Disponible à / Available at permalink :

- - -

- - -

Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository

Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Deschuyteneer, M. (1983). Etude de l'endocytose adsorptive dans les hépatocytes en culture primaire (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.

Disponible à / Available at permalink : https://dipot.ulb.ac.be/dspace/bitstream/2013/213804/1/bf8a97e0-61b7-40cb-b1f3-15699d5936b3.txt

(English version below)

Cette thèse de doctorat a été numérisée par l’Université libre de Bruxelles. L’auteur qui s’opposerait à sa mise en ligne dans DI-fusion est invité à prendre contact avec l’Université (di-fusion@ulb.be).

Dans le cas où une version électronique native de la thèse existe, l’Université ne peut garantir que la présente version numérisée soit identique à la version électronique native, ni qu’elle soit la version officielle définitive de la thèse.

DI-fusion, le Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles, recueille la production scientifique de l’Université, mise à disposition en libre accès autant que possible. Les œuvres accessibles dans DI-fusion sont protégées par la législation belge relative aux droits d'auteur et aux droits voisins. Toute personne peut, sans avoir à demander l’autorisation de l’auteur ou de l’ayant-droit, à des fins d’usage privé ou à des fins d’illustration de l’enseignement ou de recherche scientifique, dans la mesure justifiée par le but non lucratif poursuivi, lire, télécharger ou reproduire sur papier ou sur tout autre support, les articles ou des fragments d’autres œuvres, disponibles dans DI-fusion, pour autant que :

Le nom des auteurs, le titre et la référence bibliographique complète soient cités;

L’identifiant unique attribué aux métadonnées dans DI-fusion (permalink) soit indiqué;

Le contenu ne soit pas modifié.

L’œuvre ne peut être stockée dans une autre base de données dans le but d’y donner accès ; l’identifiant unique (permalink) indiqué ci-dessus doit toujours être utilisé pour donner accès à l’œuvre. Toute autre utilisation non mentionnée ci-dessus nécessite l’autorisation de l’auteur de l’œuvre ou de l’ayant droit.

--- English Version ---

This Ph.D. thesis has been digitized by Université libre de Bruxelles. The author who would disagree on its online availability in DI-fusion is invited to contact the University (di-fusion@ulb.be).

If a native electronic version of the thesis exists, the University can guarantee neither that the present digitized version is identical to the native electronic version, nor that it is the definitive official version of the thesis.

DI-fusion is the Institutional Repository of Université libre de Bruxelles; it collects the research output of the University, available on open access as much as possible. The works included in DI-fusion are protected by the Belgian legislation relating to authors’ rights and neighbouring rights.

Any user may, without prior permission from the authors or copyright owners, for private usage or for educational or scientific research purposes, to the extent justified by the non-profit activity, read, download or reproduce on paper or on any other media, the articles or fragments of other works, available in DI-fusion, provided:

The authors, title and full bibliographic details are credited in any copy;

The unique identifier (permalink) for the original metadata page in DI-fusion is indicated;

The content is not changed in any way.

It is not permitted to store the work in another database in order to provide access to it; the unique identifier (permalink) indicated above must always be used to provide access to the work. Any other use not mentioned above requires the authors’ or copyright owners’ permission.

ETUDE DE L'ENDOCYTOSE

ADSORPTIVE DANS LES HEPATOCYTES EN CULTURE PRIMAIRE.

Thèse présentée en vue de l'obtention du grade de

Docteur en Sciences Zoologiques.

\ MICHEL DESCHUYTENEER

LABO.RATOIRE FONDE PAR ALBERT CLAUDE

Michel DESCHUYTENEER Titre de la thèse annexe:

"L'étude conjointe des modifications de glycoconju- gués membranaires et de l'apparition du potentiel invasif au cours de la cancérogenèse devrait permettre de mieux définir la corrélation entre les deux

phénomènes et le rôle des glycoconjugués dans

1'invasion."

FACULTE DE MEDECINE

LABORATOIRE DE CYTOLOGIE ET DE CANCEROLOGIE EXPERIMENTALE

ETUDE DE L'ENDOCYTOSE

ADSORPTIVE DANS LES HEPATOCYTES EN CULTURE PRIMAIRE.

3C)A SI Q

-ZD S SH

Thèse présentée en vue de l'obtention du grade de

Docteur en Sciences Zoologiques.

MICHEL DESCHUYTENEER

5ViS'iC

dz ntaJLOiQJi une tkz&z de doctorat danA ion laboAxutolAz. Vz la. t/iop b^zvz pzAÂodz où j'cU. iAaocUZlz ioui io. dOizctlon, jz goA.dz'icU.

ivuitovut Iz iouoznÀA. du zkz/LzkzuA à V znthouilaimz cormunlcatii qui guida mz6 pfiZMizni poi dam la AzcheAchz en bi.ologlz zzUutaiAz.

J Z ioukcuLtz zxpAÂjnzn. ma gA.atitudz au PA.o^ziizuA

Gyiztz 'Jan dz \U,jvzn., zo-pKomotzuA de czt ouofiagz, pouA l'appui, zomlant zt la con^lancz qu'zllz m'a accoAdz.

Jz AzmzAcû.z lAzà vlvmznt Iz PAo^zazoA. Paul Galand dzi zncouAagzmzntô zt dzi conôeÂlà qu'il m'a pAodlguzi, alnil quz d'avolA blzn voulu iz ckoAgzA dz la IzctuAz cAltiquz dz mon

pAQjnlzA manuicÂXt.

Czttz Ihziz Z6t zn gAandz poAllz Iz AziulXat d'unz ^

- tuzuiz zoUaboAcUlon avzz Jzan-Paul PAlzzli, du laboAotolAz dz Chlmiz GznzAolz l, qui m'a aldz zl zonizillz avzz patiznzz tout au long dz mon tAavcUl. Qu'Il tAouvz Ici V zxpAZiilon dz ma pAo^ondz Azconnaliiancz.

Jz AzmzAclz poAtlculizAzmznt RogzA Moiizlmani, avzz qui j'zui gAond plalilA à zollaboAZA zt qui me {^It loAgzmznt pAo^ltzA dz ion zxpêAlzncz en mlcAoizoplz zlzztAonlquz.

Jz tlzni à AzmzAzlzA Vznliz BzAnazAt, Claudz May zt

Jzan-Paul PzAAoudln qui m'ont'■^cût bznz^lzlzA dz IzuAi pAzclzux

zonizili.

J'adAZ66z un t/iz-b gn.and mz/izl à ma - ôozua MoAtinz qui .ô'zàt gzntùnznt dzvouzz à ta dactgtogfiaphtz dz mon tA.avatt.

Ne pouvant tz6 cÂXzA tovu>, ce qui accAoZt>icUt Iz fiti,quz dz {lâzhzux oubtl&, jz azmzActz zn{^in cottzctlvzmznt touà ceux qui, à quztquz titnz quz ce ^ott, ont appohtz tzuA zontAtbution à ta azatitation dz zzt ouvfiagz. Qu'tti, iachznt combtzn j'ai appnzziz tzuÂ. zonzouu.

Czttz thziz dz doctorat a ztz azatUzz avzz tz

-ioutizn t^tnanziza dz t'Institut pouA t'EncouAogzmznt dz ta

RzchzAchz dans t'îndustAiz zt t'AgnicuttuAz.

