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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:
Avalosse, B. (1993). Parvovirus et oncosuppression: recherche de facteurs cellulaires, modulables par la transformation, susceptibles de contrôler le cycle viral (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.
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UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES FACULTE DES SCIENCES
Laboratoire de Biophysique et RadiobioLogique Professeur J. Rom meLaere
Parvovirus et oncosuppression : recherche de facteurs cellulaires, modulables par la transformation, susceptibles de contrôler le cycle viral.
THESE PRESENTEE EN VUE DE L' OBTENTION DU GRADE SCIENTIFIQUE DE DOCTEUR EN SCIENCES CHIMIQUES
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UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES FACULTE DES SCIENCES
Laboratoire de Biophysique et RadiobioLogique Professeur J. Rom meLaere
Parvovirus et oncosuppression : recherche de facteurs cellulaires, modulables par la transformation, susceptibles de contrôler le cycle viral.
THESE PRESENTEE EN VUE DE L' OBTENTION DU GRADE SCIENTIFIQUE DE DOCTEUR EN SCIENCES CHIHIQUES
RESUME
- Le phénomène d'oncosuppression exercé par Les parvovirus est encore une boîte noire ; nous avons toutefois montré que des cellules en culture, établies à partir de tumeur ou transformées in vitro (par des agents physico-chimiques ou viraux) se montraient plus sensibles à L'infection parvovirale, par rapport aux cellules normales dont ils dérivent. Dans les couples de fibroblastes humains étudiés, cette sensibilisation ne s’accompagne pas nécessairement d'une production accrue de particules infectieuses, mais bien d'une augmentation de
L'amplification de L'ADN parvoviral.
- La faible complexité génétique des parvovirus rend L'accomplissement du cycle viral tributaire de nombreuses fonctions cellulaires. Parmi Les facteurs capables de lier Le génome parvoviral et exprimés différement dans des couples de fibroblastes humains normaux et transformés,nous avons identifié la nucléoline, qui Lie spécifiquement une séquence monocaténaire de 222 nucléotides, située à L'intérieur de La zone codant pour Les protéines non structurales du parvovirus MVMp.
Nous avons montré que La nucléoline des cellules transformées se distingue de celle de cellules normales par sa phosphorylation et sa capacité de former des aggrégats. Etant donné que L'ADN du parvovirus se réplique dans La nucléole de La cellule-hôte et que le pléomorphisme nucléolaire est une caratéristique des cellules tumorales, la nucléoline constitue un effecteur potentiel de La réplication et/ou expression parvovirale : les premières expériences de réplication de L'ADN in vitro ont montré que, si La nucléoline n'a pas d'influence sur La conversion de L'ADN simple brin (forme encapsidée) en forme réplicative
ABREVIATIONS
AAV : Adéno-Associated Virus ADN : Acide désoxyribonucléique ARN : Acide ribonucLéique
cdc2 : Protéine kinase dépendante du cycle cellulaire de type 2 CK2 : Protéine kinase de type caséine II
DNAse : Désoxyribonucléase DTT : Dithiothérol
EDTA : Ethylènediaminetétraacétate H-1 : Hamster-osteolytic Virus
Hepes : N-2-hydroxyethyIpiperazine-N'-2-ethanesuIfonic acid kb : Ki lobase
kDa : KiloDalton
NVH(p ou 1) : Minute virus of mice (souche prototype ou immunosuppressive) PBS : Phosphate-buffered saline
PMSF : Phenylmethylsulfonyl fluoride RF : Forme réplicative
SDS-PAGE : Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis SV40 : Simian Virus 40
TCA : Acide trichloroacétique TRIS : Hydroxymethyl aminomethane
These annexe
L'addition de prions à des protéines dénaturées ou
dans un système de traduction in vitro devrait
permettre de statuer sur son rôle potentiel de
molécule chaperonne
TABLE DES MATIERES
I. INTRODUCTION... 1
1. Avant propos... 1
2. Structure et organisation virale... 3
2.1. Le virion... 3
2.2. Le génome viral... 4
2.3. Les protéines structurales... 5
3. Réplication de l'ADN parvoviral... 5
3.1. Structure du génome parvoviral... 5
3.2. Réplication de l'ADN parvoviral... 6
3.3. Facteurs impliqués dans la réplication de l'ADN parvoviral... 8
a-Facteurs viraux... 8
b-Facteurs cellulaires... 10
4. Expression du génome parvoviral... 11
4.1. Stratégie... 11
4.2. Facteurs impliqués dans l'expression du génome parvoviral... 13
a-Facteurs viraux... 13
b-Facteurs cellulaires... 16
b.1. Au niveau du palindrome 3' et du promoteur P4... 16
b.2. Au niveau du promoteur p38... 20
5. Le point sur la réplication et l'expression du génome parvoviral... 21
Je remercie le Professeur Jean Rommelaere de m'avoir
accueilli dans son laboratoire, il y a bientôt onze ans, au moment où le parvovirus servait de sonde pour l'étude de la réparation de lésions dans le génome des cellules de mammifère. Il a permis par la suite que ma contribution à l'étude du pouvoir oncosuppresseur des parvovirus fasse l'objet d'une thèse, et je lui en suis très
reconnaissant.
Je remercie également Jan Cornelis et Jean-Michel Vos, qui m'ont enseigné tous les secrets du parfait biologiste moléculaire, les étudiants (Yong, Zhennan, Saïd), avec lesquels j'ai travaillé tout au long de cette thèse et les Docteurs Pascale Belenguer et Kurt
Willwant pour leur collaboration. Un clin d'oeil à Pierre, Marcel et Francis, avec lesquels nous nous sommes toujours serré les coudes.
Merci à Michel de m'avoir consacré tant de week-ends (entre les matchs de football, évidemment) à dactylographier ce travail, à mes parents pour m'avoir encouragé à chaque fois que le moral frôlait la barre des 740 mm de mercure et à Anne-Marie que j'ai renoncé à contredire lorsqu'elle affirme que mon caractère reflète de plus en plus mes origines ardennaises : pour ta patience et ton réconfort, merci.
