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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Higgins, P. (1967). Etude de l'érythropoièse chez l'embryon de poulet sous l'influence de diverses substances stimulatrices ou inhibitrices (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.

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DE BRUXELLES

FACULTE DES SCIENCES Laboratoire de Morphologie Animale

ETUDE DE L’ERYTHROPOIESE

CHEZ L’EMBRYON DE POULET

sous L'

INFLUENCE DE DIVERSES SUBSTANCES

STIMULATRICES OU INHIBITRICES

Thèse présentée pour l’obtention

du grade de Doctorat ( grade légal )

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Je suis heureuse de pouvoir exprimer ici ma fervente gratitude à Monsieur le Professeur Jean Brachet, qui fut l'inspirateur de ce travail, que j'ai eu le privilège d'ef­ fectuer sous sa direction bienveillante.

Je suis très reconnaissante à Madame Ficq pour l'amitié qu'elle a manifestée par ses conseils.

Mes remerciements chaleureux vont également à

Madame De Saedeleer, qui a apporté son aide dans l'illustra tion de ce mémoire, et à tous les chercheurs de ce labora­ toire dont l'amitié, l'entrain et la cordialité créent l'ambiance et le soutien indispensables à la poursuite de recherches de longue haleine.

Ce travail a pu être réalisé grâce à l'Association Euratom-U.L.B. (Contrat 016 - 6l - ABIB), que je remercie également.

I

PLAN DU TRAVAIL.

Page,

I. BUT DU travail... 1 II. INTRODUCTION GENERALE ... 2 III. MATERIEL BIOLOGIQUE ... 10

PARTIE EXPERIMENTALE.

I. LES EFFETS DE LA PUROMYCINE...1? - Introduction ... 17 - Matériels et Méthodes ... 18 - Résultats ;

1) Observations morphologiques ... 22 2) Autoradiographies ... 23 3) Aires vasculaires cultivées in vitro ... 24

- dosages biochimiques de Hb, autres protéines,

RNAs; e„

- incorporation de ^Fe;

- autoradiographies ; incorporation de précur­ seurs d'acides nucléiques et de protéines.

4) Erythroblastes cultivés in vitro ... 2? - autoradiographies et mesures de la radio­

activité au compteur à scintillation, après incorporation de précurseurs d'acides nucléi­ ques et de protéines;

- analyse de la synthèse des RNAs ribosomiaux et de transfert,

- Discussion des résultats 35

II. QUELQUES EFFETS DE L'ACTINOMYCINE ... ... 39

Etude de l'incorporation de la lysine, de la valine et de la leucine, en présence et en absence d'actino- mycine (aire vasculaire d'embryons de poulet),

III. HISTONES HOMOLOGUES ET HETEROLOGUES ... 43

- Introduction ... ... ... 43 - Matériels et Méthodes .... ... ... 49 - Résultats s

a") Embryons de poulets ; observations morphologi­

ques ...

33

b) Erythroblastes cultivés in vitro; effets d'histones homologues et hétérologues sur

c) Noyaux isolés d'érythroblastes et de jeunes embryons : effets d'histones homologues et hétérologues sur l'incorporation de

1'uri-dine-^H...

63

Discussion des résultats ...

65

IV.a)QUELQUES EFFETS DES ACIDES RIBONUCLEIQUES EXOGENES

7

I b)LES EFFETS DE L'ACIDE POLYADENYLIQUE (SEUL OU ASSOCIE A L'ACTINOMYCINE) SUR L'INCORPORATION DE LA LYSINE...

71

- Introduction ... 7i

- Matériels et Méthodes ... 77

- Résultats : a") Induction de la synthèse de l'hémoglobine "de novo"... 79

b) Stimulation de la synthèse d'hémoglobine dans l'aire vasculaire de l'embryon de poulet . . 80

c) Activité inductrice sur l'ectoblaste de Batra­ cien de microsomes et de ribosomes de Pleurodeles waltlii ... 84

- Effets de l'acide polyadénylique seul ou associé à 1'actinomycine ... 87

- Discussion des résultats ... 90

V. LES EFFETS DE L'ERYTHROPOIETINE... 97

A. Introduction... 97

B. Matériels et Méthodes...IO

3

C. Résul tats ; . 104

- effets sur la synthèse de l'hémoglobine, des autres protéines et du RNA; „ - incorporation de leucine-^H, uridine-'^H et ^^Fe en présence et en l'absence de 1'érythropoié-t ine . - Discussion et conclusions ... 110

RESUME GENERAL ... 112

CONCLUSIONS GENERALES ET PERSPECTIVES ... 115

I. BUT DU TRAVAIL.

Nous avons choisi d'étudier la différenciation du tissu hématopoiétique de l'embryon du poulet parce qu'elle conduit à la synthèse d'une protéine spécifique bien connue, 1'hémogloblne.

Sans perdre de vue la complexité du processus de la différenciation, son extension dans le temps et dans l'espace, nous avons cherché à obtenir des renseignements complémentaires au sujet de certaines étapes précises de la différenciation chez l'embryon de poulet, en utilisant diverses substances pouvant exercer une action Inhibitrice, stimulatrice ou régula­ trice sur le métabolisme des acides nucléiques ou des protéines.

Les substances utilisées ont été les suivantes : la puromyclne, 1'actlnomyclne, les acides rlbonuclélques, l'acide polyadényllque, l'érythropoiétine, les hlstones homologues et hétérologues.

II. INTRODUCTION GENERALE.

Il est essentiel pour l'embryologiste d'identifier les différentes étapes qui permettent à l'information uniformé­ ment inscrite dans le génome d'être traduite de façon à donner naissance aux tissus adultes spécialisés. L'analyse expéri­ mentale en est compliquée, bien que nous disposions actuelle­ ment d'un schéma de base précis.

Le DNA des chromosomes contient l'information généti­ que, qui est transcrite d'abord dans les séquences complémentai­ res de nucléotides des RNAs messagers. Les messages

qu'apportent ces derniers sont traduits au niveau des polyri­ bosomes en séquences polypeptidiques, selon un code en triplets de nucléotides. Différents RNAs de transfert amènent les acides aminés aux polyribosomes actifs. L'information requise pour la synthèse de plusieurs protéines appartenant à une voie métabo­ lique particulière semble, tout au moins chez les bactéries, être soumise à un mécanisme commun de contrôle. On peut citer par exemple la région "gai" du chromosome d'E.coli, qui a été

étudiée avec précision par Jacob et Monod (

1961

) s les gènes

structuraux pour plusieurs enzymes se situent dans une même région du génome, l'opéron, dont le fonctionnement est contrôlé par un gène opérateur adjacent, qui se trouve lui-même sous le

contrôle d'un gène régulateur. Ce dernier peut être inactivé ou activé par certains métabolites spécifiques. Le fonctionne­ ment du génome, chez les bactéries, dépend donc en partie de

la présence ou de l'absence de substances de faible poids molé­ culaire. Un tel système de régulation convient à l'organisation cellulaire et au mode d'existence des microorganismes, qui

doivent pouvoir s'adapter rapidement aux fluctuations possibles de leur milieu environnant. Il ne suffit pas pour rendre

3.

Chez les métazoaires, la direction de l'évolution tend au maintien d'un milieu cellulaire constant. Cela néces­ site l'intervention de contrôles supplémentaires, protégeant les cellules individuelles d'une trop grande dépendance

vis-à-vis de leiar milieu environnant et permettant une sélection des sites génomiques actifs dans la synthèse des RNAs messagers spécifiques de chaque tissu adulte. Le génome des organismes supérieurs est donc composé d'un plus grand nombre de molécules de DNA que celui des bactéries(qui se limite souvent à une

seule longue molécule de DNa). Les molécules de DNA sont

associées aux hlstones et à d'autres protéines et arrangées en des structures définies et organisées : les chromosomes.

L'existence de deux niveaux d'organisation cellulaire bien sé­ parés, le noyau et le cytoplasme, la présence de nucléoles dans le noyau, sont autant de faits qui, parmi d'autres, témoi­ gnent de cette différence de complexité structurale et fonc­ tionnelle. Rappelons, d'autre part, que plusieurs des concepts tirés du schéma élaboré pour les bactéries n'ont jamais,

jusqu'à présent, reçu de confirmation expérimentale en ce qui concerne les organismes multicellulaires (induction enzymati­ que, existence d'opérons, par exemple).

