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Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository
Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:
Eskinazi, R. (2000). Contribution à la carcinogénèse colique (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté de Médecine – Médecine, Bruxelles.
Disponible à / Available at permalink : https://dipot.ulb.ac.be/dspace/bitstream/2013/211700/1/4e476c62-e477-47d4-b294-9a3a5ef764ec.txt
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CONTRIBUTION A LA
CARCINOGENESE COLIQUE
Rally ESKINAZI
Docteur en Médecine
Service de Gastro-Entérologie et d’Hépato-Pancréatologie
Travail présenté en vue de l'obtention du titre de Docteur en Sciences Médicales
Année Académique 1999-2000
Université Libre de Bruxelles Faculté de Médecine
Cliniques Universitaires de Bruxelles Hôpital Erasme
CONTRIBUTION A LA
CARCINOGENESE COLIQUE
Rally ESKINAZI
Docteur en Médecine
Service de Gastro-Entérologie et d’Hépato-Pancréatologie
Travail présenté en vue de l’obtention du titre de Docteur en Sciences Médicales
Année Académique 1999-2000
pour son immense capacité intellectuelle, sa rigueur scientifique et son sens critique. Je lui suis reconnaissante pour sa disponibilité, son ouverture d’esprit, son accueil soutenu au sein du laboratoire, et surtout pour la grande gentillesse, le soutien moral, l’écoute et la générosité qu’il m’a témoignés à une période où j’en étais particulièrement en manque. Ce fut pour moi un privilège de le connaître et de le cotoyer au cours de ces dernières années.
Je voudrais également remercier le Professeur Devière de m’avoir permis de réaliser cette thèse au sein de son service. Je reste en permanence épatée par son intelligence, ses prouesses techniques, son calme et sa simplicité.
Mille mercis à Michal Svoboda dont la patience, la disponibilité et la gentillesse ont été de l’ordre de l’exploit en face de mes talents limités de biologiste moléculaire. Je remercie Annette Résibois dont le perfectionnisme légendaire n’est plus un secret mais dont le sens de l’humour et de la dérision, le sens pédagogique et la gentillesse méritent également d’être connus. Merci aussi à Pascale qui a soutenu mes débuts dans le labo et a réussi, malgré les obstacles, à m’apprendre les bases des techniques de biologie moléculaire. Merci à Magali, Laetitia, Donald, Michèle, Laurence, Johnny, Flupke, Piotr, Philippe, Diem et tous les autres. Sans eux, ce travail n’aurait pas été possible.
Je garderai de mes années « érasmiennes », le souvenir de tous ceux (chercheurs, infirmières, secrétaires, brancardiers, confrères, kinés, techniciens, internes, collègues, patients ... ) qui, par un sourire dans un ascenseur, un mot gentil, un « comment vas-tu ? », une douceur à mon égard, un conseil, m’ont encouragée et aidé à surmonter les obstacles.
Un dernier remerciement à mes amis et mes parents que j’aime énormément.
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TABLE DES MATIERES ;
• Introduction
• Les Cancers Colorectaux Héréditaires
• Nos Travaux
• Intégration dans et Contribution à la Théorie Actuelle de la Carcinogenèse Colique
• Remarques et Conclusions
• Références
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Annexes
INTRODUCTION ;
Le cancer du colorectum est une maladie fréquente avec un nombre annuel de nouveaux cas atteignant 150.000 par an en Europe (Conférence de consensus
1998). Environ 60.000 de ces patients mourront suite à l’évolution de leur maladie.
Les cancers du colorectum représentent 15% de toutes les tumeurs malignes et dans nos pays, constituent le cancer le plus fréquent quand les deux sexes sont réunis. Le pronostic au moment du diagnostic dépend du stade de la maladie. La survie à 5 ans est de 90% pour les Dukes A, 70% pour les Dukes B et de 30% pour les Dukes C. Le taux de suivie relative globale à 5 ans est d’environ 48% avec un pronostic plutôt réservé au stade généralisé.
Par ailleurs, au moins 50 % de la population occidentale développera un adénome colorectal avant l’âge de 70 ans et dans 10% de ces cas, ces adénomes progresseront vers un cancer invasif (Kinzler & Vogelstein, 1996).
Au moins 15% de tous les cancers colorectaux surviennent dans des contextes de prédisposition héréditaire. Cependant, seulement 2 à 6% peuvent être attribués aux syndrômes bien connus des cancers colorectaux héréditaires de type polypose familiale et HNPCC (Hereditaiy Non Polyposis Colon Cancer). Pourtant, les membres de la famille rapprochée de patients atteints de cancer du colorectum présentent un risque multiplié par 2 à 3 par rapport à la population générale de développer des adénomes (Conférence de consensus 1998).
Le cancer colorectal constitue, et cela depuis longtemps, un modèle de choix
pour l’étude de la carcinogenèse en général grâce â son évolution par étapes bien
caractérisées et la disponibilité des lésions intermédiaires. Par ailleurs, de nombreux
indices expérimentaux commencent à peindre un tableau de carcinogenèse cohque
avec l’existence de mécanismes multiples et différents au niveau moléculaire variant
d’un type de tumeur à un autre. Aujourd’hui on sait que les voies de dégénérescence
maligne suivies par les cellules dans la polypose familiale ne sont pas tout à fait les
3
mêmes que dans le syndrome HNPCC (Hereditaiy Non Polyposis Colon Cancer) ni dans le groupe probablement très hétérogène qui reprend les cancers "sporadiques".
Cependant, au moment de l’élaboration théorique du projet de recherche faisant l’objet de cette thèse, la plupart des différences de pathogénie des différents types de tumeurs colorectales n’étaient pas encore coimues. Le paysage de la carcinogenèse a changé parallèlement aux manipulations qui ont mené aux articles ci-joints et un effort est fait ici pour intégrer d’ime part les théories encore mouvantes de la carcinogenèse colique et d’autre part les résultats de nos recherches.
Le comportement de la cellule cancéreuse colique diffère considérablement de celui de la cellule épithéliale correspondante normale. Les propriétés spécifiques aux cellules néoplasiques leur permettant d’échapper au contrôle de la croissance
auquel sont soumises toutes les autres cellules de l’organisme sont au moins en partie attribuables à l’expression différentielle dans la celliole transformée de toute une série de facteurs de croissance et de protéines régulatrices de la transcription.
Le but de notre travail était de détécter des différences d’expression de récepteurs àTGFp (Transforming Growth Factor P: facteur de croissance à potentialités
multiples et variées agissant, entre autres, au niveau des cellules epithéliales) et de PCD/DCoH (Ptérine-4a-carbinolamine Déshydratase/ Dimerization Cofactor of HNFl: protéine bifonctionnelle agissant soit comme stabilisatrice des dimères de facteurs de transcription soit comme enzyme impliquée dans le recyclage du BH<t) d’une part entre cellules néoplasiques coliques et cellules epithéliales normales correspondantes et d’autre part entre tumeurs sporadiques colorectales et tumeurs équivalentes faisant partie de syndromes néoplasiques héréditaires. L’absence ou la présence de récepteurs mutés à TGFP a été une hypothèse possible pouvant
expliquer la résistance des cellules cancéreuses à l’effet inhibiteur de la croissance
du TGFp. Pendant nos recherches, d’autres ont décrit des mutations entreprenant
des régions de type microsatellite du récepteur de type II du TGFp dans des sous-
groupes de tumeurs coliques. Nous avons étudié l’expression et la distribution des récepteurs à TGFp dans des cancers coliques sporadiques et des colons normaux.