I. L'ENDOCYTOSE 4

I.l. La phagocytose 4

1.2. La pinocytose 5

1.2.1. Pinocytose adsorptive aspécifique 6

1.2.2. Pinocytose adsorptive spécifique 6

1.3. Le système vacuolaire de l'endocytose 7

1.3.1. Les vésicules d'endocytose 7

1.3.1.1. Le phagosome 7

1.3.1.2. La vésicule de pinocytose fluide 7

1.3.1.3. La vésicule d'endocytose adsorptive 8

1.3.2. Les endosomes 9

1.3.3. Les lysosomes 9

1.3.4. L'appareil de Golgi 10

1.4. Le trafic des membranes cellulaires 11

1.4.1. L'exocytose 11

1.4.2. Le transit transcellulaire 12

1.5. Le recyclage des membranes 13

II. LES LECTINES MEMBRANAIRES 14

II.1. Les lectines 14

N-acétylglucosamine 18 11.2.4. Le récepteur hépatique de la N-acétylglucosamine chez les

oiseaux 18

11.2.5. Le récepteur mannose-6-phosphate 19

• III. LES CELLULES HEPATIQUES 20

111.1. Les cellules sinusoïdales 20

111.2. Les hépatocytes 20

111.2.1. Surface cellulaire 21

111.2.2. Cytoplasme et noyau 22

III.3. Isolement et culture des hépatocytes 22

BUTS DU TRAVAIL 25

MATERIEL ET METHODES 29

1. Modèle animal 30

2. Produits spéciaux 30

5. Etude des récepteurs galactose et fucose 33

5.1. Préparation des sondes moléculaires 33

5.2. Procédure expérimentale 33

5.2.1. Cellules isolées 33

5.2.2. Cellules en culture 34

5.2.3. Procédures communes 34

6. Rôle du récepteur galactose dans la réassociation des

hépatocytes 35

7. Préparation des cellules en culture pour la microscopie

électronique 35

7.1. Fixation et post-fixation 35

7.2. Mise en évidence cytochimique des phosphatases acides 36

7.3. Enrobage 36

7.4 Coupes 37

7.5 Coloration 37

7.6. Observations 37

9.1. Préparation des colloïdes d'or 38

9.2. Couplage des protéines à l'or 39

9.3. Procédure expérimentale 40

9.3.1. Captation et endocytose des complexes galBSA-Au 40 9.3.2. Analyse quantitative du transfert intracellulaire du marqueur 40

9.3.3. Contrôles 41

RESULTATS ET DISCUSSION 43

I. ETUDE DES SYSTEMES HEPATIQUES DE RECONNAISSANCE DE

CARBOHYDRATES 44

1.1. Préservation du récepteur d'asialoglycoprotéines dans les

cultures d'hépatocytes 44

1.1.1. Captation et internalisation d'asialo-orosomucoîde 44 1.1.2. Spécificité de la captation d'^^^I-ASOR 45 1.1.3. Captation spécifique d'N-acétyllactosaminyl-albumine 45

DISCUSSION 46

1.2. Rôle du récepteur d'asialoglycoprotéines dans la réassociation

des hépatocytes en culture 47

DISCUSSION 47

1.3.2. Captation spécifique de la fucosyl-albumine 49

DISCUSSION 49

1.4. Etude des systèmes de reconnaissance du galactose et du fucose dans les hépatocytes isolés maintenus en suspension 50

DISCUSSION 51

1.5. Essais en vue de la mise en évidence éventuelle de sites spécifiques de fixation pour la N-acétylglucosamine de

glycoprotéines sur les hépatocytes en culture 52 1.5.1. Captation spécifique de 1'agalacto-orosomucoTde 52

DISCUSSION 53

1.5.2. Captation de la N-acétylglucosaminyl-albumine 53 1.5.3. Inhibition de la captation d'^^^I-AGOR par différents ligands 54

DISCUSSION 54

II. ETUDE MORPHOLOGIQUE DE L'ENDOCYTOSE ADSORPTIVE DANS

HEPATOCYTES EN CULTURE 55

11.1. Endocytose spécifique par l'intermédiaire du récepteur

d'asialoglycoprotéines 55

11.1.1. Reconnaissance spécifique du complexe galBSA/or colloïdal par

le récepteur d'asialoglycoprotéines 56

11.1.2. Endocytose du complexe gaIBSA/or colloïdal lors d'incubations

continues à 37°C jusqu'à 90 min 56

11.1.2.1. Surface cellulaire 56

11.1.2.2. "Coated vesicles" et endosomes 57

11.1.2.3. Structures tubuliformes 58

11.1.2.4. Corps multivésiculaires 58

11.1.5. Analyse quantitative de la distribution du ligand à la surface

cellulaire 61

11.1.6. Incubations continues de longue durée avec la gaIBSA/or

colloïdal 61

11.1.6.1. Accumulation du traceur dans les lysosomes 61

11.1.6.2. Marquage des canalicul es biliaires 62

DISCUSSION 62

Lenteur du transport dans les hépatoaytes en aultvœe 62

Les aoated pïts et l Hntemalisation du complexe 63

Passage du complexe dans les aoated vestcles et les

endosomes 64

Accumulation transitoire du ligand dans les corps

multivêsiculaires 65

Dégradation du ligand dans les lysosomes 66 Présence du ligand dans les vésicules de sécrétion 67

Préservation fonctionnelle de la polccrité biliaire dans

les hépatocytes en cultune . 68

En résumé 69

11.2. Endocytose de la ferritine cationique 70

11.2.1. Etapes de l'internalisation de la FC 70

11.2.2. Marquage de vésicules de sécrétion par la FC 71 11.2.3. Retour de la FC à la surface cellulaire 72

11.2.4. Blocage de l'endocytose à 4°C 72

DISCUSSION 72

Endocytose de la FC via les coated pits 72

Transport intracellulaire de la FC 73

Retour de la FC vers la surface cellulaire 73

Rôle de l’appareil de Golgi 74

En résumé 75

REFERENCES 82

APPENDICES 104

1. Interaction de la lactoferrine humaine avec des hépatocytes

isolés maintenus en suspension. 105

2. Analyse morphologique de l'endocytose de la lactoferrine

humaine par les hépatocytes en culture 107

3. Incorporation d'^^^I-ASOR par des hépatocytes en culture

isolés de rats traités à la diétylnitrosamine 109

LISTE DES ABREVIATIONS

TABLEAUX/ FIGURES/ PLANCHES D'ILLUSTRATIONS !

DANS UNE FARDE ANNEXE,

L^6 coAactéÂM>tiqu

J> pfii/6^otog.lquz6 du ioÂ,o. en ^OYit dzpuÂJ>

Zongtmp6 un modèle zxpéAÂjmntaZ pfUvdJié.gZz dani de nombreux domcu- neô de la Azch^ache biologique et médicale.

Le laboaatolAe de Cytologie oX de Cancérologie expérimen­

tale -à'eét épéclatlàé depuis de nombreuxeà années dan& l'étude de la cancérogenèse hépatique Induite chlmlquejnent. Ce modèle expéri­

mental apparaît en eüet comme un moyen valable pour étudier les altérations morphologiques et physiologiques des cellules au cours du processus de cancérisation, ainsi que pour observer l'acquisi­

tion de nouvelles propriétés par ces cellules cancéreuses. Vans ce but, deux systèmes expérimentaux ont été développés qui permettent l’étude des cellules de iole In vitro ; VIsolmeYvt des cellules du parenchyme hépatique et leur mise en culture.

La dissociation enzymatique du parenchyme hépatique permet d'obtenir une population d'hépatocytes débarrasés des autres typer cellulaires présents dans le iole {cellules sinusoïdales, {fibrocy­

tes, cellules des canaux biliaires] et o{{re la possibilité d’étu­

dier de {açon précise les caractéristiques métaboliques propres à ce type de cellule (Vrochmans et al., 1975). Les hépatocytes main­

tenus en culture primaire se réassocient et reconstituent des

cU^i^ë.A.&ncÂ.cUu.on6 mmbAo.naÂAej> eX dzà contactà ZntzAcelIuZcUAe^

cdfiactêAyUtyiqu^Â du ce type, do, attiuZz (Wanàon et al., 197?]. Ce -içf.6tme peAmet donc, l'étude tn vtXAo en )^Aaction6 quoôt puaeô de

cellules demeuAont bien dli^^éAencléei et 6emblableà à celleà de l'oAgane d'oàtglne. Selon les conditions expéAlmentales, les hépa­

tocytes peuvent êtae ainsi maintenus en cultuae de t'iols youAS à tAols s moines.

