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Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository
Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:
Brotcorne, A. (1986). Contribution à l'étude de la mutagenèse SOS chez Escherichia Coli. Rôle de la réplication de l'ADN (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.
Disponible à / Available at permalink : https://dipot.ulb.ac.be/dspace/bitstream/2013/213556/3/8b06da89-36cc-4a56-aa23-45821b35118a.txt
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Laboratoire de Biophysique et de Radiobiologie
CONTRIBUTION A L’ETUDE DE LA MUTAGENESE SOS CHEZ ESCHERICHIA COU.
Rô!e de Sa réplication de TAON
Thèse présentée pour l’obtention du grade de Docteur en Sciences (Section Biologie Moléculaire)
Université Libre de Bruxe Les Anne BRüTCORNE-LAMNOYE décembre 1986
y
Certaines propriétés de structure et de réplications caractéristiques du génome des parvovirus pourraient être exploitées pour la fabrication de sondes
moléculaires destinées à prévenir les maladies par
ces virus.
CONTRIBUTION A L’ETUDE DE LA MUTAGENESE SOS CHEZ ESCHERICHIA COU.
Rôle de la réplication de i’ADN
Thèse présentée pour l'obtention du grade de Docteur en Sciences (Section Biologie Moléculaire)
Anne BROTCORNE-LANNOYE
décembre 1986
que ce travail acconpli
leur rende une maman
et une épouse accomplie.
Jean Romme£oene, pnenoni 4a ne£ève, m'a encouAogée e-t
■ioutznaz. Je -£'en nemenc^e y-cvemen-t.
MeAC4 aiiA^i à M-cA04^av Radman dont l'tmagtncUton ioAttlz zt ^ubt-<J.z Aont à l'oniginz de ce tAavoÀZ.
Je 4U44 poAttcultèAzmznt AzconncÛM>antz znozA^ Gznzvtzvz Maznhaut qui m'a.
0^{iZ>it .ion ioutizn zt ia zollaboAation iciznti^i- quz. C'zit zgaizmznt Gznzvizvz, dont j'ai appAZciz £'zipAit cAitiquz, qui m'a aidzz pouA ta Azdaction de zzttz thziz.
Ma gAotitudz va zgatzmznt à PzAAinz Caitizt pouA ia cotta- boAatxon zt ta poAt qu'zttz a pAiiZaux diicuiiiom iciznti^iquzi.
Vani tz domainz de ta gznztiquz, tzi comziti de Michzt Faztzn me iuAznt d'une aÀdz pAzzizuiZ zt appAZcizz.
J'adAZiiz dzi A.zmzAcizmznti aux iZCAZtaiAZi MoAiz-Jzannz, Ctaudinz zt Tatiana -taquzttz aiiuAa avzz zHizasiitè. ta dac.tytogAapkiz de ce tAavait-, acczuittantzi en toutzi ciAccnitanczi, tzuAi iouAiAZi zt tzuA gzntittziiz m' ont iouvzni nzmontz tz. mo^at.
MzAci, zn{iin, à toui ceux qui ^uAznt mzi compagnoni zt
czAtaini mzi amii, duAont czi annzzi de AzchzAchz: Annick, FA.anç.oiiz,
LauAZncz, ChAiitianz, ÛtivzA, Phitippz, Sitvano, MoAtiat, Litianz,
Itiana, Jan, Gznzvizvz, BznnoAd, PizAKZ, Chzn, ChAiitian, Edmond,
PzAcy, ....
I. INTRODUCTION 1 A. LA REPLICATION DE L'ADN CHEZ E. COLI :généralités 3 A.1. L'ADN polymérase III et 1'holoenzyme 4
A.2. Le réplisome d'E. coli 5
B. LE CONTROLE GENETIQUE DE LA MUTAGENESE SPONTANEE 7 BJ. Origine de la mutagénèse spontanée 7 B.2. Fidélité de la réplication de 1'ADN 7
B. 3. Les lésions spontanées 11
C. LE CONTROLE GENETIQUE DE LA MUTAGENESE INDUITE 12
C. 1. Les lésions induites 12
C.2. Les rayons ultraviolets 13
C.3. Réparation des lésions de l'ADN 14 C. 4. La tolérance des lésions dans l'ADN 15
D. LE SYSTEME SOS 17
D. 1. Tiodèle de régulation 17
D.2. Les mutants des gènes recA et lexA
D. 3. Le signal SOS 21
E. LA REPARATION SOS 22
E. 1. Naissance du concept 22
E.2. Mécanisme moléculaire : hypothèse 22 E.3. Gènes impliqués dans la réparation SOS 24 E.4. Analyse biochimique, de molécules d'ADN irradiées aux UV 26
et répliquées in vivo
E.5. UV mutagénèse et ADN polymérases 27
E.6. La spécificité des mutations 31
E.7. Les lésions prémutagènes 34
II. RESULTATS 35
A. CARACTERISATION DE MUTANTS MUTATEURS THERMOSENSIBLES DU GENE 35 polC (dnaE)
A.1.Cotransduction du caractère thermosensible des mutants SG 37 avec le gène metD
A.2. Mesure de la synthèse d'ADN dans les mutants polCts 38 A.3. Complémentation des mutations polCts par le phage 40
dpolC43
A.4. Fréquence de mutation spontanée des mutants polCts 42 A.5. Réplication in vitro du phage 0X174 irradié aux UV 45
par l'ADN poTÿmérase III des mutants polCts
B.1. Article 1: Involvement of DNA polymerase III in UV- 48 induced mutagenesis of bactériophage lambda
B.2. Cinétique de production de phages et d'induction de 54 la mutagénèse UV non ciblée du phage lambda dans
le mutant polC74
B.3. Effet de la mutation polC74 combinée à différents 57 allèles du gène recA sur 1'expression de la mutagénèse
UV non ciblée du phage lambda
B.4. Influence de la mutation polC74 sur l'induction des 59 fonctions SOS
B. 5. L'inhibition de la fonction exo 3'- 5' augmentera 64 survie et la mutagénèse d'E.coli et du phage lambda
irradiés.aux UV
C. ROLE DE LA PROTEINE RECA ET DU GENE dinB DANS LA MUTAGENESE 73 UV NON CIBLEE DU PHAGE LAMBDA
C. 1. Article 2: Rôle of RecA protein in untargeted UV 74 mutagenesis of bactériophage lambda: evidence for the
requirement of the dinB gene
, C.2. Fréquence de réversion de la mutation Ram221 du phage 79 lambda non irradié induite par l'irradiation d'un
hôte dinB~
C.3. Yield of phage lambda by irradiated and unirradiated 81 dinA and dinB strains
C. 4. Mise en évidence d'une intéraction spécifique entre les 83 mutations polC74 et recAl
D. MUTAGENESE UV CIBLEE ET NON CIBLEE DU CHROMOSOME D'E. COLI 86 D. 1. Effet de l'inhibition du système de correction des 86
bases mal appariées
D.2. Effet de la mutation po1C74 88
E. ISOLEMENT D'UN NOUVEAU MUTANT DU GENE recA 94
E.1. Isolment du mutant ABL122 94
E.2. Caractérisation du mutant ABL122 96 E.3. Localisation de la nouvelle mutation portée 104
par le mutant ABL122
III. DISCUSSION GENERALE 105
IV. RESUME 121
V. MATERIEL ET METHODES 123
VI. REFERENCES 155
I. INTRODUCTION
Le programme génétique d'une cellule étant contenu dans l'ADN sous forme de séquence nucléotidique, une alté
ration de celui-ci (mutation, réarrangement) peut conduire à une modification du programme héréditaire qui régit le com
portement et la croissance d'une cellule. De telles altérations du matériel héréditaire se produisent spon
tanément mais peuvent aussi être induites, parfois à très haute fréquence, par des agents physiques ou chimiques dits, pour cette raison, agents mutagènes.
