEURS DE LA TERMINAISON
Reconnaisænce facteur de terminaison- codon fin de chaîne
Réaction de rélâchement du polypeptide
I. Groupe streptomycine Groupe tétracycline Thiostreptone
a) Inducteurs de "misreading" PAROMOMYCIN
NH
II
b) Non inducteurs de "misreading"
SPECTINOMYCIN
OH
CH3
ultérieure. Ainsi en mesurant la stabilité du complexe d'initiation 30S, ils ont observé que l'antibiotique n'inhibe que légèrement sa formation, cependant la streptomycine déstabilise la formation du complexe d'initiation 70S (associée à l'hydrolyse du GTP] en provoquant la libération du f-met-t- RNA. Lelong et al (l97l) sont arrivés à des résultats similaires, ils ont suggéré que la streptomycine provoque une distorsion du site P qui entraine la perte du f-met-tRNA,
Wallace et al (l9'73) d'autre part, ont mesuré l'action de la strepto mycine sur les polysomes (endogènes ou formés in vitro], lesquels peuvent continuer la synthèse de peptides en formation mais ne peuvent pas la rèi- nitier. Ils ont constaté que la vitesse de synthèse est réduite après l'ad dition de la drogue. Ces résultats suggèrent que la streptomycine entraîne un blocage incomplet sur les ribosomes qui ont fixé la drogue à l'état de 70S, mais cette inhibition serait complète quand le ribosome est séparé des autres ligands.
Après que l'antibiotique ait causé la libération du ribosome 30S du complexe d'initiation, il reste associé à la sous-unité 30S. Ces sous-unités associées à la streptomycine sont inertes du point de vue de la synthèse protéique, mais elles peuvent toujours réinitier des complexes qui sont détectables à l'état de polysomes (Cuzzato et al,1969), en constituant un microcycle de réinitiation.
L'existence de ce microcycle pourrait expliquer le phénomène de dominan ce de la sensibilité sur la résistance à l'antibiotique. En effet, la libé ration éventuelle de la streptomycine et la réinitiation constante condui sent à la disparition du messager soit par dégradation soit par blocage dans le complexe (Wallace et Davis,1973).
La streptomycine induit des erreurs de lecture
En 1964, Gorini et Kataja ont observé que l'addition de streptomycine in vivo à des concentrations subléthales, n'inhibe pas la synthèse protéi que, mais provoque la suppression phénotypique de mutations nonsense, appa remment par induction d'erreurs de traduction.
Ces effets de la streptomycine sur la bactérie complète ont conduit à l'étude du phénomène in vitro. On a constaté que dans un système protéosyn- thétique dirigé par des homopolymères, la streptomycine à des concentrations élevées,non seulement inhibe l'incorporation de l'acide aminé correct., mais provoque encore l'incorporation des acide aminés qui ne sont pas codés par 1'homopolymère (Oavies et al, 1964),
de bactériffirésistantes a la streptomycine, a révélé que la 'fréquence d'induction d'erreurs par la drogue était fortement diminuée par rapport au système constitué de ribosomes sensibles (üavies et al,1964).
Le "misreading" induit par la streptomycine et d'autres aminoglyco- sides a été étudié par Davies et al [196S). Ils ont utilisé des systèmes dirigés par différents homopolymères et ont établi certairosrègles pour le"misreading" induit par la streptomycine [Tableau 5)
l'ablc 4. Sitmmary of misnadiug paticrns induccd by strcpich
tfiyàn
5'-basc Internai base 3'-base
U -V C, A U -vC wobblc C -> U C - U A ] no misreading, i ncighbouring G J base cfTects A ] no misreading, I ncighbouring G I base cfl'ccts I less niarked ( du codon ) TABLEAU 5
Misreading des messagers naturels
Leffiénomène de misreading détecté avec les homopolymères semble para doxal; comment comprendre le fait que la drogue inhibe la synthèse protéi que et en même temps exerce son effet d'induction d'erreurs?
Davies et al[l974)ont fait l'hypothèse qu.' à basse concentration la streptomycine dminuerait la vitesse d'élongation des ribosomes en affec tant leur fonction mais en leur permettant cependant de participer à la synthèse protéique et d'induire des erreurs de lecture. Ils ont corroboré cette hypothèse en montrant in vitro la coexistencecfes deux actions.