A JONATHAN
Bernard
6. Le cycle viral... 22
6.1. Le cycle lytique ... 22
6.2. L'infection non productive... 25
7. Etude du phénomène d'oncosuppression... 26
7.1. Inhibition de la cancérogenèse in vivo... 26
7.2. Interaction tumeur/parvovirus... 27
7.3. Lyse préférentielle des cellules transformées par H-1 et MVM 28 7.4. Facteurs impliqués dans la cytotoxicités parvovirale... 29
7.5. Réversion du phénotype transformé... 30
7.6. Et le futur... 31
II.Résultats expérimentaux 1. Amplification de l'ADN parvoviral en fonction de la transformation de la cellule hôte... 33
-Article 1... 35
2. Identification de protéines nucléaires,sensibles à la transformation, qui interagissent spécifiquement avec le génome parvoviral... 48
-Article II... 50
3. La nucléoline forme un complexe spécifique avec un fragment du brin viral de l'ADN de MVM... 57
-ArticlelII... 58
4. Résultats complémentaires... 66
4.1.Phénomènes étudiés... 66
4.2.Matériel et méthodes 68 4.3.Résultats... 71
III Discussion
1. Augmentation de la susceptibilité de cellules humaines transformées à l'infection par les parvovirus H-1 et MVM... 80
2. Recherche des facteurs interagissant avec le génome de MVMp dans
les fibroblastes humains normaux ... 82
3. La nucléoline forme un complexe spécifique avec un fragment du brin viral (brin-)de l'ADN de MVMp... 82
4. Extractibi lité de La nucléoline et capacité de Lier l'ADN parvoviral 84
5. Phosphorylation de la nucléoline... 85
6. Rôle de la nucléoline dans La réplication parvovirale in vitro...85
IV Références... 87
V Annexe 97
I. INTRODUCTION
1. Avant-propos
Lorsqu'on parle de virus, on pense généralement à des agents pathogènes. De fait, les parvovirus sont responsables de maladies, notamment chez les animaux domestiques. Leur action pathogène est toutefois très spécifique car ils requièrent pour leur propagation des cellules en prolifération et dans un état de différentiation bien déterminé (souvent peu différencié). Il n'est donc pas étonnant que les parvovirus soient des agents tératogènes, provoquant suivant la souche utilisée pour l'infection, le mode et le moment de l'injection des malformations osseuses et/ou des maladies bien définies (hépatites, entérites,__ ). Ces effets pathogènes résultent de l'attaque par le virus de cellules en cours de différentiation et dont le taux de prolifération est généralement élevé. Il est toutefois clair que toutes les cellules à activité mitotique élevée ne sont pas une cible pour les parvovirus. Chez l'adulte, l'infection parvovirale épargnera la plupart des tissus à risque chez le foetus, mais est parfois capable de provoquer la destruction de l'épithelium intestinal et du système réticuloendothélial, entraînant la mort de l'animal; il n'est donc pas étonnant que l'on ait développé des vaccins contre les parvovirus du chien, du chat, du vison, du porc... Signalons toutefois que si certains tissus sont amenés à croître de façon anormale (fracture, hépatectomie partielle) ils redeviennent sensibles
aux parvovirus. Chez L'homme qui est L'hôte d'une demi-douzaine de parvovirus. seuL Le B19 est pathogène : iL est responsabLe de L'érythème infectieux (5° maLadie) et provoque des crises d'apLasie chez Les individus atteints d'anémie hémoLytique, en s'attaquant à un précurseur bien déterminé de La Lignée érythroïde. Notre but n'est pas d'étudier ce virus, mais bien ceux qui sont capabLes de provoquer une virémie chez L'homme, sans pathoLogie : ce sont Les parvovirus H-1 (Hamster - OsteoLytic Virus) et son homoLogue (Minute Virus of Mice) qui exercent une action anticancéreuse chez L'animaL. D'autres groupes étudient égaLement L'action oncosuppressive des AAV (Adeno Associated Virus) qui requièrent pour Leur propagation La coinfection avec un autre virus (Adéno ou herpesvirus), ou des conditions de cuLture très particuLières. Le but est commun : voir si cette propriété est appLicabLe à L'homme.
Le phénomène d'oncosuppression est encore à L'heure actueLLe une boîte noire ; iL sembLe toutefois vraisembLabLe que Les parvovirus interagissent directement avec La ceLLuLe (pré)-cancéreuse, puisque des expériences ont montré que des cuLtures de ceLLuLes transformées étaient en généraL beaucoup pLus sensibLes à L'infection parvoviraLe que Leur correspondant normaL. IL est donc Légitime de penser que ces études in vitro refLètent La réaLité chez L'animaL, ce qui permet de disséquer pLus faciLement Les mécanismes responsabLes de L'activité anti-néopLasique exercée par Les parvovirus : teL est L'objet de cette thèse. Notre matérieL de base est constitué de coupLes de ceLLuLes (humaines notamment) normaLes et transformées in vitro par des agents chimiques, physiques ou viraux, qui se sont avérées pLus sensibLes à L'infection parvoviraLe ; grâce à ce système, nous avons pu identifier
dans Les ceLLuLes normales certaines barrières à la permissivité (article I). Nous avons d'autre part recherché des facteurs cellulaires, modulables par La transformation, et capables d'interagir spécifiquement avec le génome parvoviral (article II). Un facteur répondant à ces critères a été caractérisé (article III) : il s'agit de La nucLéoLine, dont L'effet éventuel a été étudié dans un système de réplication in vitro de l'ADN parvoviral (résultats complémentaires).
Dans une étude parallèle, nous avons également déterminé les produits viraux responsables de la cytotoxicité dans Les cellules transformées (article IV, annexe).
Le parvovirus est un virus simple, dont La réplication reflète l'état physiologique de La cellule hôte. Si L'on en croît la diversité des barrières à la réplication, on doit admettre que l'accomplissement du cycle viral requiert un grand nombre de protéines cellulaires. Si notre étude n'aura permis d'élucider qu'un ou L'autre maillon de la chaîne, puisse notre modeste contribution aider à comprendre Le phénomène d'oncosuppression et, un jour peut-être, à utiliser Le parvovirus dans La thérapie de certains cancers humains.
2. Structure et organisation virale
2.1. Le virion (1)
Les parvovirus sont des particules icosaédriques de 20 à 25 nm de diamètre, dépourvues d'enveloppe. Leur génome consiste en une molécule
d'ADN monocaténaire d'environ 5000 nucléotides, flanquées de palindromes. Les particules ne contiennent ni lipides, ni hydrates de carbone, ni enzymes ; elles sont résistantes à la chaleur (56® pendant 60 minutes), à des concentrations relativement hautes en sels, aux solvants non ioniques et à une gamme de pH variant de 3 à 9.
Si ces caractéristiques sont communes à tous les membres du genre parvovirus, il n'en reste pas moins que les parvovirus autonomes peuvent être divisés en différents groupes, suivant la structure de la capside. Les membres du groupe RV (Kilhan's rat virus), qui comprennent notamment les parvovirus H1 et MVM ont des virions infectieux formés de trois polypeptides majeurs : VP-1 (83-86kDa), VP-2 (64-66kDa), et VP-3 (60-62kDa) qui dérive du clivage protéolytique de VP-2. La proportion VP-3 : VP-2 varie d'une préparation de virus à l'autre et augmente progressivement dans une culture cellulaire ; cependant cette conversion n'est pas requise pour la pénétration dans le noyau puisque le rapport est identique dans les particules extraites dans le cytoplasme et le noyau.
2.2. Le génome viral (1)
Chaque virion contient une seule copie d'une molécule d'ADN linéaire; chez le parvovirus MVMp, le brin-(brin codant pour toutes les protéines virales) constitue plus de 90% de la forme encapsidée.
Les extrémités adoptent des structures palindromiques en forme d'oreille de lapin du côté 3' et en épingle à cheveux du côté 5' (respectivement 115 et 207 nucléotides pour MVM). Par convention, on représente le génome parvoviral avec e sens codant (RNA messager 5'
Figure 1. Réplication de l'ADN parvoviral
A. Structure du genome de MVMp
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3') partant de La gauche vers la droite, ce qui place L'extrémité 3'de l'ADN à gauche.
2.3. Les protéines non structurales (1)
Les protéines non structurales (NS-1(83kDa) et NS-2(25kDa)chez MVMp) sont impliquées aussi bien dans la régulation de La réplication que de l'expression du génome parvoviral (voir chapitres 2 et 3).
NS-1 se fixe de façon covalente à L'extrémité 5' des formes réplicatives du génome parvoviral (RFI) ; Lors de l'encapsidation. Les 18 nucLéotides 5' terminaux, coupLés à NSI, font extension en-dehors de La capside et pourront ensuite être cLivés.
3. Réplication de L'ADN parvoviraL (1-3)
3.1. Structure du génome parvoviral (figure 1,A)
L'ADN du parvovirus MVMp est formé de 5149 nucléotides dont Les extrémités forment des palindromes imparfaits : 115 nucLéotides du côté 3', dont 104 sont appariés et 206 nucLéotides du côté 5', dont 200 sont appariés. Le palindromes 5' se présente sous 2 orientations, dont Les séquences sont complémentaires inversées : "flip" et "flop", qu'on trouve avec une fréquence comparable dans La forme réplicative double brin monomérique (RFI) du génome isolé à partir de cellules infectées, ainsi que dans L'ADN simple brin extrait des virions. Il n'y a pas d'inversion au niveau du palindrome 3'. D'autres observations, telles que La présence de formes réplicatives multimériques et de 18 nucléotides supplémentaires à l'extrémité 5' de
La forme RF1 par rapport à La forme encapsidée^ ont permis d'étabLir un modèLe de répLication de L'ADN parvoviraL.