Dans la mesure où les organismes vivant sur notre planète sont constamment, et sans doute de plus en plus, exposés à une grande variété d'agents mutagènes (rayon
nements UV émis par le soleil, produits de l'industrie • chimique, ...)1'étude de la mutagénèse est certainement pertinente . Des évidences de plus en plus nombreuses associent, en effet, les mutations et les réarrangements chromosomiques à certains processus pathologiques tels que l'artériosclérose, le cancer et d'autres maladies, ainsi qu'au processus de vieillissement. Cependant, sous l'angle des théories darwiniennes, les mutations apparaissent sous une forme plus positive puisqu'elles sont la pierre angulaire de l'évolution largement basée sur les principes de diversification et d'adaptation.
De plus, elles sont un facteur important de la diversité
des anticorps.
Face à ces deux exigences contradictoires de la vie sur terre que sont la stabilité et la variabilité génétique, on peut s'attendre à ce que les organismes vivants aient développé des mécanismes permettant de contrôler le taux de mutation. La cellule possède en effet diverses stratégies visant à maintenir intact et à perpétuer fidèlement son patrimoine héréditaire.
Les principaux mécanismes impliqués sont la réplication, la réparation et la recombinaison de l'ADN. Ces
processus complexes sont souvent associés puisque certains types de réparation nécessitent une réplication ou une recombinaison. Cependant, si la plupart de ces mécanismes tentent à diminuer le taux dé mutation, il existe au moins un processus dont l'action a pour conséquence une augmen
tation du taux de mutation. C'est la réparation mutagène SOS.
Au cours de ce travail, nous nous sommes intéressés à la fois au rôle de la réplication de l'ADN (principa
lement au rôle de l'ADN polymérase III) et au rôle de la
protéine de recombinaison RecA dans la mutagénèse SOS chez
Eschérichia coli.
5'
Figure 1 : Complexe "matrice-amorce" en action
adapté de Kornberg, 1980.
A. L A RE PLICATION DE L'ADN CHEZ E. COLI
GENERALITES
Les caractéristiques majeures de l'action des ADN poly
merases de procaryote et d'eucaryote résident dans le com
plexe "matrice-amorce" (template-primer). Lors de la réaction de polymérisation un lien phosphodiester se forme entre
le groupement 3' hydroxyle libre du nucléotide terminal
d'une chaîne d'ADN préexistante, "l'amorce", et le groupement 5' phosphate d'un déoxyribonucléotide.
Le sens de croissance d'une chaîne d'ADN est donc 5'-»- 3'.
Chaque nucléotide ajouté à la chaîne en croissance est
sélectionné en fonction d'une seconde chaîne d'ADN préexis
tante, la "matrice", à laquelle 1'"amorce" est appariée, formant ainsi le complexe "matrice-amorce" (Fig.1).
Les ADN polymérases de procaryotes catalysent plusieurs réactions : i) réaction de polymérisation,
ii) réaction de pyrophosphorolyse, iii) réaction d'échange de pyrophosphate, iv) réaction d'excision dans le sens 3' -»■ 5' et v) réaction d'excision dans le sens 5' -»■ 3'. Les trois premères réactions sont dues à l'activité pôlymérasique.Les deux autres ont lieu en des sites actifs distincts du
site d'activité polymérasique. Selon les polymérases, ces sites actifs sont situés scit sur une même chaîne polypep
tidique (poli) soit sur des polypeptides différents (polIII) (Kornberg, 1982 ; Schuerman & Echols, 1984).
Les trois ADN polymérases d ' E. coli , appelées poli,
polll et polIII dans l'ordre de leur découverte, possèdent
une activité exo 3' ->-5'. Seules les ADN polymérases I et
III possèdent une activité exo 5' ^ 3'.
Composants de l'holoenzyme Pol III
Sous-Unité M gène activité
a 140 dnaE (polC) polymérase
-
t 25 dnaQ exo3'—5' pol III
core
0 10 ? 7
pol iir
T 83 dnaX ?
Y 52 dnaZ ? pol III^
6 32 dnax? ?
e 37 dnaN 7
A.1. L'ADN polymérase III et 1'holoenzyme.
A.1.1. Rôle physiologique.
Contrairement aux ADN polymérases I et II, l'ADN poly
mérase III, dont la sous-unité a porteuse de l'activité poly- mérasique est codée par le gène po1C (dnaE), est essentielle à la viabilité cellulaire (Gefter et al., 1971). Toutes les mutations du gène polC sont conditionnelles et létales dans des
conditions non permissives. L'ADN polymérase III est
l'enzyme du réplisome bactérien (voir A.2). Elle intervient aussi dans une voie de réparation par excision de lésions provoquées par les UV (Young & Smith, 1973, Hanawalt et al., 1981) et dans la réparation postréplicative par recombinai
son (Tomilin et al., 1974).
A.1.2.Propriétés biochimiques .
Le peu de molécules d'ADN polymérase III (10 à 20) par cellule et l'instabilité du complexe dont elle est l'élément central, rendent malaisées les études physiques, chimiques et biochimiques de cette enzyme. Les études biochimiques de l'ADN polymérase III reposent surtout sur l'utilisation par l'enzyme de "matrices" naturelles purifiées,tel 1 es que les ADN viraux et plasmidiques.
