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Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository
Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:
Nguidjoe, E. (2011). Etude de la fonction de la cellule bêta pancréatique dans un modèle de souris présentant une mutation nulle partielle de l'échangeur sodium/calcium (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté de Médecine – Sciences biomédicales, Bruxelles.
Disponible à / Available at permalink : https://dipot.ulb.ac.be/dspace/bitstream/2013/209833/6/71ee5466-b4b7-428d-9a8b-7f23c73b15ca.txt
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Université Libre de Bruxelles Faculté de Médecine
Laboratoire de Pharmacodynamie et de Thérapeutique
ULB - Campus Erasme
Bibliothèque des Sciences de - CP 607 Route de Lennick, 808 (Bat.E)
ETUDE DE LA FONCTION DE LA CELLULE BÊTA PANCREATIQUE DANS UN MODÈLE DE SOURIS PRÉSENTANT UNE MUTATION NULLE PARTIELLE
DE UÉCHANGEUR SODIUM/CALCIUM
Promoteur : Prof. André HERCHUELZ
Evrard Marcel NGUIDJOE
Licencié en Sciences Biomédicales
Thèse présentée en vue de l’obtention du grade de Docteur en Sciences Biomédicales et Pharmaceutiques
Année académique 2011-2012
Faculté de Médecine
Laboratoire de Pharmacodynamie et de Thérapeutique
ULB - Campus Erasme
Bibliothèque des Sciences de la Santé - CP 607 Route de Lennick, 808 (Bât.E)
B- 1070 Bruxelles Tél.; 02/555.61.70
ETUDE DE LA FONCTION DE LA CELLULE BÊTA PANCREATIQUE DANS UN MODÈLE DE SOURIS PRÉSENTANT UNE MUTATION NULLE PARTIELLE
DE L’ÉCHANGEUR SODIUM/CALCIUM
Promoteur : Prof. André HERCHUELZ
Evrard Marcel NGUIDJOE
Licencié en Sciences Biomédicales
Thèse présentée en vue de l’obtention du grade de Docteur en Sciences Biomédicales et Pharmaceutiques
Année académique 2011-2012
Composition du jury de thèse
• Prof. Joanne Rasschaert (Présidente)
Laboratoire de Chimie Biologique et de la Nutrition.
Université Libre de Bruxelles (ULB), Faculté de Médecine.
Bruxelles, Belgique.
• Prof. André Herchuelz (Promoteur, Secrétaire) Laboratoire de Pharmacodynamie et de Thérapeutique.
Université Libre de Bruxelles (ULB), Faculté de Médecine.
Bruxelles, Belgique.
• Prof. Renaud Beauwens
Laboratoire de Physiologie Cellulaire et Moléculaire.
Université Libre de Bruxelles (ULB), Faculté de Médecine.
Bruxelles, Belgique.
• Prof. Paolo Meda
Département de Physiologie Cellulaire et Métabolisme Université de Genève, Faculté de Médecine.
Genève, Suisse
• Prof. Marc Abramovicz
Institut de Recherche Interdisciplinaire en Biologie Humaine et Moléculaire (LRIBHM).
Université Libre de Bruxelles (ULB), Faculté de Médecine.
Bruxelles, Belgique.
• Prof. Karin Sipido
Département de Cardiologie Expérimentale.
Katholieke Universiteit Leuven (KUL), Faculté de Médecine.
Leuven, Belgique.
• Prof. Philippe Golstein
Laboratoire de Physiologie Cellulaire et Moléculaire.
Université Libre de Bruxelles (ULB), Faculté de Médecine.
Bruxelles, Belgique.
Remerciements
Premièrement, je tiens à remercier chaleureusement le Professeur André Herchuelz de m'avoir accueilli dans son laboratoire. Sous sa conduite, j’ai commencé par y effectuer un travail de mémoire pour ensuite réaliser ce travail. Mille mercis.
Je n’aurais pas su accomplir ce travail sans modèle d’étude. Les Docteurs Sophie Sokolow et Stéphane Schurmans ont généré ces souris. Qu’ils soient ici gracieusement remerciés. Il y aura encore pas mal de mystères à explorer.
Faire une thèse implique certains moments de doute. Mon parrain de thèse, Jason Perret par sa disponibilité et les conseils qu’il m’a prodigués m’a aidé à les surmonter. Mille mercis, Jason.
Je remercie tous les membres du Jury pour la lecture de mon manuscrit et les suggestions constructives qu’ils ont apportées.
Je remercie particulièrement Madame Jeanne Rasschaert, Présidente du Jury, pour ses conseils judicieux pour la finalisation de ce travail.
Je tiens à manifester ma gratitude à Anissa labkriman, pour son aide technique au début de mes travaux. Qu’elle trouve ici l’expression ma reconnaissance.
Merci à Anne Van Praet pour son aide infatigable dans différents domaines, spécialement en ce qui concerne la gestion des animaux du laboratoire et les comptages de dizaines de milliers de cellules.
Merci pour sa motivation. J’ai toujours le sms prêt : « où estAVP ? »
Une thèse ne saurait se faire sans la recherche et la constitution d’une bonne base de données d’articles scientifiques. Par son aide infatigable dans ce travail bibliographique et titanesque, je voudrais manifester ici mes sincères remerciements à Julie Brunko.
Je n’oublie pas de remercier Marie-Pierre Berghmans, la dernière à être arrivée au laboratoire. Ceci particulièrement pour son aide dans le génotypage des souris. Merci pour tout et bon vent dans le jumping belge et pourquoi pas international.
Un tout grand merci à Nathalie Pachera pour son aide, spécialement pour sa précision concernant les transplantations d’îlots. Je ne peux pas résister à lui demander : « C’est quoi les tendances ? »
Mes remerciements les plus sincères au Professeur Philippe Lebrun et à Fabienne Leleux pour leur aide précieuse dans les premières expériences de sécrétion d’insuline et les multiples conseils tant professionnels que de la vie de tous les jours.
Merci au Professeur Jean-Marie Vanderwinden de m’avoir initié à l’imagerie morphologique. Pour son sens pratique, son dévouement et ses précieux conseils.
Au Dr Karim Louchami et au Professeur Abdullah Sener, du Laboratoire d’Hormonologie Expérimentale, par ces lignes je souhaite leur traduire ma profonde reconnaissance pour plein de
choses. Parmi lesquelles, l’aide technique et les conseils sur l'étude du métabolisme de nos îlots. J'ose croire que nos discussions sur le football ne s’arrêteront pas en si bon chemin.
Un chaleureux Merci aux personnes suivantes qui de prés ou de loin m’ont aidé à la réalisation de certains travaux : Serge Bigabwa, Anne-Marie Vanbellighen, Grégory Vegh, Pascale Lybaert, Xavier Florence, les Professeurs Willy Malaisse, André Danguy, Décio L. Eizirik, les Docteurs Mario Manto et Alessandra Cardozo.
Pour ses conseils et le temps qu’il aura passé à la réalisation des expériences de microscopie électronique. Un grand merci au Dr Jan Mast et au personnel du CERVA.