Par ailleurs, le PCD/DCoH joue un rôle important dans l’intensi&cation et la modulation de l’activité transcriptionnelle du HNFl(Hépatocyte Nuclear Factor 1) et dans le recyclage du BH4 (tetrahydrobioptérine), cofacteur essentiel du NO synthase et plusieurs autres enz3nnes métaboliques. Dès lors, il était intéressant d’étudier son expression dans les tumeurs colorectales et dans des lignées de cellules coliques transformées par rapport à des tissus coliques normaux.
Nous avons pu mettre en évidence des différences moléculaires fondamentales
entre cellules malignes et bénignes de même origine. Par ailleurs, l’étiopathogénie
différente des tumeurs coliques de différents types moléculaire et génétique pourrait,
dans un avenir relativement proche, ouvrir la voie à la prise en charge diagnostique
et thérapeutique plus appropriée et plus adaptée de ces pathologies.
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LES CANCERS COLORECTAUX HEREDITAIRES
Au moins 15 à 20 % de tous les cancers colorectaux sont à transmission héréditaire (Kinzler & Vogelstein 1996, Carmon-Albright 1988, Houlston 1992). Au sein de ces cancers héréditaires, la pol3rpose familiale représente environ 1% de tous les cancers du colorectum et le HNPCC (Hereditary Non Polyposis Colon Cancer) en représente environ 2 à 4% (Lynch et al. 1996). En plus de l’importance au niveau du dépistage et du suivi clinique de reconnaître les prédispositions héréditaires au cancer colorectal, l’étude des syndromes rares de cancers héréditaires a permis de comprendre au niveau moléculaire les mécanismes de carcinogenèse au sein non seulement de ces tumeurs rares mais aussi au niveau des tumeurs "sporadiques"
beaucoup plus fréquentes.
La polypose familiale (Familial Adenomatous Polyposis ou FAP) est le syndrome héréditaire le mieux connu à cause de sa présentation tout à fait caractéristique avec une atteinte du cadre colique par des centaines ou milliers de polypes
adénomateux. La FAP est une maladie autosomale dominante qui atteint environ 1 individu sur 7000 (Knudson 1993). Le gène muté, l’APC, se trouve sur le bras long du chromosome 5 et la plupart des mutations décrites sont tronquantes (dues à des mutations nonsense ou frameshift) avec production d’une protéine courte et non fonctionnelle. 67 % des patients atteints de polypose familiale sont porteurs d’une mutation héritée au niveau des cellules gerroinales avec environ 33 % des patients qui ont une mutation de novo. Le gène APC a une pénétrance très élevée (de l’ordre de 80 à 100%) et les patients porteurs d'une mutation l’expriment la plupart du temps à un âge précoce. Typiquement, l’expression phénotypique commence à la puberté ( ce qui justifie le dépistage en clinique par rectosigmoidoscopie à partir de la puberté) avec le développement de centaines voire de milliers de polypes
adénomateux au niveau de tout le cadre colique conduisant classiquement, comme
Frizzled (Receptor)
T I
DSH
GSK3(3
Wnt-1 ____ LJ___ E-cadherin
3-cat
Cell membrane
APC
|3-cat _____► C, P-caT^ P-cat
6
sanction thérapeutique, à une colectomie totale « prophylactique » avant l’âge de vingt ans. Ces polypes coliques peuvent être accompagnés chez un même patient de polypes gastriques et intestinaux ainsi que d’atteintes d’autres organes tels que l’hypertrophie de l’épithélium rétinien (présente dans 2/3 des cas), des tumeurs desmoides, des ostéomes, des lésions pigmentées cutanées...
La polypose familiale est le paradigme de la carcinogenèse pour la plupart des cancers colorectaux sporadiques. Le gène APC régule les concentrations
intracellulaires de p-caténine et fonctionne comme un gène suppresseur de la tumorigenèse (voir schéma 1) : L’APC normal (wild-type) se He au GSK3P (Glycogen Synthase Kinase 3p). Ce complexe se lie à la p-caténine cytoplasmique pour la dégrader. Si eUe n’est pas détruite, la P-caténine est transloquée dans le noyau où elle initie la transcription de gènes après s’être dimérisée avec le TCF-4 (T-cell factor 4), un facteur de transcription qui induit l’expression de gènes promouvant la prolifération cellulaire et inhibant l’apoptose. Parmi les gènes qui peuvent être ainsi activés sont le c-MYC, la cycline Dl, la PPAR6 (peroxisome proUferator-activated receptor ô). Bien sûr, si l’APC est fonctionnel, la p-caténine est dégradée et la cellule ne procède pas à l’activation de ces gènes. Dans les cas où l’APC est muté, il existe une accumulation aberrante de p-caténine et une augmentation d’activation transcriptionnelle non appropriée (He et al. 1998, Boland et al. 2000).
A noter également une variante du syndrome où les patients atteints ont des mutations de l’APC particulières et présentent un syndrome avec beaucoup moins d’adénomes (entre 0 et 100). Cette variante est appelée la polypose familiale
atténuée (Spirio et al. 1993). Cependant, malgré la rareté des polypes trouvés chez
ces patients, ce syndrome est compliqué par des manifestations extracoHques très
fréquentes (par exemple des tumeurs desmoides) et s’exprime une dizaine d’années
plus tard que la polypose classique.
L’Hereditary Non Polyposis Colon Cancer est l’autre des deux syndromes moeurs de cancers colorectaux héréditaires. Le syndrome de l’Hereditary Non Polyposis Colon Cancer représente environ 4 à 8 % (et selon certains même jusqu’à
15 %) des cancers du colorectum. L’HNPCC est un syndrome de susceptibilité cancéreuse avec une transmission autosomale dominante et une pénétrance élevée estimée à 80-95%. Des progrès énormes ont été faits dans la compréhension de la génétique moléculaire de ce s5m.drome pendant ces dernières années. Décrit pour la première fois en 1895 par l’anatomopathologiste Alfred Warthin qui s^ était
intéressé par souci pour la dépression de sa coutiirière qui était persuadée de mourir im jour d’un cancer gynécologique ou colique car tous les membres de sa famille en étaient décédés (elle est d’ailleurs décédée jeune d’un cancer de
l’endomètre), la seule manière de détecter ou de confirmer ce syndrome a été, pendant longtemps, les critères cliniques « d’Amsterdam » (Vasen et al. 1990) appliqués à l’anamnèse familiale.
Les Critères d’Amsterdam de 1990 :
>/= 3 membres de la famille avec un cancer colorectal un patient est un parent au l®"" degré des 2 autres la maladie touche au moins 2 générations successives
>/= 1 cancer colorectal avant l’âge de 50 ans exclure une polypose familiale
tumeurs documentées par histologie
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Ces critères initiaux d’Amsterdam ont récemment été remplacés par les « Revised Clinical Criteiia : Amsterdam 11 » (Vasen et al. 1999) à cause de leur trop grande limitation aux tumeurs coliques alors que le syndrome est typiquement
multiorgartique avec des tumeurs autres que rectocoUques (cf. plus loin)
« Revised Clinical Criteiia: Amsterdam 11 »:
>/= 3 membres de la famille avec une tumeur de type HNPCC un patient est un parent au 1"^ degré des 2 autres
la maladie touche au moins 2 générations successives
>/=l cancer de type HNPCC avant l’âge de 50 ans exclure une polypose familiale
tumeurs documentées par histologie
Cependant, destinés surtout à la spécificité de la séléction de ces patients pour pouvoir ultérieurement définir avec précision le syndrome au niveau génétique, ces critères, malgré les services qu’üs ont rendu, sont aujourd’hui beaucoup trop rigides. En effet, en clinique quotidierme, ü est importante d’insister sur le fait que ces critères ne sont plus destinés à exclure des familles suspectes d’étre porteuses des mutations en question. Maintenant que ces dernières commencent à être bien cormues, ü est important de penser à l’éventualité de l’existence du syndrome HNPCC devant toute famille avec un clustering de cancers du colorectum et des autres organes associés (cf. plus loin) et un âge de survenue précoce.