E2IIII • l'ADN polymérase III a été isolée et purifiée sous différentes formes qui sont des sous-ensembles de sous- unités de l'holoenzyme (Tableau 1). Ces différentes formes se distinguent par le type de "matrice" qu'elles sont capa
bles d'utiliser, ainsi que par le niveau de leur capacité de synthèse continue (processivity). La purification à l'homo
généité de l'ADN polymérase III active a abouti à l'isolement d'une enzyme, polIII ou polIII core, composée de trois sous- unités, a, e et 0 (Tableau 1) (Mac Henry & Crow, 1979). La sous-unité a (po1C) 140 kd, constitue la composante poly
mères i que. La sous-unité e, 25 kd (dnaQ) porte l'activité
exonucléotidique 3' 5' (Scheuerman & Echols, 1 984).
binding
protein i 66 3] 50 0.5 -
protein n 28 2 primosome 80 0.4 —
protein n' 76 1 assembly and
>-r fonction 70 OJ -
protein n" 17 1 — — —
dnaC 29 1 100 0.2 50
dnaB 300 6 20 0.3 200
primase pollll
60 1 primer synthesis 50 0.2 50
holoenzyme (760) (2) 20 0.5 -
a 140 f - - -
e 25 1 processive chain —
9 10 1 élongation — — —
P 37 1
U
2 ^300“ 0.3 5y 52 1 CM O - 70
S 32 1
T 83 l
pol I 102 1 gap filling. 300 10 70
primer excision
ligase 74 1 ligation 300 10 500
gyrase 400 4 supercoiling - - ■ -
gyrA 210 2 250 40 50
gyrB 190 2 25 4 30
rep 65 1 helicase 50 0.6 10
helicase II 75 1 helicase 5000 1.8 -
dnaA 48 origin of 200 - 50
réplication
"Final yield of purified protein:mg/kg wet weight of nonnal cclls
^Normal cell protein level increased this many times by introducing plasmid or phage containing the gene.
*The stoichiometry of these polypeptides in the primosome is not known: the current estimate ia one of each except for six each of dnaC and dnaB protomers.
^As dimers of ^ subunit
Tableau 2 : Protéines de réplication d'£. coli
extrait de Kornberg, 1982.
Aucun gène ni aucune fonction n'ont encore pu être asso
ciés à la sous-unité 0, 10 kd. PolIII est donc le terme utilisé pour la forme isolée la plus simple de l'enzyme.
polIII core est capable de combler de courtes brèches créées par une nucléase dans une double hélice d'ADN.
Ll!ü2l2§D?^']]§_E9liII • complexe protéique compre
nant de multiples (jusqu'à 13) sous-unités (Mac Henry , 1982), dont polIII (Tableau 1). Après la formation d'une "amorce"
par une primase ou une ARN polymérase, l'holoenzyme peut convertir un ADN de phage monocaténaire en une molécule bicaténaire. Le gène dnaZ dont le produit est la sous-
unité Y> 52 kd, serait une partie du gène dnaX qui code pour la sous-unité 5, 83 kd. Le gène dnaX coderait donc à la fois pour la sous-unité 6 et pour un précurseur de la sous-unité Y (Kodaira et al., 1983, Mullin et al., 1983). La sous-unité
6, 32 kd, pourrait être l'autre partie du produit du gène dnaX (Kodaira, et al., 1983, Mullin, et al., 1983).
L'holoenzyme est la clé d'une unité d'assemblage plus grande encore : le réplisome.
A.2. Le réplisome d'E. col i.
L'origine de réplication du chromosome d'_E. col i
est unique. Elle se situe au site oriC. A partir de ce site deux fourches de réplication se déplacent en sens opposés.
Les nombreuses protéines de réplication (Tableau 2) et les moyens qu'elles utilisent pour déplacer les fourches de réplication sont illustrés dans la Figure 2. La comple
xité de ce processus justifie la notion de réplisome qui résulterait de l'intégration de ces protéines en une structure, stable in vivo , comparable en complexité et de par sa fonction au ribosome. Cependant, au vu des
difficultés que présente l'isolement d'un réplisome, celui-
ci serait moins stable et plus grand que le ribosome.
réplication bidirectionnelle du chromosome d'Escherichia
coli (Extrait de Kornberg, 1982).
Les éléments nécessaires à l'établissement d'un modèle de fonctionnement d'une fourche réplicative (Figure 2)
proviennent du développement de systèmes de réplication in vitro d'ADN circulaires monocaténaires de petits phages (M13, G4, 0X174). Ces phages ont un contenu génétique limité et, en conséquence, utilisent les protéines de réplication de leur hôte pour répliquer leur propre ADN.
Grâce à la disponibi1ité de mutants thermosensibles de la réplicationjdes fonctions spécifiques ont pu être attribuées à une vingtaine de polypeptides nécessaires à la conversion d'un ADN viral monocaténaire en ADN bica- ténaire (Tableau 2).
L'initiation de ce processus de conversion fait intervenir plusieurs protéines. Celles-ci s'assemblent dans un ordre et en un site déterminés sur la "matrice" en un préprimosome Ensuite une. primase s'adjoint au préprimosome, formant ainsi le primosome. Le primosome synthétise une "amorce".
Durant l'élongation de cette "amorce" par 1'holoenzyme, le primosome reste associé à la fourche réplicative. Une ou plusieurs hélicases déroulent la double hélice en amont du primosome.
En résumé, le réplisome d'£. coli se composerait donc, à chaque fourche réplicative, d'une ou plusieurs hélicases, d'un primosome et d'une molécule d'ADN polymérase dimérique pour permettre la réplication simultanée des deux fibres complémentaires de la double hélice.
L'intégration des protéines de réplication en un réplisome tel que nous l'avons décrit présente l'avantage important d'une diminution du coût temporel et énergétique du pro
cessus de réplication. En effet, elle évite une activation répétée de l'enzyme sur le brin discontinu et coordonne les actions du primosome et de la polymérase (Kornberg, supp.
1982).
MUTAGENESE SPONTANEE
B.1. Origines de la mutagénèse spontanée.
Les mutations spontanées résultent principalement d'erreurs commises par les ADN polymérases au cours de la réplication de l'ADN. Cependant des altérations spontanées de l'ADN, si elles ne sont pas réparées, peuvent également engendrer des mutations.
Plusieurs travaux suggèrent en effet, que l'ADN se dégrade à une vitesse significative in vivo (Lindahl , 1 979 , Rydber
& Lindahl, 1982, Lindahl, 1982, Brùynninckx et al., 1978).
La cellule dispose de mécanismes de réparation spécifiques de ces dommages (Lindahl, 1982).
B.2. Fidélité de la réplication de l'ADN.
B.2.1. Rôle des ADN polymérases.
Les ADN polymérases participent activement à la
fidélité de la réplication de l'ADN. Elles ont la capacité de sélectionner les nucléotides triphosphates (dNTPs)
complémentaires à la matrice qu'elles répliquent (sélection de base). En outre, en cours de synthèse, la fonction exonucl éol i ti que 3' -*■ 5' associée excise sélectivement les nucléotides monophosphates (dNMPs) non complémentaires (activité de " proof rea d i ng " ) (Brutlag &. Kornberg, 1 972).