Merci aux Professeurs Jacques Rahier et Edouard Montana et à Géraldine Joanny pour leur aide dans l’interprétation de certains résultats.
Je n’oublie pas de remercier tous mes relecteurs et correcteurs. Ils se reconnaîtront. Merci pour votre disponibilité et le temps passé à me conseiller sur mon manuscrit.
Un tout grand merci à tous ceux et celles qui m’ont soutenu durant mes travaux ;
- d’abord ma famille : mon père, ma mère, mon grand frère, ma sœur et mon petit frère Hervé, parti trop tôt. Je leur dédie à tous ce travail.
- A tous mes amis et connaissances, pour leurs multiples encouragements. J’en oublierai sûrement. Pascal, Daniel, Chantal, Cyril, Marco, Bruno, Claude, François K., Michel, Josiane, Vincent, Jacques, François G., Fanny, Léopold, Stephan, Achille,...
Bref, qu’ils trouvent tous ici l’expression de mes profonds remerciements.
1. Table des matières...5
2. Liste des abréviations...9
3. Liste des figures...16
4. Liste des tableaux...18
5. Résumé...20
6. Introduction...22
6.1. L’homéostasie calcique...22
6.1.1. Les mouvements calciques membranaires et intracellulaires (cytoplasme, réticulum endoplasmique, mitochondrie, enveloppe nucléaire, etc.)... 23
6.1.1.1. Les canaux calciques membranaires... 23
6.1.1.2. Le Ca^”^ dans le cytoplasme (ou la diffusion restreinte du Ca^’')...26
6.1.1.3. Le Ca^’^ dans le RE (ou Lautoroute cellulaire du Ca^"^?)...26
6.1.1.4. Les protéines « tampons »... 27
6.1.1.5. Le Ca^’^ dans la mitochondrie (ou le Ca^’^ dans tous ses états)... 28
6.1.1.6. Le Ca^"^ dans le noyau (ou le Ca^'^ à la gouverne)...29
6.1.2. Mécanismes contrôlant la sortie du Ca^’^... 29
6.1.2.1. L'échangeur Na/Ca membranaire... 29
6.1.2.2. La Ca^’^-ATPase membranaire...30
6.1.3. Caractéristiques moléculaires de l'échangeur Na/Ca membranaire... 31
6.1.3.1. Phylogénie de l’échangeur Na/Ca... 31
6.1.3.2. Clonage et localisation chromosomique de l'échangeur Na/Ca... 33
6.1.3.3. Epissage alternatif des échangeurs et distribution tissulaire de leurs variants d’épissage... 33
6.1.3.4. Topologie membranaire de l'échangeur Na/Ca... 34
6.1.4. Similarité de fonction entre les 4 NCXs...36
6.1.5. Régulation et rôles physiologiques de l'échangeur Na/Ca... 38
6.2. La Mort Cellulaire... 42
6.2.1. Présentation générale...42
6.2.2. L’Apoptose... 42
6.2.3. Comparaison entre apoptose et nécrose... 43
6.2.4. Ca^’' et apoptose... 46
6.3. Le développement et la croissance du pancréas endocrine...46
6.4. Les îlots pancréatiques et la cellule p... 48
6.4.1. Composition des îlots de Langerhans... 48
6.4.2. Biosynthèse, sécrétion et effets de l’insuline...48
6.4.2.1. Les gènes...48
6.4.2.2. La protéine... 49
6.4.2.3. Synthèse et régulation de la sécrétion d’insuline... 52
6.5 Les canaux calciques et protéines responsables de l’homéostasie calcique dans la cellule p ... 56
6.5.1 Les canaux calciques voltage-dépendants... 56
6.5.2 Les canaux TRP (Transient Receptor Potential)... 61
6.5.2.1 Généralités...61
6.5.2.2 Les TRPs et la cellule p...61
6.5.3 Les SOC(E)s (Store-Operated Ca^’^ (Entry))...66
6.5.4 Canaux calciques intracellulaires de la cellule P:... 66
6.5.5 Les messagers intracellulaires (cADPr et NAADP) permettant la libération du Ca^’’ dans la cellule p.. ...67
6.5.6 L'échangeur Na/Ca de la cellule P-pancréatique (Ncxl)...68
6.6 L’excitabilité de la cellule p... 70
6.6.1 Généralités... 70
6.6.2 Quelques protéines intervenant dans l’activité électrique de la cellule P...75
6.6.3 Oscillation du Vm, activité électrique et oscillations de la [Ca^'^]i... 82
6.6.4 Electrophysiologie par Patch clamp de la cellule P... 86
6.7. Masse cellulaire p...86
6.7.1. Généralités... 86
6.7.2. Modification de la taille des cellules P... 89
6.7.3. Modification du nombre des cellules P (néogenèse, réplication et mort cellulaire)... 89
6.7.3.1. Néogenèse... 89
6.7.3.2. Réplication... 90
6.7.3.2.1. Progression du cycle cellulaire dans la cellule p... 90
6.7.3.3. Mort cellulaire...92
6.7.3.3.2. Nécrose... 92
6.8. Ca^^ et prolifération de la cellule p...93
6.9. Glucose et cellule p pancréatique... 97
6.10. Le Diabète... 97
6.10.1. Généralités... 97
6.10.2. Le diabète de type 1...98
6.10.2.1. Ethiopathogénie de la maladie...98
6.10.2.2. Destruction des cellules P dans le diabète de type 1 ... 99
6.10.3. Le diabète de type 2... 103
6.10.3.1. Ethiopathogénie de la maladie... 103
6.11. Le Réticulum endoplasmique (RE) et la cellule p... 105
6.11.1. Rôle physiologique et stress du RE... 105
6.11.2. Stress du RE et diabète...106
7. But du travail...107
8. Matériels et méthodes...108
8.1. Production de souris transgéniques... 108
8.2. Élevages et croisements des souris... 109
8.3. Génotypage... 109
8.3.1. Design des amorces de la réaction de polymérisation en chaîne (PCR, Polymerization Chain Reaction) 109 8.3.2. Biopsies de queue et extraction de l’ADN génomique...110
8.3.3. Réaction PCR... 111
8.3.4. Electrophorèse des produits PCR et révélation... 112
8.4. Isolement des îlots de Langerhans... 112
8.5. Culture des cellules p isolées et des îlots de Langerhans... 113
8.5.1. Préparation des cellules insulaires...113
8.5.2. Culture simple... 114
8.5.3. Culture en présence d’inducteurs d’apoptose... 114
8.5.4. Culture en présence de cytokines pro-inflammatoires... 115
8.5.5. Culture en milieu hypoxique... 115
8.6. Isolement de l’ARN messager des îlots de Langerhans...115
8.8. Extraits des protéines totales d’îlots de Langerhans... 119
8.9. Western Blot...119
8.10. Mesure de la concentration de Ca^"^ intracellulaire (cytoplasmique) ([Ca^^]i )des îlots de Langerhans 120
8.10.1. Préalables... 120
8.10.2. Mesure de la [Ca^*]i en l’absence de sodium extracellulaire... 121
8.10.3. Mesure de la [Ca^^Ji en réponse à la dépolarisation au KCl... 121
