Le cycle viral

6.1. Cycle lytique

a) Adsorption des virions

L'adsorption des virions se fait via des récepteurs spécifiques dont La nature est encore mal connue ; toutefois Le prétraitement des cellules à la neuraminidase et à la trypsine empêchent l'adsorption, suggérant L'implication de résidus d'acide N-acétylneuraminique et d'éléments protéiques pour la reconnaissance des virions.

Le nombre des récepteurs est évalué entre 10^ et 5.1,0^ par cellule, suggérant l'implication de nombreuses protéines d'une même espèce. La présence de ces récepteurs constitue La première "barrière" à

L'infection parvovirale et dépend de L'état de différentiation de La ceLLuLe : ainsi, La Lignée des Lymphocytes B est dépourvue de récepteurs pour Le parvovirus MVMp.

b) InternaLisation et décapsidation

Les virions sont incLus dans des corps muLti-vésicuLaires et des hétérophagosomes pour être transportés vers Le noyau. Si Les observations au microscope éLectronique ont permis de suivre Le virus jusqu'au noyau, sa décapsidation reste un probLème non résoLu. L'absence de génomes Libres en quantité déceLabLe dans Le cytopLasme suggère que La décapsidation à bien Lieu dans Le noyau. Le processus de décapsidation n'est pas éLucidé. La nature de L'interaction capside-ADN est maL connue , tout au pLus sait-on qu'eLLe fait appeL à des forces ioniques ; ainsi Le traitement à La formamide, qui diminue La force ionique, a pour effet de dégager L'ADN de sa capside, LaqueLLe reste toutefois attachée à une extrémité du génome. IL est en tout cas probLabLe qu'eLLe protège efficacement L'ADN parvoviraL contre "L'agression" par des nucLéases ceLLuLaires tout au Long du cycLe infectieux. J'ai personneLLement comparé La sensibiLité à La DNAse -I de virions radiactifs (MVM dont L'ADN est marqué au phosphore 32) extraits au moyen de détergents doux de noyaux de ceLLuLes

f

normaLes et transformées, après différentes durées d'infection et j'ai observé une parfaite résistance de tout Le matérieL radioactif au traitement enzymatique. Un témoin de ceLLuLes A9, où Le taux de conversion de L'ADN parentaL en formes répLicatives mono- et dimériques et par conséquent Le taux de décapsidation atteint Les 15% montrait La même résistance. Dans tous Les cas, L'ADN parvoviraL

amplifié (radioactif ou non) était toutefois clivé par la DNAse -I : par conséquent, la durée de non-protection de l'ADN simple brin par des protéines (cellulaires ou virales) est très courte.

c) Réplication et expression

Ces processus, ainsi que les facteurs potentiellement impliqués dans chaque étape, ont été décrits en détail dans les paragraphes 3 et 4.

d) Assemblage et maturation des virions

Les protéines associées avec l'ADN simple brin et susceptibles de participer à son encapsidation sont mal connues ; leur étude est

rendue plus compliquée encore par le fait que la fraction d'ADN complexé avec ces protéines varie d'une préparation à l'autre. Des expériences de marquage ont montré que la protéine terminale restait attachée à l'extrémité 5' du brin viral durant les 10 minutes qui suivent l'encapsidation. D'autre part, la stabilité en gradient de chlorure de césium n'est acquise qu'après 10 à 15 minutes d'encapsidation : la densité passe alors de 1.44 à 1.41 g/cm3 ; toutefois aucune corrélation entre ces deux phénomènes n'a pu être établie jusqu'à présent. Les parvovirus MVM et H-1 qui ont été étudiés tout au long de notre travail encapsident à plus de 99% le brin négatif (complémentaire de l'ARN), alors que d'autre parvovirus (LuIII et B19) encapsident les deux polarités avec la même fréquence. Comme on retrouve ces mêmes proportions pour les virus H-1 et Lu III se répliquant dans la même cellule, il est problable que le choix de

la fibre soit mené par un facteur viral, plutôt qu'un facteur cellulaire, ce facteur étant situé au niveau des extrémités puisque des génomes constitués uniquement des régions palindromiques sont encapsidés correctement. Il est probable que les signaux soient portés sur le palindrome de droite, puisque le brin viral est encapsidé par synthèse de déplacement (direction 5*—►S'). Une fraction seulement des capsides préformées encapside l'ADN parvoviral.