Il est intéressant de souligner quelques points impor­ tants qui confèrent un caractère particulier au développement embryonnaire et à la différenciation cellulaire. Au cours de l'ontogénèse, il existe des périodes de latence où certains principes actifs essentiels à la morphogénèse restent inexpri­ més. Brachet a souvent insisté sur ce phénomène, qui peut maintenant être expliqué en précisant l'existence dans le cyto­ plasme de relais d'information héréditaire sous la forme de DNA cytoplasmique ou de mRNAs stables (Brachet, 19^^» 19^2,

1963

a, 1964 a,

1965

a),

L'oocyte contient déjà une réserve de mRNAs de source maternelle s il suffit d'activer parthénogénétiquement des

fragments anucléés d'oeufs d'oursin (Brachet et al.,

1963

?

Baltus et al., I

965

) pour y induire immédiatement une intense

d'embryons, est indépendante d'une nouvelle synthèse de mRNA s 1'actinomycine n'arrête leur développement qu'au moment de la gastrulation (Brachet et al, 1964 c). Certains auteurs (Gross

et al,

1965

» Brown et Littna,

1966

) signalent toutefois la syn­

thèse de petites quantités de mRNA rapidement renouvelé, hété­ rogène et ressemblant au DNA, s'effectuant déjà à partir du stade 4 blastomères. L'hybridation des RNAs, isolés à diffé­ rents stades d'embryons de Xenopus, avec du DNA homologue adulte a permis de mettre en évidence une classe de mRNAs

stables, dont l'apparition au cours du développement est simul­

tanée avec le processus de la différenciation (Denis, I

966

).

Certains gènes n'entrent en activité que pendant un certain

temps, après le stade neurula, puis cessent de fonctionner î

leurs produits restent toutefois présents dans les embryons plus avancés sous une forme stabilisée, mais apparemment en un nombre réduit de copies. D'autres sites génomiques sont

actifs à tous les stades postérieurs à la segmentation et le sont probablement aussi chez l'adulte s le mRNA transcrit sur ces

sites se renouvelle rapidement; il est présent en beaucoup plus de copies chez l'embryon avancé que chez le jeune embryon. Des travaux similaires à celui de Denis, chez d'autres espèces, ont révélé une situation comparable, caractérisée par la synthèse, au cours de l'ontogénèse, de plusieurs types de mRNA de durée de vie différente, les uns spécifiques pour certains stades enibryonnaires, les autres identiques à travers l'ontogénèse

(Brown et Littna, I

966

, Glisin et al, I

966

; Comb et al, I

965

;

Whiteley et al,

1966

). Beaucoup de points restent à préciser,

notamment en ce qui concerne la nature exacte des synthèses contrôlées par chaque type de mRNA. Mais il est clair que, aux différentes étapes de l'ontogénèse, il s'établit une indépendance partielle vis-à-vis du génome. D'autre part, une classe de

mRNAs à renouvellement rapide co-existe dans les tissus diffé­ renciés avec du mRNA stable. Au contraire, tous les RNAs messagers identifiés chez les bactéries ont une durée de vie

5

Il est possible que tout ou partie du mRNA instable joue un rôle régulateur dans le fonctionnement des gènes. Ce messager instable pourrait ne pas être traduit sous la forme de protéine; il ne quitterait Jamais le noyau, mais serait dégradé

sur place(Harris et La Cour , I

963

» Harris, 1964; Denis, I

966

;

Georgiev, I

966

; Freedman et al, I

966

; Shearer et McCarthy,

1966

). Le mRNA stable est probablement le produit de gènes de

structure et il servirait directement à la synthèse de protéines. Divers arguments expérimentaux s'accumulent pour

indiquer le masquage, par un composant protéique, de certains mRNAs stables non-exprimés pendant des périodes déterminées de

l'ontogénèse (revue par Spirin, I

966

). Spirin les dénomme ;

"informosomes"; associés à des ribosomes, ils formeraient des "oligoribosomes inactifs" (cf. complexes m-RNA-ribosomes

entourés par protéinespostulés par Monroy et al, I

965

). Spirin

interprète les données de la littérature comme suit s le mRNA de source maternelle est prêt à fonctionner aussitôt après la fécondation par démasquage d'informosornes inactifs dans l'oeuf non-fécondé. Il permet le développement de l'embryon jusqu'à la fin du clivage, ainsi que Brachet et Denis l'ont démontré

(

1964

). Tout mRNA nouvellement synthétisé pendant cette période

de multiplication rapide est mis en veilleuse sous la forme d'informosomes et ne devient actif qu'à la gastrulation. Aux stades plus avancés, à partir de la gastrula, les informosomes synthétisés pendant la vie embryonnaire entrent en fonction, tandis que d'autres sont synthétisés pour la première fois. D'autres mRNAs de "transit", à l'inverse des informosomes,

sont rapidement renouvelés et expriment rapidement leur message en termes de polypeptides. Ils quittent le noyau sous la

forme de particules sédimentant à 45S (cf, Scherrer et al,1966;

Hadjiolov, I

966

) et ils s'incorporent immédiatement dans des

spécifiques coïnciderait avec la mise en activité par démasqua­ ge de mRNAs précédemment formés (cf. les travaux de Humphreys

et al,

1964

, montrant que des tétrades ribosomes inactifs dans

l'épithélium de jeunes embryons de poulet ne prennent leur

forme active qu'au l4ème jour de la vie embryonnaire

5

des phé­

nomènes similaires ont été signalés par Yaivin I

966

, et

Garren I

966

. L'activité "synthétique" (ou plutôt "template")

de mRNAs déjà fonctionnels pourrait être supprimée, dans cer­ taines conditions, par la présence de protéines régulatrices nouvellement synthétisées. Toutes ces hypothèses correspondent à de nombreuses données de la littérature, notamment en ce qui concerne la sédimentation en gradients de densité de certains types de RNA; Spirin lui-même insiste cependant sur leur caractère spéculatif à l'heure actuelle.

Il reste aussi à élucider la nature des signaux qui déclenchent l'activité spécifique du génome au bon moment. Il est clair qu'au fur et à mesure que le développement embryon­ naire se poursuit, différents sites génomiques deviennent

fonctionnels tandis que d'autres cessent de fonctionner. Dans les tissus différenciés, seule une fraction des sites génomiques est transcrite pendant l'interphase des cellules; cette

sélection génomique est stable, étant transmise lors des divi­ sions mitotiques aux cellules filles par un mécanisme encore

inconnu. Les hypothèses de Frenster (

19

Ù

3

»

19^5»

I

966

) tentent

7.

phénomène de compensation dans le fonctionnement des gènes (cf. Robinson et al, 1964). L'association, dans la chromatine,

d'histones et de RNAs dérépresseurs permettrait la transmission aux cellules filles d'une sélection stable de sites génomiques. Les ligands ayant une capacité connue pour s'associer au DNA

in vivo ou in vitro (Frenster, I

966

; Goldberg et Atchley,

1966

)

se révèlent soit inhibiteurs soit stimulateurs de la synthèse de RNA, selon qu'ils se lient respectivement aux hélices doubles ou simples du DNA. Par exemple, la testostérone, le méthyl- cholanthrène ou le RNA complémentaire s'associent préférentielle ment à l'hélice simple; ces substances facilitent la séparation des fibres de DNA et stimulent la synthèse de RNA. Les histones la polylysine et 1'Actinomycine D exercent des effets totalement opposés; elles stabilisent la forme inactive en hélice double du DNA et inhibent la synthèse du RNA. Il n'y a pas de preuve directe que la différenciation embryonnaire soit contrôlée de cette manière. Mais quelle que soit l'explication finale, il ne sera probablement pas possible d'expliquer la différencia­ tion sans comprendre le rôle exact des histones, des hormones, et de certains RNAs, vraisemblablement régulateurs, qui semblent se synthétiser et se dégrader dans le noyau.