3.2. Réplication de L’ADN parvoviraL : Le Bodèle "roLling hairpin " ■odifié (fig 1,B)
La répLication de L'ADN parvoviraL peut-être divisée en une douzaine d'étapes :
1- Synthèse d'un brin compLémentaire C au brin viraL (Vpar):
L'extrémité 3'OH sert d'amorce à La poLymérase.
2- Ligation des extrémités 5' et 3', donnant naissance à un intermédiaire circuLaire fermé.
3- Réouverture du brin néo-synthétisé par une endonucléase spécifique (protéine terminaLe T), 18 nucLéotides en amont du site de Ligation.
4- Copie du paLindrome 5' à partir de L'extrémité 3'-0H engendrée par La protéine T.
5- Obtention d'une forme répLicative monomérique compLète, pLus Longue de 18 nucLéotides que Le brin viraL, en raison du site de coupure de L'endonucLéase (étape 3).
6- Reformation des paLindromes.
7- Synthèse d'un nouveau brin viral (Vprog), à partir de L'extrémité 3'OH, par déplacement du brin parental (Vpar).
8- Poursuite de La synthèse jusqu'à ce que la polymérase rencontre la protéine T.
9- Copie du palindrome 5' (voir étapes 4 et 5) et clivage du brin complémentaire par la protéine T (voir étape 3), ainsi que du brin viral en amont du palindrome 3'^ par une protéine (différente de T?) qui reste attachée à L'extrémité 5' : cette protéine pourrait être NS-1 (voir point 3.3.).
10- Synthèse des palindromes 3' du brin viral et 5' du brin complémentaire à partir des extrémités 3'OH créées par l'endonucléase.
11- Clivage de la forme réplicative dimérique en monomères, impliquant une réaction de coupure au même site qu'à l'étape 9 (image miroir), resoudure catalysée par La protéine T : le monomère de droite pourra être réengagé dans le cycle réplicatif à l'étape 6 ce qui explique les orientations "flip" et "flop". Le palindrome 5' sur le brin Vpar (molécule de gauche) sera coupé par une autre protéine terminale (P), 18 nucléotides après La protéine T, ce qui a pour effet de créer une nouvelle amorce pour Le polymérase.
12- Encapsidation de l'ADN parvoviral : durant La synthèse d'un nouveau brin viral, le brin Vpar est déplacé et encapsidé au fur et à mesure de la synthèse du nouveau brin viral.
3.3, Facteurs iapLiqués dans La réplication de l'ADN parvoviraL
a,Facteurs viraux (2,3)
NS-1 : il est probable que NS-1 intervienne dans l'une ou l'autre étape du cycle réplicatif^ puisqu'on l'a trouvée associée de façon covalente à l'extrémité 5' des formes réplicatives monomériques étendues (lien tyrosine-phosphate) et de l'ADN simple brin encapsidé.
On a montré (4) que la protéine purifiée avait des propriétés d' ATPase et d'hélicase ATP dépendante. D'autre part, la protéine rep68, équivalente de NS-1 chez le parvovirus adéno-associé type 2 (AAV-2), est une endonucléase site- et brin-spécifique (5). Les expériences suivantes confirment l'intervention de la protéine NS-1 dans le processus de réplication.
Le génome de MVMp, a été cloné dans un plasmide bactérien (pBR322). Après transfection dans des cellules permissives, le fragment d'ADN parvoviral est capable de s'exciser, de se répliquer et de donner naissance à une progéniture de virions infectieux. Des mutants de délétion conservant au moins les 250 nucléotides 3'et 5'terminaux, donc les 2 palindromes, sont également capables de s'exciser et de se répliquer, pourvu que NS-1 soit fournie en trans.
Les palindromes constituent donc des origines de réplication de l'ADN parvoviral, avec lesquelles NS-1 peut interagir directement. Une étape potentielle où NS-1 pourrait intervenir est la résolution des concatémères en tête bêche, palindromes 3'-3'(voir figure IB, étape 8)(6). Ces jonctions ont été clonées dans un plasmide bactérien et transfectées dans des cellules de souris (A9), permissives à MVMp.
Si l'on surinfecte les cellules avec MVMp, les plasmides se
Linéarisent et se répliquent comme des chromosomes Linéaires, avec Les séquences parvoviraLes aux extrémités; deux types de molécules sont produites : des formes dont Les brins sont associés de façon covalente, et des formes dont Le palindrome est étendu et associé de façon covalente à NS-1 par son extrémité 5'. Des expériences semblables ont été effectuées avec des jonctions 5'-5', qui apparaissent dans Les formes tétramériques (non représentées dans Le schéma de réplication) ; dans ce cas, on n'observe que des molécules avec des extrémités étendues liées en 5' à NS-1. La résolution de ces jonctions 5'-5' peut également se faire in vitro , dans un extrait de cellule HeLa, contenant NS-1 produit à partir d'un vecteur recombinant du virus de la vaccine (7): la réplication se fait de la même façon, et l'on retrouve Les formes "flip", "flop" observées in vivo. Le rôle de NS-1 est donc crutial pour la réplication parvovirale ; il reste toutefois à établir si la molécule est capable à elle seule de résoudre les jonctions palindromiques, ou si cette résolution nécessite l'interaction avec d'autres facteurs cellulaires. Quoi qu'il en soit, les expériences réalisées in vivo et in vitro tentent à prouver la validité du modèle de réplication de l'ADN parvoviral décrit à la figure 1.
Les protéines de capside : les protéines de capside sont nécessaires à la synthèse des brins viraux (monocaténaires)(8), vraisemblablement en se liant à L'ADN parvoviral et catalysant ainsi Leur déplacement et leur encapsidation simultanée (voir figure IB, étape 12). Cette interaction a été montrée in vitro : VP2 et VP3 de BPV (bovine parvovirus) séparées par électrophorèse et fixées sur nitrocelluLose sont capables de Lier spécifiquement L'extrémité 3' du génome, tandis que VP3 reconnaît également l'extrémité 5*(9). D'autre part, des
expériences utilisant La technique du gel retard ont permis de montrer que L'extrémité 3' palindromique du génome (forme réplicative) interagit spécifiquement avec Les capsides vides de MVM : cette interaction est attribuée à VP1 qui lie les séquences de branchement formant La structure en T (10). Puisque les séquences en acides aminés de VP1 et VP2 sont identiques, excepté pour la région amino-terminale, il semble bien que ce soit cette petite portion de La protéine qui soit responsable de L'interaction avec Le palindrome 3'.
b. Facteurs cellulaires
Les polymérases : La (Les) poLymérase(s) utilisée(s) et d'autres protéines requises pour la réplication sont d'origine cellulaire.
L'utilisation d'inhibiteurs spécifiques de polymérase (aphidicoLine pour la polymérase et 2',3'-didéoxythimidine-5'-triphosphate (ddTTP) qui inhibe dans L'ordre croissant Les polymérases a permis de montrer que La polymérase dC et probablement la polyméraseî/ sont impliquées dans Le processus de réplication, à des étapes différentes (11). En effet, dans ce système de réplication in vitro (noyaux de cellules NB incubés en présence de nucléotides radioactifs à différents temps après l'infection par le virus H-1), Le taux de synthèse de L'ADN parvoviral varie différemment en fonction de l'inhibiteur utilisé : L'aphidicoLine inhibe très tôt la réplication, mais n'a plus d'effet après un certain temps de réaction, tandis que Le ddTTP voit son effet inhibiteur augmenter avec La durée de réaction, suggérant que La poLyméraseif* intervient dans une étape tardive de la synthèse de l'ADN. Comme ce système de réplication donne
Figurez. Organisation génétique du génome de MVMp
RI R2 R3 F1
VP1 VP2
F2 □ □
F3 I
NS1 13___________ I
^ [!□ [O O (a.a)
NS2 i D [2Z] (b,t)
L D [?□ Q<3 (a.b)
3> 1
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1
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toutefois trop tôt pour attribuer un rôle défini de L'une ou L'autre poLymérase dans Le processus de répLication.