Les sujets atteints de HNPCC présentent une tumeur, localisée dans 66 % des
cas au niveau du colon droit, à un âge jeune (avec une moyenne de 45 ans), sont
atteints de tumeurs coliques multiples (tumeurs s3mchrones ou métachrones dans 35 % des patients) avec en plus une mtiltitude de tumeurs d’autres organes
associées (endomètre, ovaires, estomac surtout chez les sujets asiatiques, cerveau, intestin grêle, uretère, rein, tractus hépatobiliaire) chez le probant ou chez des membres de sa famille rapprochée.
Ce n’est qu’à partir de 1993 (Peltomaki et al. 1993) que les gènes de
susceptibilité au syndrome ont commencé à être connus. La plupart des cancers colorectaux (90 à 95%) observés chez des patients atteints du syndrome HNPCC présentent une instabilité micro satellite (Aaltonen et al. 1993, Liu et al. 1996). Par ailleurs, 12 à 15 % des cancers colorectaux sporadiques ont des insertions et/ ou des délétions dans ces mêmes séquences répétitives (lonov et al. 1993, Thibodeau et al. 1993). L’anomalie de base en cause est une mutation inactivante d’une série de gènes (hMSH2, hMLHi, hPMSi, hPMS2, hMSHe ou hMSHa) codant pour les enzymes réparatrices du DNA, les « mismatch repair genes » (à noter que les deux gènes hMSH2 et hMLHi sont responsables de plus de 90% des mutations identifiées à ce jour). Le déficit fonctionnel de ces gènes de réparation résulte dans l’accumulation
de mutations au niveau de séquences simples et répétitives qui sont
particulièrement vulnérables pendant la réplication du DNA et que l’on appelle microsatellites. Le phénotype ainsi obtenu est nommé le phénotype RER (réplication error) ou MSI (microsatellite instabüily). A noter que les nouveaux critères
d’instabüité microsateUite font état actuellement de MSI-high (instabilité au niveau d’au moins 2 des 5 régions microsatellites des consensus) et MSl-low (0 ou 1 des 5 régions microsatellites de consensus) (Boland et al. 1998).
La plupart des séquences microsatellites du génome se trouvent dans des
régions non codantes du DNA et des mutations à leur niveau n’ont pas d’expression au niveau du phénotype de la cellule. Cependant, certaines séquences
microsateUites sont dans des régions codantes de gènes impliqués dans la
croissance cellulaire. Les gènes suivants contiennent des séquences microsateUites
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dans leurs régions codantes ; Récepteur II à TGF(i, Récepteur à IGF2 (Insulin Uke Growth Factor 2), TCF-4, P-caténine, BAX (gène impliqué dans l’apoptose), caspase- 5 (une protéase), et même certains gènes impliqués dans le mismatch repair
(hMSHe, hMSHs). Certaines de ces mutations donnent lieu à une perte de fonction d’un gène « tumor-suppressor » (RII, BAX, MMR, IGF2R) et certaines donnent Heu à un gain de fonction d’im oncogène (P-caténine) (Boland et al. 2000).
L’étude moléculaire et clinique de ces 2 syndromes héréditaires majeurs (HNPCC et polypose familiale) a permis de scinder les tumeurs colorectales en 2 groupes : les tumeurs avec instabiüté micro sateUite et les tumeurs avec instabüité
chromosomique (mutations suivies de pertes d’hétéroi^gosité). Les deux syndromes héréditaires servent d’exemples-types presque caricaturaux à ces deux voies de carcinogenèse qui sont très probablement opérationnelles dans la totahté des cancers du colorectum. Les tumeirrs avec instabüité microsatelHte dont l’exemple type est constitué par les HNPCC mais dont l’expression s’étend parmi les tumeurs dites « sporadiques », se présentent de manière prédominante au niveau du colon droit, contiennent du DNA diploide, hébergent au sein de leurs cellules constitutives une série de mutations caractéristiques (BAX, R II TGFp, caspase-5), se manifestent de manière plus indolente et avec un pronostic légèrement meilleur à stade égal, et ont souvent une histologie mucineuse et peu différenciée avec un infiltrat
lymphocytaire (réaction de l’hôte) importante en périphérie des tumeurs. Les adénomes dans le syndrome HNPCC (qui existent malgré la dénomination !) sont souvent de type villeux, avec souvent de la dysplasie et progresseraient plus vite que les adénomes sporadiques habituels. Par contre, les tumeurs avec une instabüité chromosomique qui sont représentées par la polypose famüiale et la majeure partie des tumeurs sporadiques, se locaHsent plutôt au niveau du colon gauche,
contiennent du DNA aneuploide, hébergent aussi une série de mutations
caractéristiques mais distinctes (k-ras, APC, p53...), et ont, en général, un
comportement plus agressif.
Dans les cancers « sporadiques » (donc ne faisant pas partie des syndromes héréditaires) avec instabilité micro satellite (~ 15% des cancers colorectaux
sporadiques), des mutations hMLHi ont été détéctés (Liu et al. 1995). Ce qui est plus
fréquent dans ce type de tumeurs est cependant une hyperméthylation de la zone
5’CpG de hMLHi et cette hyperméthylation est souvent associée à une perte
d’expression de la protéine hMLHi. Dans certaines lignées cellulaires de cancers
coliques avec ime instabilité microsateUite, la déméthylation permet de réstaurer et
l’expression de hMLHi et la capacité MMR (mismatch repair). Donc, probablement,
l’instabilité micro satellite dans les cancers sporadiques est due, au moins parfois, à
l’inactivation épigénétique de hMLHi par méthylation du DNA (Herman et al. 1998).
Latency Associated
Peptide
\ activâtes
NOS TRAVAUX :
a) Cancers colorectaux et Récepteurs à TGFP
Les Transfonning Growth Factor p (TGF-pi, -Pa, et -pa) font partie d’une famille de peptides à potentialités multiples fonctionnant, entre autres, comme des
inhibiteurs de croissance cellulaire et inducteurs d’apoptose dans certains types de cellules épithéliales. Le TGFp est également impliqué dans la réponse immune et inflammatoire ainsi que dans la formation de fibrose notamment dans la cirrhose hépatique, la glomérulonéphrite... (Moses et al. 1990, Spom et al. 1992, Spom et al.
1986, Wang et al. 1995, Massagué et al. 1992).
Le TGFp est sécrété sous une forme latente, incluant 3 parties : le TGFp
proprement dit, la partie N-terminale inactive du précurseur et une protéine ligante (« Latent TGFp Binding Protein » ou LTBP). L’ensemble est appelé le « large latent TGFp complex ». La LTBP joue un rôle crucial dans l’assemblage, la sécrétion et l’activation du TGFp latent (Roberts 8a Spom 1990, Miyazono et al. 1988).