Des expériences de transplantation de noyaux ont montré, d'autre part, le rôle déterminant que peut jouer ini­ tialement le cytoplasme de l'oeuf dans la détermination du développement de l'embryon (cf. Morgan, 1934). Si l'on transfère le noyau d'un neurula dans un oeuf de batracien anucléé et non-fécondé, celui-ci se développe; le noyau

transféré perd immédiatement sa capacité de synthétiser du RNA et prend l'aspect du noyau d'un oeuf normal, inerte à ce stade (sans nucléole). Ce n'est qu'après la segmentation, au moment de la gastrulation, que les noyaux, s'étant multipliés, forment des nucléoles et recommencent à synthétiser du RNA (Gurdon et

Brown, I

965

). De même, des noyaux de tissus adultes, inactifs

dans la synthèse du DNA,recommencent à incorporer la thymidine lorsqu'ils sont transférés dans des oeufs anucléés non-fécondés

cytoplasme de sa propre cellule et, peut-être, de celui des cellules et des tissus avoisinants. L'hétérogénéité cytoplasmi­

que confère, en fait, une importance considérable à certaines régions de l'oeuf dès le début du développement. Si le

croissant gris d'un oeuf de batracien est excisé de l'oeuf fécondé, son développement s'arrête avant la gastrulation; la greffe d'un deuxième croissant gris, sur le côté ventral d'un oeuf indivis, produit par contre un embryon double. L'endomma­ gement du cortex dans la région du croissant gris semble pro­

voquer des troubles transmissibles

t

le croisement de femelles

issues de tels oeufs avec des mâles normaux fournit un pour­

centage élevé de létaux (Curtis,

1960

). Or, le croissant gris

est à l'origine de la lèvre dorsale du blastopore; il se diffé­ rencie en chordoblaste et constitue l'organisateur qui transfor­ me l'ectoblaste en tissu nerveux. Un matériel non encore

identifié, accumulé dans le cortex de l'oeuf fécondé, condi­ tionne, semble-t-il, l'activation des gènes et la production de RNAs messagers dans la lèvre dorsale du blastopore. On trouve des régions cytoplasmiques d'importance similaire chez

d'autres espèces (lobe polaire des mollusques - Clément,

1956

,

Davidson, I

965

' micromères du pôle végétatif des oursins).

Cette hétérogénéité du cytoplasme pourrait résulter de la

présence ou de l'accumulation progressive de DNA cytoplasmique, de mRNAs, de RNAs dérépresseurs, d'hormones, de diverses

protéines (répresseurs , dérépresseurs, enzymes), de substrats ou de précurseurs spécifiques. L'intervention de plusieurs de ces facteurs simultanément n'est pas exclue. Bien que l'on connaisse les gradients intéressant les RNAs (Brachet, 19^2,

19

^^»

1962

, Bacharova I

966

), la répartition d'autres molécules

comme les hormones au cours de la morphogénèse - ainsi que la distribution exacte des différents types de RNAs - n'a pas encore subi une analyse complète.

La compréhension des étapes diverses que suit la différenciation cellulaire est rendue encore plus difficile par la capacité qu'ont certaines régions de l'embryon de

9.

(le chordoblaste des batraciens, "organisateur" pour l'ectoblaste la cupule optique qui détermine la différenciation du cristallin de l'oeil). La nature du stimulus inducteur n'est pas connue, et on ne sait pas avec certitude si ce phénomène implique le mouvement de macromolécules d'un tissu à l'autre. Il se

produit également des phénomènes n'intéressant que les surfaces de cellules avoisinantes et ils ne sont pas encore expliqués

(Weiss,

19

^

7

»

1955

» Grobstein, I

966

).

On peut se demander à quel moment précis débute le processus qui aboutit à la formation d'un tissu différencié. Il est certain que 1'organogénèse précède la différenciation complète des cellules individuelles. La première répartition des couches cellulaires en ectoblaste, mésoblaste et entoblaste est suivie de la séparation des organes qui s'y forment.

Ensuite, les cellules individuelles se distinguent les unes des autres et prennent leur forme définitive. A chaque étape doit correspondre un nouveau palier de spécialisation, conditionné en dernière analyse par l'expression partielle du génome, mais

soumis progressivement à divers contrôles nucléaires et

cytoplasmiques. C'est la chronologie, aussi bien que la nature exacte de chaque étape, qui restent à élucider.

Telle est la complexité des problèmes qui restent à résoudre que l'on ne peut les aborder dans leur ensemble à

III. MATERIEL BIOLOGIQUE.

C'est à partir du mésoderme que les tissus hématopoié­

tiques se développent. Sous l'influence de mouvements de migra­ tion, l'épiblaste est amené vers la ligne médiane et s'invagine autour des lèvres de ce sillon; arrivées en profondeur, les cellules se réfléchissent latéralement, constituant ainsi le

feuillet mésodermique. Pour Spratt et Haas (

1965

), le mésoderme

prendrait son origine plutôt par prolifération mitotique de la couche superficielle sans avoir subi un mouvement d'invagina­

tion. Rosenquist (

1966

), par contre, insiste sur l'existence

d'un phénomène d'invagination à travers la ligne primitive, site vraisemblablement exclusif de la formation du mésoderme.

Déjà dans le jeune embryon (stades 1 et

2

), le potentiel héma­

topoiétique ne semble pas être distribué d'une manière égale dans toutes les régions de l'embryon, mais se limiter à une région postérieure bien localisée; celle-ci change de forme et de position avec la prolifération et la migration des

cellules s du stade 4 au stade 8, cette région est en forme de U, entourant l'aire pellucide, et le potentiel hématopoiétique

est plus intense dans la partie postérieure (Settle, 1954, Wilt,

1966

a). Le feuillet mésodermique s'accole intimement à l'en­

doderme sous-jacent, de sorte que la délimitation des deux feuillets est initialement difficile. On ne sait pas s'il

existe à ce moment des interactions homotypiques ou hétérotypiques

(Grobstein, I

962

). Signalons simplement que Wilt

(1965

a)

a constaté que la présence do l'endoderme facilite la différen­ ciation d'érythroblastes en culture de tissu, bien que l'hémo­ globine puisse se synthétiser en son absence. Wilt en conclut à un passage d'une substance, jouant un rôle dans le déclen­ chement de la synthèse de l'hémoglobine, de l'endoderme aux

cellules des îlots sanguins, Murray (1932) et Slonimsky (

1931

)

11.

serait indépendante des tissus adjacents, Slonimsky (l93l) a, en effet, montré que, chez les Batraciens, si on enlève la région hématopoiétique présomptive, on obtient des larves in­ capables de produire des érythrocytes.

Initialement, les cellules du mésoderme qui vont former dos îlots sanguins constituent des masses apparemment solides, ayant l'aspect d'un syncytium (Sabin, 1920) s ces

"angioblastos" donnent naissance à des mégaloblastes, premières cellules de la lignée primitive du sang, à l'endothélium et au plasma sanguin. Les premières érythroblastes apparaissent après environ 20 à 25 heures d'incubation; de nouveaux

érythroblastes continuent à se développer à partir des méga­ loblastes; mais, en même temps, on assiste à la multiplication d'un certain nombre de cellules qui ont déjà commencé leur

différenciation. Se basant sur une étude de l'incorporation

de la thymidine, A. Hell (

1965

) a calculé qu'il y aurait un

cycle de division mitotique d'environ 11 heures. Salera (1956)

établit la durée de synthèse du DNA

k ^ k 8,6

heures. Il est

généralement admis (üanchakoff, I

908

; Till et al,, 1964) qu'à

chaque division d'une cellule primitive correspond la formation de deux types de cellules filles ;

une cellule qui demeure non-différenciée et sera la

source de nouveaux érythroblastes et une cellule dont la voie de différenciation est définitivement déterminée et qui entre en maturation. La maturation, à partir des mégaloblastes, en proérythroblastes, érythroblastes, proérythrocytes et érythro­ cytes, se prolonge pendant un temps variable (de 2 à 8 jours généralement). Déjà au troisième et quatrième jour, quelques éléments de la première lignée ont commencé à dégénérer; mais la durée de vie des érythrocytes embryonnaires est très varia­

ble s de 2 à 22 jours, avec une moyenne de 8 à 9 jours (BussI,

de prolifération et de maturation, ces cellules sont libérées dans le sang d'embryons de 4 à 5 jours; leur maturation suit les mêmes phases que la première lignée, qu'elles remplacent.