Vans ce contexte, nous nous sommes au dépoAt pAoposés d’appAo^ondlA la question de la pAêscAvation des hépatocytes en cutluAe en poAtant notAe attention sua les pAopAlétés fonctionnel­

les de la mmbaane plasmique. La plasmalemme est en effet un com­

posant essentiel de la cellule vivante. SI la Aeconstltutlon en cultuAe d'un aspect moAphologlque de la mmbaane slmllalAe à celui présenté poA les cellules In vivo constituait un oAgument en faveuA de sa pAéseAvation, Il ne pAouvalt pas que les fonctions en étalent maintenues. Nous nous sommes poA la suite attachés à l'analyse du pAocessus d'endocytose adsoAptlve spécifique, notAe système expéAl- mental offAont d'IntéAessantes possibilités pouA l'étude de ce pAo- cessu^ complexe, en pantlculleA pouA colle des étapes successives amenant une substance captée à la suAface cellalalAe veAS le lyso­

some.

I. L'ENDOCYTOSE

Le terme "endocytose" désigne l'ensemble des processus par lesquels la cellule intériorise du matériel extracellulaire.

On subdivise traditionnellement l'endocytose en phagocy­

tose ((()aYeiv = manger) et en pinocytose (iriveiv = boire). Le pre­

mier terme se rapporte à l'ingestion de matériel particulaire ou cellulaire d'une taille telle qu'il puisse être détecté en micros­

copie optique. La pinocytose quant à elle recouvre l'ensemble des processus allant de la captation de molécules à l'internalisation de microparticules décelables uniquement en microscopie électroni­

que (de Robertis et de Robertis, 1980).

La distinction entre la phagocytose et la pinocytose ne tient toutefois pas seulement à la qualité ou la taille de ce qui est endocyté mais aussi aux phénomènes qui entourent le processus d'endocytose.

I.l. La phagocytose

Observée chez la plupart des protozoaires où elle remplit une fonction nutritive, elle ne se retrouve plus, chez les métazo­

aires plus évolués, que parmi certains types cellulaires spéciali­

sés notamment dans la défense de l'organisme. Ce sont, par exem­

ple, les macrophages du système réticuloendothélial (de Robertis et

de Robertis, 1980).

La phagocytose se déroule en deux phases principales : 1) la particule à endocyter adhère à la surface cellulaire et 2) la cellule enveloppe la particule dans des extensions cytoplasmiques qui, en fusionnant, donnent naissance à une vésicule indépendante, le phagosome.

On peut également subdiviser plus finement le processus en sept étapes (Stossel, 1976) :

1) reconnaissance de la particule à endocyter, 2) réception du message de reconnaissance,

3) transmission de celui-ci au cytoplasme avec déclenchement d'un mécanisme effecteur par lequel

4) la membrane plasmique adhère solidement à la particule et 5) est induite la formation de pseudopodes qui

6) enveloppent la particule et

7) fusionnent finalement pour donner naissance au phagosome.

De nombreux facteurs, qui tiennent aussi bien à la nature et aux propriétés physico-chimiques du matériel ingéré, qu'aux pro­

priétés de la membrane plasmique du phagocyte, entrent en ligne de compte dans la régulation de la phagocytose (Silverstein et al,, 1981; Besterman et Low, 1983),

1,2, La pinocytose

La pinocytose permet le transport, de l'extérieur de la

cellule vers l'intérieur de celle-ci, de molécules, de complexes

macromoléculaires ou de microparticules qui ne peuvent autrement

franchir la barrière de la plasmalemme. Il existe deux types de pinocytose : 1) la pinocytose en phase fluide, qui concerne tout ce qui pénètre sans interaction préalable avec la membrane plasmique et 2) la pinocytose adsorptive, où le matériel intériorisé intéra- git, de façon spécifique ou non, avec la surface cellulaire. Ce dernier mécanisme augmente considérablement l'efficacité avec

laquelle les molécules sont captées dans l'environnement cellulaire (de Robertis et de Robertis, 1980; Besterman et Low, 1983).

1.2.1. Pinocytose adsorptive aspécifique

Parmi les substances captées par ce processus, citons par exemple les complexes immuns de la peroxidase (Steinman et Cohn, 1972) et la ferritine cationique qui se lie très efficacement aux sites anioniques de la membrane plasmique (Danon et al., 1972).

1.2.2. Pinocytose adsorptive spécifique

L'endocytose spécifique par l'intermédiaire de récepteurs a quant à elle été abondamment illustrée tant biochimiquement que morphologiquement. On connaît des dizaines de substances - lipo­

protéines, glycoprotéines, hormones, toxines, immunoglobulines,

enzymes - qui pénètrent ainsi dans de nombreux types cellulaires,

captés spécifiquement par des récepteurs dont un grand nombre a été

purifié et caractérisé (Steinman et al., 1983).

1.3. Le système vacuolaire de l'endocytose

En simplifiant à l'extrême, il est possible de classer les composants subcellulaires impliqués dans l'endocytose et le trafic des membranes en trois sections : 1) les vacuoles de phago- et de pinocytose qui se forment au niveau de la membrane plasmique, 2) le système lysosomal et 3) l'appareil de Golgi et ses annexes. Ces compartiments sont en constante communication les uns avec les autres par fusion des vésicules et de leurs membranes. Ils subis­

sent en outre de nombreuses transformations tant morphologiques que biochimiques (Steinman et al., 1983).

1.3.1. Les vésicules d'endocytose 1.3.1.1. Le phagosome

Le phagosome est une vésicule de grande taille, dont le diamètre peut largement excéder le ym, enveloppée dans un large fragment de la membrane plasmique (Silverstein et al., 1977). Ces vésicules sont environnées d'un réseau dense de filaments cytoplas­

miques qui comportent de nombreuses protéines contractiles (Stossel, 1976).

1.3.1.2. La vésicule de pinocytose fluide

Ce type de vésicule a été notamment mis en évidence à l'aide de traceurs cytochimiques tels la peroxidase. La membrane de ces vésicules est apparemment dépourvue de filaments et ne pré­

sente ni les épaississements ni les spiculations des vésicules à

clathrine (Steinman et al., 1976).

.3.1.3. La vésicule d'endocytose adsorptive

Observé dans tous les cas de pinocytose adsorptive, et tout particulièrement lorsque des récepteurs sont impliqués, ce type vésiculaire et ses caractéristiques sont bien connus. Il pré­

sente la particularité de posséder une membrane apparemment épais­

sie et présentant de fines spiculations étoilées. Ces vésicules se forment au niveau d'invaginations de la membrane plasmique dont la face cytoplasmique présente les mêmes caractéristiques que la vési­

cule indépendante.

N.B. : à défaut d'une traduction claire et acceptée généralement, et vu la lourdeur des périphrases proposées par certains (par exemple : "crypte ou vésicule à paroi spiculée",

A. Tixier-Vidal, colloque de la SFME, Poitiers, 1980) nous avons choisi de désigner ces structures par les termes anglo-saxons qui les désignent, à savoir :

- "coated pit" pour l'invagination de la plasmalemme et - "coated vesicle" pour la vésicule libre.

L'épaississement de la membrane plasmique au niveau des coated pits et coated vesicles correspond à un assemblage macromo­

léculaire complexe. L'unité de base de cet assemblage, dénomée

"triskell" en raison de sa ressemblance avec le symbole gaélique, est un trimère qui comprend trois sous-unités composées principale­

ment de clathrine une protéine de 180.000 kd, et d'autres protéines

associées de différents poids moléculaires.

Le complexe apparaît morphologiquement comme un panier ' dont la trame combine hexagones et pentagones à la manière d'un ballon de football. La fonction de ce système est manifestement de favoriser la formation de vésicules par invagination de petits fragments privilégiés de la membrane plasmique, fragments enrichis de sites récepteurs spécifiques. La durée de vie des "coated vesi- cles" est très brève, l'assemblage de triskells se désorganisant rapidement dès que la vésicule est libre dans le cytoplasme.

(Goldstein et al., 1979; Heuser et Evans, 1980; Pearse et Bretscher, 1981; Steer et Klausner, 1983).