La transmission de signal intracellulaire dépendante du TGFp se fait via deux protéines kinases sérine/ thréonine transmembranaires nommées le Récepteur à TGFp de t5qje I (RI) et le Récepteur à TGFp de type II (RII). Le mécanisme détaillé de la transmission de signal intracellulaire TGFp-dépendante est illustré dans la figure 2. (A noter que celle-ci est adaptée en fonction de données expérimentales disponibles actuellement mais dont la plupart n’étaient pas encore connues à
l’époque des études faisant l’objet de cette thèse). Le TGFp est sécrété par les cellules
épithéliales et est lié, une fois à l’extérieur de la cellule, au peptide LAP (latency-
associated peptide). Pour activer le TGFp, le LAP doit être cHvé par HGFIIR. Le TGFp
ainsi libéré se lie à son RII ce qui induit la formation de l’hétérodimère RII-Rl et la
transphosphoiylation du RI par le RII. La forme active phosphorylée de
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RI sera dès lors responsable de toute une série de fonctions intracellulaires du TGPp, notamment rarrêt du cycle cellulaire à la phase Gl-S et l’induction de
l’expression de gènes cibles (Deiynck et al. 1994, Markowitz et al. 1996, Wrana et al.
1994). Le signal intracellulaire de TGPp utilise la famille des protéines Smad. Quand le TGPp est lié à son récepteur membranaire, les deux protéines c3doplasmiques Smad2 et Smad3 migrent vers le noyau. Le Smad3 dégrade le SnoN et libère ainsi le Smad4. Le Smad4 libéré forme un complexe avec le Smad2 et ce complexe procède à l’activation de gènes suppresseurs de la croissance cellulaire.
Cependant, l’effet biologique du TGPp dans les lignées cellulaires colorectales malignes n’est pas univoque. En mars 1995, au début de ce travail, il était connu que le TGPP était exprimé dans la plupart des lignées d’adénomes et de carcinomes coliques et exerçait en principe, une inhibition de la croissance des cellules
normales et tumorales. Il existait également la notion de résistance au TGPp : l’effet
inhibiteur de la croissance était considéré comme étant de moins en moins marqué
à mesure que la tumeur était de plus en plus maligne et indifférenciée. On supposait
que cette résistance était due à \me absence d’expression d’vm des récepteurs ou à
l’expression d’un récepteur muté et dès lors non-fonctionnel, raison pour laquelle
nous avons initié l’étude de l’expression des deux récepteurs dans les cancers
colorectaux humains. Cependant, il faut savoir que si le TGF(Î agit parfois en effet
comme un inhibiteur de la croissance et multiplication cellulaires, il se comporte
aussi parfois, et de façon paradoxale, comme im stimulateur de la croissance et du
potentiel envahissant de certaines cellules cancéreuses en culture (Hsu et al. 1994,
Manning et al. 1991, Hoosein et al. 1989, MacKay et al. 1995, Schroy et al. 1990,
Park et al. 1994, Kadin et al. 1994).
Markowitz et al. ont publié, en décembre 1995, des résultats expérimentaux montrant une quantité fortement réduite voire indétectable de mRNA de RII associée à l’absence de récepteurs de surface dans 80% de lignées cellulaires cancéreuses coliques et de xénogreffes de tumeurs exhibant une instabilité micro satellite (ou le phénotype « RER » ou « réplication error »). Cette découverte presque de hasard a ouvert le chemin à une conception différente de la carcinogenèse colique au niveau moléculaire. La synthèse de récepteurs tronqués et inactifs dans ces cellules était due à des mutations dans deux régions « microsateUite-lLke » du gène de RII.
L’instabilité microsatellite est présente dans environ 95 % des cancers du
colorectum chez des patients atteints de « Hereditaiy Nonpolyposis Colon Cancer » ou HNPCC avec des mutations fréquentes de RII mais dans seulement 10-15 % des cancers colorectaux sporadiques. Dès lors, moins que 10 % des cancers colorectaux sporadiques devraient avoir des RII mutés ou absents. Il manquait des doimées sur les 90 % restants des cancers sporadiques ainsi que sur l’expression des récepteurs àTGFp dans la muqueuse colique normale. Nous avons donc étudié l’expression et la localisation cellulaire de RI et RII dans les tumeurs colorectales humaines sporadiques (population non-selectionnée) et dans des tissus normaux
correspondants, (cf. Article dans annexe ; Expression of Transforming Growth Factor p Receptors in Normal Human Colon and Sporadic Adenocarcinomas, Eskinazi et al. Gastroenterology 1998.)
Dans la muqueuse colique normale, nous avons détecté de l’immunoréactivité
pour RI et RII dans les couches superficielles des cryptes qui sont occupées par des
cellules différenciées et/ou apoptotiques. Il n’y avait pas de marquage dans les
couches profondes des ciyptes y compris le compartiment prolifératif. A noter que
cette distribution correspond à celle déjà décrite du TGFp lui-méme dans le colon
humain ( Aveiy et al. 1993) et est compatible avec un processus autocrine et/ou
paracrine.
15
L’expression des RI et RII est plus importante dans les adénocarcinomes
colorectaux que dans les tissus normaux. Et, de nouveau, cette surexpression imite celle du TGPp lui-même dans les cancers colorectaux déjà décrite par Tsushima et collaborateurs ( Tsushima et al. 1996). Une fonction autocrine et/ou paracrine devient donc également envisageable dans ces tissus néoplasiques.
L’expression dans plus de 50 % des cellules épithéliales de Rll était plus
fréquente dans les tumeurs bien différenciées que dans les tumeurs moyennement différenciées, confirmant, à nouveau, l’association de Rll avec le phénotype
différencié déjà observé dans les colons normaux. A noter ici qu’vuie des
caractéristiques des tumeurs colorectales dans le syndrome HNPCC, où Rll est souvent muté et inactif, est leur histologie peu différenciée. Il nous semble donc trouver ici une relation positive entre phénotype différencié et expression de Rll, et inversement une diminution d’expression ou de fonctionnalité de Rll et phénotype dédifférencié. Ceci semble constant et dans les tissus normaux et dans les tissus cancéreux colorectaux et semble également concorder avec l’expression de la protéine TGFp elle-même.
La surexpression de Rll a déjà été observée également par Friess et
collaborateurs dans des adénocarcinomes pancréatiques, suggérant im mécanisme plus généralisé dans la tumorigenêse.
Dans notre étude, 32 des 33 tumeurs sporadiques investiguées présentaient im immunomarquage (cf. Tableau 1 dans l’article) des deux récepteurs (RI et RII) au sein d’amas de cellules néoplasiques. Les anticorps utilisés pour les marquages étaient dirigés contre les extrémités carbojQ^-terrninales de RI et de RII, et par
conséquent, n’auraient pas marqué des récepteurs tronqués. Dés lors, ü n’existe pas d’éléments jmuvant faire croire à l’existence dans ces tumeurs de récepteurs mutés et amputés au niveau de leurs domaines intracellulaires nécessaires à la
transmission de signaux intracellulaires, comme c’est le cas dans la majorité des
cancers à phénotype RER (réplication error). De surcroit, nous avons effectué, dans
18 des tumeurs utilisées, un séquençage des régions « microsateUite-like » du RII (régions décrites par des études publiées dans la littérature comme étant les lieux de la plupart des mutations somatiques dans les lignées RE R), avec comme résultat l’absence de mutations à ces niveaux, (cf. l’article) Nous insistons ici sur le fait que les 33 tumeurs utilisées étaient sporadiques et donc probablement ne comportaient pas d’instabilité microsatellite.
Outre les mutations tronquantes du RII , des mécanismes impliquant des anomalies de glycosylation associées à im problème d’acheminement vers la membrane cellulaire de récepteurs ont été proposés comme explication à l’absence d’elfet inhibiteur sur la croissance du TGFp dans certaines cellules. Par exemple, les cellules MCF-7, une lignée de cancer mammaire, expriment très peu de RII à leur surface et répondent également très mal au TGFp mais contiennent du RII dans leur c3dosol. Le même profil est exprimé dans les cellules T de patients atteints de
syndrome de Sézaiy avec la même absence d’acheminement de la protéine jusqu’à la membrane cellulaire (Koli et al. 1997, Capocasale et al. 1995).