L'activité mitotique des cellules sanguines après 5 jours et 20 h. d'incubation est de 2,2 p.lOO (Oawson, 1936)»

La durée de vie d'environ 9 jours des cellules san­ guines embryonnaires est moins longue que chez la poule adulte

(où les érythrocytes rie dégénèrent qu'après

JO

jours environ).

Par conséquent, la synthèse d'hémoglobine dans les jeunes

érythroblastes est relativement plus précoce, chevauchant même la période de prolifération. Il existe dans l'aire vasculaire de l'embryon de poulet de 2 jours et dans le sang d'embryons

de

5

jours 20 heures, une proportion élevée d'érythroblastes

(95s4 ^ et 74,9 ^ respectivement); leur cytoplasme est

basophile, mais contient déjà de 1'Hb colorable par 1'ortho-

dianisidine (

0

'Brien,I

96

I); le noyau est grand et contient

I à 2 nucléoles (Romanoff, I

96

O; Lucas et Jamroz, I

961

).

La synthèse de l'hémoglobine commence au stade

9

de la vie

embryonnaire (O'Brien, I

961

). Certains auteurs pensent que

cette synthèse débute dans le noyau (O'Brien, I

96

I; Hammel

et Bessmann, 1964); d'autres considèrent que l'Hb se synthé­

tise uniquement dans le cytoplasme (Kabat et Attardi, I

966

).

II est impossible de trancher cette controverse actuellement. La durée de vie relativement courte et la différenciation rapide de ces cellules, dans lesquelles les synthèses de DNA, de RNA et de protéines se suivent de près ou s'effectuent simultanément les rend particulièrement intéressantes pour l'étude de la synthèse d'une protéine spécifique associée à la différenciation cellulaire.

La molécule d'hémoglobine est constituée de deux

parties

%

1

) la globine, composée de 4 chaînes polypeptidiques (normale­

ment 2 a et 2 g);

2

) 1'hème, composé de protoporphyrines porteuses d'atomes de

13.

L'étude de certaines maladies comme la thalassémie a permis de démontrer que les deux gènes contrôlant la synthèse des chaînes ot et 6 de la globine sont transmis indépendamment lors de

ségrégations chromosomiales, Selon les études de Colomb et Baglioni (l966),les chaînes a sont synthétisées d'abord; elles ne quittent pas les polysomes avant que des chaînes 3 soient achevées. L'insertion de 1'hème dans la poche extrême­ ment hydrophobique formée par la globine complète la molécule

d'hémoglobine; on ne sait si le reploiement de la globine est spontané, ou conditionné par la présence de l'hème. Il y a toujours une relation Isl entre l'hème et la globine lorsqu'on mesure leur synthèse par incorporation de la glycine (Oranick,

1964).

L'hème est synthétisé à partir de glycine et de succinate et la première étape de cette synthèse consiste en

la formation de l'acide 6 -aminolévulinique (aLA) sous l'effet

de l'enzyme 6 -aminolévulinique synthétase, qui est localisé dans les mitochondries. Cette enzyme posséderait, selon Granick (1964), une grande importance pour la régulation de

la synthèse do l'hémoglobine : étant le premier de la chaîne d'enzymes conduisant à la synthèse de l'hème, 1'ALA synthétase serait le seul enzyme présent en quantité limitante. L'addi­ tion d'ALA au milieu de culture d'aires vasculaires isolés d'embryons de poulet augmente la synthèse nette d'Hb; cette stimulation est inhibée par la puromycine, ce qui fait invoquer

par les auteurs (Granick et Levere, I

965

) un mécanisme de

contrôle éventuel au niveau des polysomes (bien que cette expérience n,e paraisse pas de nature à décider si le contrôle est au niveau de la transcription ou de la traduction).

Wilt (

1966

) insiste, d'autre part, sur le fait que cette

stimulation est transitoire, variable, ou même parfois

absente, L'ALA synthétase disparaît au cours de la maturation des érythrocytes; chez les mammifères, seuls les érythrocytes nuclé'és sont capables d'effectuer la première étape de la

synthèse (glycine + succinate = AL,a) ; les réticulocytes exigent

Des modifications qualitatives apparaissent pendant

l'ontogénèse de diverses espèces : Hell (

1965

) et Wilt (

1962

)

ont établi l'existence d'une hémoglobine embryonnaire distincte des hémoglobines adultes chez le poulet. Selon Fraser (1964 a) les deux Hb embryonnaires et adultes se ressemblent; mais

un troisième composant apparaît au 7®nie jour et persiste

jusqu'à la vie adulte. Manwell (

1966

) distingue

3

hémoglobines

différentes des deux adultes, mais possédant deux chaînes polypeptidiques communes. L'hémoglobine embryonnaire a une plus grande affinité pour l'oxygène et un effet Bohr moindre que l'hémoglobine adulte.

Il est généralement admis que le RNA messager de 1'Hb est stable, puisqu'il semble exister un certain décalage entre la synthèse des RNAs et celle des protéines pendant les différents stades de la maturation des érythrocytes

(Cameron et Prescott,

1963

» Grasso, Woodard et Swift,

1963

»

Marks et al, 1962; Wilt,

1965

b; Hell, 1964). Pendant un

certain temps, cependant, la synthèse des RNAs et celle de 1'Hb sont simultanées. Il serait important de savoir quelle proportion de la synthèse d'hémoglobine s'effectue après la cessation de toute synthèse de RNA, D'après Granick et

Devise (1964), la synthèse d'hémoglobine qui s'effectue dans les réticulocytes ne correspondrait qu'à 10 ^ de l'Hb totale

synthétisée tout au long de la maturation. Vilt

(1966

b),

par contre, estime que la synthèse de l'Hb, chez l'embryon de poulet, serait indépendante de la synthèse de RNA de poids

moléculaire élevé et il pense qu'il n'existerait, au stade

7

somites, une régulation qu'au niveau de la traduction.

Il est difficile d'établir, à partir de ces données générales, le moment exact où débute la différenciation du tissu hématopoiétique. On pourrait aisément reposer ici les diverses questions soulevées d'une manière générale au

15.

et inhibée de polyribosomes, soit dans les mégaloblastes ou hématocytoblastes, soit à des stades ultérieurs ? Ou bien les polyribosomes entrent-ils en fonction dès que les RNA messagers appropriés s'associent aux ribosomes ? Les mécanismes de

17

I. LES EFFETS DE LA PUROMYCINE.

L'emploi de la puromycine a permis de confirmer l'hypothèse qu'une synthèse ordonnée de protéines spécifiques est indispensable pour le déroulement normal de la morphogénèse

(Brachet, I

963

a

>

1964; Legros et Brachet, I

965

). Le méca­

nisme d'action de la puromycine est connu

t

elle se substitue

au RNA de transfert par une liaison entre son groupement aminé libre et le groupement carboxyle de la chaîne peptidique naissan­ te, décrochant celle-ci des polyribosomes et interrompant

ainsi la synthèse protéique (Yarmolinska et de la Haba, 1959*

Morris et Schweet, I

96

I; Nathans, 1964; Noll, I

963

;

Levinthal et coll. I

963

). Elle entraîne une fragmentation des

polysomes en ribosomes individuels par un mécanisme indirect qui résulte, peut-être, d'une augmentation de la vitesse du roulement des ribosomes le long du RNA messager (Williamson et Schweet,

1965

* Colombo et Baglioni, I

966

),

Nous nous sommes demandée si cet inhibiteur pourrait empêcher immédiatement soit le déclenchement, soit la poursuite de la synthèse de l'hémoglobine : un effet différentiel, à

quelque niveau que ce soit, pourrait permettre de déceler des protéines régulatrices ou structurales ayant une importance particulière pour la différenciation.