1.3.2. Les endosomes

Issus de la fusion de petites vésicules de pinocytose, les endosomes consituent une classe de vacuoles sphériques ou irrégu­

lières où se concentre le matériel endocyté avant son transfert dans les lysosomes. Ce ne sont donc pas, au sens strict du terme, des vésicules d'endocytose mais plutôt un aspect de l'évolution intracellulaire de celles-ci. En raison de leur rôle dans l'endo­

cytose adsorptive spécifique, on les a également désignées sous le nom de réceptosomes (Pastan et Willingham, 1981; Steinman et al., 1983).

1.3.3. Les lysosomes

D'aspect et d'importance très variable d'un type cellu­

laire à l'autre, les lysosomes sont par définition des vacuoles

riches en hydrolases acides. Leur fonction est de dégrader

différents substrats acquis tant par endocytose que par autophagie.

Une distinction est habituellement faite entre lysosomes "primai­

res" non encore entrés en action et les lysosomes "secondaires" qui eux contiennent, outre leur stock d'hydrolases, du matériel en cours de dégradation.

Morphologiquement, les lysosomes "secondaires" se distin­

guent par leur contenu, qui comprend souvent du matériel amorphe, dense aux électrons, ainsi que des fragments membranaires identi­

fiables et diverses structures particulaires. Il se retrouvent principalement autour du noyau cellulaire et à proximité de l'appa­

reil de Golgi (de Robertis et de Robertis, 1980; Steinman et al., 1983).

D'autres types vésiculaires tels les corps multivésiculai- res ou des macrovésicules de l'appareil de Golgi sont parfois

inclus dans le compartiment lysosomal (Novikoff, 1982).

1.3.4. L'appareil de Golgi

La principale fonction de l'appareil de Golgi est d'assu­

rer la sécrétion cellulaire, ce qui comprend les enzymes lysosoma- les aussi bien que les substances exportées. Dans les saccules du dictyosome, les produits synthétisés au niveau du réticulum endo­

plasmique sont triés, éventuellement remaniés et/ou glycosylés par action des glycosyl-transférases, puis envoyés vers leurs destina­

tions respectives. Cette fonction implique un flux de membranes

important. En relation avec ces processus, il est apparu que le

système golgien joue un rôle important sinon central dans le trafic

vésiculaire et membranaire et, sans doute, dans sa régulation (Tartakoff, 1980; Farquahr et Palade, 1981; Mellman, 1982).

L'implication de l'appareil de Golgi dans le processus de l'endocytose est encore controversée. Si dans certains cas on a montré que des marqueurs de l'endocytose adsorptive pouvaient atteindre des vésicules ou des saccules du complexe de Golgi, ce n'est semble-t-il pas une propriété générale. Il semble toutefois que cet organite, sans doute du fait de sa participation au trafic vésiculaire intracellulaire, pourrait être impliqué dans la régula­

tion du transport de matériel endocyté vers les lysosomes (Steinman et al., 1983; Farquhar, 1983).

1.4. Le trafic des membranes cellulaires

L'endocytose s'inscrit dans le cadre plus vaste de l'ensemble des mouvements membranaires et vésiculaires de la cel­

lule vivante qui incluent principalement l'exocytose, mais aussi les transferts et échanges entre divers compartiments subcellulai­

res, en particulier l'appareil de Golgi et le réticulum endoplasmi­

que, ainsi que les transports transcellulaires.

1.4.1. L'exocytose

Particulièrement visible dans les cellules spécialisées

dans la sécrétion où ce processus fut beaucoup étudié, l'exocytose

rend compte du transport de matériel de l'intérieur de la cellule

vers l'extérieur de celle-ci. Elle est impliquée dans le

relarguage par les cellules d'une grande variété de substances allant des protéines aux mucopolysaccharides, des neurotransmet­

teurs aux constituants du lait et du sang. C'est également par la voie exocytaire que se reconstitue la membrane plasmique (Morré, 1981; Farquahr et Palade 1981; Farquahr, 1983).

1.4.2. Le transit transcellulaire

Observé dans différents types cellulaires d'origine épi­

théliale et endothéliale, le phénomène du transport de matériel au travers de la cellule sans interaction avec d'autres constituants de ces cellules est encore relativement peu connu.

Ainsi le passage de substances au travers de 1'endothelium des vaisseaux capillaires serait dû non pas à un transit vésicu­

laire mais plutôt à l'existence de microcanaux qui s'ouvrent aux deux pôles de la cellule (Frdkaer-Jensen, 1980; Bundgaard, 1983).

Un autre phénomène, le transport des Ig G maternelles au travers des cellules de 1'épithélium intestinal pourrait n'être qu'un cas particulier de l'endocytose. Il s'effectuerait un tri du contenu vésiculaire qui permettrait aux immunoglobulines d'échapper au catabolisme lysosomal (Abrahamson et Rodewald, 1981).

La sécrétion biliaire des Ig A s'effectue suite à un tran­

sit vésiculaire au travers des hépatocytes, mais, ici aussi, il

peut s'agir d'un cas particulier dérivé de l'endocytose (Renston

et al., 1980 a, 1980 b).

.5. Le recyclage des membranes

Le concept de recyclage et de réutilisation des membranes cellulaires a été développé aussi bien pour l'endocytose que pour l'exocytose. Il résulte de l'observation que des cellules peuvent maintenir pendant de longues périodes des taux élevés d'endocytose ou de sécrétion sans que leurs dimensions et notamment celles de la membrane plasmique et du système vacuolaire, soient affectées de façon notable (Palade, 1975; Silverstein et al., 1977; Meldolesi et al., 1978; Brown et Goldstein 1979; Morré et al., 1979).

Si de nombreuses études ont montré, le plus souvent de façon indirecte, la réalité de ce processus de recyclage membra­

naire, son mécanisme demeure en grande partie hypothétique (Steinman et al., 1983, Besterman et Low, 1983, Farquhar, 1983).

Ce système est particulièrement remarquable dans le cas de

l'endocytose puisque les ligands et les solutés s'accumulent dans

la cellule tandis que récepteurs et membranes sont réutilisés. Le

système de tri que ces observations implique n'a pas encore été

élucidé. Le parcours du matériel recyclé, membranes ou récepteurs

demeure encore le plus souvent hypothétique.

Les lectines

On connaît depuis longtemps l'existence de protéines d'origine non-immunitaire qui ont la propriété de lier spécifique­

ment des glucides faisant partie des chaînes oligosaccharidiques de glycoconjugués. Appelées parfois agglutinines car elles ont sou­

vent la capacité d'agglutiner différents types de cellules ou de précipiter les glycoconjugués, on les dégigne plus communément sous le terme générique de lectines.

Les lectines sont présentes dans tous les être vivants : bactéries, plantes, levures, invertébrés et vertébrés. Localisées principalement à l'intérieur des cellules, on les détecte également au niveau de la membrane plasmique. Ces lectines membranaires com­

mencent à être bien caractérisées biochimiquement. Leur fonction demeure néanmoins le plus souvent peu connue (Barondes, 1978;

Monsigny, 1979).

Endocytose adsorptive de glycoprotéines

On connaît actuellement cinq lectines membranaires qui jouent un rôle de récepteur dans le processus d'endocytose spécifi­

que de certaines glycoprotéines :

- les récepteurs des hépatocytes de mammifère spécifiques l'un des glycoprotéines du plasma sanguin qui présentent des résidus galactose accessibles à l'extrémité de leurs chaînes oligosaccha­

ridiques, l'autre du L-fucose lié à la N-acétylglucosamine en a l->-3.

- le récepteur hépatique des oiseaux spécifique de la N-acétylglu- cosamine.

- le système de reconnaissance du mannose-6-phosphate mis en évi­

dence sur les fibroblastes humains, également présent dans les hépatocytes.

- le récepteur du système réticuloendothélial spécifique à la fois du mannose et de la N-acétylglucosamine.

(Neufeld et Ashwell, 1980; Stockert et Morel 1 , 1982).

II.2.1. Le récepteur galactose des hépatocytes

La structure de la partie oligosaccharidique des glycocon- jugués, tant glycoprotéines que glycolipides, est de mieux en mieux connue (Strecker et Montreuil, 1979; Yogeeswaran, 1983). Malgré l'énorme diversité potentielle de ces structures, celles-ci présen­

tent un nombre relativement restreint de variations autour de com­

plexes-types (Strecker et Montreuil, 1979).