L'existence de ces fonctions de fidélité
propres aux ADN polymérases est étayée par une série de résultats expérimentaux :
(1) Certains mutants mutateurs ou antimutateurs du bactério phage T4 sont mutés dans le gène de structure de l'ADN
polymérase du phage. Parmi ceux-ci on distingue des
mutants affectés dans la (les) fonction(s) de sélection
de base (Reha-Krantz & Bessman, 1981, Hershfield, 1973,
Gillin & Nossal , 1 976) et d'autres dont l'activité
exo 3' 5' est diminuée (mutants mutateurs) ou augmentée (mutantsantimutateurs) par rapport à l'activité polymé- rasique (Muzyczka et al., 1972, Gillin & Nossal, 1976, Ko-Yu-Lo & Bessman, 1976, Reha-Krantz & Bessman, 1977).
(2) Des mutants mutateurs d'ADN polymérase
ont été identifiés chez Bacillus subtillis (Bazil & Cross, 1973), chez Salmonella thyphimurium (Engler & Bessman, 1 978) et chez £. col i . Chez c.ol i il existe des mutants mutateurs affectant les gènes codant pour l'ADN polymérase I (mutant polA) (Siegle & Vaccaro, 1978) et l'ADN polymérase III (mutants polCts
ou dnaE ts) (Hall & Bramar, 1973, Sevastopoulos et al., 1977, Konrad, 1978). Les mutations polA augmentent
exclusivement les mutations par décalage du cadre.de lecture.
(3) Il a été montré récemment que les mutations mutatrices mutPS (Degnen & Cox, 1974) et dnaQ 49
(Horiuchi et al., 1978) réduisent spécifiquement l'activité exo 3' - 5' associée à l'ADN polymérase III (Echols et al., 1983). Ces deux mutations sont situées dans le même gène (dnaQ), qui code pour la sous-unité e de
l'ADN polymérase III (Scheuerman et al., 1983 ,cf.Tableau 2).
(4) La fidélité de réplication in vitro par l'ADN poly
mérase I est réduite lorsque l'expérience est menée
dans des conditions où l'activité exo 3' - 5' est inhibée (Bryne et al., 1977 , Que et al., 1 978 , Kunkel et al., 1981a).
(5) La fréquence d'erreur d'incorporation en un site donné, mesurée in vitro, est fonction, d'une part, du rapport
des concentrations en nucléotides corrects et incorrects (Fersht, 1979) et, d'autre part, de la concentration en dNTP complémentaire à la base suivant le site en question, dans le sens de la réplication (Kunkel et al., 1981b).
(6) La réaction d'échange de pyrophosphate pourrait être le siège d'un mécanisme de sélection de base (Lecomte et al., 1 986 ). Ces auteurs montrent que le taux d'échange de pyrophosphate entre un dNTP et un
pyrophosphate (PPi) exogène radioactif est plus élevé
pour un nucléotide non complémentaire que pour un nucléotide complémentaire. De plus une diminution de la concentration en PPi par addition d'une pyrophosphatase ou d'un analogue non métabol i sabl e du PPi dans un milieu réacti onnel_, i nh i be
la synthèse de 1'ADN et diminue la fidélité de la réplication (Lecomte étal., 1986).
B.2.2. Rôles des protéines de réplication associées.
Certains mutants ssb~ présentent un faible caractère mutateur (Lieberman & Witkin, 1983). La protéine SSB
(Fig.2. et Tableau 2) est nécessaire à la réplication du chromosome bactérien (Meyer et al., 1979). In vitro cette protéine augmente la fidélité des ADN polymérases pourvues et dépourvues d'exo 3' 5' (Kunkel et al., 1 979 ). Son
action porterait soit sur la fonction de sélection de base, soit sur la structure du brin modèle. En se fixant à l'ADN simple brin présent au niveau de la fourche réplicative, elle pourrait empêcher des modifications de conformation des bases. Certains états conformationnels des bases sont supposés responsables de mutations spontanées (Drake
& Baltz, 1976). La protéine SSB est également impliquée dans les processus de réparation de l'ADN (Glassberg et al., 1979, Vales et al., 1980, Lieberman & Witkin, 1983), de recombinaison de l'ADN (Glassberg et al., 1979, Cox et al., 1983 ) et d'induction des fonctions SOS (Baluch et al., 1980, Resnick & Sussman,1982, Lieberman & Witkin, 1983).
Le gène 32 du bactériophage T4 code pour une
protéine semblable à la protéine SSB d'^. coli. Les mutants du gène 32 présentent un caractère mutateur in vivo (Bernstein et al., 1 972). Comme la protéine SSB d'£. coli , la
protéine 32 de T4 augmente la fidélité de réplication de l'ADN
in vitro (Liu et al., 1978, Topai & Sinha , 1983).
D'autres mutants de protéines de réplication du phage T4 augmentent la fréquence de réversion spontanée de mutations amber (Watanade & Goodman, 1978, Mufti, 1979).
Le gène mutateur m utT d'^. col i augmente spécifiquement la fréquence des transversions AT -> CG. Son mécanisme d'action n'est pas connu mais on sait que son expression nécessite la réplication de l'ADN et qu'il interagit. avec le gène po1C (Cox, 1976, Ray, 1978).
B. 2.3. La correction postréolicative des bases malappariées.
En plus des fonctions de sélection de base et de
"proofreading", qui opèrent au cours de la réplication, un troisième processus, postréplicatif, contribue à la fidélité de la réplication de l'ADN. C'est le système de correction des bases mal appariées. Il augmente la fidélité de la ré
plication d'environ trois ordres de grandeur (Radman et al., 1 979). Il requiert les produits des gènes mutH, mutL, mutS et mutU (uvr E) qui avaient été identifiés comme gènes muta- teurs (Cox, 1976, Never & Spatz, 1975, Rydberg, 1978,
C-lickman & Radman, 1980 , Lu et al., 1 983 , Pukkila et al., 1983). Il procède par excision et resynthèse localisée ('//i 1 denberç & Messelson, 1 975 , Lu et al., 1983).
La reconnaissance du brin néo-synthétisé par les enzymes de correction est guidée par la sous-méthylation transitoire des séouences 5'-G-A-T-C-3 ' de ce brin (Radman et al., 1 980 , Pukkila et al., 1983). La méthylation sur l'adénine de ces
séquences signal dépend du çftne dam qui code pour une méthylase.