Certains travaux du laboratoire ont fait ressortir la possibilité d'un effet différentiel de la puromycine sur la synthèse des histones s la synthèse des protéines basiques ne serait peut-être pas influencée autant que celle des autres pro­ téines par la puromycine (Bosseler, 1964). Busch (1964) a

résumé les arguments faisant penser que les histones seraient peut-être synthétisées directement sur le DNA du génome, ou sur des ribosomes nucléaires rapidement renouvellés. En effet,

McCarthy et Holland (

1965

) ont démontré que, in vitro, des

déoxyribonucléotides peuvent servir directement comme modèles

que la puromycine n'affecterait pas leur synthèse. Vu leur intérêt, il devenait intéressant de comparer, chez l'embryon de poulet, l'incorporation des acides aminés basiques à celle des acides aminés neutres en présence de puromycine.

Il était intéressant de savoir, d'autre part, si

un arrêt brutal des synthèses protéiques aurait des répercussions importantes sur d'autres synthèses essentielles à la morphogé- nèse et à la différenciation.

Nous avons donc étudié la synthèse des protéines, (celle de l'hémoglobine en particulier) et celle des acides ribonucléiques dans le tissu hématopoiétique d'embryons de poulet; à titre de comparaison, les effets morphostatiques de la puromycine sur le jeune embryon de poulet ont été examinés. Afin de mieux définir les effets différentiels de la puromycine, nous avons fait ensuite une étude de l'incorporation d'acides aminés et de nucléosides dans les érythroblastes métaboliquement actifs du sang embryonnaire incubé in vitro. Des mesures paral­ lèles effectuées par autoradiographie et au compteur à scintilla­ tion, ont permis d'établir la séquence selon laquelle les inhi­ bitions observées ont lieu. Une analyse de la synthèse des RNAs ribosomlaux et de transfert en présence de la puromycine a

complété cette investigation.

A. Matériels et Méthodes.

1. Observations morphologiques.

Des embryons de poulet aux stades jeunes (stades 6 à 12, Hamburger-Hamilton, 1951 ) ont été cultivés sur dii milieu à 1'agar simple et observés au binoculaire pendant des périodes variant de 1 à 24 heures. Après avoir été fixés par un mélange éthanol-acétique (95 “ 5)> üs ont été enrobés dans de la

19.

radioactifs des protéines (leucine-^H) et des acides nucléiques

q 3 3

( thymidine--^H, uridine-"^H, cytidine-

d)

dans les embryons témoins

et dans ceux traités à la puromycine. Des tests enzymatiques (RNase, DNase) et cytochimique s (Feulgen) ont été effectués avant autoradiographie pour préciser l'incorporation des pré- cruseurs dans le DNA ou le RNA.

2.

Aires vasculaires cultivées in vitro.

La culture in vitro pendant 24 heures d'aires vascu­

laires d'embryons de poulet désembryonnés aux stades

6

à

12

a

permis d'étudier les effets de la puromycine sur s

1

'hémoglobine

dosée par sa réaction pseudopéroxidasique en présence d'HgOg

et d'ortho-dianisidine (o'Brien, I

961

); les protéines globales,

dosées par la méthode de Lowry et al.(l95l)» les acides ribonucléiques dosées par la méthode de Miller et al.(l950) modifiée. Ce procédé a été décrit en détail par Hell (1964).

59

Nous avons suivi aussi l'incorporation du Fe dans le tissu hématopoiétique. La radioactivité utilisée dans ces expériences étaient de 1,5 yc/ml. Afin de favoriser l'incorpo­ ration spécifique du fer, une quantité appropriée de ce précur­

seur est incubée à

370

pendant plusieurs heures, avec du plasma

frais de poule adulte, pour assurer sa fixation sur les protéines métallofixatrices avant qu'il ne soit ajouté au milieu agar,

Après l'incubation des blastodisques pendant 24 heures, ils étaient lavés plusieurs fois au Ringer contenant le précurseur froid, avant l'extraction de 1'hème selon la méthode préconisée

par Krantz et al. (

1963

). Après addition d'HCL, l'hème acide

3. Erythroblastes cultivés in vitro.

Une méthode permettant d'étudier In vitro les

cellules de la lignée définitive du sang d'embryons de poulet a été mise au point en s'inspirant d'un travail de Fraser

(1963

a). Ce matériel se prête très bien à des études auto­ radiographiques et biochimiques parallèles. Il suffit d'effec­ tuer des frottis de sang et de prélever simultanément des

aliquots égaux pour les dosages biochimiques ou pour la prépa­ ration des précipités dont on veut mesurer la radioactivité au compteur à scintillation. Cela permet, notamment, de

s'assurer à tout moment que les inhibitions observées ne sont pas dues à des phénomènes de cytotoxicité.

Le sang, prélevé à des embryons âgés de

5

à, l4 jours,

est incubé pendant des temps variables, en présence ou non des protéines et des acides nucléiques. L'incorporation de ces précurseurs a été suivie par autoradiographie sur des frottis de sang.

Les résultats obtenus ont été comparés avec des

mesures de l'incorporation de ribonucléosides et d'acides aminés radioactifs faites au compteur à scintillation. Les précipités ont été préparés pour comptage par la méthode décrite par

Erslev, 1964 et Wilt, I

965

Après incubation, les cellules

sont lavées deux fois au Ringer,lysées par congélation -

décongélation, et traitées de la manière suivante s après l'in­ corporation d'acides aminés, on effectue deux lavages à l'acide trichloracétique 10 à chaud; après incorporation de nucléosi des, on utilise le TCA à 5 9^ à froid. Après centrifugation, les précipités sont délipidées par un mélange éthanol-éther 3^1

pendant 10' à

60

®. Le résidu est dissout dans 0,5 ml d'hyamine

et ajouté au liquide à scintillation (4 g : PPO ( 2,5“diip6^6nyloxa

zole); 100 mg

s

POPOP (l,4 - Di ^2-5-phenyloxazolylj) - benzène;

1000 ml Toluol).

21.

Les cellules lavées et lysées sont suspendues dans du tampon Tris-HCl pH 7,4 (NaCl 0,l4 M; sodium dodécylsulfate - 0,5 naphtalène-disulfonate 1 mg/ml et éthylènediaminetétracétate

lO' La déprotéinisation est effectuée rapidement par deux

extractions successives au phénol fraîchement distillé et contenant de 1'hydroxyquinoléine à la concentration de 0,1 On centrifuge, et les surnageants aqueux contenant les acides ribonucléiques sont réunis, puis lavés deux fois, à froid, au

chloroforme octanol (

9

/I) une fois à l'éther. Après addition

d'acétate de sodium

3

M à raison de 1 goutte par ml de solution,

les acides ribonucléiques sont précipités par de l'alcool absolu glacial à -20°C. Le RNA, resuspendu dans le tampon, est re­

précipité de la même manière pendant 24 h. à -20®C, Le lende­ main, un petit volume du précipité est repris dans du tampon tris - HCl - NaCl 0,l4 M contenant du naphtalène disulfonate

à la concentration de

25

y g/ml), déposé sur un gradient de

saccharose

(5

- 20 dans le même tampon et centrifugé pendant

4 heures à 37»500 r.p.m. dans une Spinco S.V. 39*

Les spectres d'absorption des différentes fractions contenant les acides ribonucléiques sont mesurés au Beckman à

260

ro y; chaque fraction est ensuite diluée dans

5

nil de solu­

tion de Bray (I

960

) et la radioactivité est mesurée au compteur

à scintillation,

4, Réactifs utilisés ,

I. Puromycine (dihydrochlorure) - Nutritional

Biochemical Corporation.