6.2. Infection non productive

Comme nous l'avons mentionné au préalable, heureusement peu de lignées cellulaires réunissent toutes les conditions nécessaires pour permettre la réalisation d'un cycle viral complet (1) ; nous avons parlé de l'importance de deux facteurs : croissance (facteurs requis durant la phase S) et état de différentiation (les cellules peu différenciées sont en général plus sensibles à l'infection parvoviraie). Il faut cependant noter que cet état de sensibilité n'est pas un phénomène irréversible, puisque l'on peut sélectionner dans une lignée sensible des mutants qui ont acquis la résistance à l'infection : le cycle parvoviral est affecté à l'une ou l'autre étape et l'on assiste à une modification du phénotype de la cellule, modification qui est fonction de la barrière acquise à l'infection productive ; dans l'autre cas cette interaction non productive virus-cellule hôte peut également donner lieu à la lyse cellulaire... Ces mutants constituent un outil précieux pour l'étude du cycle parvoviral et en particulier des facteurs cellulaires impliqués dans La réalisation de ce cycle, puisqu'ils ont permis de dissocier des processus pourtant tellement imbriqués tels la réplication de L'ADN et son expression.

7.Etude du phénomène d'oncosuppresssion

7.1.Inhibition de la cancérogenèse in vivo (37)

Comme nous L'avons dit dans La section 1 (avant-propos). Les parvovirus exercent une action antitumoraLe chez Les animaux de Laboratoire. Cette protection contre La cancérisation peut être préventive et, dans une moindre mesure, curative.

C'est HeLen TooLan qui pour La première fois en 1967 montre que Les hamsters infectés de façon chronique par des virus H déveLoppaient de 5 à 25 fois moins de tumeurs spontanées par rapport aux animaux contrôLes. Cette surveiLLance parvoviraLe s'exerce égaLement avec un taux d'au moins 50% à L'égard de tumeurs induites par des virus oncogènes, par un carcinogène chimique. Le DMBA, et égaLement par des greffes de ceLLuLes tumorigènes : dans ce cas une expérience réaLisée dans notre Laboratoire (38) montre que Le parvovirus H-1 exerce une action antitumoraLe préventive (85%), mais aussi suppresssive (50%) contre des impLants de ceLLuLes épithéLiaLes mammaires humaines dans des souris nues.

Chez L'homme, qui est porteur des parvovirus AAV2,3,5 ,B19 et H-1, on pourrait égaLement s'attendre à ce que Les individus séropositifs soient protégés contre Le cancer, mais on ne dispose actueLLement que peu d'informations : certaines données épidémioLogiques tentent toutefois à montrer une corréLation inverse entre Le taux de carcinome cervicaL et La séropositivité pour Le virus AAV. En ce qui concerne une action thérapeutique éventueLLe, une tentative de traitement de patientes atteintes d'ostéosarcome avancé par Le parvovirus H-1 s'est révéLée infructueuse, maLgré Le déveLoppement d'une virémie après infection. Cet échec peut être attribué à de nombreux facteurs : manque

de tropisme du parvovirus pour ce type de tumeur, réaction immunitaire du patient, ou encore état trop "avancé" de La maladie qui ne permet plus une accessibilité complète au virus. Avant donc d'utiliser le parvovirus comme thérapie du cancer, il convient donc d'étudier Le mode d'action cytotoxique ainsi que les facteurs cellulaires impliqués dans le cycle viral.

7.2.Interaction tumeur/parvovirus (37)

A priori, on pourrait penser que Le parvovirus n'interagit pas directement avec la cellule (pré)néoplasique, mais qu'il est capable de moduler la production d'interférons ou La réponse immunitaire, comme c'est Le cas pour certains virus enveloppés produits par bourgeonnement au niveau de la membrane plasmique,...

Toutefois, certains résultats favorisent l'hypothèse d'une interaction directe virus - cellule transformée : ainsi,

-de nombreuses lignées transformées (fibroblastes, cellules épithéliales ou Lymphoïdes) transformées in vitro par des agents chimiques, physiques ou par des oncogènes viraux ou cellulaires sont en général plus sensibles que Les témoins normaux dont elles dérivent (voir point 7.3.)

-des lignées de cellules établies à partir de tumeurs, comme des fibrosarcomes, carcinomes, lymphomes sont également plus susceptibles à l'infection que des cellules normales correspondantes (voir point 7.3.). Comme, dans ces expériences, seuls Les celLules-cible et le virus sont mis en présence, il apparaît que le parvovirus puisse exercer son pouvoir cytocide en interagissant directement avec La cellule transformée.