8.10.4. Effet du glucose sur la [Ca^'^]j...122
8.10.5. Effet de la thapsigargine en statique sur la [Ca^*]j... 122
8.11. Mesure du métabolisme de glucose...122
8.12. Capture du ‘‘*Ca dans les îlots de Langerhans... 124
8.13. Sécrétion d’insuline d’îlots en réponse au glucose...126
8.13.1. Sécrétion dynamique...126
8.14. Histologie... 126
8.14.1. Prélèvements... 126
8.14.1.1. Préparation et traitement des îlots...126
8.14.1.2. Préparation et traitement des pancréas... 127
8.14.2. Tableaux résumés du processus des marquages (généralités)... 128
8.14.2.1. Coloration à l’hématoxyline-éosine... 130
8.14.2.2. Coloration à l’Hématoxyline de Harris...130
8.15. Immunohistochimie... 130
8.15.1. Marquage de l’insuline...130
8.15.2. Taux de prolifération de la cellule P... 131
8.15.2.1. Marquage du BrdU... 131
8.15.2.2. Marquage duPCNA... 131
8.15.3. Quantification de la mort cellulaire... 132
8.15.3.1. Technique TUNEL... 132
8.15.3.2. lodure de propidium... 132
8.16. Analyse morphométrique... 133
8.16.1. La masse des cellules p (P-cell mass)...133
8.16.2. La taille individuelle des cellules P... 133
8.17. Immunofluorescence... 134
8.17.1. Détermination de la prolifération des cellules P... 134
8.17.1.1. Marquage au Ki 67... 134
8.17.2. Microscopie à fluorescence... 135
8.17.3. Microscopie confocale...135
8.17.3.1. Marquage simple à l’insuline... 135
8.17.3.2. Double marquage...136
8.18. Microscopie électronique... 137
8.18.1. Examens morphologique et morphométrique...137
8.19. Tests « in vivo »... 137
8.19.1. Induction du diabète... 137
8.19.2. Tolérance au glucose et tolérance à l’insuline. Mesure de la glycémie et de l’insulinémie de souris à jeun et nourries 138 8.19.3. Récolte du plasma pour dosage...138
8.20. Mesure du contenu en insuline des îlots de Langerhans...138
8.21. Tests de viabilité des îlots... 139
8.22. Dosage de l’insuline... 140
8.22.1. Dosage Radioimmunologique...140
8.22.2. Kit ELISA (Mecordia®)... 141
8.23. Transplantation d’îlots pancréatiques... 141
8.23.1. Préalables... 141
8.23.2. Procédure de la transplantation proprement dite... 142
8.23.3. Néphrectomie...142
8.23.4. Mesure du volume relatif des îlots après les transplantations... 142
8.24. Statistiques... 143
9. Résultats expérimentaux...144
9.1. Analyses de biologie moléculaire... 144
9.1.1. Génotypage Ncxl... 144
9.1.2. Quantité d’ARN messager du gène Ncxl dans les cellules d’îlots de Langerhans... 145
9.2. Fonction des îlots Ncxl^^'... 145
9.2.1. Capture de ‘'^Ca en présence et en absence de Na”^ extracellulaire... 147
9.2.2. Effet du retrait de Na* sur la [Ca^*]i des îlots Ncxl*'"...147
9.2.3. Effet du KCl 50 mM sur la [Ca^*]| des îlots Ncxl*^'...149
9.2.4. Sécrétion d’insuline des îlots Ncxl*^'...149
9.2.5. Effet du glucose sur la [Ca^*]j des îlots Ncxl ...151
9.2.6. Métabolisme du glucose des îlots Ncxl*^'... 152
9.2.7. Capture du ‘'^Ca en réponse au glucose dans les îlots Ncxl*^'...154
9.2.8. Contenu en insuline des îlots Ncxl ... 156
9.3. Morphologie... 157
9.3.1. Marquage de la proinsuline dans les îlots Ncxl*^'... 157
9.3.2. Microscopie électronique des cellules p Ncxl*^'... 158
9.4. Masse, taille, prolifération, apoptose et viabilité des cellules p...160
9.5. Expériences d’hypoxie sur les îlots Ncxl*^'... 161
9.6. Transplantation d’îlots Ncxl*^'... 164
9.6.1. Analyse de la glycémie après transplantation d’îlots de souris Ncxl*^'...164
9.6.2. Morphométrie d’îlots Ncxl*^' transplantés...167
9.7 Métabolisme du glucose et sensibilité à l’insuline “in vivo”...168
9.8 Stocks de Ca^* dans le réticulum endoplasmique... 168
10. Discussion...171
IL Conclusion générale...177
12. Perspectives...178
13. Références bibliographiques...180
14. Annexes...203
14.1. Publications de la thèse... 203
14.2. Autres publications... 203
14.3. Communications orales... 207
14.4. Communications écrites... 287
15. Curriculum vitae...289
16. Thèse annexe (résumé et bibliographie)...289
2. Liste des abréviations
AA : acide arachidonique aa : acides aminés
ABC : complexe avidine-biotine AC : adénylate cyclase
Ac-Ag : complexe anticorps-antigène ADN: acide désoxyribonucléique ADNc: ADN complémentaire ADP : adénosine diphosphate ag : agoniste
AIF : facteur induisant l’apoptose APC : cellules présentatrices d’antigènes
Apaf-1 : facteur activant une petidase apoptotique ARN polyA: ARN polyadénylé
ARN: acide ribonucléique ARNm: ARN messager
ATP: adénosine 5'-triphosphate ATPase: adénosine 5'-triphosphatase bp: paire de bases
BrdU : 5-bromo-2-déoxyuridine BSA : albumine de sérum bovin
C57/6N: lignée de souris consanguine C57BL/6N Ca^"^: calcium
'*^Ca: isotope radioactif du Ca^^
[Ca^^] : concentration de Ca^^
[Ca^'^jRE ou [Ca^"^] rs: calcium du réticulum endoplasmique ou sarcoplasmique [Ca^'^Ji : concentration cytosolique (ou cytoplasmique) de Ca^"^
cADPr ; récepteur-canal sensible à l’adénosine diphosphate CAM: calmoduline
cAMP : adénosine monophosphate cyclique CCK-PZ : cholécystokinine pancréozymine CDl: lignée de souris non-consanguine CDl Cdks : kinases dépendantes de cyclines CMH : complexe majeur d’histocompatibilité
Cndl : sous unité régulatrice de la calmoduline phosphatase ou Calcineurine B COOH : groupement carboxyle
CPA ; acide cyclopiazonique cpm : coups par minute
CRAC : canal calcique induisant le relargage du Ca CREE : facteur de transcription activé par le cAMP
C-terminal : l’extrémité COOH de la séquence d’une protéine CTLA4 : antigène 4 des lymphocytes T-cytotoxiques
DAB : 3,3’-diaminobenzidine DAG : diacétylglycérol
DEPC : diéthylène pyrocarbonate DMEM ; milieu Dulbecco modifié DMSO: diméthylsulfoxide
DPP4 : dipeptidyl peptidase de type 4
EC50 : représente dans une courbe dose-réponse la concentration d’un composé qui est responsable de 50% de l’effet observé.