II. Actinomycine - D, Merck, Sharp et Dohme.

Activité spécifique a) Thymidine-6-T (n) 3000 mc/mM b) Uridine-T (g) 1.44 c/mM

1.760

mc/mM c) Cytidine 2,3 C/mM d) L-leucine-^^C(u) 8.0 mc/mM e) DL-valine-T(G) 1.22mg/5mc f) Glycine-(nom,)-2-T 3.33mg/5mc 14 g) L-Lysine- C monohydrochlo­ rure 6.2 mc/mM h) Lysine O i) L-Arginine-H"^ T(g) monohy­ drochlorure 0.85nig/lmc \ 59

j)

Fe,

solution stérile pH 7»9

"carrier free"

50

yg/llOO y c

Radioactivité utilisée

a) milieu agar b) milieu

1iquide 3 yc/ml 10 yc/ml 6 Uc/ml 20 yc/ml 6 Pc/ml 20 yc/ml 4 yc/ml 10 yc/ml 4 yc/ml 10 yc/ml 4 yc/ml 10 yc/ml 0,7 U c/ml 1 yc/ml 0,7 yc/ml 1 yc/ml 2 yc/ml 5 yc/ml 1,5 yc/ml B . Résuit ats, 1. Observations morphologiques,

De faibles concentrations de puromycine

(5

yg/ml) ne

provoquent qu'un léger ralentissement de la croissance, sans qu'il y ait la moindre spécificité d'effet visible. Aux

concentrations intermédiaires (8 yg/ml), on remarque que la puromycine inhibe préférentiellement le développement des

23.

apparaître des anomalies diverses ; cerveau trilobé, chorde ondulée, microcéphalie. Le développement de l'aire vasculaire n'est que lentement influencé. En général, on observe un

certain délai (environ 6 heures) avant que l'inhibition se manifeste visiblement. Lorsque le traitement est précoce

(stade 7)» une plage de lyse peut apparaître dans la région postérieure des somites après 6 à 10 heures d'un traitement par 7 à 10 y g/ml. L'arrêt du développement est immédiat

dans le cas des fortes doses de puromycine

(15

à 25 yS/®î)»

qui provoquent assez rapidement une perte de basophilie du cytoplasme, tout en laissant les nucléoles fortement colorés par la pyronine. Après des traitements plus prolongés à ces concentrations, les cellules se lysent.

2. Autoradiographies.

L'inhibition de la synthèse protéique, mesurée par O

l'incorporation de la leucine-'^H, ne paraît pas être complète et immédiate.

Concentration de puromycine (/<g/ml)

Des doses de 10 yg/ml de puromycine diminuent déjà 3

l'incorporation de la cytidine- H dans le RNA d'environ 20 à

30 ^ après 6 h, de traitement. Après 24 h., 10 yg de puromycine/ ml inhibent l'incorporation de la thymidine dans le DNA; mais, à cette concentration,on observe déjà un certain nombre de pycnos es,

3. Aires vasculaires cultivés in vitro.

La synthèse de l'hémoglobine se déclenche et se

poursuit en présence de puromycine; il s'est avéré impossible d'inhiber la synthèse de cette protéine complètement, même aux

très jeunes stades (

7

)» sans utiliser des doses cytotoxiques.

En 24 heures, 7 Vg puromycine par ml ne produisent qu'une diminution de 77 de la synthèse de l'hémoglobine si le

traitement débute au stade

7

(soit 6 heures avant que la syn­

thèse de l'hémoglobine ne commence normalement).

Si, avec

5

^g/nil, on obtient déjà une inhibition de

la synthèse de l'hémoglobine après 24 heures sans que la synthèse des RNAs soit influencée, il suffit d'augmenter de très peu (jusqu'à 6 yg/ml) la concentration de puromycine dans le milieu pour obtenir un effet, sans doute secondaire, sur

la synthèse des RNAs (fig.

2

). Aux plus fortes concentrations,

ce phénomène s'accentue.

59

L'incorporation du ^Fe dans 1'hème est également dimi­ nuée en présence de puromycine, bien que le taux d'inhibition soit nettement moindre que celui observé pour la synthèse de l'hémoglobine totale. 6 yg/ml de puromycine n'inhibent la synthèse de l'hème, mesurée par l'incorporation du fer, que

de 10 à 20 Avec 8 yg/ml, l'inhibition est de 60

^

si le

traitement débute au stade

7

» elle est moindre si le traitement

débute plus tardivement. Une inhibition comparable est obtenue 59

pour le ^^Fe "non-hème" contenu dans le résidu protéique après extraction de l'hème.

Les points importants qui ressortent de cette série

25.

A

B

Stades

Fig.2. Pourcentages d'inhibition par rapport aux témoins de la synthèse de l'hémoglobine,

des autres protéines et des acides ribonuclé- iques dans l'aire vasculaire cultivée in vitro

pendant

2k

h. à partir des stades 7» 8, 9 et

7 8 9 10 11 Stades 8 9 10

Fifc. 3 ■ Pourcentage d'inhibition de l'incorporation de 59pe dans 1'hème et dans les protéines de

l'aire vasculaire à différents stades. Concentrations de puromycine utilisée ;

A

i

8 y g/inl

B s 10 y g/ml.

3

Planche__1. Incorporation de leucine- H dans les érythroblastes

des îlots sanguins de l'aire vasculaire. Autoradiographie. A. Témoin, B. Traité s explantat incubé sur agar additionné

27.

4. Erythroblastes cultivés in vitro.

Au cinquième jour du développement, les erythroblastes 3 incorporent les précurseurs des acides nucléiques s thymidine- H,

3 3

cytidine-'^H et uridine-’^H (Planche 2). Dès le début du sixième jour, la maturation de ces cellules en érythrocytes s’accompa­ gne d'un arrêt quasi total de ces incorporations, donc de la

synthèse des acides nucléiques. Par contre, l'incorporation

3 3 3

d'acides aminés radioactifs (glycine- H, valine- H, leucine- H, lysine- C, arginine-'^H) témoigne d'une continuation des synthè­ ses protéiques dans toutes les cellules sanguines du cinquième au quatorzième jour du développement. Ce net décalage observé entre la période de la synthèse des acides nucléiques et celle de la synthèse des protéines nous a permis d'agir sélectivement sur l'une ou l'autre de ces synthèses lors du traitement par la puromycine.

Les érythroblastes cultivés in vitro se sont avérés beaucoup plus sensibles à la puromycine que l'embryon entier. En effet, aux concentrations supérieures à 2 y g/ml, on observe des phénomènes de toxicité, notamment des pycnoses. C'est pourquoi les concentrations de 0,5. 0»75» 1»5 et 2 y g de puromycine /ml ont été choisies pour étudier les effets de cette substance sur l'incorporation des divers précurseurs.

a) Résultats autoradiograghigues et mesures de la radioactivité globale au compteur à scintillation.

- Incorporation d'acides aminés.

Nous avons étudié l'incorporation de trois acides

3 3 3

aminés neutres i la leucine- H, la valine- H et la glycine- H; et celle de deux acides aminés basiques : la lysine- C et 1 ' arginine-'^H. Les résultats, qui sont résumés dans les figures 4 et 5 » sont exprimés en pourcentage d'inhibition de l'incorporation d'un acide aminé par rapport au témoin; ils montrent que la synthèse protéique est active dans des

Planche 2. „

A ; Incorporation de thymidine-'^H dans les érythroblastes de

sang d'embryons de 5 J»

17

h,; durée d'incorporation : 1 h.

3

B ! Incorporation d'uridine- H dans les érythroblastes de

sang d'embryons de J» 17 h.; durée d'incorporation: 3 h. 3

C s Incorporation de valine--^H dans les éry throblastes de sang d'embryons de 11 jours. Témoin.

D : Idem C. Traité par 1 yg de puromycine/ml. Durée de traitement s 3 heures.

t..^

A* *

.

O

*

P

)

28. bis

Inhibition de l'incorporation de la lysine- C en présence de puromycine à la concentration de 0,75 Vi g/ml

Témoin. Traité.

Durée de traitement : 3 heures,

de g j.

17

h.

’jo

d'inhibition

Fig .4. Pourcentage d'inhibition de l'incorporation _ des acides aminés neutres ; A, leucine-^H; B, valine-*^H

C, glycine-^H; ^ 0,5 U g

WA

0,75 U g ^ et 1 ug de puromycine/ml, ^ d'inhibition 100 -A Oeufs de 13 j B Oeufs de 7 j 1 h 4 h 30 min durée du traitement

Fig.5. Pourcentage d'inhibition de 1' acides aminés basiques, A : lysine-^^

doses de puromycine s 0,5, 0,75 1 gauche à droite). incorporation des C; B, Arginine-^H; y g/ml (de autant,

30

- Incorporation de nucléosldes.