Les mutants dam sont mutateurs (Marinus â Morris, 1 975 , Cox, 1976) et plus sensibles aux analogues de base et aux rayons UV (Rydberg, 1977 et 1978, Glickman et al., 1978, Glickman & Radman, 198D) qu'une souche sauvage, dans la mesure où les enzymes de correction incisent indifféremment
le brin néo-synthétisé ou le brin parental. Il a été montré récemment qu'en absence de méthylation, le système de cor
rection détruit les molécules d'ADN contenant des paires
de bases malappariées (Doutriaux et al., 1986).
B.3. Les lésions spontanées.
Les lésions spontanées de 1'ADN sont la conséquence de la nature intrinsèque de 1'ADN ou d'interactions inévi
tables avec le milieu intracellulaire. A 37°C et à un pH physio- -logique, 1 'ADN subit j_n vivo des dépur i nati ons, des
dépyrimidinations, des déaminations, ainsi que des ouvertures de cycle (Lindahl, 1979). D'autre part des alkylations
et des oxydations sous l'action de constituants cellulaires ont été mises en évidence (Rydberg & Lindahl, 1982, Lindahl, 1982).
Ces lésions sont éliminées par des enzymes de réparation exprimées à un niveau constitutif nécessaire et suffisant
(Lindahl, 1 982). Par exempie,1'uracile présente dans 1'ADN suite à la déamination spontanée de la cytosine ou à
l'incorporation de d UTP par les ADN polymérases,est excisée par une enzyme spécifique : 1'uracile DNA glycosylase.
Les mutants ung~ , déficients en uracile DNA glycosylase, ont un caractère mutateur jji vivo (Duncan & Miller, 1 978).
De même le mutant nthA présente un caractère mutateur spontané (Cunningham & Weiss, 1984). Ce mutant est déficient dans
l'activité endonucléase III, qui reconnaît les produits d'oxydation de la thymine (Gates & Linn, 1977, Breimer &
Lindahl, 1984). D'autres glycosylases spécifiques reconnaissent diverses altérations spontanées et induites de l'ADN (Tableau 3)
(Lindahl, 1982, Friedberg, 1985).
La nature des lésions spontanées de l'ADN n'est pas nécessairement différente de celle des lésions induites.
Par exemple certains composés chimiques, comme l'acide nitreux ou le bisulfite de sodium, peuvent induire la
déamination de la cytosine en uracile (Singer & Kuszmiereck ,
1982). Les mécanismes de réparation des lésions spontanées
ne sont donc pas systématiquement distincts de ceux agissant
sur des lésions induites. C'est pourquoi nous passerons
très brièvement en revue ces mécanismes dans le chapitre
suivant (C), qui traitera de la mutagénèse induite et de son
contrôle génétique.
C. LE CONTROLE GENETIQUE DE LA MUTAGENESE INDUITE
C.1. Les lésions induites.
On a coutume de classer les agents mutagènes en
agents indirects ou directs selon que leur effet mutagène dépend /ou non de l'induction de gènes spécifiques, en particulier les gènes recA, 1exA, et umuD/C. Cependant la plupart des agents qui endommagent 1'ADN engendrent un spectre de dommages comprenant à la fois des lésions directement
mutagènes et des lésions indirectement mutagènes. Certains agents sont donc à la fois directs et indirects, comme
par exemple, la nitrosoguanidine (M-NNG).
Les lésions directement mutagènes sont des modifications de bases qui altèrent les propriétés codantes de celles-
ci, mais n'empêchent pas leur copie par les ADN polymérases.
Les agents directs ou à tendance principale directe
produisent généralement des spectres de mutations très spé
cifiques.
Par exemple, les agents déaminants comme 1 'hydroxylami ne et le bisulfite, qui provoquent la déamination de la
cytosine en uracile, provoquent des transitions G-C ->■ A-T (Singer & Kuszmiereçk, 1982). Les agents alkylants , comme l'EMS, qui produisent del'O- méthylguanine, induisent
également des transitions G-C A-T (Abbot & Saffhill, 1 979 ).
Les lésions indirectement mutagènes sont des alté
rations de bases ou de la structure de la double hélice
(par exemple des ponts inter-ou intracaténaires) qui
bloquent la progression de la fourche réplicative.
\
tu^r «
photphsM tugir ■
\ /
Figure 3 :
• N
/
„/o
• N
/■
H
>
\
C=sO- .N
\
=<
C = 0
\
tuçsr <
hi/ / -
— ■ phosphate sugar •
\ /
•N.
N : H O II c
■<
I
H
C=0
‘CH,
'^C=0
CH,
, \ ^CH3
eyclobutyl ring
TC (6-4) Product
Représentation de la formation et de la structure chimique d'un dimère de thymine B) Structure chimique du photoproduit thymine-
cytosine (6-4),
Leurs effets mutagènes, qui se manifestent soit au site même de la lésion bloquante, soit en d'autres endroits, nécessitent la mise en action d'une fonction cellulaire: la mutagénèse SOS (voir C.3). Les spectres de mutation présentés par les agents mutagènes indirects ou principalement indirects sont généralement peu spécifiques. Les UV, par exemple,
induisent des transitions, des transversions et des décalages du cadre de lecture (Miller, 1985). Les principaux agents mutagènes indirects sont les rayons UV et de nombreux
cancérogènes chimiques comme la mitomycine C, le benzo (a) pyrène, ou l'aflatoxine B1.
C.2. Les rayons ultra-violets.
Le rayonnement UV de 254 nm fut le premier traitement utilisé dans l'analyse des réponses cellulaires aux
dommages formés dans l'ADN et est probablement encore l'agent mutagène le plus étudié. Le rôle biologique des UV
est important dans la mesure où les organismes vivant sur terre sont soumis aux effets génotoxiques des rayons UV émisparlesoleil.
Les UV provoquent la formation d'un spectre de lésions dans l'ADN (Wang, 1976). Les plus répandues sont les
dimères de pyrimidine de type cyclobutane et les lésions Py (6-4) pyo (Fig.3). Aux doses modérées de radiations UV, les dimères cyclobutane sont plus fréquents dans les séquences T-T, moins fréquents dans les séquences
T-C et C-T et très peu fréquents dans les séquences C-C (Haseltine, 1983).
Les lésions (6-4) se forment surtout dans les séquences T-C (Lippke et al., 1981. Ces deux types de lésions ont une importance physiologique. Les premières sont
à la fois inductrices des fonctions SOS et mutagènes. _ Les secondes ne sont pas inductrices par elles-mêmes
mais sont mutagènes lorsque le système SOS a été déclenché
(Haseltine, 1983).
REVERSION
Transalkylation méthyltransférase
f
Figure k. Schéma des processus de réparation de l'ADN.
Les fibres d'ADN néosynthétisées sont représentées par des
traits interrompus et des lignes ondulées.