Tabeau I. Transformation cellulaire et sensibilisation a l'infection parvovirale

Cell origin In vitro transforming

agent or tumor of origin

Parvoviruses

Murine V-myc, w-src, SV40 MVMp

fibroblasts PyV, pyMT, Ha-raj, AEV MVMp

Human SV40, 4NQO, y-rays H-1, MVMp

fibroblasts Ad5-Ela H-1

fibrosarcoma H-1, MVMp

Human SV40 H-1

épithélial HPV-16, Ha-ra5 H-1

cells Epidermoid and breast H-1

D'autres arguments plaident également en faveur d'une interaction directe in vivo entre la cellule tumorale et le parvovirus : ainsi,

-l'obtention de l'effet d'oncosuppression exige l'utilisation d'une souche parvovirale infectieuse, qui soit capable de se répliquer dans ce type de cellule tumorale

-de l'ADN parvoviral a été détecté dans des tumeurs en régression (36).

7.3 Lyse préférentielle par H-1 et HVH des cellules transformées (37,3 article I).

De nombreuses lignées de cellules transformées (humaines, de rongeurs) se sont donc avérées plus sensibles à l'infection parvovirale que les cellules normales dont elles dérivent. Le tableau I reprend les données obtenues pour une série de cellules humaines transformées in vitro par des agents chimiques, physiques, ou encore des oncogènes viraux et cellulaires; en outre, une série de cellules humaines établies à partir de différentes tumeurs sont également lysées préférentiellement par rapport aux cellules extraites du même tissu sain.

Cette sensibilité accrue à l'infection parvovirale n'est pas nécessairement en corrélation avec une augmentation de la production de particules virales infectieuses, ni même avec une plus grande capacité à répliquer et/ou exprimer le génome parvoviral. Comme nous le verrons dans le point suivant (7.4.), les protéines non structurales et les palindromes interfèrent avec la vie cellulaire. Signalons toutefois que dans certains systèmes étudiés, les protéines NS sont exprimées de façon comparable dans les cellules normales (pourtant résistantes à l'infection) et les cellules transformées. Nous ne disposons pas de données systématiques suffisantes permettant d'expliquer ce phénomène.

mais il apparaît que La transformation ait notamment pour effet de modifier Les protéines non structurâtes et/ou Leurs cibLes.

7.4. Facteurs iapLiqués dans La cytotoxicité parvovirale (37).

-Le parvovirus est un virus Lytique. Toutefois^ son effet cytotoxique ne requiert pas nécessairement L'accompLissement du cycLe compLet; ainsi Les séquences terminâtes (paLindromes)ainsi que Les protéines non structurâtes (NS chez Les parvovirus autonomes, Rep chez Les adéno-associés) ont un effet direct sur Le métaboLisme ceLLuLaire :

- Les paLindromes inhibent L'ampLification de L'ADN des ceLLuLes transformées, phénomène souvent associé à La transformation, probabLement en interagissant avec des facteurs requis pour cette ampLification.

outre L'effet pré-cité. Les protéines non structurâtes sont capabLes de perturber L'expression génique contrôLée par des promoteurs hétéroLogues et sont capabLes d'inhiber La transformation stabLe par de L'ADN exogène ainsi que par Le virus du papiLLome bovin. Enfin, comme nous Le verrons à La fin du point 7.3., Les protéines non structurâtes ont égaLement un effet cytocide.

-Dans notre Laboratoire, nous avons participé à cette étude (voir articLe IV,annexe) en recherchant Les facteurs viraux responsabLes de La toxicité du parvovirus MVMp vis-à-vis des ceLLuLes NB-E (ceLLuLes humaines transformées par Le virus SV40). En voici un bref résumé : si L'on transfecté cette Lignée avec Le pLasmide pSV2 néo, qui confère La résistance à La généticine. Le pLasmide s'intégre et L'on observe L'apparition de transfectants stabLes. Si L'on co-transfecte ce même pLasmide pSV2 néo avec un cLone infectieux du parvovirus MVMp (pMM984),

Le nombre de colonies résistantes à L'antibiotique chute brutalement : Le parvovirus inhibe donc de La transformation. Grâce à une série de délétions/mutations ponctuelles successives, nous sommes arrivés à La conclusion que La protéine NS-1 est nécessaire à cette inhibition et que NS-2 agit en synergie. Comme L'expression du pLasmide pSV2 néo est sous Le contrôle du promoteur précoce du virus SV40, nous avons vérifié L'effet des plasmides parvoviraux sur -e promoteur Lors d'expériences de co-transfection transitoires : NS-1 n'inhibe pas L'expression dirigée par Le pLasmide pSV2-cat (contrôlé par le promoteur de SV40), alors qu'elle inhibe bien L'expression dirigée par Le LTR du sarcome de Rous (pRSV-cat).