Autres facteurs : outre Les poLytnérases, Le tnodèLe de répLication fait appeL à des réactions de coupure - Ligation et iL serait déraisonnabLe de penser que La protéine NS-1, quoique muLtifonctionneLLe, puisse à eLLe seuLe se charger de tout Le
"travaiL". Une protéine de 60 kDa d'origine ceLLuLaire a été trouvée associée de façon covaLente à L'extrémité 5' des formes répLicatives étendues et de L'ADN viraL (simpLe brin) ; tout comme pour NS-1, cette Liaison impLique un pont phosphodiester entre L'ADN et un résidu sérine de La protéine : son rôLe n'a pas encore été déterminé.
SignaLons égaLement que des compLexes impLiquant Les paLindromes et des protéines ceLLuLaires ont été observés chez AAV. Gu et Rhode (12) ont montré que L'ajoute de camptothecin (inhibiteur spécifique de La topoisomérase I) à des ceLLuLes HeLa 16 heures après Leur infection par Les parvovirus H-1 ou Lu III inhibe toute répLication parvoviraLe subséquente, sans toutefois affecter L'expression à partir des promoteurs P4 et P38 (voir point 4). VP16, inhibiteur spécifique de La topoisomérase II , n'a pas effet sur La synthèse de L'ADN de H-1.
4. Expression du génome parvoviraL (1,2,13)
4.1 Stratégie (figure 2)
L'organisation génomique est fort sembLabLe chez Les parvovirus autonomes et adéno-associés ; La partie gauche (3') codant pour Les protéines de réguLation, La partie de droite codant pour Les protéines
structurales. La figure 2 représente la stratégie utilisée par le virus MVMp.
Deux transcrits (R1, 4,8kb et R2, 3,3kb) sont initiés à partir du promoteur commun P4, tandis le transcript R3 (3,0kb), l'est à partir de P38. Un 4° transcript (R4) de 1,8kb, dont les proportions varient avec les préparations, semblent être le produit de formes défectives du virus. Les trois ARN messagers sont transcripts à partir du brin - de l'AON viral et se terminent par le même signal de polyadénynation AATAAA en position 4885. Le transcrit Ri subit un épissage entre les nucléotides 2280 et 2377 (épissage de type a : donneur a- accepteur a) et code pour la protéine non structurale NS-1 dans le cadre de Lecture 3 (F3). R2 qui code pour la protéine non structurale NS-2 résulte d'un épissage supplémentaire entre Les nucléotides 513 et 1991, ce qui fait passer le cadre de lecture de 3 à 2, L'épissage de type a prolongeant le cadre de lecture 2 jusqu'à un codon ambre 18 nucléotides en aval du site accepteur. Si la machinerie cellulaire est capable de supprimer une certaine proportion de ce signal STOP, le cadre de lecture reste ouvert pour 96 codons supplémentaires (voir figure 2, boîte en pointillés) ; l'existence d'une telle protéine (37 kDa) demeure hypothétique, mais la comparaison des séquences MVMp et MVMi montre que cette région est très conservée, donc essentielle pour le parvovirus. L'étude des séquences de cDNA de MVMp et MVMi a montré que le petit épissage (position 46 à 48 sur la carte) pouvait être de type b (donneur b - accepteur b : élimination des nucléotides 2317 à 2398), ce qui termine la protéine NS-2 en amont du site donneur, ainsi que de type donneur a - accepteur b, ramenant L'ARN dans le cadre de lecture 3. L'épissage alternatif du transcript R3 donne naissance aux deux protéines
structurales : VP1 résulte d'un épissage de type b, tandis que VP2 résulte soit d'un épissage de type a, ou de type donneur a - accepteur b. Enfin VP3,comme nous l'avons dit précédemment est le produit du clivage de VP-2 (20 acides aminées à l'extrémité amino-terminale).
4.2. Facteurs impliqués dans la régulation de L'expression du génome parvoviral
a. Facteurs viraux (13)
NS-1 : la protéine NS-1 est capable de transactiver le promoteur P38 du parvovirus H-1. La séquence minimale requise pour la transactivation est une séquence de 13 paires de nucléotides (CTTGGTTGGTGAA) a été appelée tar, pour trans-activation-response element, et se trouve en position -138 par rapport au site d'initiation du transcript R3 (14). Des résultats similaires ont été obtenus avec le parvovirus MVM (15), et l'on retrouve une séquence en amont du promoteur P38 qui ne diffère que d'un nucléotide par rapport à la séquence tar de H-1. La séquence TGGTTGGT est répétée tout au long du génome, mais sa fonction n'est pas encore bien claire (16).
Chez MVMi, NS-1 est également capable d'activer en trans son propre promoteur (17), et l'on retrouve une séquence qui ressemble fort à celle du tar (CNTGGTTGGTNAA), 107 nucléotides en amont du site de coiffe des transcripts RI et R2. Il n'est pas encore établi si NS-1 interagit directement avec la séquence tar : toutefois Gu et Rhode (18) ont montré dans des expériences de gel retard que la quantité de protéines à haute affinité pour la séquence tar augmente dans des extraits de cellules infectées par H-1 par rapport aux cellules non infectées. L'analyse de ce complexe révèle la présence d'une protéine
de 75 kDa, non reconnue par un anticorps dirigé contre NS-1, suggérant que NS-1 facilite L'interaction d'éléments transactivants avec La séquence tar, sans nécessairement interagir directement avec ce dernier.
On parle toujours de transactivation du P38 par NS-1 ; toutefois, il serait plus opportun de parler de levée d'inhibition de la séquence TAR par NS-1 : en effet, une délétion de la séquence augmente Le niveau de transcription à partir du promoteur P38(19). La séquence TAR pourrait donc être un élément négatif de régulation, empêchant L'expression précoce des protéines de capside et donc l'emballage prématuré de L'ADN parvoviral. Donc, NS-1 transactive les promoteurs des parvovirus autonomes, cette transactivation se faisant au niveau de L'accumulation des transcrits (2).
NS-2 : NS-2 diffère de NS-1 par son poids moléculaire, mais aussi par sa partie carboxyterminale. Il est probable que NS-2 ait une fonction de régulation au moins en partie différente de NS-1 : en effet elle est localisée aussi bien dans le cytoplasme que dans le noyau, alors qu'on ne retrouve NS-1 que dans Le noyau des cellules permissives infectées. De plus Le temps de demi-vie de NS-1 excède 6 heures, alors que NS-2 est complètement dégradée dans Les 3 heures suivant sa synthèse (13). Enfin, La synthèse de NS-2 démarre bien après celle de NS-1 (13). Des parvovirus H-ISA, mutés dans Le site accepteur d'épissage de R2 ont été créés (20). Ce mutant est toujours capable de se reproduire et de lyser des cellules humaines, de hamster et de chien, avec toutefois moins d'efficacité; par contre, La mutation supprime la production virale si L'on infecte des cellules de rat, pourtant considérées comme hôte naturel de H-1. L'analyse des produits viraux montre une diminution des formes réplicatives
dimériques et de L'ADN simple brin, mais aussi une chute de 90% des protéines virales, malgré une accumulation des transcripts RI et R3 comparable à celle obtenue avec le virus sauvage (l’un étant probablement la conséquence de l'autre). Ces résultats suggèrent que NS-2 peut jouer un rôle important au niveau de la traduction des ARN messagers, ce qui vient d'ailleurs d'être confirmés par Naeger et al.(21).