Il était donc primordial pour nous, avant de suggérer une éventuelle
fonctionnalité des récepteurs surexprimés dans nos tissus coliques néoplasiques, de nous assurer que ces récepteurs étaient effectivement présents à la surface des cellules. Pour ce faire, nous avons procédé à un fractionnement ceUvdaire suivi d’immunoempreintes dans les différents compartiments cellulaires. Dans la fraction membranaire des tumeurs, une protéine de 60 kDa était observée avec une
deuxième bande plus faible de 70 kDa, alors que dans la fraction cytosolique, une seule bande de 60 kDa était visible. Par ailleurs, l’expression était identique à celle observée dans les colons normaux, plaidant en faveur d’une absence d’anomalie à ce niveau. La distribution de RI était similaire à celle de RII.
Cependant, il est difficile de savoir avec précision si l’excédant de récepteurs au
niveau des tissus cancéreux observé correspond à des récepteurs fonctionnels ou
non. Il est tout aussi difficile de déterminer l’effet précis du TGFp dans les tissus
17
néoplasiques in vivo. Même si le TGFp est connu pour ses effets négatifs sur la croissance cellulaire et la progression maligne correspond fréquemment à une perte de réponse à cet effet, ü est aussi bien démontré que le TGFp agit aussi dans
d’autres environnements et circonstances comme un stimulateur de la croissance ( par exemple, dans certaines lignées cellulaires à partir de métastases de cancers coliques). En plus, le TGFp a déjà été décrit comme étant associé à un potentiel malin au niveau de certains types tumoraux ( Arrick et al. 1992, Gorsch et al. 1992).
Il existe une surexpression de TGFp dans les cancers coliques et pancréatiques (Tsushima et al. 1996, Friess et al. 1993). Des niveaux élevés de TGFpi ont été corrélés à une progression de la maladie dans le cancer du sein ( Gorsch et al.
1992).Le potentiel métastasiant expérimental des cellules mammaires malignes 13762 est augmenté par le TGFpi ( Welch et al. 1990). Le TGFPi induit la tumorigénicité indépendante des oestrogènes des cellules MCF-7 mammaires (Arteaga et al. 1993). Et tous ces effets sont également médiés par les mêmes récepteurs de surface.
Par edlleurs, les tumeurs in vivo présentent un mélangé de cellules répondant différemment et parfois de manière diamétralement opposée au TGFp (Hsu et al.
1994). Certaines cellules sont inhibées et d’autres sont stimulées dans levu*
croissance. Dans notre étude, une expression hétérogène de récepteurs à TGFp a été observée. Au sein du même adénocarcinome colique, certains amas cellulaires étaient immunonégatifs alors que d’autres amas étaient marqués et au sein même des amas, certaines cellules exprimaient le récepteur en question alors que d’autres ceUvdes voisines ne l’exprimaient pas. Le caractère hétérogène des tumeurs n’est pas une trouvaille récente. Ce qui serait pourtant important à déterminer serait la
différence de potentiel de croissance et d’invasion entre les cellules exprimant les
récepteurs à TGFp et celles ne les exprimant pas. L’hétérogénéité typique et bien
connue des tumeraxs pourrait justement être un mécanisme utile au développement
de celles-ci. La croissance et progression de souspopulations cellulaires tumorales
pourraient être influencées par d’autres souspopulations cellulaires tumorales ou stromales. Une hypothèse serait que des souspopulations cellulaires sans potentiel métastasiant sécrètent du TGFp actif auquel elles sont insensibles elles-mêmes mais qui aura un pouvoir stimulant au niveau de souspopulations métastasiantes et agressives de la même tumeur soHde (Theodorescu et al. 1991).
En résumé, le travail rapporté dans cet article montrait une surexpression de RI et RII dans les adénocarcinomes colorectaux humains par rapport aux tissus correspondant normaux. Ceci allait dans le sens contraire de la diminution ou l’absence de ces récepteurs de surface observées par d’autres auteurs dans la majorité de cancers colorectaux porteurs d’instabilité microsatellite. Bien sûr, ces résultats n’excluaient pas l’existence d’autres altérations au sein du « TGFp pathway » : autres mutations de RII avec des effets de type « dominant négatif » comme observés dans des carcinomes gastriques et des lymphomes, altérations à des niveaux « post-récepteur »... Depuis la publication de notre article, Grady et al.
ont pu en effet montrer des mutations inactivantes de RII à des séquences autres que la séquence BAT-RII de répétition polyadénine dans 15% de cancers coliques stables au niveau microsatellite. Donc, à ce stade-ci, dans les ~ 15% des cancers coliques sporadiques avec instabilité microsateUite, ü existe des mutations de séquences répétées BAT-RII, et dans un autre 15% de cas, il existe des mutations ponctuelles inactivant le RII avec inactivation des mécanismes du TGFp pathway. Il a également été prouvé récemment que 55% des cancers coliques stables au niveau micro satellite présentent des déficits de signalement TGFp en aval du RII. On sait maintenant que le Smad4 (ou le DPC4) qui est un gène candidat « tumor
suppressor » a un rôle critique dans la transmission de signal à partir du TGFp (cf.
schéma). Zhou et al. ont pu montrer que l’inactivation par mutation du Smad4
provoque une absence de réponse au TGFp dans des cellules de cancer colorectal
(Zhou et al. 1998).
C H A S
1106 Eskjngzi et al
AJP Oclober 1999, Vol. 15.5, No. 4
GTP
I GTPCH
r
7,8-Dihydroneopterin triphosphate
I Actions on
Donc, actuellement, il semblerait que le TGFp pathway et son RII soient des cibles importantes d’inactivation dans les cancers colorectaux stables au niveau
microsatellites ainsi que les cancers instables à ce niveau même si les voies de mutagenèse puissent être sensiblement différentes. (Grady et al. 1999). Déjà à l’époque de la rédaction de cet article, il existait des arguments allant dans le sens de routes différentes empruntées par des tumeurs colorectales de types différents.
Certains types héréditaires de cancers colorectaux, et en particulier le syndrome HNPCC, semblent exprimer des particularités génétiques différentes de celles
observées dans la séquence adénome-carcinome classique des tumeurs sporadiques.
Konishi et al. avaient déjà publié que les mutations dans l’APC, le p53 et le K-ras 2 ainsi que la perte d’hétéro^gosité étaient moins fréquentes dans les HNPCC que dans les tumeurs non-HNPCC, alors que les mutations de RII du TGPp étaient plus fréquentes dans les HNPCC. Thibodeau et al. avaient déjà postulé qu’ü pourrait y avoir deux types de progression indépendantes pour arriver à un phénotype tumoral : ime première via l’accumulation de mutations multiples dans des gènes
« tumor-suppressor » suivie de perte dhétéro2ygosité et l’autre via des mutations au sein’d’un groupe spécifique de gènes réparateurs de DNA avec comme résultat, une instabilité dans des gènes associés à des microsateUites codants, par exemple le RII àTGPp.
b) Cancers colorectaux et PCD/DCoH
Le PCD (ptérine-4a-carbinolamine deshydratase) est une protéine bifonctionnelle
connue également sous le nom de DCoH (« dimerization cofactor of hepatoc3rte
growth factor 1 (HNPl) »). En tant qu’enzyme, le PCD joue un rôle important dans la
récupération de la tétrahydrobioptérine (BH4) qui est un cofacteur essentiel de
plusieurs réactions métaboliques (cf. schéma 3). Par ailleurs, le
20
PCD/DCoH module la spécificité de liaison du HNFl au DNA, en agissant par ce biais sur l’activité transcriptionnelle de ce dernier.