C.3. Réparation des lésions de l'ADN.
La Figure 4 reprend les nombreux mécanismes permettant aux cellules de survivre aux effets létaux et, dans beau
coup de cas, d'éviter les effets mutagènes des
dommages spontanés et induits de l'ADN. Ces mécanismes comprennent des réparations vraies et des processus visant à rendre tolérables certaines lésions. Les réparations vraies restaurent fidèlement l'information génétique
initiale. Elles ont été largement décrites (pour Revue : Friedberg, 1985), et ne seront que brièvement rappelées dans le présent chapitre. Les mécanismes de tolérance dont l'un d'entre eux fait l'objet de ce travail, peuvent être infidèles et, par conséquent, engendrer des mutations.
Ils seront abordés dans les paragraphes suivants (C.4. et D.2.).
Les mécanismes de réparation vraie sont : i) la réversion des lésions, qui comprend
Î2G enzymatique des dimères
de pyrimidine de type cyclobutane (Sutherland, 1981 , Sancar et al., 1984). 2° la.traQsal^kylatign : une enzyme suicide, la 0^ méthyleguanine transférase, catalyse le transfert
d'un groupement alkyle (surtout le groupement méthyle mais aussi les groupements éthyle, propyle et butyle), situé
en position 0^ de la guanine, sur un de ses résidus cystéine, réalisant ainsi' sa propre inactivation (Olsson & Lindahl, 1980) .
ii) l'excision des lésions, qui peut être initiée par l'un ou l'autre des deux processus suivants : 1° §îÇlsion_de_la base modifiée ou non appropriée par l'une des multiples ADN glycosylases spécifiques (Lindhal., 1982), qui génère un site AP (site apurinique/apyrimidinique). Le désoxyribose phosphate privé de sa base est ensuite libéré par l'action
d'incision soitde deux AP endonucléases, l'une 3' et l'autre 5', soit d'une AP endonucléase 5' suivie de l'excision par l'exonucléase 5'-^ 3' (Fig.5) .
2^2l§l22_Ëy_Q22l22Î1^2 modifié par le complexe
i
I ONA GLYCOSYLASE
(41
S-—y
EXONUCLEASE
(3) 3” AP ENDONUCLEASE
OLIGONUCLEOTIDE EXCISION PRODUCT
:+
r J^O h
5 - DEOXYRIBOSE- PHOSPHATE RESIDUE
EXCISEC
Figure 5. Représentation schématique de la réparation de l'ADN par excision de base.
(Extrait de Friedberg, 1984)'.
UVR ABC (Seeberg , 1 978) , qui reconnaît une grande variété de bases endommagées, notamment les dimères
cyclobutane de pyrimidine et les lésions (6-4) (Yeung et al., 1983). Le complexe UVR ABC coupe deux liens phospho- diesters, l'un 3 ou 4 nucléotides en amont et l'autre 7 nucléotides en aval du dimère de pyrimidine. Un nucléotide de 12 à 13 résidus est ainsi libéré (Fig.6.) (Sancar & Rupp, 1983). Les étapes finales de ces deux processus impli
quent les mêmes enzymes. L'ADN polymérase I comble
les brèches formées lors des étapes initiales d'excision.
Ensuite une ligase joint le morceau simple brin d'ADN néosynthétisé à la fibre qui avait été endommagée.
Une autre voie de réparation par excision, initiée par le complexe UVR ABC, implique la formation de brèches
plus étendues - 1000 nucléotides - , qui sont comblées par 1'ADN polymérase III. Cette voie de réparation est inductible et dépend des gènes recA et 1 exA (Cooper, 1982).
La synthèse de l'O^ méthy1eguanine transférase et de certaines ADN glycosylases sont contrôlées par un système dit "d'adaptation" aux effets mutagènes et létaux de certains agents alkylants (Cairns et al.,
1981). Ce système constitue l'un des réseaux de régulation contrôlant les réponses cellulaires aux dommages
formés dans 1'ADN par les agents exogènes (Walker, 1984).
C.4. La tolérance des lésions dans l'ADN.
Deux mécanismes au moins permettent la tolérance d'un certain nombre de lésions dans l'ADN.
i ) La réparation post-réplicative par recombinaison:
lorsqu'une fourche réplicative rencontre une lésion bloquante
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i
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Figure 6 . Schéma proposé pour la réparation d'un dimère de pyriiiiidine par le mécanisme d'excision de nucléotides uvrABC (d'après Friedberq, 1984).
L'enzyme uvrABC catalyse l'hydrolyse du lien phosphodiester de chaque
côté du dimère. Un oligonucléotide est libéré laissant une brèche
qui sera comblée par l'ÀDN polymérase I. Une ligase reformera le lien
entre l'ADN néosynthétisé et l'ADN parental.
qui aurait échappé aux réparations précitées, la réplication arrêtée au site lésé peut cependant être réinitiée à quelque distance au-delà de la lésion (Rupp & Howard-Flanders,
1968). Il en résulte une brèche dans le brin d'ADN néo- synthétisé. La réparation post-réplicative par recombi
naison réalise l'échange d'un fragment du brin endommagé, qui fait face à la brèche, avec le fragment correspondant du
brin homologue d'une molécule d'ADN soeur. Il en résulte le transfert des lésions dans une structure double brin et une brèche en face d'un segment d'ADN intact. Cette brèche
pourra être comblée par une ADN polymérase (Hanawalt et al., 1979). Cette réparation comporte plusieurs voies et dépend de nombreux gènes dont le rôle précis n'est pas encore clair.. Il s'agit des gènes recA (Smith & Meure,
1 970 ), 1 exA, recB, recC (Youngs & Smith, 1 976) recF (Rothman & Clarck, 1977), uvrA, uvrB, uvrD (Youngs &
Smith, 1976) Rothman & Clarck, 1977, Ganesan et al., 1978), polA et polC (tait, 1974).
ii) La réparation SOS implique une synthèse d'ADN face à une lésion bloquante (réplication des lésions)soit
pour combler une brèche postrép-1 icative, soit pour permettre le "passage" d'une lésion non codante par une fourche
réplicative. Cette réparation conduit à une augmentation de la survie mais aussi de la mutagénèse. Elle nécessite l'induction de nouvelles fonctions cellulaires contrôlées par le système SOS. Son mécanisme d'action n'est pas encore connu. Néanmoins, la voie est défrichée et les divers
aspects tant génétiques que biochimiques qui tentent de l'élucider seront abordés dans un chapitre (E) consacré à cette réparation.