Cette unité de structure des grandes classes de glycocon- jugués se retrouve chez les glycoprotéines du plasma sanguin des mammifères. Ces glycoprotéines possèdent à l'extrémité de leurs chaînes oligosaccharidiques la séquence :

... - N-acétylglucosamine — galactose - acide sialique

La perte de l'acide sialique terminal démasque les résidus galac­

tose situés en avant-dernière position et constitue le signal de la dégradation de la molécule glycoprotéînique ainsi altérée dans les hépatocytes (Ashwell et Morell, 1974),

Ce phénomène de la dégradation hépatique des glycoprotéi­

nes du plasma sanguin de mammifères, suite à la perte de l'acide sialique terminal de leurs chaînes glycosylées, a d'abord été mis en évidence par l'étude du métabolisme de la céruloplasmine (Morell et al., 1968; Gregoriadis et al., 1970). Il a par la suite été montré que toute glycoprotéine du plasma sanguin dépourvue d'acides sialiques subissait le même sort'(Morell et al., 1971) - la trans- ferrine faisant partiellement exception à cette règle, le délai de survie de 1'asialotransferrine étant beaucoup plus long (Regceczi et al,, 1974) - et que c'était bien le galactose qui était responsable de la reconnaissance de ces molécules par les hépatocytes (Hickman et al., 1970).

La liaison des asialoglycoprotéines à la membrane plasmi­

que des hépatocytes a été étudiée in vitro (Pricer et Ashwell, 1971), Le récepteur a été purifié (Hudgin et al., 1974) et carac­

térisé en détail (Kawasaki et Ashwell, 1976 a, b; Sarkar et al., 1979), L'analyse de la distribution subcellulaire de cette pro­

téine a montré sa présence sur les membranes microsomiales, dans l'appareil de Golgi et dans les lysosomes (Pricer et Ashwell, 1976).

L'adhésion d'hépatocytes isolés à des galactosides immobi­

lisés sur gel de polyacrylamide (Weigel et al., 1979, 1980)

conduisit à l'hypothèse que le récepteur galactose pouvait être impliqué dans l'adhésion intercellulaire.

L'utilisation d'hépatocytes isolés pour l'étude de l'endo­

cytose spécifique des asialoglycoprotéines permit de montrer d'une part l'existence probable d'un compartiment intermédiaire entre la surface cellulaire et les lysosomes (Tolleshaug et al., 1977) et d'autre part que le récepteur était recyclé vers la surface cellu­

laire après l'endocytose (Steer et Ashwell, 1980).

II.2.2. Le récepteur spécifique de la N-acétylglucosamine et du mannose

La captation spécifique par le foie d'enzymes lysosomales et de dérivés de l'orosomucoïde présentant des résidus N-acétylglu­

cosamine ou mannose à l'extrémité de leurs chaînes glycosylées a conduit à la mise en évidence d'un second récepteur de glycoprotéi­

nes dans le foie (Stockert et al., 1976; Stahl et al., 1976; Achord et al., 1977). Il fut lui aussi isolé et caractérisé (Kawasaki et al., 1978).

Sa mise en évidence sur les cellules sinusoïdales du foie (Schlesinger et al., 1978) mais aussi sur les macrophages alvéolai­

res (Stahl et al., 1978) suggérait que ce système était propre au système réticuloendothélial en général plutôt que spécifiquement hépatique.

La fonction du système de reconnaissance N-acétylglucosa­

mine/mannose des macrophages n'a pas encore été clairement établie.

L'hypothèse couramment admise est que toute glycoprotéine ayant la structure oligosaccharidique adéquate peut être captée par ce sys­

tème, ce qui inclut autant les enzymes lysosomales relarguées dans la circulation que d'autres glycoprotéines présentes dans le milieu suite, par exemple, à une inflammation ou une infection bactérienne ou virale (Neufeld et Ashwell, 1980; Jones et al., 1980).

II.2.3. Reconnaissance spécifique du fucose lié en a l->-3 à la N-acétylglucosamine

L'existence d'un système hépatique qui lie spécifiquement le fucose fut mis en évidence en étudiant la captation par le foie de la lactoferrine et de la transferrine humaines. Le site de fixation, situé sur les hépatocytes, semble apparemment distinct du récepteur spécifique du galactose (Prieels et al., 1978).

II.2.4. Le récepteur hépatique de la N-acétylglucosamine chez les oiseaux

Ce récepteur remplit la même fonction chez les oiseaux que le récepteur galactose chez les mammifères. En effet, chez ces animaux, c'est la galactose qui occupe normalement la position ter­

minale des chaînes glycosylées des glycoprotéines circulantes, la N-acétylglucosamine venant en avant-dernière position (Lunney et Ashwell, 1976; Kawasaki et Ashwell, 1977; Neufeld et Ashwell,

1980).

II.2.5. Le récepteur mannose-6-phosphate

Mis en évidence sur les fibroblastes humains et surtout

étudié dans ce modèle expérimental, ce récepteur ne semble être

qu'accessoirement lié à la pinocytose adsorptive. Sa fonction

principale est en effet endogène : il servirait d'intermédiaire

pour le transport intracellulaire des enzymes lysosomales depuis

leur lieu de synthèse jusqu'aux lysosomes primaires (Neufeld et

Ashwell, 1980; von Figura et al., 1981; Doyle et al., 1982).

III. LES CELLULES HEPATIQUES

Les deux types cellulaires dominants dans le foie, à côté des cellules biliaires et celles des tissus vasculaires et conjonc­

tif, sont les hépatocytes ou cellules parenchymateuses (60 % des cellules, 90 % des protéines) et les cellules sinusoïdales (30 % des cellules environ).

III.1. Les cellules sinusoïdales

Cette catégorie se subdivise elle-même en trois : 1°) les cellules endothéliales, extrêmement aplaties et par

endroit fenestrées, tapissent les sinusoïdes sanguins et sont donc interposées entre les hépatocytes et le flux sanguin;

2°) les cellules de Kupffer dont le rôle de macrophage est connu depuis près d'un siècle;

3°) les lipocytes, qui doivent leur nom aux importants dépôts de graisse contenus dans leur cytoplasme et dont la fonction demeure peu connue.

II1.2. Les hépatocytes (Fig. 1)

Les cellules du parenchyme hépatique sont de loin la popu­

lation la plus importante, représentant 90 % du contenu protéinique

du foie et occupant 80 % de son volume.

Les hépatocytes sont des cellules polyhédriques associées en travées d'une cellule d'épaisseur qui s'étendent de la périphé­

rie au centre du lobule hépatique et séparées entre elles par les sinusoïdes sanguins.

II 1.2.1. Surface cellulaire

La surface des hépatocytes est hétérogène, comprenant trois domaines spécialisés : la face sinusoïdale, la face interhé- patocytaire et la membrane canalicul aire.

La face sinusoïdale est le lieu d'échange avec le milieu sanguin. Sa surface est multipliée grâce à de nombreuses microvil­

losités relativement courtes (0,5 pm) qui emplissent l'espace de Disse.

La face interhépatocytaire est lisse, séparée de celle de la cellule voisine par un espace étroit, dit, paracel lui a ire d'envi­

ron 10-15 nm de diamètre. Elle comprend des jonctions spécialisées qui renforcent l'adhésion et les contacts intercellulaires : les des­

mosomes, les jonctions "gap" et les zonulae occludentes. Celles-ci délimitent les canalicules biliaires qui s'étendent entre les hépa­

tocytes.

La membrane canaliculaire voit elle aussi sa surface mul­

tipliée par de nombreuses microvillosités dont les protrusions

réduisent considérablement la lumière de ce conduit.

II1.2.2. Cytoplasme et noyau

Un noyau d'hépatocyte ne présente pas de caractères parti­

culiers. Il est grand et régulier et contient un ou plusieurs nucléoles. Sa taille varie en fonction de la ploïdie qui peut atteindre 8 dans 2 % des cas. Un hépatocyte sur quatre est binu- cléé.

Le cytoplasme des hépatocytes est d'apparence très varia­

ble et peut refléter différents états fonctionnels de la cellule.