Le BH4 est le cofacteur essentiel de plusieurs monoo^génases telles que les hydroxylases des acides aminés aromatiques, la glycol ether mono-oxygénase, et de la NO synthase. Les trois hydroxylases des acides aminés aromatiques métaboHsent la phénylalanine, la tyrosine et le tryptophane et synthétisent les précurseurs des neurotransmetteurs tels que la dopamine, la norépinephrine, l’épinephrine et la sérotonine. Dès lors, on comprend qu\m déficit de BH^ donne, en clinique, des désordres neurologiques avec retard mental associés à l’hyperphénylalaninémie ou phénylcétonurie. En clinique pédiatrique (voir schéma 3), un déficit de PCD est associé à une forme rare et modérée d’h5q>erphénylalaninémie caractérisée par l’excrétion de ptérines dans les urines des patients atteints. Par ailleurs, le déficit locahsé au niveau de l’épiderme de PCD est associé au déficit de pigmentation connu sous le nom de vitihgo via l’inhibition de la mélanogenèse par les ptérines-7- substituées qui s’y accumulent.
Jusqu’à notre travail sur le PCD/DCoH, ces affections étaient les seules connues en pathologie humaine à impHquer le PCD/DCoH.
Les Hépatocyte Nuclear Factors (HNF) la et l(î sont une famille de facteurs de transcription à homéodomaine. Ces facteurs de transcription sont composés de trois domaines fonctionnels : un domaine de dimérisation N-terminal, un domaine de Haison au DNA avec des motifs « POU-hke » et des motifs homéodomaines, et un domaine de transactivation C-terminal. L’ HNFla et 1’ HNF1(Î (aussi appelé le v- HNFl) sont des protéines homologues qui se fient à leur cible au niveau du DNA sous forme d’home- ou hetero-dimères. L’HNFla se lie à des éléments cis du DNA avec la séquence consensus 5’-GTTAATnATTA(A/C)(A/C)-3’ (Vaxillaire et al. 1999).
L’HNFla a été initialement décrit comme étant un régulateur transcriptionnel
d’une série de gènes hépatiques dont les gènes de l’albumine, p-fîbrinogène et ai
antitrypsine (cf. tableau) (Baumliueter et al. 1990, Chouard et al. 1990, Frain et al.
1989). LTlNFla est fortement conservé au sein de la classe des vertébrés, avec une identité d’acides aminés de 94% entre la protéine humaine et celle du rat (Bach et al. 1991).
L’HNFl est impliqué dans la régulation transcriptionnelle de pênes variés :
• Albumine
• p-fibrinogène
• ai antitiypsine
• IGF-I
• Insuline
• Gènes impliqués dans le transfert du Glucose (ex. GLUT-2)
• Gènes impliqués dans le métabolisme du Glucose (ex. L-pyruvate kinase)
Par aüleurs des études avec des souris knockouts ont confirmé ce rôle important joué par 1’ HNFl dans la régulation de gènes intervenant dans la fonction hépatique
avec une dysfonction majeure à ce niveau chez des souris déficientes en HNFla
(Pontoglio 1996 ). Ces souris qui sont HNFla -/- ont un phénotype Cciractérisé par
une phénylcétonurie sévère, un syndrome de Fanconi ( tubulopathie proximale
rénale avec pertes urinaires massives de glucose, acides aminés, phosphate et une
pol3oirie osmotique d’accompagnement) se manifestant cliniquement par une
pol30irie et une cachexie majeures, et une hépatomégalie massive accompagnée
22
d’une augmentation des transaminases, de la bilirubine et de l’ammoniaque sanguins. Ces souris meurent à im âge précoce, Souvent au moment du sevrage.
Les connaissances actuelles sur l’HNFl ont pu mettre en évidence, à l’heure actuelle, la présence de plus de 80 mutations au niveau de ce gène. La plupart des mutations décrites se trouvent au niveau d’acides aminés qui ont été conservés au cours de l’évolution. Les mutations non-sense se trouvent au niveau de tous les domaines fonctionnels du HNFl, cependant, la densité la plus élevée de mutation se localise au niveau des séquences homéodomaines qui sont directement impliquées dans la liaison au DNA (VaxiUaire et al. 1999).
Certaines mutations dans l’HNFla sont liées à un type de diabète connu sous le nom de MODY-3 ( type 3 Maturity-Onset Diabètes of the Young) (Yamagata et al.
1996). On sait maintenant que l’HNFla est essentiel pour la transcription du gène de l’insuline ainsi que l’expression de plusieurs gènes impliqués dans le transport du glucose et son métabolisme. (Wang et al. 1998) Le déficit de fonctionnalité du HNFla dans cette maladie serait également responsable de la diminution d’oxidation mitochondriale de substrats métaboliques avec, entre autres, une diininution de production d’ATP. Des études récentes avec des souris knockout pour HNFl a ont montré que le contenu en insuline des cellules beta pancréatiques est diminué, suggérant un effet du HNFl a sur la synthèse de l’insuline ainsi que sa sécrétion (Okitaet al. 1999, PontogUo et al. 1998, Lee et al. 1998).
Le « dimerization cofactor » de l’HNFl (PCD/DCoH) potentialise l’activité
transcriptionnelle du HNFl en stabilisant ses dimères et module la liaison du HNFl
aux acides nucléiques ; le PCD/DCoH permet la liaison du HNFl à des séquences
qui dévient considérablement de ses palindromes de consensus et modifie par ce
biais la spécificité de liaison du HNFl au DNA. Par ailleurs, on sait que l’HNFla
peut activer l’expression de ses gènes cibles quand il est transfecté dans des lignées
cellulaires qui ne l’expriment pas constitutivement et que cette activation dépend
Rey-Campos et al. 1991, Kuo et al. 1990). Cette dépendance vis-à-vis du milieu cellulaire pourrait être expliquée par l’existence au sein de cette cellule d’une protéine nécessaire au bon fonctionnement du HNFl, et cette protéine pourrait être le PCD/DCoH.
A la lumière de ce qui vient d’être exposé au sujet du PCD/DCoH, il semble évident qu’une telle protéine, d’une part régulant l’activité d’un facteur de transcription et d’autre part étant impliquée directement dans le recyclage d’un cofacteur essentiel de la NO synthase, soit une cible d’étude dans la carcinogenèse.
Dès lors, nous avons étudié son expression dans des tumeurs colorectales et dans des cellules de cancers coliques en culture par rapport à son expression dans des prélèvements coliques normaux.
En effet, toutes les 20 tumeurs coHques présentaient une très forte
immunopositivité pour le PCD/DCoH au niveau des cellules épithéliales malignes alors que l’épithéHum normal correspondant des tissus normaux était négatif (cf.
article dans les annexes ; Eskmazi et al. American Journal of Pathology, Octobre 1999). Aucune corrélation n’existait entre l’importance du marquage et le degré de différenciation, la localisation ni le stade des tumeurs. Le marquage était massif dans tous les cas. Une importante expression de PCD/DCoH a été également observée in vitro dans les lignées cellulaires Caco-2 et HT-29. Par ailleurs, nous avons aussi détecté de l’ARN messager de HNFl dans les tissus tumoraux et normaux ainsi que dans les deux lignées cellulaires in vitro.