Le système SOS est, comme le système d'adaptation, un réseau de régulation qui contrôle certaines réponses cellulaires aux dommages induits dans l'ADN et dont les agents régula
teurs sont les produits des gènes recA et 1exA. Nous envi
sageons dans le chapitre suivant (D), le modèle actuel de
régulation du système SOS et ses propriétés principales.
mut;ii:ent.ais ol' hav.'tcriophai:i;
L‘\‘ mulaçcncsis oT bacicrial chromo^o^1e Filamenialion linhibilion oI'cl’II) iurA' fl" ( -OcpcnJent repair Lone patch repair
KccF-dependcm rccombinaiion Induction 01" stable DNA réplication Alleviation ol' restriction
E\ci^ion of element el4 C essation ot' respiration
Fis per-recombination in uvrD strains
-Inhibition oFDNA-degradation byexonuclease V Induced radiorésistance
Repair of double-strand breaks
Induction of RecA protein troles of homologous recombination;
spécifie protease involved in SOS regulaiionl
Induction of LexA protein trepressor; rôles in SOS régulation) Induction of FlimA protein (pan of intégration host factor; rôle in
site speciric recombination)
induction of UvrD protein (helicase II; rôles in excision repair and methyl-directed mismatch repair)
Induction of sihgle-strand DNA-binding protein Induction of mv locus (unknown rôle in UV résistance) Induction of JinA locus (function unknown)
Induction of liinB locus (function unknown) Induction of JinD locus (function unknown) Induction of JinF locus (in same operon as lexA) Naturally occurring plasmids
. Increased susceptibility to UV and Chemical mutagenesis.
increased résistance to UV killing. increased Weigle réactivation
Increased susceptibility to UV mutagenesis and increased résistance to UV killing
Colicin production Colicin production Colicin production Cloacin production
iwiiiDC. rccA iiittnDC. rt’cA yi(lA ixJiA) iixrA. -fl. and -C iivrA. -fl. and -C. ? rcc\
363
3. 92. 70. 166. 333. .363 3. 92. 126. 166, 333. 369 .36, 146
102. 172. 297. C. A. van Sluis, Personal communication .37. 38
1. 207. 210 174. 186 67, 76. 343 40, 121 340
206 _ _
ri’cA 270
rccA 269
ncA 3.3. 177
rccA 26. 12.3. 126. 203. 21
Ic.xA 2.3. 26. 198. 200
liimA 229
uvrD ■ 263. 328
ssh ->2
ruv 327
dinA 170. 171
dinB 170. 171
JinD 170. 171
dinF 170. 171. 178
luucAB (pKMlOl) 93. 26.3. 354
inip (TPI 10) 80
Cülicin El (CüIEI) S4, 85. 342 Colicin E2 (CoIE2) 1 41
Colicin Ib (TPllO) P. .Strike. Personal communication Cloiicin DFD
(ClüDF13) .349
Tableau 3. Les fonctions et les qènes SOS chez Escherichia coli.
(Extrait (de Walker, 1984).
D. LE SYSTEME SOS .
En réponse au blocage de-la réplication de son ADN, E. col i subit la dérépression d'une série de gènes (les gènes SOS) et exprime une série de fonctions (les fonctions SOS) (Tableau 3). C'est la réponse SOS. Plusieurs gènes SOS sont associés à des fonctions SOS. Cependant, il existe encore des fonctions dont les gènes correspondants n'ont pu être identifiés et vice versa . Les gènes SOS
ont en commun la particularité d'être contrôlés par les produits des gènes recA et 1exA . L'histoire de la
naissance du concept de la réponse SOS est élégamment décri
te par Friedberg dans son.livre "DNA REPAIR" - (voir aussi Witkin, 1982 et Walker, 1984).
D.1. Modèle de régulation.
Le modèle actuel de la régulation des gènes SOS initia
lement proposé d'après des arguments génétiques (Witkin, 1976), est confirmé et affiné par de nombreuses études biochimiques (Little & Mount, 1982, Walker, 1984). Il est illustré par la figure 7. Dans la cellule non induite, un nombre considérable de gènes (de l'ordre de 0.5 % des gènes d'£. c01i ) sont réprimés par le produit du gène 1exA : le répresseur LexA (Walker, 1984). Cependant plu
sieurs gènes SOS sont exprimés -à un taux réduit, dit cons
titutif, même à l'état non induit. C'est le cas notamment des gènes recA et uvrA, B, C dont les produits sont requis dans des fonctions autres que les fonctions SOS. C'est
également le cas du gène 1exA dont le produit est évidemment
nécessaire à l'état non induit.
( * * ) O
\ O / O
O
rec A ex O
sul A
(A) O Ci , Ci O
__ umuO umuC
«»cat^ —-I— I ««
din D .
) DNA damage or interférence wifh DNA replicofion i) Génération of SOS-inducing signol
i i ) Act ivotion of RecA (O
protease activity inducing s ignal
iv) Proteolytic cleovage of LexA by octivated Rec A protease lead ing to a
réduction in Lex A pools [' -► ûd )
Partiolly SOS-induced Cell
lex A O •
b â D *o - U vr A
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ûû'
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O I sul A
^ ••—I »«
* •« « * ^ ,—, utrtu D umuC , I j M
din D
O »«r-X| - -c.—
ilContinued génération of SOS-inducing signal iilContinued cleovage of Lex A and further
réduction of Lex A pools
Fully. SOS- Induced Cell lex A • où •
-t-«» 0 OQ ••—h
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U
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• •—I— ■ • >
rec A
t--- ■ aa •
ûo • UmuD umuC
+- -d in D
• •• —I— t ••
i) Lossof SOS-inducing signal
ii) Return of RecA to proteolyticolly inactive stote iii) Increase in LexA pools
iv) Repression of SOS genes by Lex A
Figure 7. Modèle de régulation du système SOS.
Les cercles creux représentent les molécules RecA protéolytiquement inactives et les cercles pleins représentent les molécules RecA activées. Les demi-cercles représentent les molécules LexA.
(Extrait de Walker, 1974).
Lorsque la réplication en cours d'un ADN cellulaire est inhibée (induction directe) ou lorsque un ADN endommagé exogène, tel qu'un épisome ou un ADN Hfr ou encore certains bactériophages (Rosner et al., 1968, George et al., 1974, D'Ari & Huisman, 1982), est introduit dans une cellule
(induction indirecte), un si-gnal inducteur est produit. Ce signal active, de manière réversible, une activité spécifique de la protéine RecA.careble de stimuler le clivage protéoli- tique du répresseur LexA (Little et al., 1980, Horii et al., 1981) et du répresseur CI du phage lambda (Roberts et al., 1978). Le clivage de LexA s'effectue en un site - ala-gly - proche du milieu de la protéine (Horii et al., 1981). Il donne naissance à deux fragments protéiques inactifs. Il a pour effet de diminuer le pool du répresseur LexA actif. Au fur et.à mesure de la diminution du pool de Le;<A, les gènes SOS à faible affinité pour LexA sont d'abord induits, constituant ainsi un état d'induction intermédiaire. Si le signal induc
teur est suffisamment fort et/ou persistart^une plus grande quantité de protéines RecA est activée, un plus grand nombre de molécules LexA sont clivées, les gènes à forte affinité pour LexA sont induits et l'on atteint l'état d'induction maximale lorsque tous les gènes SOS sont déréprimés.
