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Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository

Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Flandroy, L. (1978). Contribution à l'étude de la signification biologique des variations de taux en nucléotides cycliques, principalement en cGMP, induites par les oestrogènes dans l'utérus de rat (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.

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?SITE LIBRE DE BRUXELLES

IT DE RECHERCHE INTERDISCIPLINAIRE EN

;e humaine et nucléaire :UR DU MEMOIRE : P. GALAND

CONTRIBUTION A L'ETUDE DE LA SIGNIFICATION BIOLOGIQUE DES VARIATIONS DE TAUX EN NUCLEOTIDES

CYCLIQUES. PRINCIPALEMENT EN cGMP. INDUITES PAR LES OESTROGENES DANS L'UTERUS DE RAT.

5*^0.

P

-1

MEMOIRE PRESENTE POUR L'OBTENTION DU GRADE DE DOCTEUR EN SCIENCES

LUCETTE FLANDROY

INIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES

NSTITUT DE RECHERCHE INTERDISCIPLINAIRE EN IDLOGIE HUMAINE ET NUCLEAIRE

IRECTEUR DU MEMOIRE : P. GALAND

CONTRIBUTION A L'ETUDE DE LA SIGNIFICATION BIOLOGIQUE DES VARIATIONS DE TAUX EN NUCLEOTIDES

CYCLIQUES, PRINCIPALEMENT EN cGMP, INDUITES PAR

LES OESTROGENES DANS L'UTERUS DE RAT.

Ce travail fut réalisé de 1975 à 1978 dans les laboratoires

de l'Institut Interdisciplinaire en Biologie Humaine et Nucléaire dans le cadre du programme des Actions Concertées (Ministère

de la Politique Scientifique). J'ai bénéficié pour l'entre­

prendre de l'appui financier de l'I.R.S.I.A. (Institut pour la Recherche Scientifique dans l'Industrie et l'Agriculture).

Au moment de présenter ce mémoire, je tiens à exprimerrici mon estime au professeur J.E. Dumont. Au travers des difficultés financières où se débattit la Recherche pendant les années où j'ai réalisé ce travail, il a manifesté un enthousiasme, une opiniâtreté, un souci d'objectivité et de critique constructive pour permettre à chacun de mener à bien les travaux qu'il

jugeait dignes d'intérêt. Je le remercie de m'avoir accueillie dans son laboratoire, de m'y avoir donné la possibilité de

poursuivre ce travail que j'y avais entrepris, de m'avoir,à plusieurs reprises,donné des conseils, des avertissements ou des encouragements constructifs.

Commencer sa vie d'adulte à une époque de crise, par un métier en crise (financière), dans un laboratoire particulièrement

et injustement touché par cette crise est parfois, j'ose l'avouer quelque peu "déroutant". Aussi est-ce avec une reconnaissance et un plaisir sans réserve que je remercie tout particulièrement les membres de l'Unité de Biologie de 1'I.R.I.B.H.N., grâce

à qui, malgré des contrariétés, ces années de crise ont réussi à être aussi des moments de joie et d'enrichissement intellec­

tuels et humains, dont cette thèse est un des fruits présents.

Paul Galand, qui a dirigé ma thèse, a contribué,par son enthou­

siasme raisonné, à me faire, au travers des aléas, garder le goût et apprécier la Recherche tout en supportant les déceptions et les petites servitudes. Sa lucidité, sa précision de pensée, sa clairvoyance mais aussi son intérêt et son amour spontanés devant les problèmes scientifiques et humains, sa volonté de convaincre, d'encourager et de collaborer pour construire, sa

curiosité critique toujours inassouvie sont parmi ses qualités qui m'ont aidée psychologiquement ou pratiquement dans la

réalisation de ce travail.

Nicole Mairesse m'a fait connaître et m'a appris à mesurer l'"IP", dont, à vrai dire, j'ai parfois rêvé, sans malheureu­

sement percer le secret de son rôle. La gentillesse de Nicole, sa patience, sa persévérance en science et en vie, ses encoura­

gements, ses péripéties sont pour moi autant de leçons que je la remercie chaleureusement de m'avoir offertes.

J'adresse aussi un vif merci à Jacques Roorijck, dont la

compagnie et la collaboration i nf a i 11 ib 1 es m': on t souvent aidée à supporter avec le sourire la monotonie des innombrables

incubations, injections et dosages.

Merci à tous ceux dont j'ai bénéficié d'un conseil avisé,d'une collaboration occasione11e,de la gentillesse ou de la sympathie.

Je remercie en particulier Jacqeline Van S ande,Christine Gervy, Elisabeth Schell , Viviane de Maerte1aer,et les DocteursBauduin^

Delcroix et Jean-Marie Boeynaems.

Je remercie aussi les chercheurs des laboratoires du Docteur Malaisse,des Professeurs Christophe,Heuson , Hubinont et Reusse

qui m'ont plusieurs fois aimablement procuré des produits ou permi d'utiliser leur matériel.

Je remercie aussi mes anciens professeurs qui m'ont initiéeà la Biologie et fait garder l'envie de poursuivre son étude; je remercie en particulier le Professeur Kram qui m'a initiéeà l'étude des nucléotides cycliques et m'a encouragéeà poursuivre la Recherche Scientifique.

Quant à Danielle Leemans, Ghislaine Wilmes et Madame Sacton, elles méritent toutes trois un merci admiratif et la médaille de la patience et de l'application pour avoir déchiffré les

"hiéroglyphes" de mes manu s c r i L-fc s .