E8.75 : stade de développement embryonnaire (8^"’^ jour et 18®™ heure) EGF : facteur de croissance épidermique
EGTA : acide éthylène glycol tétracetique
ELISA : dosage immunoenzymatique sur support solide Em: potentiel membranaire
ENa/ca: potentiel de l'échangeur Na/Ca ESC: cellules souches embryonnaires Pas : récepteur de mort du Fas-ligand Fas-L : ligand du récepteur Fas FBS : sérum de veau fœtal fmol : femtomoles
GAD : acide glutamique décarboxylase
GAPDH : glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase GH : hormone de croissance
GIP : peptide inhibiteur gastro-intestinal GLP-1 : peptide similaire au glucagon GTP : guanosine triphosphate
: hydrogène
HCl : acide chlorhydrique
Hepes : acide hydroxyméthyl pipérazine éthane sumfonique HLA : antigène de surface du leucocyte humain (voir aussi CMH) H0342 : colorant fluorescent Hoescht 33342
125I : isotope radioactif de l’iode
ICA : anticorps anti-îlots pancréatiques
IGFl : facteur de croissance de type insuline (type 1) IL-1(3 : interleukine-1P
IMBX : isobutylméthylxanthine
IP3 (Ins (1, 4,5) P3): inositol 1, 4, 5-triphosphate InsP3R: récepteur de l'inositol 1, 4, 5-triphosphate ip : intrapéritonéale (voie)
1RS 2 : protéine associée au récepteur de type 2 de l’insuline : potassium
KCl : chlorure de potassium Kd : constante d’affinité kD: kilo dalton
KeV ; kiloélectrovolt
Km : constante de Michaelis KO : inactivation partielle ou totale Lt : lymphocytes T
LTP : potentialisation à long terme
MAGUK : guanylate kinase associée à la membrane plasmique MNCX : échangeur sodium/calcium de la mitochondrie
MPC : concentreur magnétique de particule Na/Ca: sodium/calcium
Na^ : sodium
[Na'^Ji: concentration en sodium intracytoplasmique NADH : nicotinamide adénine dinucléotide
NCX 1.7 : 7^™ isoforme du gène NCX 1
NCX: échangeur Na/Ca
NFAT : facteur nucléaire des lymphocytes T activés NFkB : facteur nucléaire kappa B
NGS : sérum normal de chèvre NH2 : groupement amine
NHERF : facteur régulateur de l’échangeur Na'^/H'^
NO : oxyde nitrique NOD : diabète non-obèse
NPC : complexe du pore nucléaire
N-terminal : l’extrémité NH2 de la séquence d’une protéine PAGE : électrophorèse sur gel de polyacrilamide
PBS: tampon phosphate salé
PCNA : antigène nucléaire de prolifération PCR: réaction de polymérisation en chaîne
Pdx 1 : gène codant pour le facteur de transcription duodéno-pancréatique PDX-1..
PDX-1 : facteur de transcription duodéno-pancréatique PDZ : disque post synaptique d’une jonction serrée PI: iodure de propidium
PIP2: phosphatidylinositol biphosphate PKA: protéine kinase A
PKC: protéine kinase C PLC: phospholipase C
PMCA: Ca^'^-ATPase de la membrane plasmique pmol : picomoles
POD : péroxydase
PRL : prolactine QH2 ; dihydroquinone
RE/RS : réticulum (sarco) endoplasmique RH: recombinant homologue
RIPA : tampon de lyse pour immunoprécipitation rpm : tours par minute
RNAi : interférence de l’ARN
ROC: canaux calciques dépendants du récepteur RT : température ambiante
RT-PCR : transcription inverse puis réaction de polymérisation en chaîne RyR: récepteur à la ryanodine
SDS: dodécylsulfate de sodium SEM: erreur standard sur la moyenne
SERCA: Ca^'^-ATPase du réticulum endo(sarco)plasmique SlcSal : autre nom donné pour l’échangeur Na/Ca de type 1 SOC: canaux calciques dépendants des stocks de Ca 2*E
SMOC : canaux calciques dépendants d’un second messager SP : peptide signal
SRIF : facteur inhibant la somatotropine
STAT : protéine effectrice et activatrice de la transcription Tl DM : diabète de type 1
T2DM : diabète de type 2
TBE : tampon Tris / Borate / EDTA TG : thapsigargine
TLR : récepteur de type Toll
TMB : tétraméthylbenzidine TMS: segment transmembranaire TNF ; facteur de nécrose cellulaire Tp: troponine
TRAF : facteurs associés aux récepteurs du TNF Tris: 2-amino-2-(hydroxyméthyl)-l, 3-propanediol UPR : réponse de protéine mal repliée
VOC: canaux calciques dépendants du potentiel de membrane vs: versus
WT: type sauvage
XIP: site d’inhibition intracytoplasmique de l’échangeur Na/Ca
3. Liste des figures
Fisure I : Transporteurs calciques dans une cellule animale, (p.24)
Fisure 2 ; Modes de résulation de rentrée de calcium dans la membrane, (p.25)
Fisure 3 : Analyse phvlosénétiaue de la famille NCX. (p.32)
Fisure 4 ; Topolosie de l’échanseur sodium-calcium, (p.34)
Fisure 5 : Schéma montrant le processus de transport de par Véchanseur Na^/Ca^'^
(p.36) Fisure 6 : Synthèse de rinsuline. (p.51 )
Fisure 7 : Mécanisme de sécrétion de l’insuline et réponse sécrétoire au slucose. (p.54)
Fisure 8 : Couplase stimulus-sécrétion de la cellule B pancréatique, (p.57)
Fisure 9 : Arborescence d’identité des Cuv clonés, (p.58)
Fisure 10 : L’activité électrique induite par le slucose dans les cellules B pancréatiques.