Les fonctions SOS concourent à la réparation de l'ADN endommagé et par conséquent à la disparition du signal
inducteur. Cette disparition provooue une chute de l'activité protéasique associée à la protéine RecA. Le répresseur LexA s'accumule et réprime à nouveau les gènes SOS, dont le niveau d'expression rejoint celui de l'état n O n i n d U i t.
Le répresseur LexA agit comme un répresseur
classique en se fixant aux séquences opérateurs cui précèdent les gènes SOS (Brent & Ftashne, 1981, Little et al., 1981, Kenyon et al., 1982, Sancar et al., 1982, a et b).
La comparaison des séquences régulatrices de plusieurs
gènes SOS a mis en évidence l'existence d'une séquence
consensus appelée "SOS box" qui lie spécifique
ment LexA (Little & Mount, 1 982 , Wa1ker, 1984).
Selon la quantité et/ou la persistance du signal inducteur, qui sont elles-mêmes fonctions de la nature et de l'intensité du traitement inducteur, la réponse SOS peut revêtir de multiples formes. Ceci grâce aux diffé
rentes propriétés du système SOS dont les principales sont l'autorégulation des gènes recA et 1exA et les dif
férentes affinités que présente LexA pour les différents gènes SOS (Brent & Ptashne, 1981, Brent, 1982, Little et al., 1981, Kreueger et al., 1983). La répression par LexA de son propre opérateur assure en effet un
retour rapide à l'état non induit (Brent & Ptashne, 1980).
L'affinité de LexA étant 10 fois plus faible pour son propre opérateur que pour celui du gène recA, l'économie d'une
induction complète de toutes les fonctions SOS par de faibles traitements inducteurs est garantie (Brent &
Ptashne, 1981). De plus, comme le gène recA est plus fortement réprimé par LexA que bon nombre d'autres gènes SOS, la production d'une petite quantité de signal
inducteur pourra conduire à un haut niveau d'expression de certaines fonctions SOS sans qu'il y ait une amplifi
cation substantielle de la protéine RecA (Brent &
Ptashne, 1981, Little et al., 1981).
L'ordre d'induction des différents gènes SOS peut également influencer la forme de la réponse SOS à un traitement inducteur modéré. Ainsi par exemple, l'induction du gène s fi A qui engendre la filamentation de la bactérie (Huisman et al., 1980) et celle des gènes
uvrA et ^ impliquées dans la réparation par excision sont
provoquées par de faibles traitements inducteurs. Ces
deux fonctions, filamentation et réparation par excision,
vont respectivement faciliter et effectuer la réparation
des lésions inductrices entraînant ainsi la disparition du
signal inducteur.
iUxA 1 scnsiiive
/<vv.A(T>I If.v/I Récessive, expresses SOS responses if shifi- ed 10 4^■C
Thermosensilive LexA proiein. does not funclion we!l as repressor al 42°C
253
/f.v.m DeO i.\pr) Récessive, consiitulively expresses LexA- repressed genes
Defeclive LexA protein I7S. 249. 262
rccA alltflïîs ira A \
Defeclive in rccombination. SOS imluclion.
and lambda induction: very UV sensitive
Dcfective in ail activitics of RecA protein 51. 99. 202. 277. 2S1.
.171 rxxA-l-llUif-l) .Ai 42'C. expresses SOS functions constiiu-
lively and induces lambda prophage
Protease activity of Rec.A more easily acti- valed
44. 219. 2.10. 26S
Tfi 7>0 Similar lo rcxA4-4l excepi expresses SOS funclion consiitulively ai .40°C
Protease activity of Rec.A much more easily aciivated
.17.1
n\A~MhUxB.’0\ Recombinalion proficienl Defeci in protease activity. dsies not cleave lambda repression, reduced ability to cleave LexA
9.1. 116. 242. 2S1. 2S4
rciA>> ci.v-dominanl consliiulive rccA expression Operaior constitutive mutation 52. 114, .150 Dertcieni in recombination and SOS induc
tion
Pronu'ier-down mutation 42. 5.1
Tableau 4. Mutations dans les gènes recA et 1 exA affectant l'induction des fonctions SOS.
(Extrait de Walker, 1984).
D.2. Les mutants des gènes recA et 1 exA.
Les propriétés des différents mutants des gènes recA et 1exA sont résumées dans le Tableau 4 . Les mutants du gène 1exA sont soit dominants (ind”), soit récessifs (ts et def). Ils sont de trois types :
i) les mutants de type ind' (lexA') sont insensibles à la protéolyse du répresseur LexA promue par la protéine RecA (Little et al., 1980). Le mutant 1exA3, par exemple, a subi un changement dans Ta séquence de son site de
clivage (ala - aspa au lieu de al a-gly )(Markham et al. ,1981 ).
ii) les mutants thermosensibles (tsl) ont un répresseur dont la fonction de répression est altérée à température non
permissive (42°C). Ils ne sont pas viables à 42°C suite à l'expression constitutive de la fonction SOS de filamen
tation à cette température (Georges et al., 1975).
iii) les mutants défectifs (spr) synthétisent une protéine LexA incapable de réprimer les gènes SOS (Mount, 1977, Krueger et al., 1983). Ils expriment constitutivement la fonction SOS de filamentation et, par conséquent, ils ne sont viables qu'en présence d'une mutation sulA (sfiA) , qui empêche l'expression de cette dernière fonction
(George et al., 1 9 75).
Les premiers mutants du gène recA furent isolés comme déficients dans la recombinaison (Clarck &
Margulies, 1985, pour revue : Clarck, 1973). Ces
mutations ont une effet pléiotrope car elles affectent également la mutagénèse et la réparation de l'ADN
(Radman , 1974).
Cette pléiotropie provient des multiples activités de
la protéine RecA qui lui confèrent à la fois des propriétés de recombinase et de protéase (Weinstock, 1982). Ces
deux fonctions de la protéine RecA sont séparables puisqu'il existe des mutants dont l'une et/ou l'autre de ces propriétés sont altérées (voir Tableau4 ) (Tessman & Peterson, 1985),
(Morano et al. , 1 977 ).
Le mutant recA441 (tif) porté à 42°C induit les fonctions SOS (Witkin, 1976). Cet effet est stimulé par la présence en excès d'adénine et contrarié par la
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