Cette étude constituait la première observation d’une siurexpression de
PCD/DCoH dans les tumeurs du colorectum. L’expression de la protéine était
abondante dans tous les ceis, tout en restant bien limitée aux ceUides épithéliales
malignes, contrastant en cela avec l’absence presque complète (sauf les quelques
cellules neuroendocrines marquées des couches profondes de l’épithélium) de
marquage dans l’épithélium colique normal.
24
L’explication exacte de cette différence frappante entre les cellules épithéliales malignes et normales relève, à leur actuelle, d’hypothèses théoriques. Le PCD/DCoH pourrait, soit en tant qu’enzyme réductrice soit en tant que régulatrice de facteurs de transcription, conférer à ces cellules un avantage sur les autres, leur permettant de se miiltiplier plus efficacement et de devenir le type cellulaire prédominant par séléction et « expansion clonale ». Ou bien, l’excès de PCD/DCoH dans les cellules malignes pourrait être un épiphénomène, produit « par hasard » comme résultat d’une autre altération qui est, elle, la cause de l’avantage séléctif. Dans les deux cas, le fait que l’expression de la protéine soit limitée aux cellules néoplasiques pourrait éventuellement permettre son utilisation comme marqueur tumoral.
En tant qu’enzyme, le PCD est impliqué dans le recyclage du BH^ ( cf. schéma 4).
Plusieurs articles ont déjà fait état des effets du BH4 sur la prolifération de lignées cellulaires : le BH4 augmente la prolifération cellulaire dans la lignée de
phéochromocytome de rat, PC 12, dans des lignées de fîbroblastes transformés et dans les cellules de gliome de rat C6. Par ailleurs, des cellules d’éiythroleucémie murine contiennent beaucoup plus de BH4 quand elles ont immatures et ne prolifèrent activement que lorsqu’elles sont au terme de leur différenciation. Dans les thymocytes de rat, la biotynthèse et l’accumulation de BH4 augmentent et atteignent un pic juste avant la phase S du cycle cellulaire. En culture de cellules d’érythroleucémie murine, le BH4 était nécessaire pour la prolifération de certaines des lignées. Cependant, la réduction du BH4 endogène n’altère pas la croissance des MOLT-4(leucémie) ni des MCF-7 (sein) en culture ( Anastasiadis et al. 1996, Tanaka et al. 1989, Ziegler et al. 1986, Schott et al. 1992, Kerler et al. 1990, Smith et al.
1992).
Une autre piste à suivre est l’implication du BH4 comme cofacteur essentiel de la
NO synthase (NOS). Le BH4 stabilise la forme active dimérisée de cette enzyme et
prévient (et même réverse) l’inhibition de la NOS par le NO, en augmentant la
quantité de NO. Et même si une perte relative de NOS a déjà été décrite dans la
néoplasie colorectale par rapport au colorectum normal par certains auteurs, d’autres ont réussi à diminuer la croissance d’un xénogreffe d’adénocarcinome colique humain en inhibant, de manière séléctive, la NOS inductible (iNOS). L’oxide nitrique pourrait donc avoir un rôle fonctionnel dans la promotion de la croissance et la progression de tumeurs solides. De plus, une cohorte d’autres en2ymes métaboliques peuvent être coinduites avec l’iNOS dans une série de lignées cellulaires humaines y compris des lignées d’adénocarcinomes colorectales. Une telle en^me est la GTP-cyclohydrolase-1 impliquée dans la voie de synthèse des bioptérines (cf. schéma 4). La coinduction de ces voies métaboliques aixxiliaires pourrait être importante dans la détermination du pouvoir d’activation de la NOS de ces tumeurs.
Il apparaît donc que le BH^, et toute emyme ayant un rôle dans son recyclage, puisse avoir une influence sur la prolifération cellulaire et dès lors, le rôle du PCD/DCoH pourrait être significatif dans un tel contexte.
D’un autre coté, le PCD/DCoH est un régulateur des facteurs de transcription HNFla et HNFip. L’activation transcriptionnelle séléctive de gènes est régulée par l’action concertée de facteurs de transcription « tissu-spécifiques » tels que ffiNFl, exprimé dans le foie, mais aussi dans le rein, estomac et intestin de plusieurs espèces d’animaux. La formation d’homo- ou hétéro-dimères de facteurs de transcription peut mener à la transformation de la spécificité de liaison au DNA et/ou l’altération de l’activité transcriptioimelle. Le rôle des protéines « cofacteurs » qui régulent le processus de dimérisation, comme le PCD/DCoH, peut être
important dans ce contexte.
Le PCD/DCoH stabilise les complexes HNF/DNA et permet des interactions de HNFl avec des sites de liaison suboptimaux au niveau du DNA tels que le TATA box.
L’hypothèse est que l’association entre le PCD/DCoH et l’HNF résulte dans
l’apparition d’une surface d’activation de HNFl qui n’est pas exprimée en l’absence
26
de DCoH. Il existe, par ailleurs, aussi des interactions de HNFl avec le RNA, mais ces interactions sont complètement abolies quand lllNFl est lié au PCD/DCoH.
L’augmentation dans la stabilité des complexes HNFl/DNA dépendante du
PCD/DCoH pourrait avoir une importance biologique. La plus grande stabilité de la liaison permet à l’HNFl plus d’opportunités pour interagir avec la machinerie transcriptionnelle avant d’être libéré du DNA. Une autre action du PCD / DCoH pourrait aussi être la libération de l’HNFl lié de manière nonspécifïque au RNA, lui procurant donc plus de disponibilité vis-à-vis du DNA (Mendel et al. 1991, Rhee et al. 1997).
Il a déjà été proposé que l’expression variable du cofacteur selon les lignées cellulaires puisse expliquer les différences de potentiel de transactivation du HNFl selon la lignée utilisée. En poursuivant ce raisormement, on peut spéculer que la présence de PCD/DCoH observée dans les cellules épithéliales malignes du colon puisse moduler le potentiel de transcription/transactivation de l’HNFl dans ces cellules.
La présence du mRNA de HNFl dans les tissus tumoraux que nous avons étudiés rend possible l’hypothèse de coopération entre le PCD/DCoH et le rôle transcriptionnel du HNFl dans ces cellules. De surcroit, la localisation
intranucléaire du PCD/DCoH (cf.article/ photos) soutient l’idée de l’impKcation de la protéine dans la régulation de la transcription. Par contre, la localisation
cytoplasmique, observée également, serait plus en faveur d’une action enz5nnatique dans le métabolisme cellulaire.
Il se pourrait aussi que le PCD/DCoH interagisse avec d’autres facteurs que le
HNFl. Dans le Xénope, par exemple, dans les stades précoces de l’embryogenèse, le
PCD/DCoH est présent alors que HNFl n’est pas détecté. Aussi, dans la larve du
Xénope, le PCD/DCoH se trouve au niveau de l’intestin. Par contre cette présence
intestinale disparaît chez l’adulte alors que l’HNFl continue à y être exprimé. Il se
pourrait que dans le développement du Xénope, la présence du PCD/DCoH soit
importante au niveau de la croissance et formation de l’intestin. Donc la protéine pourrait se comporter comme une protéine oncofoetale, n’étant plus exprimé dans le colon normal adulte mais réaugmentant à des niveaux foetaux dans les tumeurs coliques.