(p.75)
Fisure 11 : Modèle des oscillations du Vm des cellules B de souris de type sauvase (p.84X
Fisure 12 : Corrélation des oscillations du Vm et de la fCa^^/i dans la cellule B. (p.85)
Fisure 13 ; Résulation de la B-cell mass, (p.88)
Fisure 14: Schéma du cycle cellulaire des cellules B pancréatiques. (p.91)
Fisure 15: Voies de sisnalisation qui résulent la prolifération et la différentiation des cellules B. (p.94)
Fisure 16: Interaction des cellules B et des cellules immunitaires conduisant à l’insulite et à son amplification, (p. 102)
Fisure 17 : Schéma du protocole d’extraction de VARNm (kit Dvnal, Invitrosen). (p. 117)
Fisure 18 : Génotypase des souris Ncxl'^^"" et Ncxl^^'Ao. 146)
Fisure 19 : Expression de Ncxl dans les îlots des souris Ncxl^^^ et NcxÜ^'.iv. 146)
Fisure 20 : Capture du en présence et en absence de Nà^ extracellulaire, (p. 148)
Fisure 21 : Effet du reirait du Nà^ extracellulaire sur la fCa^^li des îlots des souris Ncxl'^^^
etNcxf^'A^Âm
Fisure 22 : Effet du KCl 50 mM sur la fCa^^li des îlots des souris Ncxl^^'^ et Ncxl'^^' (p. 150)
Fieure 23 : Effet de rinactivation hétérozvsote de Ncxl sur la sécrétion d’insuline induite par le slucose. (p. 150)
Fisure 24 : Effet de rinactivation hétérozvsote de Ncxl sur les oscillations de la fCa^^li induite par le slucose. (p.l53)
Fisure 25: Métabolisme du D-f5-H]slucose (a) et du D-fU-‘*CJsIucose (b) des îlots de souris Ncxl^ ^ et Ncxl* '.(p. 155)
Fisure 26 : Effet du sur slucose sur la capture de ‘*^Ca dans les îlots Ncxl'^^'^ et Ncxl""^' i(P-156)
Fisure 27 : Effet de l’inactivation hétérozvsote de Ncxl^^'sur le contenu en insuline des îlots. (p.l56)
Fisure 28 : Effet de rinactivation hétérozvsote de Ncxl sur le marauase de la proinsuline.
(p.158)
Fisure 29 : Microscopie électronique à transmission, (p. 159)
Fisure 30 : Effet de rinactivation hétérozvsote de Ncxl sur la masse, la taille, la prolifération et l’apoptose des cellules B.(v. 162)
Fisure 31 : Effet de rinactivation hétérozvsote de Ncxl sur la viabilité cellulaire des cellules B (1). (p. 163)
Fisure 32 : Effet de rinactivation hétérozvsote de Ncxl sur la viabilité cellulaire des cellules 0 (2). (p. 163)
Fisure 33: Effet de rinactivation hétérozvsote de Ncxl sur la transplantation d’îlots.
Courbes -tests avec 400, 200,100 et 50 îlots sreffés. (p. 165)
Fisure 34 ; Effet de rinactivation hétérozvsote de Ncxl sur la transplantation dIlots.
Comparaison avec 100 îlots sreffés. (p. 166)
Fisure 35 : Effet de l’inactivation hétérozvsote de Ncxl sur le volume relatif de cellules B après transplantation, (p. 167)
Fisure 36 : Effet de rinactivation hétérozvsote de Ncxl sur le métabolisme du slucose
« in vivo ». (p. 169)
Fisure 37: Effet de l’inactivation hétérozvsote de Ncxl sur le contenu en Ca^^ du RE.
(p.170)
4. Liste des tableaux
Tableau 1: Rôles physiologiques de l’échangeur Na/Ca dans la cellule P pancréatique, le neurone et les cellules musculaires striées squelettiques. (p.40)
Tableau 2 : Rôles physiologiques chez les poissons, implications physiopathologiques et thérapeutiques de l’échangeur Na/Ca. (p.41)
Tableau 3 : Comparaison de l’apoptose et de la nécrose (caractéristiques morpholoeiaues). (p.44) Tableau 4 : Comparaison de l’apoptose et de la nécrose
(caractéristiques biochimiques), (p.45) Tableau 5 : Comparaison de l’apoptose et de la nécrose
(impacts physiologiques), (p.45)
Tableau 6 : Composition cellulaire des îlots de Langerhans, hormones secrétées et rôle physiologique dans l’homéostasie glucidique. (p.50)
Tableau 7 : Les facteurs majeurs contrôlant la sécrétion d’insuline, (p.55)
Tableau 8 : Principaux rôles des Cuy dans la cellule p (1). (p.59)
Tableau 9 : Principaux rôles des Cay dans la cellule p (2). (p.60)
Rôles des TRPs dans la cellule p (1). (p.63)
Rôles des TRPs dans la cellule p (2). (p.64) Rôles des TRPs dans la cellule p (3). (p.65)
Rôles de l’échangeur Na/Ca et de la PMCA dans la cellule p. (p.69)
Protéines qui sont susceptibles d’intervenir dans l’excitabilité de la cellule p (1) . (p.75-titre, 76-tableau)
Protéines qui sont susceptibles d’intervenir dans l’excitabilité de la cellule p (2) . (p.77)
Protéines qui sont susceptibles d’interveuir dans l’excitabilité de la cellule p (3) . (p.78)
Tableau 10 :
Tableau 11 : Tableau 12 : Tableau 13 :
Tableau 14 :
Tableau 15 :
Tableau 16 :
Tableau 17 ; Protéines qui sont susceptibles d’intervenir dans l’excitabilité de la cellule P (4) . (p.79)
Tableau 18 : Protéines qui sont susceptibles d’intervenir dans l’excitabilité de la cellule p (5) . (p.80)
Tableau 19 ; Protéines qui sont susceptibles d’intervenir dans l’excitabilité de la cellule p (6) . (p.81)
^ I
Tableau 20 : Hormones et facteurs de croissance responsables de la mobilisation du Ca dans la cellule p (1^™ partie), (p.95)
Tableau 21 ; Hormones et facteurs de croissance responsables de la mobilisation du dans la cellule p (2^"’* partie), (p.96)
Tableau 22 : Résumé du processus des marquages immunohistochimiques partie).
(p.128)
Tableau 23 : Résumé du processus des marquages immunohistochimiques (2^™* partie).
(p.129)
Tableau 24 ; Métabolisme du D-[5-^H]glucose (a) et du D-[U-*‘‘C]glucose et génération de l’ATP chez Ncxr^ (p i 55)
5. Résumé
Précédemment, nous avons montré que la surexpression de l'échangeur Na/Ca (NCXl), une protéine responsable de la sortie de calcium (Ca^"^) des cellules, augmentait la mort cellulaire programmée ou « apoptose » et réduisait la prolifération des cellules p. Afin d’étudier plus en profondeur le rôle de l’échangeur dans les cellules P in vivo, nous avons développé et caractérisé des souris présentant une inactivation de NCXl.
Des méthodes biologiques et morphologiques (imagerie du Ca , capture de Ca , métabolisme du glucose, sécrétion d'insuline et morphométrie par comptage de points) ont été utilisées pour évaluer la fonction de la cellule P in vitro. Les taux de glucose et d'insuline dans le sang ont été mesurés afin de déterminer le métabolisme du glucose et la sensibilité à l’insuline in vivo. Des îlots ont été transplantés sous la capsule rénale pour évaluer leur capacité à corriger le diabète chez les souris rendues diabétiques par l’alloxane.