Lando et al [1973) ont étudié in vitro dans un système codé par des messagers tardifs du phage T4, l'effet de la streptomycine sur la synthè se protéique totale et sur l'activité spécifique du lysozyme synthétisé. Ils ont observé qu'en présence de la drogue l'activité du lysozyme est beaucoup plus altéréeque la synthèse des protéines totales; la différen ce entre les deux valeurs doit être atribuasau misreading.
Les antibiotiques comme la spectinomycine et la kasugamycine ne mon trent pas de différence entre l'inactivation de la synthèse totale et du lysozyme dans le même système.
un phénotype sensible. En présence de streptomycine la bactérie peut continuer la synthèse protéique quoiqu'elle ne se déuéloppe pas, et ac cumule des protéines anormales.
Fixation de la streptomycine radioactive aux ribosomes
Les caractéristiques et l'équilibre de cette réaction ont été étu diés par Chang et Flaks(1972a,b]ils observent que les ribosomes 70S fixent la streptomycine à raison d'une molécule par ribosome avec une
K : IX 10 dis
- 7
Le ribosome d'une bactérie résistante ne fixe pas l'antibiotique (Kaji et Tanaka,1968}, la protéine S12 (responsable de la résistance} est donc un élément essentiel du site de fixation, bien que isolement elle ne se lie pas à l'antibiotique (Schreiner and Nierhaus, 1973}.
Le site a été bien caractérisé par plusieurs groupes (Schreiner et Nierhaus,1973; Pongs et Erdmann,1973}. Il semble constitué d'au moins 5 protéines, S3, S5, 89, S14, et 810. La streptomycine semble se fixer aussi sur le RNA16S (Biswas et Gorini, 1972}. Cette fixation pourrait être la cause des observations de Garvin et Gorini,(1974}: ils trou vent que les ribosomes de bactéries qui ont poussé en présence de strep tomycine montrent une ambiguité accrue par rapport aux ribosomes qui n'ont pas été en contact avec l'antibiotique. Ceci suggère que la strep tomycine exerce son effet au niveau de l'assemblage, peut-être du fait
3 - GENETIQUE DU RIBOSOME ■
On connaît à présent un grand nombre de mutants qui affectent le système protéosynthétique. L'étude génétique du ribosome repose sur plusieurs ap
proches:
- Recherche de mutants affectés dans les composants structurels et iden tification des gènes de structure.
- Recherche de mutants affectés dans les gènes intervennant dans la mo dification de composants ribosomiaux ou dans l'assemblage de la particule.
- Etude de l'organisation de gènes dans le chromosome, et
- Recherche de mutants affectés dans le gènes de régulation de l'expres sion des gènes ribosomiaux.
3.1. Gènes de structure des rRNA ribosomiaux.
Les gènes codant pour les rRNA ribosomiaux existent à plusieurs exem plaires dans le chromosome; ils sont donc redondants;
Sur base d'études par expériences d'hybridation et des estimations du rendement molaire de séquences de differents résidus trouvés dans le rRNA 5S (Spadari et Ritosa, 1S70; Jarry et Rosset, 1971, a, b.) on pense qu'il existe entre 4 et 10 gènes pour chaque rRNA. D'autre part, des expériences d'hybridisation indiquent qu'il y a des quantités équivalentes des gènes du RNA16S et du RNA23S sur le chromosome bactérien.
Chacun des trois types de rRNA montre une hétérogénéité des séquences des rRNA mûrs. Ils diffèrent à plusieurs positions, 4 résidus dans le cas des rRNASS et 16 résidus dans le cas des rRNA16S. L'hétérogénéité a été aussi observée pour les gènes du rRNA23S.
Les différents gènes codant pour chaque rRNA, 16S, 23S, 5S, codent donc pour différents espèces de rRNA.
Diverses expériences ont permis d'établir que les rRNAs bactériens sont organisés en unités de transcription contenant un gène de chaque type, dans l'ordre 1GS - 23S - 5S. Parmi ces expériences ont peut citer les analyses de la synthèse des rRNA après inhibition par la rifampicine (Pato et von Me- yenberg, 1970). D' autre part, Nikolaev et al (l973) ont étudié un mutant de Escherichia coli qui accumule un précurseur des rRNAs. Ils ont montré que ce précurseur, prRNA "30S", entre en compétition avec les RNAs 16S et 23S dans des expériences d'hybridisationJ il semble que ce précurseur con
tient en plus des séquences spécifiques pour le rRNA5S.
muta-tions affectant directement les gènes des rRNAs et il est peu probable que l'on puisse les obtenir par les méthodes courantes.