On y retrouve de nombreuses mitochondries, des empilements de réti­

culum endoplasmique granulaire et un fin réseau de réticulum endo­

plasmique lisse. Il est caractérisé par la présence de peroxiso- mes, petits organites sphériques à la matrice homogène contenant un cristalloïde. Les lysosomes, contenant des inclusions denses aux électrons sont très caractéristiques. L'appareil de GoTgi se

retrouve principalement autour du noyau à proximité des canalicules biliaires.

Le cytoplasme des hépatocytes peut contenir d'importants dépôts de glycogène (principalement associés au réticulum endoplas­

mique lisse) et des globules lipidiques.

Références : Arias et al., (1982); Bloom et Fawcett, (1975), Fawcett, (1966), Keele et Neil, (1971).

II1.3. Isolement et culture des hépatocytes

Les hépatocytes isolés perdent progressivement toutes

leurs différenciations membranaires et se présentent finalement sous la forme de sphères d'un diamètre moyen d'environ 20 ym dont la suface est entièrement recouverte de petites microvillosités.

L'ultrastructure de ces cellules est bien préservée. Les hépatocy­

tes ainsi isolés peuvent être séparés en sous-populations soit par centrifugation isopycnique sur gradient de densité soit par élutri­

ation (Drochmans et al., 1975; Bernaert et al., 1979; Penasse et al., 1979).

Lorsqu'ils sont mis en culture, les hépatocytes adhèrent à la pellicule de collagène recouvrant le fond de la boite de culture puis s'étalent. Au bout de 4 heures, ils commencent à se réasso­

cier et dans les 24 heures qui suivent la mise en culture, des tra­

vées de cellules polyédriques sont reconstituées. Ces hépatocytes ont recouvré leurs différenciations membranaires, à l'exception des jonctions "gap" qui sont rarement dérectées. Les canalicules

biliaires sont occlus. Dans le cytoplasme, la localisation parti­

culière de l'appareil de Golgi à proximité du canalicule est sem­

blable à celle observée in vivo (Wanson et al., 1977; Penasse et al., 1979).

Les hépatocytes maintenus en culture recouvrent donc la polarité qui les caractérise in vivo. La membrane plasmique est à nouveau ségrégée en trois domaines distincts : canaliculaire, interhépatocytaire et "sinusoïdal", ce dernier étant la zone prin­

cipale de contact avec le milieu de culture, la similitude entre la

réorganisation des hépatocytes en culture et la situation observée

in vivo s'accentue lorsque des cellules sinusoïdales isolées leur

sont adjointes : les cellules endothéliales s'étalent sur les hépa­

tocytes et délimitent un espace similaire à l'espace de Disse

(Wanson et al., 1979a).

L'étude morphologique de la réassociation des hépatocytes isolés et maintenus en culture a montré que la membrane plasmique se ségrégeait à nouveau en trois domaines et que des structures spécialisées s'y reconstituaient (Wanson et al., 1977). Si ces observations constituaient une excellente indication indirecte d'une préservation satisfaisante des constituants de la membrane plasmique in vitro, elles ne fournissaient pas la preuve directe du maintien de ses capacités fonctionnelles.

Afin d'obtenir une telle information, nous nous sommes proposés de montrer la préservation de l'endocytose adsorptive spécifique dans les conditions de l'in vitro. Pour ce faire, nous avons choisi d'étudier les différents systèmes hépatiques présents au niveau de la membrane et reconnaissant sélectivement les carbo­

hydrates terminaux des résidus oligosaccharidiques des glycopro­

téines.

Ce projet impliquait tout d'abord d'établir la préserva­

tion :

1) du récepteur des hépatocytes captant les asialoglycoprotéines en vue de leur dégradation lysosomale (Ashwell et Morel 1, 1974);

2) du récepteur spécifique du fucose récemment mis en évidence dans les hépatocytes (Prieels et al., 1978).

En outre, nous avons testé la capacité éventuelle des

hépatocytes à endocyter spécifiquement des glycoprotéines exposant

des résidus N-acétylglucosamine ou mannose sur leurs chaînes gly-

cosidiques. Le fait que les cellules sinusoïdales aient cette

propriété (Schlesinger et al., 1978) n'excluait nullement l'exis­

tence d'un récepteur similaire sur les cellules parenchymales.

Dans le deuxième volet de notre travail, nous nous propo­

sions d'utiliser les récepteurs ainsi mis en évidence pour abor­

der l'aspect fonctionnel de la question que nous avions posée, et visualiser, à l'échelon ultrastructural, le processus de pinocy­

tose adsorptive spécifique dans ses différentes étapes. Divers travaux suggéraient que le transport vers les lysosomes de sub­

stances captées au niveau de la surface cellulaire, devait faire intervenir au moins un compartiment intermédiaire important

(Tolleshaug et al., 1979; Hubbard et al., 1979; Wall et al., 1980;

Willingham et Pastan, 1980).

De plus, des évidences directes de recyclage de la mem­

brane plasmique avaient été obtenues dans différents modèles expé­

rimentaux (Herzog et Farquhar, 1977; Farquhar, 1978; Herzog et Miller, 1979; Schneider et al., 1979). Cela nous a conduit à étudier de près ce processus dans les hépatocytes afin, si possi­

ble de mieux définir les relations pouvant exister entre l'endo-et l'exocytose dans le trafic intracellulaire des membranes. Les études précédentes dans ce domaine n'avaient conduit qu'à une juxtaposition de schémas sans réelle synthèse (Silverstein et al.,

1977), en grande partie à cause du fait qu'elles avaient été réali­

sées sur des cellules spécialisées, privilégiant donc un aspect du phénomène. De ce point de vue, les hépatocytes comme modèle expé­

rimental présentent l'intérêt d'accomplir simultanément endocytose

et sécrétion, sans prédominance apparente d'un processus par

rapport à 1'autre.

Pour analyser la captation spécifique de glycoprotéines en fonction des résidus glycosylés accessibles, nous avons utilisé des dérivés d'une glycoprotéine naturelle, 1'orosomucoïde, et dif­

férentes glycoprotéines artificielles ou "néoglycoprotéines"

(Stowell et Lee, 1980) toutes marquées à l'iode 125.

L'étude en microscopie électronique du processus d'endo­

cytose et de recyclage membranaire se fit essentiellement à l'aide de la technique de l'or colloïdal (Horisberger, 1979; De Mey, 1983), complétée par des observations réalisées grâce à un mar­

queur général de la membrane plasmique, la ferritine cationique

(Danon et al., 1972).

Dawley provenant de l'élevage de notre laboratoire ont été utilisés tout au long de cette étude.

Produits spéciaux

L'orosomucoïde de plasma sanguin humain et les dérivés glycosylés de l'albumine (galBSA, fucBSA, glcNAcBSA et lacNAcBSA) nous ont été fournis par le Dr. R.L. Hill, Département de Biochi­

mie, Duke Uni versity, Durham NC, USA. L'anticorps dirigé contre le récepteur hépatique d'asialoglycoprotéines nous a été fourni par le Dr. G. Ashwell, National Institutes of Health, Bethesda MD, USA.

Nous tenons à leur exprimer ici notre gratitude.

Isolation des hépatocytes

La procédure d'isolation se subdivise en quatre étapes (Drochmans et al., 1975; Wanson et al., 1979b).

1®) Pré-perfusion du foie avec une solution Krebs-Ringer sans Ca^'*’, pH 7.4, à 37°C pendant 10 min, suivie de la perfusion enzymati­

que proprement dite. La même solution, à laquelle est ajoutée 0,05 % de collagénase et 0,1 % d'hyaluronidase, est mise en circulation pendant 30 min.

Il résulte de ce traitement un organe où les travées

d'hépatocytes sont disloquées et les cellules presque totale­

ment dissociées, le tout enveloppé dans une matrice de tissus conjonctif et vasculaire partiellement digérée.