Les protéines de capside : les parvovirus MVMp et MVMi sont appelés variants allotropiques car chacun se réplique dans des cellules de souris dans un état de différentiation différent (MVMp dans des fibroblastes et MVMi dans les lymphocytes T), malgré une séquence nucléotidique identique à 97%. Dans les cas productif et restrictif, la conversion de l'ADN viral en forme réplicative monomérique RFI est comparable, alors que L' amplification des RFI n'est observée que dans le cas de l'infection productive. Comme l'accumulation de transcrits (100 x supérieure lors d' une infection productive) précède l'étape d'amplification du génome parvoviral, il est probable que la différence d'infectivité soit Liée à un défaut d'initiation de la transcription. Cette initiation requiert apparemment l'interaction des particules virales avec un facteur cellulaire propre à l'état de différentiation (22). Grâce à des chimères MVMp - MVMi, l'élément responsable de cette spécificité d'hôte a été cartographié : il s'agit d'une séquence de 237 nucléotides, située au milieu de la séquence codant pour les capsides (23).
Figure 3. Facteurs cellulaires impliqués dans la transcription
A. Au niveau du promoteur P4
0
palindrome
! 100
________J I
ATF _____
MLTF NFY
GC
TATA
R1,R2 200
I ■
atténuateur
B. Au niveau du promoteur P38
R3
1900 2000
1
CAT GC TATA
C. Atténuateur
A-ATTENUATION GAUGAAGUÙU
2dO'C
AU
AG—6Kcol
2»
G À
C G
U A
G c
A G
0-C U-A 0-C U-A 220-C-O
U-A-2AO
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C A A
A A
l^uuguuuuQa
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G-C-3A0 G-U G-C
G-U ^ C-G
Terminotion sjtes
300-AA-U
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•G U-A G -C G-C U-A 50-U-A A-U
A A-33D
B-READTHROUGH AG— 19 Kcol
290
AG—6 Kcol
230 U 280-C-G
A^-°U-G
G-C
3»
uuuguuuuùa C-340
©c::@
2TO-AA^'*A-yX3
b. Facteurs cellulaires
Grâce à l'informatique, des éléments de régulation potentiels, ainsi que des séquences d'ADN répétées ont été répertoriés tout au long du génome du parvovirus MVM (16,24). Par souci de clarté, nous traiterons successivement de 3 zones : le palindrome 3', le promoteur P4 et le promoteur P38. Si la fonction de certain de ces éléments reste hypothétique, d'autres s'avèrent être de véritables régulateurs du cycle parvoviral (construction de mutants de délétion et corrélation entre d'une part l'expression d'un gène rapporteur sous le contrôle des promoteurs parvoviraux et d'autre part la disponibilité de ces facteurs dans des cellules résistantes et sensibles à
l'infection).
b.i. Le palindrome 3* et le promoteur P4 (figure 3-A)
Le génome est représenté avec le palindrome 3' étendu ; les motifs à l'intérieur de cette région sont donc dupliqués, dans des orientations opposées de gauche à droite :
séquences consensus ATF : site de fixation potentielle de facteurs de la famille CREB/ATF (activating transcription factor), dont l'activité est stimulée par le cAMP. Il s'agit de la seule séquence commune aux palindromes 3' de tous les parvovirus. ATF interagit avec les promoteurs de nombreux gènes précoces de l'adénovirus, induits par les produits du gène E1A (25). Les protéines qui interagissent avec le consencus ATF/CREB sont modulées par La différentiation cellulaire (26). Dans Le couple des cellules FR3T3 (cellules normales résistantes à MVMp), FREJ4 (dérivé transformé par L'oncogène c-Ha ras). L'infection par Le parvovirus MVMp se caractérise par un taux équivalent de l'amplification de L'ADN
parvoviraL, mais une stimulation de L'expression du génome dans Les ceLLuLes transformées (27). Des résultats récents obtenus dans notre Laboratoire (Manoussos Perros et al.) montrent que Les interactions site potentiel ATF/CREB-protéines sont en partie différentes selon Les extraits nucléaires utilisés; toutefois, le rôle fonctionnel reste à évaluer. Il est intéressant de noter que ni L'infection de cellules HeLa (résistantes à MVM) par L'adénovirus 2, ni La transformation d'une lignée de fibroblastes humains normaux par L'adénovirus 5 (cellules 293, qui contiennent de nombreuses copies de E1A/E1B), n'ont pour effet d'activer La transcription à partir des promoteurs P4 et P38 ; par contre, La synthèse d'ADN est stimulée (28).
Deux sites chevauchants ; MLTF et NFY, dont L'interaction avec des protéines cellulaires, ainsi que L'implication dans La régulation de l'expression du génome ont été démontrées expérimentalement :
1) la boîte E site de Liaison du MLTF (major late transcription factor) ou USF ; chez les parvovirus adéno-associés (AAV), type 2, Le
promoteur P5 est activé par les produits du gène E1A (29). Des expériences de délétion de séquences d'ADN ont montré que cette activation se fait via 2 éléments : un site de Liaison du MLTF et 2 séquences de 10 nucléotides (R1-R2) répétées en tandem en aval de ce site. (La délétion de la séquence de fixation au MLTF augmente toutefois L'expression de base du P5 en L'absence de E1A, ce qui augmente donc l'amplitude de La réponse à E1A). Greffées séparément en amont d'un promoteur hétérologue (promoteur précoce de SV40), Les séquences MLTF et R1-R2 confèrent une inductibi lité par Les produits du gène E1A. Toujours chez Les AAV, il a été démontré qu'une protéine de 68 kDa (YY1) se Lie à la région R1-R2 et au site de démarrage de
L'ARN. En absence de E1A, Les séquences de reconnaissance de YY1 cLonées en amont d'un promoteur minimal diminuent le niveau d'expression du gène rapporteur. Toute mutation de séquence compromettant la liaison de YY1 rétablit L''expression du promoteur minimal. En présence de E1A, on observe une stimulation de L'expression. Comme YY1 se lie aux éléments de P5, en absence et en présence de E1A, il est probable que YY1 agisse comme répresseur de transcription dans Le premier cas, tandis que E1A puisse la transformer en activateur, en La modifiant ou en se liant à elle
(30).
D'autre part, Plaza et co-auteurs (31) ont montré que MLTF se Lie à L'élément E dans les extraits de cellules FREJ4 ; cette association requiert la présence de L'oncogène FOS, mais pas la préservation du site API, contigu à la boîte E, suggérant une interaction protéine-protéine. Des mutations ponctuelles affectant la liaison USF-FOS sur L'élément E se traduisant par une réduction de L'activité du promoteur.
2) La boîte Y (30 nucléotides) qui lie l'élément NFY : les expériences de gel-retard montrent une différence de Liaison entre
cette séquence d'ADN et Le facteur de transcription, suivant que l'on utilise des extraits de cellules normales (MRC-5) ou transformées (MRC-5V1). Dans les cellules permissives à MVM(NB-E), une mutation ponctuelle à L'intérieur de La séquence de L'ADN reconnue se traduit par une perte de reconnaissance protéine-ADN, ainsi qu'une diminution de L'activité du promoteur P4. IL est intéressant de noter qu'en présence de La boîte Y, la protéine parvovirale non structurale NS-1 active le promoteur P4 (Zhennam Gu, coirnunication personnelle).