Il apparaissait donc probable que NS-1 exerce une action cytotoxique directe sur Les cellules NB-E. Il restait toutefois à vérifier que cet effet cytotoxique apparent ne résultait pas d'une inhibition par NS de l'intégration du pLasmide pSV2 néo dans l'ADN cellulaire. Ce problème a été résolu par Perrine Caillet - Fauquet et co-auteurs (39) : Ils ont obtenu des clones ayant intégré NS sous le contrôle du promoteur (LTR) du virus MMTV; L'induction du promoteur par la dexaméthasone provoque la mort cellulaire, confirmant L'hypothèse que les protéines non structurales peuvent avoir un effet cytocide sur La cellule.

7.5. Réversion du phénotype transformé (37).

Bien qu'observé à présent uniquement chez les AAV, ce phénomène mérite d'être cité, car il constitue un mode possible de l'action antitransformante des parvovirus. Ainsi, des cellules de hamster transformées par un adénovirus et infectées par AAV voient leur

concentration intracellulaire en antigène tumoral 58K (codée par E1B) diminuer de façon drastique. De même, AAV pourrait exercer une inhibition semblable sur des oncogènes cellulaires (c- myc et c- ras).

7.6. Et le futur ?

On peut conclure que les interactions cellules-parvovirus sont très complexes et que l'utilisation du parvovirus à des fins thérapeutiques chez l'homme requiert une connaissance plus approfondie des facteurs cellulaires qui contrôlent le cycle viral. C'est cette étude qui constitue le fil conducteur de cette thèse :

-mettre en évidence des facteurs cellulaires, modulés par la transformation, interagissant spécifiquement avec le génome parvoviral (article II)

-identifier ces facteurs et déterminer leur zone d'interaction avec l'ADN parvoviral (article III)

-déterminer les effets de la transformation sur ce facteur (résultats complémentaires)

-et enfin mesurer l'effet de ce facteur purifié sur la réplication de l'ADN parvoviral in vitro (résultats complémentaires).

Article I : Aaplification de L*ADN parvoviraL en fonction de la

transforaation de la cellule hôte.

Cette étude confirme et élargit les données de la littérature montrant une sensibilité accrue, d'une part des fibroblastes murins transformés par Les oncogènes d'origine cellulaire (c-Ha-ras-1) ou virale (poLyoma middle T) à l'infection par Le virus MVM (40) et d'autre part de fibroblastes humains tranformés par Le virus SV40 à infection par H-1, étude à laquelle nous avons d'ailleurs participé (41). Dans ces systèmes. L'augmentation de sensibilité était en corrélation avec une stimulation de L'amplification de l'ADN parvoviraL. Notre publication (article I) étend ces observations à des fibroblastes humains transformés in vitro par des rayons ou par l'oxyde de 4-nitroquinone, un carcinogène chimique, ainsi qu'à une lignée dérivée d'un fibrosarcome, infectés par les parvovirus MVMp et H-1. Grâce à L'utilisation de virus radioactif, nous avons pu montrer, dans un couple de fibroblastes humains normaux (MRC-5) et transformés par SV40 (MRC-5V1), que cet accroissement du taux d'amplification ne résulte ni d'une augmentation de l'adsorbtion du virus, ni d'une stimulation du taux de conversion de l'ADN monocaténaire en forme réplicative monomérique (voir figure 1,B,, étape 1). L'amplification de L'ADN parvoviraL s'accompagne de la fixation de protéines, dont L'origine n'a pas été déterminée, aux extrémités du génome. L'identification de L'un ou de l'autre de ces facteurs (cellulaire) fera l'objet de notre travaiL ultérieur. Dans une étape subséquente (42), nous avons

mont ré que Les fibroblastes transformés précités sont plus sensibles à l'infection parvovirale que les

dont ils dérivent, et que cette sensibilité nécessairement associée à une stimulation de particules virales infectieuses.