En absence de mutations, on a utilisé d'autres moyens pour localiser ces gènes. D'unepart on a employé des techniques d'hybridation DNA - RNA en utilisant des bactéries mérodiploides portant différents épisomes , sur la base que le DNA de souches portant des gènes de rRNA dans son é- pisome aurait une plus grande capacité d'hybrider les rRNA].
D'autre part on a employé des méthodes de croisements intergénériques ou interspécifiques en utilisant comme marqueur un oligonucléotide spécifique
du rRNASS; de cette façon on est arrivé à identifier plusieurs gènes codant pour le rRNASS: les gènes cqsA et cqsB chez E;coli K et les gènes cqs B - C - D chez H/1RE600 [Tableau s].
Ces expériences permettent de localiser sans ambiguité les gènes dans la souche donneuse, mais n'assurent pas la présence d'un gène équivalent dans la souche réceptrice. Le même principe a été utilisé pour localiser les gènes du rRNA16S et 23S.
Différentes approches de localisation faites indépendemment, montrent des positions coinoidentes pour les gènes de rRNA16S et 23S dans quatre régions du chromosome où les gènes des rRNASS ont été localisés.
L'ensemble de ces données(Tableau 5) est compatible avec l'hypothèse que dans une bactérie tous les gènes de rRNA sont organisés en unités de transcription contenant un gène de chaque type, bien que il y ait contra diction quant à la place définitive de deux groupes de gènes de rRNA16S et 23S.
A présent, une unité de transcription a été définitivement localisée à la minute 77. Elle inclut les gènes du rRNASS. (cqsA) et aussi le gène de structure du tRNAglu. Cette unité a été identifiée par des croisement in-" ' tergénériques et par la présence de ces gènes dans un phage A transducteur.
3.2. Genes de structure des protéines ribosomiales.
Sélection des mutants
Dans la recherche de mutants affectant les gènes qui codent pour les composants d'unestructure aussi complexe que le ribosome, le moyen de sé lection qu'on emploie est décisif pour le type de mutation qu'on peut obte nir.
Mutation Dénomina tion du gène
Composant altéré :
Protéine RNA Modifica teur
Position dans la carte
5élection ou phénotype Références
res 1 ? 0,5' restriction non associéeà une
résistance, accompagne la muta tion ksgA
Garvin et Gorini,197>
ram B S4 î 0,5' modification de 54, phénotype
d'aumentation de l'ambiguité in vitro Zimmerman et al,1973 ksg A 16S méthylase spécifique 1 ' résistance à la kasugamycine 30us-méthylation du RNA16S Helser et al,1972 S20 1 ' réversion de la thermosensibi—
lité due à la mutation de l'.a— lanyl-tRNA-synthétase
Bück et al,1973 Wittmann et al, 1974
rpxB 52 3,5' réversion de la cryosensibilité
due à la mutation sad.
Nashimoto et Ushida, 1975.
présence du gène dans un phage X transducteur de polC
Nomura, comm, pers.
ksg C 52 ? 10' résistance à la kasugamycine Yoshikawa et al,1975
linB rimC 25' 25' ts ? IF3 30' relB rimB 30 ' 30 ' rib.. 16S + 235 55-59' rib.. cqsD (MRE600) ram A rpxD 165 + 235 55 54 60-66' 62,5-63,5 64' I
résistance à la lincomycine Apirion et 5chlessin- ger, 1969
cryosensibilité, défaut de la maturation du"ribosome; 505 à 20°
5ypherd et al, 1974
thermosensibilité de l'initia tion de la synthèse protéique in vitro qui est corrigée par le IF3 normal
phénotype partiellement relax
Opringer et Grumberg Wlanago, 1975.