- Une boîte TATA, site de reconnaissance du facteur TFIID,
notamment, connue pour réguler La transcription par La RNA polymérase II, est située 30 nucléotides environ en amont du site d'initiation de l’ARN; de plus, un boîte GC reconnue par Le facteur de transcription Sp1, qui régule le niveau d'expression basal de nombreux gènes viraux et cellulaires. IL apparaît que seules Les boîtes GC et TATA sont indispensables pour la transcription in vitro dirigée par Le promoteur P4. Toutefois, les séquences régulatrices (potentielles ou démontrées) situées en amont des boîtes TATA et GC sont requises pour une transcription optimale in vivo (transfections) (32).
- Parmi Les éléments de régulation potentiels de l'expression, signalons également :
1) Une séquence de 25 nucléotides, juste en amont de la TATA box, qui contient 3 éléments qui ont de fortes homologies avec des activateurs viraux bien connus (16,24) : une séquence homologue à l'activateur du virus du polyome (10/12), une autre à celui du gène E1A (8/10) et la troisième à celui de SV40 (8/10). A l'intérieur de ces éléments, s'imbrique un site de fixation du facteur E2F, dont l'activation est maximale en phase S : élément potentiellement intéressant donc, puisque la réplication parvovirale dépend des facteurs exprimés durant cette phase , et que E2F est induit par E1A.
E2F est impliqué dans le contrôle de la transcription de nombreux gènes viraux précoces mais, si sa fixation sur l'ADN parvoviral a été démontrée, on ne dispose pas à l'heure actuelle d'arguments fonctionnels (Steffen Faisst, communication personnelle). Signalons aussi des séquences contenant des homologies ou concensus des facteurs PEA3, E4TF1, et c/EBP.
2) Une séquence formée d'une alternance de purines-pyrimidines, pouvant conférer la forme de Z à l'ADN, reconnues
par certaines protéines spécifiques.
3) Un site API (PEA1) dégénéré est répété tout au Long du génome, suggérant un rôle important pour La répLication viraLe (i6).
-Un atténuateur (figure 30, situé à L'intérieur de La zone codant pour La protéine NS-1 (33,34) : dans des expériences d'éLongation in vitro d'ARN pré-initié in vivo à partir du promoteur P4, Ben-Asher et ALoni ont constaté qu'iLs généraient un ARN de 142 nucLéotides. ILs ont détecté de teLs transcrits in vivo, et ont montré qu'iLs ne résuLtaient pas de La maturation d'un ARN corapLet, mais bien d'une terminaison précoce de La transcription : iL s'agit donc d'un mécanisme de réguLation possibLe de La transcription dirigée par Le promoteur P4, qu'iLs ont appeLé "atténuation". Ce phénomène a été attribué à La possibiLité pour L'ARN initié de se repLier de 2 façons différentes : une configuration "atténuation" où un paLindrome est suivi d'une séquence poLy U (comme c'est Le cas pour d'autres atténuateurs) et une configuration "readthrough", qui séquestre Le premier AUG dans une structure paLindromique . La réguLation de L'expression des protéines non structurâtes pourrait donc se faire au niveau de La transcription et de La traduction. iL doit obLigatoirement y avoir un équiLibre entre ces deux configurations (puisque ceLLe qui permet La traduction empêche La transcription, et vice versa), et iL est tentant de penser que cet équiLibre soit régi par des facteurs ceLLuLaires.
b.2. Le promoteur P38 (figure 3-B) : si La séquence TAR a fait L'objet de nombreuses pubLications, Le promoteur p38 a été moins étudié que Le promoteur P4, quant-aux facteurs ceLLuLaires responsabLes de sa réguLation :
des boîtes TATA et GC. Tout comme pour Le promoteur P4, ces motifs s'avèrent indispensables à L'expression du promoteur P38, tant
in vitro qu'in vivo(19).
une boîte CCAAT box. Cet élément est requis pour La transcription optimale in vivo(19).
Un élément de 365 nucléotides, en aval du site d'initiation de R3 (DPE : downstream promoter element),non représenté dans la figure 3 (35). Si La transcription à partir du promoteur P38 est très inefficace dans Les extraits de cellule HeLa, L'ajoute d'extrait de cellules ascitiques (Ehrlich ascites) non infectées ou infectées augmente le taux d'initiation d'un facteur 2 et 6, respectivement.
Dans Le premier cas, la digestion par La DNase I à montré une région protégée par un facteur cellulaire. Dans Le cas des extraits de cellules infectées, La protéine non structurale NS-1 s'associe avec L'élément DPE, directement ou via Le facteur cellulaire. Donc NS-1 pourrait réguler La transcription à partir du promoteur P38 via des régions en amont (TAR) et en aval (DPE) de ce promoteur.
5. Mise au point sur la réplication et l'expression du génome parvoviral
Nous pouvons conclure que L'étude de La régulation de La réplication et de L'expression des protéines du parvovirus est loin d'être terminée, tant elle fait intervenir d'éléments cellulaires et viraux. L'expression régie par le promoteur P4, en particulier, fait appel à de nombreux motifs (dont La plupart restent d'ailleurs hypothétiques) qui sont concentrés, imbriqués L'un dans L'autre et semblent avoir un effet synergique. La plupart des études d'expression ont eu pour cible des régions très proches des promoteurs
et L'implication de L'un ou L'autre facteur est déterminée par La délétion ou des mutations ponctuelles à L'intérieur de ces très courtes séquences ; l'élément DPE étant toutefois situé 300 nucléotides en aval du site d'initiation de l'ARN R3, il ne serait pas étonnant que d'autres éléments régulateurs (de La transcription ou de La réplication) soient disséminés tout au Long du génome : c'est ce qui nous a amené à utiliser la technique du South-Western (article II). Cette technique a permis de montrer que La nucLéoLine^
composant majeur du nucléole Lie spécifiquement l'ADN parvoviral (articles II, III) ; son état est différent dans Les cellules normales et transformées, et sa présence peut être mise en corrélation avec une plus grande formation de formes réplicatives dimériques dans des expériences de réplication in vitro (résultats complémentaires).
6. Le cycle viral (1,2,36)
6.1. Cycle lytique
a) Adsorption des virions
L'adsorption des virions se fait via des récepteurs spécifiques dont La nature est encore mal connue ; toutefois Le prétraitement des cellules à la neuraminidase et à la trypsine empêchent l'adsorption, suggérant L'implication de résidus d'acide N-acétylneuraminique et d'éléments protéiques pour la reconnaissance des virions.
Le nombre des récepteurs est évalué entre 10^ et 5.1,0^ par cellule, suggérant l'implication de nombreuses protéines d'une même espèce.
La présence de ces récepteurs constitue La première "barrière" à
L'infection parvovirale et dépend de L'état de différentiation de La ceLLuLe : ainsi, La Lignée des Lymphocytes B est dépourvue de récepteurs pour Le parvovirus MVMp.
b) InternaLisation et décapsidation
Les virions sont incLus dans des corps muLti-vésicuLaires et des hétérophagosomes pour être transportés vers Le noyau. Si Les observations au microscope éLectronique ont permis de suivre Le virus jusqu'au noyau, sa décapsidation reste un probLème non résoLu.