L'inactivation hétérozygote de Ncxl chez les souris provoque une augmentation de la sécrétion d’insuline induite par le glucose avec un renforcement important à la fois de la première et de la deuxième phase. Ces résultats s’accompagnent d’une augmentation de la masse et de la prolifération des cellules p. La mutation augmente également le contenu en insuline, l’immunomarquage de la proinsuline, la capture de Ca induite par le glucose et la résistance à l'hypoxie des cellules p. En outre, les îlots de souris Ncxl"^^' montrent une capacité à compenser le diabète 2 à 4 fois plus élevé que les îlots de souris Ncxl^^^ lorsque transplantés chez des souris diabétiques.
En conclusion, l’inactivation de l'échangeur Na/Ca conduit à une augmentation de la fonction de la cellule P, de sa prolifération, de sa masse et de sa résistance au stress physiologique, à savoir à divers changements de fonction des cellules p opposés aux principales anomalies rencontrées dans le diabète de type 2 (Type 2 Diabètes Mellitus,
T2DM). Ceci nous procure un modèle unique pour la prévention et le traitement du dysfonctionnement des cellules P dans le T2DM et pour la transplantation d'îlots.
6. Introduction
6.1. L’homéostasie calcique
La découverte par Sidney Ringer du rôle du Ca^"^ dans les processus biologiques date de la fin du siècle (1). Cet ion joue un rôle de second messager intracellulaire (2-3) parmi les plus importants dans de nombreux tissus. En effet, il contrôle des processus aussi variés que la fertilisation, la contraction musculaire, la sécrétion d’hormones, la transmission nerveuse, la transcription de gènes et la mort cellulaire (3).
Afin de jouer un tel rôle, il est essentiel que la concentration cytosolique ([Ca ],) soit contrôlée de façon étroite, ceci s’effectuant via divers canaux, pompes et échangeurs. A titre d’exemple, la contraction de la fibre myocardique est déclenchée par l’entrée de Ca^^ dans la cellule via des canaux calciques voltage-dépendants. L’augmentation résultante de la [Ca^"^]!
provoque à son tour une libération de Ca^^ à partir du réticulum (sarco) endoplasmique (RE/RS) qui induit la contraction. Cette augmentation résultante de la [Ca^"^]i active les protéines contractiles sensibles au Ca^^ et déclenche la contraction du muscle cardiaque. La relaxation cardiaque exige la recapture du Ca^^ du cytoplasme vers le RS via la Ca^'^-ATPase de la membrane de ce dernier (Sarco-Endoplasmic Réticulum Ca^^-ATPase, SERCA) (4).
Ensuite, le Ca^"^ est expulsé du cytoplasme vers l'extérieur de la cellule via l'échangeur Na/Ca et la Ca^'^-ATPase de la membrane plasmique (PMCA, Plasma Membrane Ca^^-ATPase).
Ceci entraîne sa diminution dans ce compartiment cellulaire. Un autre mécanisme de diminution de la [Ca^^Ji est la capture de Ca^^ par l'uniporteur calcique mitochondrial. Ces transporteurs et canaux calciques sont actifs dans d'autres types de cellules de mammifères bien que leur contribution relative dans le transport du Ca^"^ puisse changer d’un type de cellule à l’autre. Les ruptures de l'homéostasie intracellulaire de Ca^"^ sont à la base d'un nombre considérable de maladies récemment caractérisées et appelées calciumpathies (5).
Ceci permet de dire que la perte d’homéostasie calcique joue un rôle direct dans diverses maladies (4; 6; 7). La figure 1 illustre les différents mouvements calciques susceptibles de se produire dans une cellule animale.
6.1.1. Les mouvements calciques membranaires et
intracellulaires (cytoplasme, réticulum endoplasmique, mitochondrie, enveloppe nucléaire, etc.)
6.1.1.1. Les canaux calciques membranaires
Les canaux calciques, comme les autres types de canaux de la membrane plasmique d’une cellule, sont classifiés en diverses catégories, par exemple les canaux dépendants du potentiel de membrane ou de la liaison de divers types de ligands etc....
La figure 2 illustre les modes de régulation de l’entrée de Ca (influx) au travers de la membrane cellulaire. Comme indiqué, les canaux portent les noms suivants ; les canaux calciques dépendants du potentiel de membrane VOC ; Voltage-Operated Channels, les canaux qui s’ouvrent en réponse d’un messager intracellulaire' SMOC : Second Messenger-Operated Channels, les canaux couplés à des récepteurs membranaires ROC : Receptor-Operated Channels et enfin les canaux calciques dépendants des stocks de Ca^"^
SOC : Store-Operated Channels. De plus, comme on le détaillera plus loin, l’échangeur Na/Ca peut dans certaines circonstances favoriser l’entrée de Ca^"^ (fonctionnement en mode inversé).
' A titre d’exemple des seconds messagers, on peut citer le diacétylglycérol (DAG), l’acide arachidonique (AA) et quelques uns de ces métabolites.
(cADPi
(cADPrfl)
MNCX
Ch9nnel$
Unlporter
SERCA
^PMCA
(10^M)
Fisure 1 : Transporteurs calciques dans une cellule animale.
Les canaux calciques de la membrane plasmique (PM) sont ouverts par une dépolarisation, par des ligands (ex. des neurotransmetteurs) ou par la vidange des stocks de (CRAC^, Ca^^
Release-Activated Ca^"^ Channel) du RE. Les canaux dans le RE sont ouverts par I’IPb
(inositol triphosphate) ou le cADPr (le canal cADPr est sensible à la ryanodine et est appelé récepteur à la ryanodine, RyR). Des ATP-ases sont retrouvées à la membrane plasmique (PMCA) et dans le RE (SERCA). L’envelope nucléaire qui est une extension du RE, contient les mêmes transporteurs que ce dernier. Les échangeurs Na/Ca sont localisés à la membrane plasmique (NCX) ou à la membrane interne de la mitochondrie (MNCX). Un uniporteur transporte le Ca^"^ dans la mitochondrie à la faveur d’un potentiel de membrane interne très électronégatif (-180mV). Les protéines liant le Ca^^ sont représentées sous forme d’une haltère, caractéristique de la calmoduline.
D’après Carafoli, PNAS, 99, 1115-1122, 2002.
2 2+
Canal calcique situé au niveau de la membrane plasmique induisant le relargage du Ca par le RE.
Modes of Regulated Calcium Entry Across the Plasma Membrane
SMOC SOC
Fisure 2 : Modes de résulation de rentrée de calcium dans la membrane.
Le Ca peut entrer dans les cellules par plusieurs grandes classes de canaux, comme les canaux calciques dépendants du potentiel de la membrane plasmique (VOC, Voltage- Operated Channels), les canaux dépendant de l’action de certains seconds messagers (SMOC, Second Messengers-Operated Channels), les canaux calciques dépendant des stocks de Ca^"^
(SOC, Store-Operated Channels) ou encore par les canaux calciques dépendants des récepteurs (ROC, Receptors-Operated Channels). Les VOC sont activés par la dépolarisation de la membrane. Les SMOC quant à eux, sont activés par un certain nombre de petites molécules messagères, les plus communes étant les inositols phosphates, les nucléotides cycliques, et les messagers dérivés lipidiques (DAG et AA et leurs métabolites). Les SOC sont activés par la déplétion des stocks de Ca^"^ intracellulaire tandis que les ROC sont activés par liaison directe d’un neurotransmetteur ou d’une hormone agoniste (ag). De plus, sous certaines conditions, le Ca^"*^ peut entrer dans les cellules par l’échangeur Na^-Ca^”^ (NCX) agissant en mode inversé.