Les mêmes concentrations de puromycine ont

été

uti­

lisées que dans les expériences précédentes, les durées de traitement variant de 45' à 4 h. Le sang a été prélevé à

des embryons qui avaient été incubés pendant 5 jours

17

heures.

Trois nucléosides ont été utilisés comme précurseurs, avec

3 3

une radioactivité de 20 yc/ml, la cytidine- H, l'uridine- H 3

et la thymidine- H. Si l'incorporation globale de la cyti­ dine ne paraît pas être inhibée, on observe une légère dimi­

nution (environ 20 de l'incorporation de l'uridine dans

le RNA en présence de 0,75 yg/ml. Après un traitement de

4 h. par 1 yg/ml, l'inhibition est de

30

^ (Figure 6).

Après extraction du RNA au phénol, on observe une inhibition

spécifique globale de ''^

50

^ et de 80 ^ avec des concen­

trations de puromycine de 1,5 et de 2 yg/ml respectivement.

9^ inhibition 1001 -20 -2 h 30 min durée de traitement,

Fig,6. Pourcentage d'inhibition de l'incorporation

d ' ur idine--^H dans le sang d'embryons de

5

j-

17

,

5

yg de puromycine ^So

,75

yg/ml de puromycine

®1 y g de pur omycine/ml.

L'incorporation de la thymidine- H est plus fortement inhibée par 1 yg/ de puromycine/ml (après 4 h, l'inhibition

est d'environ

50

à

70

^),

Des contrôles autoradiographiques parallèles à

ils et de confirmer les effets inhibiteurs de la puromycine;

ne semblent pas être plus intenses dans le noyau que dans le cytoplasme.

b) Séparation des différents types de RNAs et mesure de leur radioactivité spécifique.

Les résultats sont illustrés par les graphiques

(Figures 7s 8 et

9

) ©1 1© Tableau 1,

Fig,7. Effets de 1 y g/ml de puromycine sur les différents types de RNAs extraits au phénol et

séparés en gradient de sucrose

5

©. 20 9^, Densité

optique

s A_ _ _ _ _ _ Aj

puromycine;»---• témoin. Radio­

activité (mesure de l’incorporation d'uridine-^n)

exprimé en coups par minute

s

x---x puromycine;

■0

témoin.

32.

500 e D. ê vü .s •O

100

Fi^

0

8

> Effets de 1,5 puromycine/ral sur les

différents types de RNAs extraits au phénol et

séparés en gradients de sucrose 5

^

20

^

(légende

t

'Concentration 'puromycine

' ( yg/ml

' Pourcentage inhibition correspondant aux

' pics f 1 ' 28 S ' (rib.lourd)

16

s '

(rib.léger) ' 4 S RNA de transrert

t 1 f ' 1 t 1 ' 44 t 36 Pas d'effet 1 1 1 ’ 1,5 t ' 50

1

43,5 23 1 1 ' 2 t ' 7^ t 3,2 90 t t

Tableau 1 ; Pourcentage d'inhibition de la radioactivité spécifique de chaque pic de RNA séparé par centrifugation en gradient de sucrose.

34.

La courbe de densité optique à 260 my n'est générale­

ment pas modifiée par un traitement à la puromycine ou une concen­ tration de 1 y g/ml ; tout au plus observe-t-on occasionnelle­

ment une légère augmentation du pic 16 S aux dépens du pic 23 S. Si on considère la radioactivité spécifique, calculée pour

chaque pic de RNA (tableau l), on observe une inhibition d'environ 50 ^ au niveau du RNA ribosomial 28 S et d'environ 30 ^ au niveau du RNA ribosomial 16 S. La radioactivité du pic 4 S n'est pas modifiée par cette concentration de puromy- c ine .

L'augmentation de la concentration en puromycine (à 1,5 yg/ml) dans le milieu de culture accentue, comme on pouvait s'y attendre, le pourcentage d'inhibition de l'incorporation de

l'uridine dans les différents RNA (28 S, 16 S et 4 S); toutefois, l'existence d'une incorporation résiduelle démontre que l'inhi­ bition est loin d'être complète. L'augmentation du pic 16 S par rapport au pic 28 S est plus marquée et plus constante qu'avec 1 yg/ml; le pic 4 S n'est toutefois pas sensiblement

modifié (cf. fig. 9)» 0*1 peut en conclure que l'inhibition

3

de l'incorporation de l'uridine- H s'effectue sans qu'il se produise une dénaturation considérable de RNA ribosomial en RNA de poids moléculaire plus faible.

Lorsqu'on augmente la concentration de puromycine jusqu'à 2 yg/ml, la proportion entre les pics 28 S et 16 S est rétablie (fig. lO); mais la forte augmentation du pic 4 S témoigne probablement d'une dégradation de RNA ribosomial en RNA plus léger; en effet, elle ne s'accompagne pas d'une augmentation parallèle de la radioactivité spécifique du pic 4 S. Le niveau extrêmement bas de l'incorporation de

3

C. Discussion.

S'il existe souvent, aux concentrations de puromycine dépourvues d'effets cytotoxiques (6 à 10 y g/ml), un certain délai avant l'apparition des synptômes de l'inhibition, ce n'est dû, apparemment, qu'au délai requis pour la pénétration de cette substance dans l'aire vasculaire ou dans l'embryon entier. Nous en voyons une preuve dans le fait que des éry- throblastes incubés in vitro sont plus rapidement sensibles à la puromycine que l'embryon cultivé sur un milieu à l'agar. Dès lors, le fait que la synthèse de l'hémoglobine se déclenche en présence de puromycine pourrait être dû à cette latence. Toutefois, même de fortes concentrations de puromycine pendant des temps prolongés n'inhibent pas complètement la synthèse de l'hémoglobine, sauf aux très jeunes stades; ce fait semble indiquer que la synthèse des enzymes et des précurseurs de l'hémoglobine (la globine, en particulier) débute à un stade précoce. Une inhibition considérable de la synthèse protéique n'est obtenue qu'au prix d'effets secondaires au niveau,

notamment, des acides nucléiques; cette circonstance complique l'interprétation des résultats, que l'on peut difficilement attribuer uniquement à l'inhibition de la synthèse protéique.

Dans un premier temps, cependant, aux concentrations

faibles

(5

yg/ml pour l'embryon entier et

0,5

yg/ml pour les

érythroblastes cultivés in vitro), l'effet de la puromycine se limite à une inhibition de la synthèse protéique; cette inhibition semble d'ailleurs être sans spécificité, atteignant autant l'hémoglobine que les autres protéines; elle porte autant sur l'incorporation des acides aminés basiques que sur celle des acides aminés neutres (valine, glycine, leucine). Il est donc vraisemblable que la synthèse des protéines basi­

ques s'effectue de la même manière que celle des autres protéines cellulaires s mais rien n'exclut la possibilité que les unes

36

De toute manière, les acides aminés basiques entrent dans la composition d'autres protéines que les histones (et notamment dans la globine) j l'inhibition de leur incorporation n'est

donc pas directement assimilable à une inhibition de la synthèse

des histones

0

II serait donc utile de compléter cette étude

par une extraction et une séparation des histones nucléaires qui ont incorporé des acides aminés basiques, en la présence

et en l'absence de puromycine.

5

9

La puromycine inhibe l'incorporation du Fe dans l'hème. Il peut s'agir d'un effet secondaire résultant soit de l'inhi­ bition de la synthèse de la globine, soit de celle des enzymes de synthèse de l'hème. Dans le premier cas, il existerait un mécanisme de contrôle réciproque, de telle sorte que l'inten­

sité de la synthèse de la globine influence celle de l'hème,

et vice versa. En effet, les travaux de Bruns et London (

1965

)

ont démontré que l'addition d'hème stimule la synthèse in vitro de globine; nos résultats suggèrent qu'il existe une certaine réciprocité dans le mécanisme de contrôle, que Bruns et London

identifient à une dérépression du site génomique spécifique. Granick et Levere (1964) imaginent que la globine ne quitterait pas les polysomes sans la présence de l'hème, tandis que Colombo

et Baglioni (

1966

) pensent que l'hème et la globine se combinent

librement dans le cytoplasme, indépendamment des polysomes.