cryosensibilité, défaut de la maturation du ribosome 505 à 20°
Oypherd et al, 1974
hybridation avec le DNA de sou ches mérodiploides pour cette région
Unger et al, 1972
Il II Gorelic, 1970
transduction des oligomères spécifiques Jarry et Rosset, 1973 augmentation de l'ambiguité de la traduction Rosset et Gorini,1969 réversion de la dépendance à la streptomycine Zimmerman et al, 1971 Birge et Kurland, 1970 Bjare et Gorini, 1971
résistance à la néamine en com binaison avec certaines mutations dans le gène de 512(rpxL°
cette thèse
(smD^^'^)
traduction
rréversion de la dépendance à la streptomycine
(sad } -défaut d'assemblage du riboso
me 30 S
-réversion de la thermosensibili té due à la mutation de l'alanyl- tRNAsynthétase
-résistance à la néamine en com binaison avec certainesmutations dans le gène de S12
neaA rpxQ S'17 64' résistance à la néamine
augmentation de la fidélité de la traduction
ts rpxWI SB 64' thermosensibilité pour la crois
sance
réversion de la thermosensibili— té due à la mutation de la valyl- tRNA-synthétase
nek rpxF S6 64' corésistanpe à la néomycine et à
la kanamycine
rpyE L5 64' résistance à la thiopectine
rpy LIS 64' thermosensibilité et cryosensibi-
lité pour la croissance
ery A rpyD L4 64' résistance à
1
'érythromycineCabezon et al, 1976 Sfûffler et al, 1971 Kreider et Brownstein, 1972 Gutrie et al, 1969 a, b Nasimoto et al, 1971 Ruffler et al, 1974 Witmann et al, 1974 De Wilde et al, 1975 Bollen et al, 1975 Phillips et al, 1969 Stadler, comm. pers. Wittmann et al, 1975 Apirion et Schlessinger, 196B Hitz et al, 1975 Liou et al, 1975 Berger et al, 1975 □taka et al, 1970
Brown and Apirion, 1974 Wittmann et al, 1974
strA fus "K" cqsC (MRE600) rpxC 53 rpxL 512 EFG rpxH 57 55 64' 64' 64’ 64' 65,3-65, réversion de la cryosensibilité due à la mutation sad
Nashimoto et Ushida, 1975
•résistance à la streptomycine •dépencbnce à la streptomycine •aumentation de la fidélité de la
traduction: restriction de la sup pression informationnelle
•résistance à la néamine en com binaison avec certaines mu
tations dans le gène de 55 (rpxE) ■résistance à la néamine en combi
naison avec certaines mutations dans le gène de 54
•restriction de la suppression in- fomationnelle non associéeà la résistance
•thermosensibilité pour la crois sance Ozaki et al, 1969 Birge et kurland, 1969 Gorini, 1969 •Breckenbridge et Gorini, 1970 De Wilde et al, cette thèrsè Garvin et Gorini, 1975 Kang et al, 1970 a, b.
■résistance à l'acicb fusidique Tocchini-Valentini et Mattoccia, 1968
•thermosensibilité pour la crois sance
Ku'i'ano et al, 1971 Tanaka et al, 1971
différence de charge et de PM entre les protéines 57 des sou ches K et B
Leboy et al, 1964 Birge et al, 1969
transduction des olygomères spécifiques
Jarry et Rosset, 1973
cqsB (K12S) 55 rib. 2 [k12S) 165 + 235 rib i 165 + 235 cqsA (K12S) 55 165
[2
exemplaires) rib 2 165 + 235 rib 2 165 + 235 + 55 rimA rimD res ? rpyL L7 - L12 relC L10? rpx 518 74,3 -74,7 74.6 -74,7 74.7 -78' 75,5 -77,5 78' 78.7 -78,9 79' 75' 75 -81' 75' 79' 79' 84'transduction des olygomères spécifiques
Jarry et Rosset, 1973
hybridation avec le DNA de l'épi some KLM
-Deonier et al, 1974
Il II Il II
transduction des olygomères spécifiques
Jarry et Rosset,1973
conjugaison: transfert des olygomères spécifiques
Matsubara et al, 1972
hybridation avec le DNA de l'épi some KLM et M. Electrohique
-Deonier et al, 1974
présents dans un phage X trans ducteur Lindhal et al, 1975 cryosensibilité, défaut de la maturation du ribosome 505 à 20° 5ypherd et al, 1974 Il II Il II
restriction non associé à la ré sistance à la streptomycine
Elseviers et Gorini, 1975
altération de la mobilité élec trophorétique
Watson et al, 1975
phénotype relax en présence du produit du gène relA+
,-riesen et al, 1974
résistants aux antibiotiques a été un des moyensles plus fructueux. On est arrivé ainsi à localiser plusieurs marqueurs de résistance à la mi nute 64, notamment les marqueurs spcA, eryA, eryB, strA, fus et neaA
(cette thèse) et à l'identification des gènes de structure des protéines correspondantes*(voir Tableau 5 et carte; Fig.6).