D’après Anant B. Parekh et James W. Putney Jr. Physiol Rev 85: 757-810, 2005.
6.1.1.2. Le dans le cytoplasme (ou la diffusion restreinte du Ca^^
A l’état de repos, la [Ca^'^]j est très faible (~ 0.1 pM). Cette dernière augmente très rapidement lors de la stimulation cellulaire suite à l’entrée massive de Ca^^ au travers de la membrane plasmique selon son gradient électrochimique et/ou à la libération de Ca^"^ au départ des stocks intracellulaires, principalement du RE. Cette élévation de la [Ca^'^]i, atteint de manière générale l’ordre du micromolaire. Ceci varie d’un type cellulaire à l’autre. Il existe plusieurs types de sondes fluorescentes permettant de mesurer la [Ca^"^]i malgré que certaines d’entre elles la sous-estiment. Par exemple, le fura-2 sature à 5 pM (8-9). Après augmentation, le Ca^^ peut être repris par le RE ou expulsé de la cellule par des mécanismes spécifiques présents dans la membrane plasmique de la cellule.
6.1.1.3. Le dans le RE (ou l’autoroute cellulaire du
Ca^^?)
Quel que soit le type cellulaire, et même si on lui attribue plusieurs rôles de premier plan dans la cellule animale, le RE est le lieu de stockage principal du Ca^"^ (10-12). De manière générale, toute élévation importante de la concentration cytosolique de Ca^^ est dépendante de la capacité de mobilisation du Ca^^ du RE.
Le Ca sort du RE principalement via des récepteurs présents dans la membrane de l’organelle et couplés à des canaux calciques. Il s’agit des récepteurs à la ryanodine (RyRs, lyanodin receptors) (13; 14) et des récepteurs à l’inositol triphosphate IPs ; fPsR (15-16). Ces récepteurs sont ubiquitaires.
Une autre protéine, la SERCA, est par contre, responsable de l’entrée de Ca^’^ dans le RE (17-19). Cette pompe, dont le fonctionnement dépend de l’ATP, appartient à la famille des Ca^’'-ATPases de type P dont il existe plusieurs isoformes : SERCA 1, SERCA2, SERCA3.
De plus, dans certaines isoformes telle la SERCA2, il existe plusieurs variants d’épissage . Les modifications génétiques de ces protéines ont montré différents types de phénotypes chez certains animaux de laboratoire (20). Cette pompe est inhibée de façon spécifique par la thapsigargine (TG) (21) et l’acide cyclopiazonique (CPA) (22).
L’altération de l’homéostasie de Ca^^ de cet organite peut entrainer un stress du RE (voir plus loin).
6.1.1.4. Les protéines « tampons »
Aussi appelées protéines liant le Ca^"^ (binding-proteins), les protéines tampons sont présentes tant dans le cytoplasme que dans les organites. Elles sont de divers types, certaines étant plus abondantes dans certains tissus par rapport à d’autres. Parmi celles-ci, citons la calséquestrine (muscles striés squelettiques) ou la calcineurine (neurones). La liaison du Ca
à ces protéines dépend de leur affinité pour cet ion (23-24). Dans le cytoplasme, elles ont une forte affinité pour le Ca^^ (Kd très faible).
En outre, étant donné que les principaux stocks de Ca^^ se trouvent dans le RE, la concentration de cet ion doit y être finement régulée. Ce rôle revient principalement à ces protéines tampons qui dans le RE, ont une faible affinité pour le Ca^"^ (Kd important, parfois de l’ordre du millimolaire). Il en découle donc que dans le RE le Ca^"^ est principalement sous forme libre. Néanmoins, leur rôle n’en est pas moins négligeable. En effet, il existe des souris ayant une inactivation génique pour l’une ou l’autre protéine tampon (24). Chez les souris déficientes pour la calcireticuline, le développement cardiaque est altéré car l’absence de cette protéine ne permet plus le tamponnage du Ca (25-26).
^ La SERCA2b est exprimée de manière ubiquitaire et son activité est régulée par la concentration de Ca^"^ dans la lumière du RE via des protéines tampons telles que la calcireticuline.
6.1.1.5. Le dans la mitochondrie (ou le Ca^^ dans tous ses états)
L’importance du dans la mitochondrie est connue depuis les années 50. Bien qu’il fût découvert dans ces années que la mitochondrie accumulait le Ca^^ et que celui-ci était susceptible de stimuler les enzymes respiratoires, l’intérêt pour le Ca^"^ mitochondrial retomba rapidement dans les années 80, lorsqu’il fût réalisé que l’affinité de l’uniporteur transportant le Ca^^ dans la mitochondrie était très faible (10-15 pM). 11 apparaissait donc peu probable que la mitochondrie puisse tamponner le Ca^"^ cytoplasmique sensé ne pas dépasser le micromolaire (2). 11 fut conclu que la mitochondrie n’accumulait de Ca^^ que dans des situations extrêmes, à savoir lorsque la [Ca^^Ji s’élevait de façon anormale, par exemple en cas
Tl
d’ischémie, juste avant la mort cellulaire. Ultérieurement, il apparût en fait que la [Ca ]j pouvait s’élever de façon importante et de façon localisée dans le cytoplasme (Ca^"^ hotspots), jusqu’à des valeurs de 50 pM, et que les mitochondries localisées auprès des canaux calciques (de la membrane cytoplasmique ou du RE) pouvaient dès lors accumuler des quantités substantielles de Ca^^ (27). Dans la cellule chromaffine, le pourcentage de mitochondries au contact des canaux calciques (de la membrane cytoplasmique ou du RE), est respectivement de 30 et de 20 % du total (27). Alors que la [Ca^”^] peut s’élever jusqu’à des valeurs de 800 pM dans ces dernières mitochondries, elle n’atteint que des valeurs de 2 pM dans celles qui sont éloignées des canaux calciques (figure 2). Au niveau mitochondrial, le Ca stimule les enzymes respiratoires, de sorte qu’une cellule stimulée par une élévation de sa [Ca ]i, voit sa production d’ATP adaptée à ses besoins (28). Après l’élévation de la [Ca^"^] dans la matrice mitochondriale, le Ca^"^ en est rapidement expulsé par un échangeur Na/Ca mitochondrial (2).