L'absence de génomes Libres en quantité déceLabLe dans Le cytopLasme suggère que La décapsidation à bien Lieu dans Le noyau. Le processus de décapsidation n'est pas éLucidé. La nature de L'interaction capside-ADN est maL connue , tout au pLus sait-on qu'eLLe fait appeL à des forces ioniques ; ainsi Le traitement à La formamide, qui diminue La force ionique, a pour effet de dégager L'ADN de sa capside, LaqueLLe reste toutefois attachée à une extrémité du génome. IL est en tout cas probLabLe qu'eLLe protège efficacement L'ADN parvoviraL contre "L'agression" par des nucLéases ceLLuLaires tout au Long du cycLe infectieux. J'ai personneLLement comparé La sensibiLité à La DNAse -I de virions radiactifs (MVM dont L'ADN est marqué au phosphore 32) extraits au moyen de détergents doux de noyaux de ceLLuLes
f
normaLes et transformées, après différentes durées d'infection et j'ai observé une parfaite résistance de tout Le matérieL radioactif au traitement enzymatique. Un témoin de ceLLuLes A9, où Le taux de conversion de L'ADN parentaL en formes répLicatives mono- et dimériques et par conséquent Le taux de décapsidation atteint Les 15%
montrait La même résistance. Dans tous Les cas, L'ADN parvoviraL
amplifié (radioactif ou non) était toutefois clivé par la DNAse -I : par conséquent, la durée de non-protection de l'ADN simple brin par des protéines (cellulaires ou virales) est très courte.
c) Réplication et expression
Ces processus, ainsi que les facteurs potentiellement impliqués dans chaque étape, ont été décrits en détail dans les paragraphes 3 et 4.
d) Assemblage et maturation des virions
Les protéines associées avec l'ADN simple brin et susceptibles de participer à son encapsidation sont mal connues ; leur étude est rendue plus compliquée encore par le fait que la fraction d'ADN complexé avec ces protéines varie d'une préparation à l'autre. Des expériences de marquage ont montré que la protéine terminale restait attachée à l'extrémité 5' du brin viral durant les 10 minutes qui suivent l'encapsidation. D'autre part, la stabilité en gradient de chlorure de césium n'est acquise qu'après 10 à 15 minutes d'encapsidation : la densité passe alors de 1.44 à 1.41 g/cm3 ; toutefois aucune corrélation entre ces deux phénomènes n'a pu être établie jusqu'à présent. Les parvovirus MVM et H-1 qui ont été étudiés tout au long de notre travail encapsident à plus de 99% le brin négatif (complémentaire de l'ARN), alors que d'autre parvovirus (LuIII et B19) encapsident les deux polarités avec la même fréquence.
Comme on retrouve ces mêmes proportions pour les virus H-1 et Lu III se répliquant dans la même cellule, il est problable que le choix de
la fibre soit mené par un facteur viral, plutôt qu'un facteur cellulaire, ce facteur étant situé au niveau des extrémités puisque des génomes constitués uniquement des régions palindromiques sont encapsidés correctement. Il est probable que les signaux soient portés sur le palindrome de droite, puisque le brin viral est encapsidé par synthèse de déplacement (direction 5*—►S'). Une fraction seulement des capsides préformées encapside l'ADN parvoviral.
6.2. Infection non productive
Comme nous l'avons mentionné au préalable, heureusement peu de lignées cellulaires réunissent toutes les conditions nécessaires pour permettre la réalisation d'un cycle viral complet (1) ; nous avons parlé de l'importance de deux facteurs : croissance (facteurs requis durant la phase S) et état de différentiation (les cellules peu différenciées sont en général plus sensibles à l'infection parvoviraie). Il faut cependant noter que cet état de sensibilité n'est pas un phénomène irréversible, puisque l'on peut sélectionner dans une lignée sensible des mutants qui ont acquis la résistance à l'infection : le cycle parvoviral est affecté à l'une ou l'autre étape et l'on assiste à une modification du phénotype de la cellule, modification qui est fonction de la barrière acquise à l'infection productive ; dans l'autre cas cette interaction non productive virus-cellule hôte peut également donner lieu à la lyse cellulaire...
Ces mutants constituent un outil précieux pour l'étude du cycle parvoviral et en particulier des facteurs cellulaires impliqués dans La réalisation de ce cycle, puisqu'ils ont permis de dissocier des processus pourtant tellement imbriqués tels la réplication de L'ADN et son expression.
7.Etude du phénomène d'oncosuppresssion
7.1.Inhibition de la cancérogenèse in vivo (37)
Comme nous L'avons dit dans La section 1 (avant-propos). Les parvovirus exercent une action antitumoraLe chez Les animaux de Laboratoire. Cette protection contre La cancérisation peut être préventive et, dans une moindre mesure, curative.
C'est HeLen TooLan qui pour La première fois en 1967 montre que Les hamsters infectés de façon chronique par des virus H déveLoppaient de 5 à 25 fois moins de tumeurs spontanées par rapport aux animaux contrôLes. Cette surveiLLance parvoviraLe s'exerce égaLement avec un taux d'au moins 50% à L'égard de tumeurs induites par des virus oncogènes, par un carcinogène chimique. Le DMBA, et égaLement par des greffes de ceLLuLes tumorigènes : dans ce cas une expérience réaLisée dans notre Laboratoire (38) montre que Le parvovirus H-1 exerce une action antitumoraLe préventive (85%), mais aussi suppresssive (50%) contre des impLants de ceLLuLes épithéLiaLes mammaires humaines dans des souris nues.
Chez L'homme, qui est porteur des parvovirus AAV2,3,5 ,B19 et H-1, on pourrait égaLement s'attendre à ce que Les individus séropositifs soient protégés contre Le cancer, mais on ne dispose actueLLement que peu d'informations : certaines données épidémioLogiques tentent toutefois à montrer une corréLation inverse entre Le taux de carcinome cervicaL et La séropositivité pour Le virus AAV. En ce qui concerne une action thérapeutique éventueLLe, une tentative de traitement de patientes atteintes d'ostéosarcome avancé par Le parvovirus H-1 s'est révéLée infructueuse, maLgré Le déveLoppement d'une virémie après infection. Cet échec peut être attribué à de nombreux facteurs : manque
de tropisme du parvovirus pour ce type de tumeur, réaction immunitaire du patient, ou encore état trop "avancé" de La maladie qui ne permet plus une accessibilité complète au virus. Avant donc d'utiliser le parvovirus comme thérapie du cancer, il convient donc d'étudier Le mode d'action cytotoxique ainsi que les facteurs cellulaires impliqués dans le cycle viral.
7.2.Interaction tumeur/parvovirus (37)
A priori, on pourrait penser que Le parvovirus n'interagit pas directement avec la cellule (pré)néoplasique, mais qu'il est capable de moduler la production d'interférons ou La réponse immunitaire, comme c'est Le cas pour certains virus enveloppés produits par bourgeonnement au niveau de la membrane plasmique,...
Toutefois, certains résultats favorisent l'hypothèse d'une interaction directe virus - cellule transformée : ainsi,
-de nombreuses lignées transformées (fibroblastes, cellules épithéliales ou Lymphoïdes) transformées in vitro par des agents chimiques, physiques ou par des oncogènes viraux ou cellulaires sont en général plus sensibles que Les témoins normaux dont elles dérivent (voir point 7.3.)
-des lignées de cellules établies à partir de tumeurs, comme des fibrosarcomes, carcinomes, lymphomes sont également plus susceptibles à l'infection que des cellules normales correspondantes (voir point 7.3.).
Comme, dans ces expériences, seuls Les celLules-cible et le virus sont mis en présence, il apparaît que le parvovirus puisse exercer son pouvoir cytocide en interagissant directement avec La cellule transformée.
Tabeau I. Transformation cellulaire et sensibilisation a l'infection parvovirale
Cell origin In vitro transforming agent or tumor of origin
Parvoviruses
Murine V-myc, w-src, SV40 MVMp
fibroblasts PyV, pyMT, Ha-raj, AEV MVMp
Human SV40, 4NQO, y-rays H-1, MVMp
fibroblasts Ad5-Ela H-1
fibrosarcoma H-1, MVMp
Human SV40 H-1
épithélial HPV-16, Ha-ra5 H-1
cells Epidermoid and breast H-1 carcinomas
D'autres arguments plaident également en faveur d'une interaction directe in vivo entre la cellule tumorale et le parvovirus : ainsi,
-l'obtention de l'effet d'oncosuppression exige l'utilisation d'une souche parvovirale infectieuse, qui soit capable de se répliquer dans ce type de cellule tumorale
-de l'ADN parvoviral a été détecté dans des tumeurs en régression (36).