D'autres méthodes d 'isolement des mutants tels que la recherche des mu tants conditionnels létaux, ont été utiliséspour la recherche de mutants cryosensibles et thermosensibles. Parmi les mutants thermosensibles obte nus jusqu'à présent, on a trouvé des mutants affectant le gène du facteur d'élongation G (fus) et le gène strA (rpxL). Bien que, l'identité entre le phénotype thermosensible et l'altération dans la protéine SI2 n'ait pas été définitivement établie, ce mutant a été exploité biochimiquement pour ^ ses propriétés particulières dans l'initiation.
On a aussi obtenu des mutants thermosensibles affectés dans les facteurs d'élongation Tu et Ts . Leurs mutations n'ont pas été localisées. Cependant les expériences de Jaskunas et al (l975c)sur la localisation des gènes pré sents dans des phages transducteurs (on les discutera plus loin) montrent 1'exis'*"ence de deux gènes pour le facteur Tu, ce qui pose un problème
f
dans l'interprétation du phenotype thermosensible du mutant affecté dans le gêne de Tu.
L'observation que l'assemblage in vitro dépend de la température est à la base de la recherche des mutants cryosensibles, parmi ceux-ci on atten dait deux types :d'üne part desmutants affectés dans des gènes dé structure d'un composant crucial pour l'assemblage; d'autre part si l'assemblage était couplé à d'autres processus de biosynthèse des composants, on pouvait trou ver des mutations affectant les gènes de structure d'enzymes impliqués dans des modifications postranacriftionelles des composants ribosomiaux.
Plusieurs^^cryosensibles ont été sélectionnés, mais n'ont pas été carac térisés au point de pouvoir les atribuer à l'urEou l'autre des classes atten dues. Ainsi Guthrie et al.(l96§)*ont obtenu des mutants qui accumulent des précurseurs du 5üS ou bien du 30S et SOS; certains d'entre eux ont été loca lisés dans la région aroE, d'autres ailleurs, mais leurs composants altérés n'ont pas été identifiés.
D'autre part, Sypherd et al (l974) ont trouvé quatre classes de mutants cryosensibles, placés à des endroits différents de la carte génétique en
dehors de la région 64'. Ils présentent tous des défauts d'assemblage du ribosome SOS, mais le composant altéré n'a pas non plus été identifié.
Néanmoins, Nashimoto et al (l97l], en sélectionnant des mutants spcR qui présentaient en même temps un phénotype cryosensible, ont trouvé un mutant qui à basse température accumule un précurseur de 30 et SOS qui sert d'intermédiaire normal dans la biosynthèse des sous-unités riboso- miales. Ce mutant a été utilisé ensuite pour la recherche de pseudoré- vertants pour la cryosensibilité et l'assemblage normal (Nashimoto et Uchida,197S) en obtenant des mutants affectés dans d'autres protéines notamment S2 (localisée à 3,S), S3 (localisée à 64'} et aussi dans la pro téine SS (64').
y
Ces résultats sont intéressants notamment dans la mesure où la
cor-J
relation fonctionnelle entre ces protéines observée génétiquement lors de la sélection, se retrouve quand on analyse leurs relations dans la carte d'assemblage (Fig.3-a .pag, }.
Des mutants affectant la maturation des composants ont été trouvés par d'autres moyens de sélection. Un cas est constitué par les mutants résistants à la Kasugamycine KsgA (localisés à 1'} qui portent un rRNA16S
!
sous.nethylé; ce fait est la conséquence d ' ure mutation qui affecte le gène
)
codant pour une methylase spécifique.
Dans un cas , l'isolement des mutants ksgR à la NTG à conduit
.en même temps à l'obtention d'une mutation affectant la protéine S4 (loca lisée également à 1'}. Etant donné que le gène de structure de la protéine S4 a été identifié et localisé à 64'cette mutation pourrait affecter un gène de modification.
Finalement on a le cas des mutants affectés dans le gène de structure de la RNAaselII, qui accumulent un grand précurseur de rRNA16S et23S (Niko- laev et al,1971}
Il y deux autres approches intéressantes bassées aussi sur l'interdépen dance fonctionnelle des éléments qui interviennent dans la synthèse protéi que. D'une part, la recherche de pseudorévertants cfun mutant thermosensible
>
pour la synthèse d'une aminoacyl-tRNA-synthetase a conduit à l'obtention de mutants altérés dans la protéine S2Q (la mutation est localisée A 1'} .
Localisation des groupements de gènes
Plusieurs gènes codant pour les protéines ribosomiales ont été localisés près de la minute 64 sur la carte génétique, par transduction intergéné rique, ou par transfert d'épisomes de E. coli dans Serratia (Takata,1972) Ces méthodes ont permis la localisation de 20 gènes de protéines riboso miales (Pig.e).