6.1.1.6. Le Ca^"^ dans le noyau (ou le Ca^^ à la gouverne)
Les pores nucléaires (NPC, Nuclear Pore Complex) jouent un rôle prépondérant dans la régulation de la concentration du Ca^"^ dans le noyau (29). En effet, une des voies d’entrée du Ca^^ dans cet organe se fait par ces pores qui fonctionnent suivant le transport passif. En outre, le noyau étant en continuité avec le RE, il contient des quantités importantes de Ca qui peuvent en être libérées via les récepteurs aux IP3 et à la ryanodine. La concentration en Ca^^ dans un état de repos est estimée à environ 100 pM. La fonction principale du Ca^^ dans le noyau est la régulation de la transcription génique. Divers mécanismes sont impliqués, dont les plus étudiés, et les mieux compris, sont l’activation par le Ca^^ du facteur de transcription CREE (cAMP response élément binding protein) (30) et aussi de la calcineurine-NFAT (Nuclear Factor of Activated T-Cells) (31).
6.1.2. Mécanismes contrôlant la sortie du Ca^^
Un certain nombre de processus sont utilisés par la cellule afin de maintenir la concentration du Ca^"^ libre entre 100-200 nM, niveau nécessaire pour une homéostasie optimale. Deux protéines sont responsables de la sortie de Ca^"^ : l’échangeur Sodium/Calcium et la PMCA.
6.I.2.I. L'échangeur Na/Ca membranaire
Ce point sera développé ultérieurement.
6.1.2.2. La Ca^^-ATPase membranaire
La Ca^'^-ATPase membranaire est une ATPase de type P codée par quatre gènes (ATP2B1-4). Chez les mammifères, ces quatre gènes codent pour quatre isoformes de la PMCA. PMCAl et PMCA4 sont exprimées de manière ubiquitaire, et PMCA2 et PMCA3 sont exprimées principalement dans le système nerveux central. Par le mécanisme d’épissage alternatif, plus de 30 protéines différentes sont produites.
Les ATPases (PMCA) ont une haute affinité pour le Ca^"^ (Kd -100 nM) mais une faible capacité (30-250 s'*) à exporter le Ca^"^ à l’extérieur de la cellule (32). La pompe utilise une molécule dATP pour transporter une molécule de Ca^"^ du cytosol vers l'environnement externe.
La signification physiologique de l'existence de tant d'isoformes est mal connue mais il semble qu’elle soit liée aux demandes spécifiques de chaque cellule par rapport à son homéostasie calcique (33-35).Des études récentes suggèrent que les régions alternativement épissées dans les PMCA sont responsables de l'adressage spécifique de certains domaines protéiques de la membrane plasmique. Ces protéines qui se fixent spécifiquement aux pompes pourraient contribuer davantage à la régulation du Ca^^. De plus, la combinaison des protéines obtenues par épissage alternatif (deux emplacements distincts) peut être responsable de différentes caractéristiques fonctionnelles des pompes (36-38).
A très faible concentration en Ca^^, les PMCAs sont presque inactives. Elles peuvent être activées par la calmoduline, par les phospholipides acides, par des protéines kinases ou encore par d’autres moyens tels qu’un processus de dimérisation.
D'autres protéines interagissent avec les PMCAs : les MAGUK (Membrane Associated Guanylate Kinase) et les NHERP (Na'^/H'^ exchanger regulatory factor) au niveau du domaine de PDZ (Post synaptic Disc-large Zona ou zonula occludens). La calcineurine A, se lie sur le
domaine intracellulaire principal pour les amener aux régions spécifiques de la membrane de cellules ou pour régler leur fonction. Des souris présentant une mutation nulle des 4 PMCAs ont été produites et ont contribué à mieux comprendre l'importance des PMCAs dans les cellules. Jusqu'ici, une seule maladie génétique humaine a été liée à un défaut de la PMCA, à savoir la perte d'audition et la perte d’équilibre (20). Le rôle de cette protéine dans la cellule p pancréatique a fait l’objet de plusieurs études au sein de notre laboratoire (39-40).
6.1.3. Caractéristiques moléculaires de l'échangeur Na/Ca membranaire
6.I.3.I. Phylogénie de l’échangeur Na/Ca
De manière générale pour cette protéine, il y a une différence claire entre les vertébrés et les invertébrés (voir figure 3). Chez les vertébrés, les séquences NCX forment 3 classes de protéines, à savoir NCXl, NCX2 et NCX3. D’un point de vue évolutif, les échangeurs des invertébrés et des vertébrés non-mammifêres ont divergé avant que les échangeurs chez les mammifères ne se groupent en NCXl, NCX2 et NCX3 (41). Certaines espèces de poissons possèdent un quatrième isoforme de NCX que l’on appelle NCX4 (42).
Fisure 3 : Analyse phylosénétiaue de la famille NCX.
Les séquences de vertébrés et d’invertébrés sont indiquées entre crochets tandis que les gènes Ncx des vertébrés sont marqués par des lignes verticales. L’arbre est subdivisé en plusieurs branches avec comme point d’origine les espèces Pirellula. Ncx4 (en gras) indique un groupe potentiel et unique d’espèces de poissons. Les astérisques montrent les isoformes de Ncx qui sont dérivés de tous les génomes.
D’après Christian R. Marshall et al. Physiol Genomics 21: 161-173, 2005.
6.1.3.2. Clonage et localisation chromosomique de réchangeur Na/Ca
L’échangeur Na/Ca fut cloné en 1990 au départ du cœur (43). Cette protéine (NCX) joue un rôle primordial au niveau de cet organe. Antérieurement, la protéine avait été purifiée.
Cette purification avait permis d’identifier les différents poids moléculaires de la protéine à savoir 160, 120 et 70 KDa. Le gène Ncxl appelé aussi Soluté Carrier Family 8 member 1 (SlcSal) (sodium/calcium exchanger, member 1) est localisé chez l’homme sur le chromosome 2 (2p23-p22) et chez la souris sur le chromosome 17(17 48.0 cM).
6.1.3.3. Epissage alternatif des échangeurs et distribution tissulaire de leurs variants d’épissage
L’échangeur Na/Ca est présent dans tous les tissus. On pense que sa fonction est spécifique dans la régulation du Ca^"^. Cette dernière étant très particulière d’un tissu à l’autre, un épissage alternatif s’effectue à cet effet. Par exemple dans la cellule P de rat, nous avons les isoformes NCX1.3 et 1.7. La souris par contre en possède 3 connus à savoir : les isoformes
1.2, 1.3 et 1.7 (44)
Ncxl est un gène ubiquitaire avec de nombreux variants d’épissage. 11 a été bien caractérisé au niveau des myocytes cardiaques chez les mammifères et est responsable principalement de l’extrusion de Ca^"^ de ces cellules.
11 est admis qu’au niveau des neurones, c’est NCX2 qui est responsable de l’efflux de Ca^’’. Par contre NCX3 a le même rôle dans le muscle strié squelettique et dans certaines parties du cerveau (45-46).
Ncx4 est exclusivement retrouvé dans les génomes des téléostéens, des amphibiens et de certains reptiles. En outre, le rôle de NCX4a dans le développement du zebrafish serait de