7.3 Lyse préférentielle par H-1 et HVH des cellules transformées (37,3 article I).
De nombreuses lignées de cellules transformées (humaines, de rongeurs) se sont donc avérées plus sensibles à l'infection parvovirale que les cellules normales dont elles dérivent. Le tableau I reprend les données obtenues pour une série de cellules humaines transformées in vitro par des agents chimiques, physiques, ou encore des oncogènes viraux et cellulaires; en outre, une série de cellules humaines établies à partir de différentes tumeurs sont également lysées préférentiellement par rapport aux cellules extraites du même tissu sain.
Cette sensibilité accrue à l'infection parvovirale n'est pas nécessairement en corrélation avec une augmentation de la production de particules virales infectieuses, ni même avec une plus grande capacité à répliquer et/ou exprimer le génome parvoviral. Comme nous le verrons dans le point suivant (7.4.), les protéines non structurales et les palindromes interfèrent avec la vie cellulaire. Signalons toutefois que dans certains systèmes étudiés, les protéines NS sont exprimées de façon comparable dans les cellules normales (pourtant résistantes à l'infection) et les cellules transformées. Nous ne disposons pas de données systématiques suffisantes permettant d'expliquer ce phénomène.
mais il apparaît que La transformation ait notamment pour effet de modifier Les protéines non structurâtes et/ou Leurs cibLes.
7.4. Facteurs iapLiqués dans La cytotoxicité parvovirale (37).
-Le parvovirus est un virus Lytique. Toutefois^ son effet cytotoxique ne requiert pas nécessairement L'accompLissement du cycLe compLet; ainsi Les séquences terminâtes (paLindromes)ainsi que Les protéines non structurâtes (NS chez Les parvovirus autonomes, Rep chez Les adéno-associés) ont un effet direct sur Le métaboLisme ceLLuLaire :
- Les paLindromes inhibent L'ampLification de L'ADN des ceLLuLes transformées, phénomène souvent associé à La transformation, probabLement en interagissant avec des facteurs requis pour cette ampLification.
outre L'effet pré-cité. Les protéines non structurâtes sont capabLes de perturber L'expression génique contrôLée par des promoteurs hétéroLogues et sont capabLes d'inhiber La transformation stabLe par de L'ADN exogène ainsi que par Le virus du papiLLome bovin. Enfin, comme nous Le verrons à La fin du point 7.3., Les protéines non structurâtes ont égaLement un effet cytocide.
-Dans notre Laboratoire, nous avons participé à cette étude (voir articLe IV,annexe) en recherchant Les facteurs viraux responsabLes de La toxicité du parvovirus MVMp vis-à-vis des ceLLuLes NB-E (ceLLuLes humaines transformées par Le virus SV40). En voici un bref résumé : si L'on transfecté cette Lignée avec Le pLasmide pSV2 néo, qui confère La résistance à La généticine. Le pLasmide s'intégre et L'on observe L'apparition de transfectants stabLes. Si L'on co-transfecte ce même pLasmide pSV2 néo avec un cLone infectieux du parvovirus MVMp (pMM984),
Le nombre de colonies résistantes à L'antibiotique chute brutalement : Le parvovirus inhibe donc de La transformation. Grâce à une série de délétions/mutations ponctuelles successives, nous sommes arrivés à La conclusion que La protéine NS-1 est nécessaire à cette inhibition et que NS-2 agit en synergie. Comme L'expression du pLasmide pSV2 néo est sous Le contrôle du promoteur précoce du virus SV40, nous avons vérifié L'effet des plasmides parvoviraux sur -e promoteur Lors d'expériences de co-transfection transitoires : NS-1 n'inhibe pas L'expression dirigée par Le pLasmide pSV2-cat (contrôlé par le promoteur de SV40), alors qu'elle inhibe bien L'expression dirigée par Le LTR du sarcome de Rous (pRSV-cat).
Il apparaissait donc probable que NS-1 exerce une action cytotoxique directe sur Les cellules NB-E. Il restait toutefois à vérifier que cet effet cytotoxique apparent ne résultait pas d'une inhibition par NS de l'intégration du pLasmide pSV2 néo dans l'ADN cellulaire. Ce problème a été résolu par Perrine Caillet - Fauquet et co-auteurs (39) : Ils ont obtenu des clones ayant intégré NS sous le contrôle du promoteur (LTR) du virus MMTV; L'induction du promoteur par la dexaméthasone provoque la mort cellulaire, confirmant L'hypothèse que les protéines non structurales peuvent avoir un effet cytocide sur La cellule.
7.5. Réversion du phénotype transformé (37).
Bien qu'observé à présent uniquement chez les AAV, ce phénomène mérite d'être cité, car il constitue un mode possible de l'action antitransformante des parvovirus. Ainsi, des cellules de hamster transformées par un adénovirus et infectées par AAV voient leur
concentration intracellulaire en antigène tumoral 58K (codée par E1B) diminuer de façon drastique. De même, AAV pourrait exercer une inhibition semblable sur des oncogènes cellulaires (c- myc et c- ras).
7.6. Et le futur ?
On peut conclure que les interactions cellules-parvovirus sont très complexes et que l'utilisation du parvovirus à des fins thérapeutiques chez l'homme requiert une connaissance plus approfondie des facteurs cellulaires qui contrôlent le cycle viral. C'est cette étude qui constitue le fil conducteur de cette thèse :
-mettre en évidence des facteurs cellulaires, modulés par la transformation, interagissant spécifiquement avec le génome parvoviral (article II)
-identifier ces facteurs et déterminer leur zone d'interaction avec l'ADN parvoviral (article III)
-déterminer les effets de la transformation sur ce facteur (résultats complémentaires)
-et enfin mesurer l'effet de ce facteur purifié sur la réplication de l'ADN parvoviral in vitro (résultats complémentaires).
II-Résultats expérimentaux
Article I : Aaplification de L*ADN parvoviraL en fonction de la transforaation de la cellule hôte.
Cette étude confirme et élargit les données de la littérature montrant une sensibilité accrue, d'une part des fibroblastes murins transformés par Les oncogènes d'origine cellulaire (c-Ha-ras-1) ou virale (poLyoma middle T) à l'infection par Le virus MVM (40) et d'autre part de fibroblastes humains tranformés par Le virus SV40 à infection par H-1, étude à laquelle nous avons d'ailleurs participé (41). Dans ces systèmes. L'augmentation de sensibilité était en corrélation avec une stimulation de L'amplification de l'ADN parvoviraL. Notre publication (article I) étend ces observations à des fibroblastes humains transformés in vitro par des rayons ou par l'oxyde de 4-nitroquinone, un carcinogène chimique, ainsi qu'à une lignée dérivée d'un fibrosarcome, infectés par les parvovirus MVMp et H-1. Grâce à L'utilisation de virus radioactif, nous avons pu montrer, dans un couple de fibroblastes humains normaux (MRC-5) et transformés par SV40 (MRC-5V1), que cet accroissement du taux d'amplification ne résulte ni d'une augmentation de l'adsorbtion du virus, ni d'une stimulation du taux de conversion de l'ADN monocaténaire en forme réplicative monomérique (voir figure 1,B,, étape 1). L'amplification de L'ADN parvoviraL s'accompagne de la fixation de protéines, dont L'origine n'a pas été déterminée, aux extrémités du génome. L'identification de L'un ou de l'autre de ces facteurs (cellulaire) fera l'objet de notre travaiL ultérieur. Dans une étape subséquente (42), nous avons
mont ré que Les fibroblastes transformés précités sont plus sensibles à l'infection parvovirale que les
dont ils dérivent, et que cette sensibilité nécessairement associée à une stimulation de particules virales infectieuses.
cellules normales accrue n'est pas La production de