2®) La capsule de Glisson est rompue et les cellules sont libérées doucement à l'aide d'une spatule. La dissociation des cordons de cellules est achevée par un traitement mécanique. Celui-ci consiste à maintenir la suspension cellulaire en agitation giratoire dans un flacon siliconé pendant 10 min. à 37®C dans une solution Krebs-Ringer pH 7.4 à laquelle sont ajoutés 2 % d'albumine dialysée et 2 mM EDTA.

3°) La suspension cellulaire originale est purifiée par filtrations successives sur Perl on de porosité 100 ym et 63.ym. Celles-ci retiennent les grands aggregats non dissociés et les restes de trame conjonctive. La suspension cellulaire obtenue contient encore une certaine proportion (20-30 %) de doublets et de tri­

plets d'hépatocytes. Lorsqu'une suspension de cellules parfai­

tement isolées est nécessaire, une filtration supplémentaire sur Perl on de porosité 28 ym est effectuée.

4°) Pour terminer, afin de débarrasser la préparation des débris subcellulaires, des cellules endommagées et des cellules sinu­

soïdales contaminantes, la suspension obtenue après filtration est diluée de 5 à 10 fois dans une solution Krebs-Ringer pH 7.4 et laissée 10-15 min à température ambiante dans un bêcher siliconé pour permettre aux hépatocytes de sédimenter; les élé­

ments indésirables restent dans le surnageant qui est éliminé.

La suspension cellulaire ainsi obtenue contient plus

de 90 % d'hépatocytes bien préservés. L'analyse des frottis et des comptages de cellules à l'aide d'un Compteur Coulter montrent une légère contamination de la préparation finale par des cellules sinusoïdales. Celle-ci n'excède pas 4 % du nombre de cellules, au maximum.

Pour les essais sur cellules isolées, les hépatocytes sont resuspendus dans du milieu Leibowitz L15 sans additifs à raison de 2.5 10^ cellules par ml puis incubés en flacons siliconés pendant 30 min environ, avant le début des essais. Pendant cette incuba­

tion les cellules redevenues sphériques acquièrent une surface homogène couverte de microvillosités (Penasse et al., 1979).

4. Mise en culture des hépatocytes • '

Pour la mise en culture, les hépatocytes isolés sont

resuspendus à raison de 10^ cellules par ml dans du milieu Dulbecco enrichi de 17 % de sérum de veau foetal et contenant des antibioti­

ques (100 yg/ml streptomycine et 100 lU/ml de pénicilline). 3 ml de cette préparation cellulaire sont étalés dans une boîte de Pétri en plastique de 60 mm de diamètre, au fond recouvert d'une pelli­

cule de collagène. Les boîtes sont maintenues en incubateur à 37°C sous atmosphère air et CO2 en proportion 95:5.

Avant l'emploi, la qualité de la culture est contrôlée sous microscope inversé en contraste de phase. Les boîtes conte­

nant des plages de nécroses sont rejetées.

Les différents dérivés de 1'orosomucoïde ont été obtenus par clivage enzymatique séquentiel des chaînes oligosaccharidiques à l'aide de glycosidases spécifiques selon la méthode décrite par Paulson et al. (1978) (schématisé Fig. 2).

Les molécules ont été marquées à l'iode 125 par réaction à la chloramine T (Paulson et al., 1978).

La fraction Ig G de l'antiserum de chèvre contenant l'an­

ticorps anti-récepteur galactose a été obtenue par précipitation au sulfate d'ammonium suivie de chromatographie sur DEAE cellulose (DE 52) selon la méthode décrite par Fahey et Terry (1973).

Procédure expérimentale Cellules isolées

Des fioles de scintillation contenant 2 ml de suspension d'hépatocytes isolés à raison de 2.5 10^ cellules par ml sont main­

tenues en agitation giratoire soit à 37°C, soit à 4°C. Le ligand radioactif est ajouté à la suspension cellulaire dans un petit volume (10-20 yl). Aux différents temps considérés une aliquote de la suspension (150-200 yl) est prélevée et transférée dans un tube microfuge Beckman de 400 yl contenant 150 yl d'un mélange d'huiles jusqu'à une densité de 1.208. Les tubes sont immédiatement centri­

fugés, l'huile permettant une séparation quasi instantanée des

cellules et du milieu (Tolleshaug et al., 1977). La radioactivité totale est mesurée puis le tube est sectionné sous l'interface huile/milieu pour mesurer la radioactivité associée aux cellules.

5.2.2. Cellules en culture

Au moment des essais, le milieu d'incubation Dubelcco est remplacé par du milieu Leibovitz L15 sans sérum ni antibiotiques et les cellules sont laissées un minimum de 15 minutes à 37°C avant de commencer l'expérience. Comme pour les cellules isolées, le ligand radioactif est ajouté dans un petit volume (10-20 yl) est homogé­

néisé dans le milieu par une agitation douce de la boite de cul­

ture. A la fin de la période d'incubation, le milieu est retiré et les boîtes lavées trois fois à l'aide de tampon Krebs-Ringer

(pH 7.35). Les cellules sont alors décrochées par addition de 3 ml NaOH IM puis récoltées et transférées dans un tube pour la mesure de la radioactivité associée.

5.2.3. Procédures communes

Dans le cas des expériences d'inhibition compétitives, le compétiteur non marqué du ligand radioactif est ajouté une minute avant ce dernier sauf l'anticorps, ajouté 30 minutes auparavant.

L'incubation dure 30 minutes.

La liaison non spécifique des sondes radioactives a été

déterminée en incubant les cellules en culture ou en suspension

avec le traceur radioactif et un large excès (400:1) de la molécule

non marquée pendant 30 minutes.

6. Rôle du récepteur galactose dans la réassociation des hépatocytes

Pour tester le rôle éventuel du récepteur galactose dans l'établissement des contacts interhépatocytaires, ce récepteur est bloqué dès la mise en culture par addition de 50 yg d'anticorps anti-récepteur au milieu de culture Dulbecco. Les cultures testées et les contrôles sont photographiés à 8h et 24h de culture.

Simultanément, le blocage du récepteur est évalué par mesure de la capacité des cultures à capter 1'asialo-orosomucoîde marqué à l'iode 125.

7. Préparation des cellules en culture pour la microscopie électronique

Toutes les opérations de fixation, de cytochimie et d'enrobage sont effectuées directement dans la boite de culture.

7.1 Fixation et post-fixation

La matériel observé a été fixé à 4°C

- soit avec de la glutaraldéhyde distillée à 2,5 % en solution dans du tampon cacodylate de sodium O.IM, pH 7.4, pendant 10 minutes;

- soit avec le fixateur de Karnowsky modifié par Hopkins et Farquhar (1973) pendant 30 à 60 min.

Les cellules sont lavées trois fois avec du tampon cacody­

late de sodium O.IM, pH 7.4 à 4'’C pendant 10 min , puis

post-fixées Ih à 4°C par l'OsO^ 2 % en tampon cacodylate de sodium O.IM, pH 7.4.

7.2. Mise en évidence cytochimique des phosphatases acides Les hépatocytes sont préalablement fixés à la glutaraldé- hyde pendant 1 minute à 4°C et lavés plusieurs fois rapidement avec le tampon cacodylate de sodium O.IM, pH 7.4.

Afin de permettre une pénétration homogène et aisée des substrats, les hépatocytes sont congelés dans l'azote liquide après imprégnation préalable dans une solution cryoprotectrice de glycérol à 10 % en tampon cacodylate.

Aussitôt décongelées, les cellules sont lavées brièvement et à plusieurs reprises, dans le tampon cacodylate puis incubées dans le milieu de réaction contenant du nitrate de Pb 3 mM et du

3-glycérophosphate 1 mM en solution dans du tampon acétate de sodium 12 mM pH 5 pendant 20 minutes à 37°C.

La spécificité de la réaction est contrôlée par blocage des enzymes. Pour ce faire, les cellules sont incubées 15 min à 37°C avec une solution de NaF 25 mM avant la réaction proprement dite.

7.3. Enrobage

Le matériel est déshydraté graduellement dans des concen­

trations croissantes d'éthanol :

- éthanol 70 % trois fois 1 min à 4°C

- éthanol 94 % trois fois 5 min à 4°C

- éthanol 100 % trois fois 15 min à température ambiante.