Récemment Jaskunas et al(l975 a et c) ont isolé des phages Atransduc- teur des gènes compris entre les marqueurs trkA et strA et entre trkA et fus. Ils ont détecté dans ces phages la présence de quelques gènes nou veaux, ce qui porte à 39 le nombre des gènes des protéines ribosomiales qui se trouvent placés à la minute 64 (Pig.6].
L'obtention des phages transducteurs a ouvert des possibilités nouvelles dans l'étude de l'organisation des gènes ribosomiaux. D'une part, la loca lisation des groupes de gèries portés par le phage peut être réalisée selon deux approches: stimulation de la synthèse in vivo, ou analyse des pro duits synthétisés in vitro. D'autre part ces phages permettent des loca lisations plus précises in vitro: à l'aide des enzymes de restriction le DNA du phage est fragmenté et les produits codés par ces fragments sont analysés in vitro. L'utilisation des différents enzymes de restriction permet d'étudier l'ordre des fragments et les gènes qu'ils portent (jas kunas et al, 1975b,c).
Il reste cependant une objection à l'utilisation de ces phages, c'est la possibilité qu'au moment de la formationdes phages transducteurs se produisent des délétions ou réorganisation des gènes. Un exemple de ce ty pe de problèmes serait le fait que le gène eryA (L4) et neaA (S17) locali sés entre spc et str n'ont pas été détectés dans les phages transducteurs. Finalement ces phages permettent d'aborder le problème de l’expression des gènes ribosomiaux; cet aspect du problème sera discuté dans la dernier section.
Nous avons mentionné l'existence d'un mutant de phenotype relax, loca lisé à la minute *79, ayant une protéine du ribosome 50S modifiée Lindahl et al et al(1975) ont étudié les gènes présents dans un phage transducteur des
sous-unités (3 et p' de la RNApolymerase, isolé par Kirschbaum et Scaife, (1974) et effectivement, ils ont trouvé un groupe de protéines du 50S as sociés à des gènes de structure des RNAribosomiaux (Fig 6).
30' sont localisés des mutations qui, soit directement, soit indirecte ment affectent des fonctions ribosomiales, citons entre autres: relB, macD et probablement le gène du facteur IF3 [Fig.6 et Tableau 5).
3.3 Mutations ribosomiales et fidélité de la traduction
Parmi les mutants résistants aux antibiotiques, les mutants strR ont été les premiers dont le phénotype ait pu être associé à un chan gement dans ure protéine du ribosome 30S et leur position dans le chromo some a été localisée à la minute 64 (Hashimoto, I960].
Le gène strA (rpxL) définit la synthèse de la protéine SI 2 [Osaki et al, 1969). les mutations qui l'affectent sont pléiotropiques: résistance ou dépendance à la streptomycine, dépendance à d'autres drogues [ Gorini et al,1967); Bjare et Gorini,197l) et le plus caractéristique, le phéno type de restriction de l'efficacité de la suppression informationnelle
[couturier et al,1964; Kuwano et al,1968; Strignini et Gorini, 1970; Bis- was et Gorini, 19'72).
Une des premières indications concernant le phénotype restrictif de la mutation strR fut 1'observation que le phénotype "leaky" de certaines mutations non sense se transforme en auxotrophie absolue quand la bactérie porte une mutation strR. Le phénotype de "leakyness" pouvait être récu péré dans cette bactérie de deux façons:en remplaçant la mutation strR par l'allèle strA+ [Gorini et al, 1966) ou bien par addition aux cultures de doses subléthales de streptomycine [Gorini et Kataja,1964). Ce dernier phénomène a été appelé "suppression phénotypique".
In vitro, la présence de l'antibiotique provoque des erreurs de lectu re [misreading) ,* ce phénomène est fortement réduit lorqu'on utilise des ribosomes d'une bactérie strR [Oavies et al,1964),
Ces faits ont suggéré l'existence d'un contrôle ribosomial de l'ambi guité de la traduction [celui-ci serait accentué par la présence de la mu tation strR et diminué par la présence de la streptomycine) et ont conduit
Rosset et Gorini [l969) à rechercher des mutants ribosomiaux dans lesquels ce contrôle est altéré.
Ainsi, par sélection de révertants phénotypiques de la restriction
im-/ im-/
posé par la mutation strR, c'est à dire, par récupération du phenotype leaky on obtient les mutants ram. Ces mutations affectent le produit du gène