cellules normales accrue n'est pas La production de

Amplification of Parvoviral DNA as a

Function of Host-Cell Transformation

B. L. Avalasse, Y. Q. Chen, J. /. Cornelis, N. Duponchel,

P. Beccfuart, M. Namba, and J. Romm'elaere

Parvoviruses are small animal viruses that are widespread, in particular among mammals-, including humans.*'^ The genome of parvoviruses is characterized by its peculiar structure (a single-stranded DNA molécule with hairpin termini), small size (about 5 X 10^ nucléotides), and low genetic complexity.^ Consequently, parvoviruses strongly rely on host cells for their réplication. This is especially true for the subgroup of autonomous parvoviruses that replicate in the absence of a helpervirus ' in permissive cells. The ongoing life cycle of autonomous parvoviruses is conditional upon several facets of their host-cell physiology. Thus, productive infection by autonomous parvoviruses is restricted to pro- liferating cells that are in defined, often immature, différentiation States.Most parvoviruses were first isolated from tumors or related materials.' This fact originally raised the possibility that parvoviruses might play a causative rôle in neoplastic diseases; however, this spéc­ ulation was not supported by subséquent investigations showing that parvoviruses rather suppress both spontaneous and virally or chemically induced carcinogenesis.^"® Therefore, a more likely interprétation of the association of nondefective parvoviruses with cancer is that the virus was selectively picked by preexisting tumors, possibly as a resuit of its affinity for dividing and poorly differentiated cells. The réplication of parvoviruses is accompanied by a cytopathic effect and eventually causes the lysis of the permissive host cells; therefore, it was hypothesized that oncosuppression by autonomous parvoviruses might involve an oncolytic process and that the parvoviral life cycle may provide markers of ma- lignant transformation.^ Whereas the former possibility has not been substantiated so far, the latter is supported by recent experiments using

in vitro cell cultures.

Minute-virus-of-mice (MVM), an autonomous parvovirus, was shown to inhibit in vitro transformation of MVM-resistant mouse cells by the tumor virus SV40.'° This effect was ascribed to the killing of

Supported by the Services de Programmation de la Politique Scientifique (Belgium) and the Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (France) and by grants from the Caisse Générale d'Epargne et de Retraite (Belgium), Centre National de la Recherche Scientifique and Association pour la Recherche sur le Cancer (France) and Commission of

Avalasse et at. 141 SV40 transformants that displayed a greater sensitivity to MVM than their normal progenitors. Similarly, rodent cells transformed by onco­ gènes of cellular (c-Ha-ras-1) or viral (polyoma middle T) origin were found to be more susceptible to the cytocidal effect of MVM than normal parental cells.In ail Systems tested, the sensitization of transformed cells to parvoviruses did not appear to resuit from a more efficient virus uptake. Therefore, these results raise the possibility that transformation may overcome (an) intracellular limitation(s) to parvovirus réplication, which protect(s) normal cells from viral attack. Consistently, the greater sensitivity of a sériés of SV40-transformed human fibroblasts to the killing effect of parvovirus H-1 correlated with their enhanced capacity to support H-1 DNA réplication, as compared with normal cells.^ The présent study provides additional support to the use of parvoviral DNA réplication as a marker of cell transformation by showing that human fibroblasts derived from a fibrosarcoma or transformed in vitro by gamma rays or a Chemical carcinogen, 4-nitroquinoline 1-oxide, also achieve a greater amplification of MVM DNA than nçrmal cells.

The mechanism underlying the transformation-associated enhance- ment of the cell capacity to amplify parvoviral DNA is not known. Par­ voviral DNA réplication involves three successive steps consisting of (1) the conversion of parental single-stranded DNA to a double-stranded réplicative form (RF), (2) the réplication of RF DNA, and (3) the dis­ placement synthesis of progeny single strands.^^ Viral DNA synthesized in cells infected with several autonomous parvoviruses was isolated in a covalent complex with a protein.^^"'® This protein is specifically as- sociated with the 5'-ends of DNA réplicative intermediates and is prob- ably important for the réplication of the parvoviral genome. Other pro­ teins also appear to associate tightly but noncovalently with parvoviral RF DNA. At least some of the proteîns compl'exed with parvoviral DNA are likely to be of cellular origin.In this study, the transformation- sensitive step of parvoviral DNA réplication was investigated by com- paring the processing of MVM DNA in a pair of normal and SV40- transformed human lung fibroblasts. The fraction of parental single- stranded DNA recovered in a double-stranded form was similar for