En résumé, l’excès de PCD/DCoH observé dans le cancer colorectal pourrait être important via sa fonction enz3miatique dans la récupération du BH4 et/ou comme cofacteur régulant la dimérisation de facteurs de transcription. Il est cependant tentant d’imaginer que les deux rôles ne soient pas mutuellement exclusifs mais plutôt complémentaires ou du moins coexistants. Il est intéressant de noter, dans cette optique, que après sa liaison au HNFl, le PCD/DCoH garde son activité enzymatique. En effet, des études de mutagenèse dirigée ont montré que l’activité enzymatique, la capacité de liaison au HNFl et l’activité de potentialisation de la transcription sont indépendantes (Johnen et Kaufman 1997). Par conséquent, on pourrait même imaginer que l’activité de type « deshydratase » puisse être impliquée dans l’activité transcriptionnelle du HNFl.
Une autre question à se poser comme cible d’investigations ultérieures est de voir si l’augmentation de l’itmmmomarquage pour le PCD/DCoH est due à une
augmentation de l’expression du mRNA ou si des mécanismes
posttranscriptionnelles sont en cause, prolongeant la durée de demi-vie de la protéine.
A l’heure actuelle, les deux fonctions du PCD / DCoH semblent avoir une importance potentielle dans la carcinogenèse colorectale. Notre travail était le premier à faire état de cette expression massive du PCD/DCoH dans un tissu tumoral alors que son expression est quasi nulle dans le tissu normal
correspondant. Cette expression pourrait avoir des implications
physiopathologiques, diagnostiques et même thérapeutiques qui restent à préciser à
l’avenir.
28
Un dernier mot, à présent, sur les protéines régulatrices de la transcription à dualité fonctionnelle...
Une des cibles transcriptionnelles de l’HNFl est le gène de l’enzyme
phénylalanine hydroxylase (PAH) (Lei & Kaufman 1998) ! Le PCD/DCoH potentialise la transcription de PAH dépendante de HNFl. Donc, dans ce contexte, le PCD/DCoH semble avoir un rôle régulateur double au niveau de l’hydroxylation de la
phénylalanine. A travers son activité enzymatique, le PCD régénère le BH4, cofacteur essentiel pour cette hydroxylation. Et en plus, le DCoH, en stabilisant les
dimères de HNFl, up-régule la transcription du gène de PAH. Les deux actions du PCD/DCoH semblent ici en effet se compléter et se renforcer.
A première vue la dualité fonctionnelle du PCD / DCoH nous semblait tout à fait étonnante et exceptionnelle. En plus, cette synergie fonctionnelle était remarquable.
Cependant, il existe toute une série de cofacteurs qui sont essentiels à l’activation transcriptionnelle avec, en plus, une activité enzymatique propre (René St Arnaud
1999). Et le PCD/DCoH ne représente pas le seul exemple de ce type de
renforcement de fonction par des protéines bifonctionnelles. Le deuxième exemple, dans le domaine de la carcinogenèse colique, est constitué par la (i-caténine ( cf schéma 1). Les caténines (a, p, et y) constituent une famille de protéines interagissant avec les cadhérines, qui sont une famille de molécules d’adhésion cellulaire. La p-caténine joue un rôle dans la transmission de signaux de la
membrane cellulaire au noyau. Au niveau de la membrane cellulaire, la p-caténine
est liée aiix cadhérines et contribue à la régulation d’adhésion intercellulaire. Mais
la même protéine, à l’intérieur du cytoplasme, fait partie d’un complexe constitué de
GSKSp (glycogen synthase kinase-SP) et APC ! En l’absence de tout signal, le GSK3p
phosphoryle le complexe p-caténine-APC ce qui permet l’ubiquitinylation et la
dégradation de la p-caténine. En présence de nombreux signaux, on procède à
l’inhibition du GSK3P avec, par conséquent, une stabilisation de la p-caténine
facteurs LEF/TCF (lymphoid enhancer factor/T-cell factor) et active la transcription de ses gènes cibles. Au niveau de la membrane cellulaire, la p-caténine régule l’adhésion par les cadhérines et au niveau du noyau régule l’expression du gène de cadhérine ! (St Arnaud 1999)
Donc, dans les deux exemples donnés ci-haut, qui ne constituent d’ailleurs
aucunement une revue exhaustive, une même protéine bifonctionnelle agit à deitx
endroits différents de la cellule pour optimaliser la contrôle transcriptionnel et
l’efEcacité d’une même fonction cellulaire. Bien entendu, dans le cas du PCD/DCoH,
un tel feedback positif dans la carcinogenèse colique est loin d’être démontré ni
même suggéré dans l’état actuel de nos connaissances...
30
INTEGRATION DANS ET CONTRIBUTION A LA THEORIE ACTUELLE DE LA CARCINOGENESE COLIQUE :
Un des gènes cibles de mutation au niveau de séquences microsatellites est le Récepteur II àTGPp. Les deux régions microsatellites atteintes dans les cancers colorectaux avec instabilité microsateUite sont les nucléotides 709 à 719 du mRNA correspondant à une séquence de 10 adénylates et une séquence (GT)3 au niveau des nucléotides 1931 à 1936 de la séquence codante (Lin et al. 1992). Nous avons montré que, alors que cette mutation semble importante dans la transformation néoplasique des tumeurs à instabilité microsatellite, ce mécanisme ne semble pas être en jeu dans les tumeurs sporadiques de notre série. Même si l’intégrité du système TGPp puisse être touchée dans la carcinogenèse colique sporadique, dans notre série, aucxine des tumeurs étudiées ne comportait de mutations au niveau des deux régions microsatellites décrites au niveau du gène du récepteur de type II.
D’un autre côté, les mutations de l’APC, le p53, le K-ras et la perte
d’hétérozygosité existent certes dans les HNPCC mais sont moins fréquentes que dans les tumeurs sporadiques (Konishi et al.). La vision que l’on a actuellement de ces gènes de susceptibilité est une où leurs produits sont les garants directs du contrôle de prolifération cellulaire. C’est-à-dire ils agissent à la manière de gardiens ou « gatekeepers » ( Kinzler & Vogelstein 1998). Mais ü semble aujourd’hui que les gènes qui ont comme but de maintenir l’intégrité du génôme ou les « caretakers » sont au moins tout aussi importants dans le contrôle de la prolifération et le maintien du phénotype bénin et ceci semble être un phénomène généralisé dans la carcinogenèse avec des exemples dans d’autres types de cancers.
Par exemple, les gènes BRCAl et BRCA2 impliqués dans le cancer du sein se
lient à la protéine appelée le RadSl. RadSl serait impliqué dans le maintien de
l’intégrité du génome en réparant des cassures double-brin de DNA et
«recombination-linked repair ». Dès lors, tout empêchement de fonctionnement de ce système BRCA/Rad51 pourrait aboutir à une instabilité génomique et ouvrir la voie à un type de carcionogenèse. D’où l’élaboration de la théorie actuelle de
carcinogenèse où, d’une part, il existe ime voie « classique » avec l’accumulation de mutations « aléatoires » au niveau de gènes de type « gatekeepers » c.à.d. des gènes dont la fonction immédiate est de réguler la croissance des cellules en inhibant la multiplication ou en promouvant l’apoptose. Dans cette voie de carcinogenèse, chaque type cellulaire possède un nombre limité de gènes « gatekeepers » et
l’inactivation d’un « gatekeeper » bien spécifique résulte dans la genèse d’un cancer spécifique à un tissu (cf tableau 1).
Tableau 1 : Quelques gènes « gatekeepers » avec le type de tumeur correspondante.
Gène du Rétinoblastome---...-^Tumeur de la rétine Gène de Von Hippel Lindau--- ...-> Tumeur rénale Gène de Neurofibromatose type 1---...-> Schwannomes Gène APC...
Gène STKll... ---Peutz-Jeghers Syndrome