L'inclusion dans la résine epoxy (Epon 812) est effectuée directement de la manière suivante : 2 lavages à l'Epon en agitant constamment la boite de culture puis inclusion définitive dans la résine et polymérisation à 60® pendant trois jours.

7.4. Coupes

Des blocs de 1-2 mm de côté sont coupés dans la boite, O réduits à une surface restreinte et coupés directement à 250-350 A d'épaisseur.

Les coupes sont recueillies sur grilles de cuivre à trame carrée (300 trous par grille).

7.5 Coloration

Le contraste du matériel est obtenu par coloration des coupes au citrate de plomb (Reynolds, 1963).

7.6 Observations

L'ensemble des observations morphologiques ont été réali­

sées sur un microscope électronique Philips EM 200.

8. Etude de l'endocytose de la ferritine cationique

Après 24h de culture, le milieu Dulbecco est remplacé par du milieu Leibovitz L15 sans additifs. Trois modalités d'incuba­

tion avec la ferritine cationique diluée à 0.5 mg/ml de milieu ont

été essayées.

1°) Incubation continue pendant 2, 15, 30, 60, 90 et 120 min à 37°C. Des incubations continues plus longues ne sont pas pos­

sibles, ce traceur se révélant cytotoxique. A l'issue de ces périodes, les cultures sont lavées avec du milieu L15 puis fixées.

2°) A l'issue d'une incubation continue de 60 min à 37°C, les cul­

tures sont lavées avec le milieu L15 puis réincubées à 37°C pendant 15, 30, 60, 90 et 120 min avant fixation.

3°) Incubation continue à 4°C pendant 30 et 60 min avant lavage et fixation.

9. Etude morphologique de l'endocytose spécifique par l'intermédiaire du récepteur galactose

9.1. Préparation des colloïdes d'or

Les particules d'or colloïdal d'un diamètre moyen approxi­

matif de 17 nm sont obtenues par réduction de l'acide chloraurique par le citrate de sodium, selon la méthode de Frens (1973)

(PI. 1).

En bref, 2 ml d'une solution aqueuse de citrate de sodium à 1 % et 1 ml de solution aqueuse d'acide tetrachloroaurique à 2 % sont ajoutés successivement à 200 ml d'eau bidistillée bouillante.

La solution est maintenue à ébullition pendant 30 min avec reflux.

Le diamètre moyen des particules a été mesuré pour trois

préparations à l'aide d'un analyseur granulométrique Zeiss TGZ III (Tableau I). Les histogrammes de distribution des diamètres mon­

trent l'homogénéité des colloïdes d'or produits par cette méthode (PI. I).

9.2. Couplage des protéines à l'or

Avant couplage avec les particules d'or, la BSA et son dérivé glycosylé ont été dialysés pendant 12h à 4® dans du NaCl 5 mM.

La quantité optimale de protéine à adsorber sur le col­

loïde pour le stabiliser totalement et empêcher sa flocculation en présence d'électrolytes a été déterminée selon la méthode préconi­

sée par Horisberger-(1979). Des quantités croissantes de la sub­

stance à coupler sont ajoutées à des volumes constants de la sus­

pension colloïdale puis, après 5 min à température ambiante, du NaCl à la concentration finale de 1 % est additionné aux échantil­

lons. La flocculation des colloïdes non saturés a pour conséquence un changement de couleur de la solution qui passe du rouge brillant au bleu-gris. Cet optimum de saturation a été mesuré pour chaque préparation de colloïde, et se situe entre 20 et 25 ug de BSA ou de BSA glycosylée par ml de colloïde d'or d'environ 17 nm de diamètre moyen. Cet intervalle correspond à environ 10 molécules adsorbées par particule d'or, estimation corroborée par l'analyse moléculaire de De Roe et al., (1982) (8.5 molécules de galBSA par granule d'or de 17 nm de diamètre).

Le couplage est réalisé en mélangeant la quantité optimale

de macromolécule à adsorber augmentée de 10 % avec la quantité appropriée de colloïde, à température ambiante pendant 20 à 30 min. Afin d'éliminer l'excès de substance non couplée, la prépara­

tion est ultracentrifugée 60 min à 30.000 g et le surnageant rejeté (Horisberger, 1979). Le culot est resuspendu en tampon phosphate salin, pH 7.4.

Une nouvelle préparation du complexe protéine-or a été réalisée pour chaque expérience d'incubation avec les cellules.

Procédure expérimentale

Captation et endocytose des complexes galBSA-Au

La procédure est ici identique à celle utilisée pour les marqueurs radioactifs (cf. 5.2.2.).

La marqueur, à des concentrations comprises entre 0.5 et 0.8 10 en équivalents de protéine, a été incubé en continu avec les cellules pendant 15, 30, 60, 90 min, 6h et 12h à 37°C. A l'issue de la période d'incubation, celles-ci ont été lavées trois fois avec du tampon phosphate salin pH 7.4 et fixées.

9.3.2. Analyse quantitative du transfert intracellulaire du marqueur

L'analyse quantitative du transfert intracellulaire requiert deux conditions :

1°) l'endocytose du marqueur doit débuter simultanément dans toutes les cellules;

9.3

9.3.1.

2°) une quantité de marqueur limitée doit être disponible afin de pouvoir visualiser la vidange et le remplissage successifs des compartiments subcellulaires.

Dans ce but, l'endocytose a été tout d'abord bloquée en plaçant les cellules à 4°C pendant 15 min minimum. Puis le com­

plexe galBSA-Au à la même concentration que ci-dessus a été ajouté au milieu pendant 60 min. Les cellules ont alors été lavées trois fois avec le milieu Leibovitz L15 puis elles ont été soit fixées immédiatement ce qui correspond au point de départ de la cinétique (t = 0 min), soit replacées à 37®C pendant 15, 30, 60 et 90 min puis fixées.

Lors de l'observation des coupes, pour chaque mesure une coupe couvrant complètement plusieurs trous de grille (grille à 300 trous carrés) a été sélectionnée à faible grossissement puis, à un grossissement constant de 10.000, la surface des trous a été systé­

matiquement examinée et chaque grain d'or détecté fut photographié.

Le comptage successif de la quantité d'or visible dans trois trous de grille tirés au sort montre que 2 % au maximum des grains ont pu échapper à l'observateur.

Le degré de signification statistique des résultats a été évalué par le test de Student (Schwarz, 1960).

9.3.3. Contrôles

Afin de vérifier que le complexe gaIBSA-Au est bel et bien

capté par les hépatocytes par 1'intermédiaire du récepteur

d'asialoglycoprotéines les cellules ont été incubées dans les con­

ditions décrites ci-dessus soit 30 min à 37°C soit 60 min à 4°C

avec le marqueur en présence d'un excès d'ASOR (7 ug/ml)• Comme

contrôle complémentaire, le complexe BSA-Au a été incubé avec les

cultures dans les mêmes conditions que le complexe gaiBSA-Au.

r. ETUDE DES SYSTEMES HEPATIQUES DE RECONNAISSANCE DE CARBOHYDRATES

La plupart des résultats présentés dans ce chapitre ont fait l'objet d'une publication :

M. Deschuyteneer, J.P. Prieels, C. May, J.P. Perraudin and J.C. Wanson, 1982.

Studies ont the liver galactose and fucose réco­

gnition Systems in cultured and isolated adult rat hépa­

tocytes .

Biol. Cell., 44, 15 - 24.

I.l. Préservation du récepteur d'asialoglycoprotéines dans les cultures d'hépatocytes

I.l.l. Captation et internalisation d'asialo-orosomucoîde

L'ASOR, un des meilleurs ligands du récepteur galactose (Morel 1 et al., 1971) fut utilisé comme sonde.

A 37°C, ce marqueur est capté et s'accumule continuelle­

ment dans les cellules pendant au moins 45 minutes (Fig. 3).

Durant cette période, aucune dégradation notable de cette substance

ne peut être mise en évidence, le surnageant contenant toujours, à

la fin de l'incubation, plus de 90 % de radioactivité précipitable

à l'aide d'acide trichloroacétique.