Il existe donc une controverse concernant le niveau de contrôle (transcription ou traduction) des proportions d'hème et de

globine; nos résultats ne permettent pas de la trancher. Il n'est pas exclu non plus que l'effet observé à propos de l'in­ corporation du fer soit le résultat de l'inhibition secondaire de la synthèse des RNAs, puisque nous n'obtenons aucun effet

avec

5

<^6 puromycine/ml.

59

Nous avons observé une légère incorporation de Fe dans les molécules "non-hème" et insolubles dans le TCA; elle peut s'expliquer par une synthèse de ferritine qui, selon

Grasso et al. (

1962

), précéderait celle de l'hémoglobine dans

toutes les cellules hématopoiétiques. Cette synthèse est éga­ lement inhibée par la puromycine, ce qui implique qu'il ne

Tant que l'effet de la puromycine se limite à un

ralentissement des synthèses protéiques, son influence semble être sans spécificité, tant en ce qui concerne l'inhibition morphostatique - qui atteint également toutes les régions de l'embryon, que les synthèses protéiques. Dès qu'on dépasse le seuil où on observe un effet secondaire au niveau des RNÂs, on voit apparaître une certaine sélectivité d'effet ? ce sont les somites qui sont tout d'abord atteints et déformés; le système nerveux présente bientôt des anomalies diverses, dont le caractère semble dépendre du stade précis où le traitement a commencé. Bien que sa formation soit inhibée en présence de puromycine, l'aire vasculaire se développe plus facilement

que toutes les autres régions de l'embryon. On peut conclure qu'initialement il doit exister des différences plus profondes entre les mécanismes de contrôle régissant la transcription

(synthèse de RNAs) qu'en ce qui concerne la traduction (syn­ thèses protéiques), puisque l'effet différentiel de la puromy­ cine n'apparaît qu'au moment où les RNAs sont affectés.

On peut se demander pourquoi l'inhibition des synthè­ ses protéiques est suivie d'une inhibition de la synthèse de RNA. L'analyse biochimique nous a permis de démontrer qu'une

dose de 1 yg/ml de puromycine/ml suffit pour inhiber de façon préférentielle la synthèse des acides ribonucléiques ribosomiaux dans les érythroblastes, L'inhibition est de l'ordre de 50 ^ pour le RNA 28 S et de 30 pour le RNA 16 S. C'est cet effet initial et sélectif qui nous intéresse; en

effet, lorsqu'on double la concentration de la puromycine

(2

yg/ml), l'inhibition touche toutes les formes de RNA et elle

devient quantitativement plus importante; mais on assiste alors à une dégradation progressive des RNA ribosomiaux en RNAs de faible poids moléculaire (ce qui pourrait indiquer un besoin de protéines stabilisantes pour maintenir l'inté­

grité des RNa).

38

épuisé, le RNA ribosomial ne serait plus synthétisé» Les

travaux de Perry (

1965

) soulignent, en effet, l'importance

de l'addition de la partie protéique aux acides ribonucléiques lors de la formation des ribosomes. Il est intéressant à

cet égard de citer un travail de Bosseler et coll. (1964) s dans les racines d'Allium cepa, on observe, en présence de

puromycine, une inhibition de

50

^ de l'incorporation de deux

acides aminés (la phénylalanine et la lysine) dans la fraction

des ribosomes et polysomes. Monier (

1966

) a signalé toutefois,

que dans les organismes supérieurs, il existe généralement une réserve assez importante de protéines ribosomiales et que la synthèse de RNA ribosomial ne nécessite pas, de ce fait, une synthèse concomitante de protéine. Utilisant la cyclo- heximide comme inhibiteur de la synthèse protéique, Warner et

al. (

1966

) ont démontré que, dans les cellules Hela, la quantité

de protéine disponible n'est suffisante que pour permettre la maturation des ribosomes pendant 1 à 2 heures. Notons simple­ ment que, dans les érythrocytes, dès que la synthèse de l'Hb

commence, on assiste à une dilution apparente du nombre de ribo­

somes dans le cytoplasme (Orasso et al.,

1962

) s au moment où

le nucléole se fragmente et disparaît, la synthèse des ribosomes s'arrête. Il est vraisemblable qu'en empêchant la synthèse de l'Hb, la puromycine accélère ce processus normal. Un même type d'effet a toutefois été observé dans des cellules dont le noyau ne perd pas son activité métabolique au cours du cycle

normal de la cellule s Tamaoki et Mueller (

1965

) signalent,

en effet, une inhibition sélective par la puromycine de la synthèse des RNA ribosomiaux 28 S et 16 S dans les cellules

Hela. Chez les bactéries, Sells (l963> I

965

) signale une

accumulation, par contre, de RNAs ribosomiaux en présence de puromycine.

stables, des mécanismes de contrôle coexistent encore tant en ce qui concerne la transcription que la traduction. Rappelons que, au cours de ces expériences, nous avons pu constater

l'incorporation d'acides aminés dans toutes les cellules san­ guines, à tous les stades de la maturation, dans le sang

d'embryons de 5 à. l4 jours. On sait que ces cellules ont une

durée de vie moyenne d'environ 9 jours

5

le mRNA pour l'Hb

pourrait donc être stable pendant plusieurs jours. Il reste à établir, cependant, quelle est la proportion de l'Hb qui se synthétise après que toute synthèse de RNA ait cessé. On sait que, dans les réticulocytes, la synthèse d'Hb ne correspond

qu'à 5 ou 10 <1® l'Hb totale de l'érythrocyte adulte; il en

est probablement de même pour les érythroblastes embryonnaires. Remarquons, enfin, que la puromycine inhibe

l'incorpora-O

tion de la thymidine-*^H. D'autres auteurs (Legros, I

9651

Gottlieb et al., 1964 « Lieberman et al„, I

9635

Baserga et al.,

19655

Bloch,

1966

) ont déjà constaté le même phénomène. Bloch en conclut qu'une synthèse nouvelle de protéine est essentielle

pour que la synthèse du DNA continue et Maaljz^e (

196

I) est arrivé

à la même conclusion pour les bactéries. Ce problème mérite d'être approfondi.

II. QUELQUES EFFETS DE L'ACTINOMYCINE.

Nous avons constaté une augmentation de la stimulation de.

l'incorporation de la lysine due à l'acide polyadénylique en pré­ sence d'actinomycine (voir p.73)« D'autre part, plusieurs auteurs ont

signalé que l'inhibition de la synthèse de RNA s'accompagne rapidement d'une inhibition de l'incorporation de la lysine dans le noyau (Honig et Rabinovitz, 1964) et, plus précisément,

dans le nucléole (Suskind, I

965

). Etant donné l'absence d'un

40

différence éventuelle entre la synthèse des histones et celle

des autres protéineso

AO Matériel et Méthode„

Cette étude a été effectuée sur l'aire vasculaire désembryonnée de jeunes embryons de poulet, coupés en deux au moment de l'explantation, les deux fragments du même embryon

servant chaque fois l'un de témoin, l'autre de traité. L'in­ corporation de lysine-^^C a été mesurée au compteur à scintilla tion, après avoir fait précipiter et délipider la fraction

acido-insolubie de la manière indiquée précédemment (p,

2

l),

3 3

L'incorporation de l'uridine- H et de valine- H a egalement été mesurée. Les résultats rapportés ci-dessous sont basés sur trois expériences,

B O Résultats,

Après 24 heures, l'inhibition de l'incorporation de la lysine-^^C est relativement importante (- 60 à -80 à la

concentration (o

,25

Më d'actinomycine/ml) qui semble inhiber

la synthèse des RNAs messagers (cf, chapitres III et IV d), Le degré d'inhibition de l'incorporation de la valine est

nettement moindre que celui de la lysine (-14 à

-36

^),

L'incorporation de la lysine- C est plus intense dans le noyau des jeunes érythroblastes qu'aux stades ultérieurs de

la maturation

s

ci-dessus une photographie de a) Jeune