Merci aussi à David Martins qui, grâce à la part de philosophie méditérranéenne qu'il a pu garder sous la grisaille de notre

pays, se débrouille toujours pour contenter tantôt plus vite.

tantôt moins vite^les demandes de tout le monde et faire

compter sur un temps record des milliers de fioles scintillantes même s'il n'y a que des centaines de places.

Quemes parents trouvent ici aussi la certitude de ma reconnais­

sance; ils sont certainement les premiers responsables des

qualités qui m'ont été nécessaires à la réalisation de ma thèse.

Enfin, je tiens à remercier ma grande soeur dont l'amitié fut, à plus d'une occasion, un atout des plus précieux au cours de ces années.

SOMMAIRE

INTRODUCTION GENERALE

Pages

1

I. Action hormonale et mécanismes de

de régulation biologique ...

1

II. But du travail ... ...

'il

III. Description du système biologique étudié :

oestrogènes - tissus cibles ... i5

MATERIEL ET METHODES

I. Matériel ... VÇ

II. Méthodes ... 4?

RESULTATS

I. Point de départ du travail : données de la littéra­

ture sur l'influence des oestrogènes sur la concen­

tration utérine en nucléotides cycliques -

Vérification de ces observations ...

6

IIj. Caractère spécifiquement oestrogénique de l'action des oestrogènes sur l'augmentation du titre en cGMP dans l'utérus de rats...

4

i O

Caractère oestrogénique direct de l'action des oestrogènes sur l'augmentation du titre

en cGMP dans l'utérus de rats . ... ..

3 ^

III. Rôle de la réponse cGMP dans l'action

oestrogénique ...

IIIj. Données sur la biologie de la réponse ;

son apparition dans différents tissus cibles

aux oestrogènes ... '10 8 III^. Relation entre l'évolution du taux en cGMP et

d'autres paramètres de la réponse utérotrophique.

IV. Elévation du taux en cGMP dans des cornes utérines incubées in vitro en présence d'oestrogènes ...'1 H 3

IV. Données sur le mécanisme de l'augmentation

du titre en cGMP ... ... 'l 4 1

CONCLUSIONS GENERALES ; DISCUSSIONS ; PERSPECTIVES

I. Résumé des résultats ... ...

loo

II. Conclusions directement tirées des résultats, intégrant la réponse cGMP dans le mécanisme

général de l'action des oestrogènes ...

hO^

III. Suggestions théoriques; perspectives expéri­

mentales visant à établir la signification biologique exacte des élévations du taux en

cGMP dans 1 ' ac t ion o es t rogéni que ... 2» 0 8

IV. Conclusions générales ... ...

IIH

ANNEXES

1. Baisse du taux en cAMP dans l'utérus de rats après traitement par l'oestradiol, l'oestriol

et la nafoxidine ...

Z l

2. Augmentation spontanée du taux en cGMP dans

l'utérus de rats au cours de l'incubation ...

LIS

BIBLIOGRAPHIE

ABREVIATIONS couramment employées dans le texte

cGMP : guanosine-3' 5monophosphate cyclique

CAMP : adénosine-3’ 5monophosphate cyclique

^2 oes tradiol

^3 oestriol

DES : diethylstilboestrol

UA : nafoxidine

RE :

c complexe oestrogène-récepteur cytoplasmique

RE :

n complexe oestrogène-récepteur nucléaire IP "induced protein" (Notides et Gorski, 1966)

FORMULES DES AGENTS HORMONAUX UTILISES.

CH3

Oestradiol -17 (b

Oestriol

Diethylstilboestrol

FORMULES DES AGENTS HORMONAUX UTILISES (ANTIOESTROGENES) .

ICI - 46, 474 (Tamoxifen)

CI - 628

U-11, 100 A

(Nafoxidinc)

IMTRODUCTION GENERALE

1.

I. ACTION HORMONALE et MECANISMES

de REGULATION BIOLOGIQUE

A« Généralités,

Pour assurer 1 * intégration fonctionnelle de•différents tis­

sus d* un organisme, les cellules échangent entre elles des mes­

sages sous la forme d’hormones. Une hormone est un médiateur chimique, produit généralement en petite quantité par une cel­

lule et qui, libéré dans le milieu intérieur Cle sang chez les animaux) est capable de provoquer un effet physiologique spéci­

fique dans une ce1lule—cible, distante de la cellule productri­

ce, Les hormones assurent l’harmonie fonctionnelle d’un orga­

nisme pluricellulaire en agissant sur le métabolisme de certai­

nes cellules de manière à l’adapter à des changements du milieu dont la production et la diffusion de l’hormone ad hoc sont une c ons équenc e,

Le contenu informationnel des hormones est strictement dé­

terminé par leur structure chimique et des structures chimiques parfois très voisines (cf les différents stéroïdes) ont, sur différents tissus, des effets physiologiques extrêmement variés.

Les hormones stéroïdes en particulier, notamment les oestrogè­

nes, ont, sur divers tissus,, des effets différenciateurs ou mi­

togéniques, variables suivant les tissus (voir p, IC ), Elles constituent donc un matériel de choix dans l’étude expérimentale de l’enchaînement des processus responsables de la différencia­

tion ou de la croissance cellulaire. L’étude du mécanisme d’ac­

tion de ces agents doit,par ai Heurs,répondre à des questions fondamentales concernant l’origine de la spécificité, d’une part, des ce 1lu le s—cible s, d’autre part, de la réponse fonctionnelle.

l.

B. Origine de la spécificité des. effets hoj:.mona.ux- Le-s, "Récep­

teurs".

L’origine de la spécificité tissulaire des effets Ivormonaux réside dans l’interaction entre l’h-ormone et une protéine spé­

cifique, Cette interaction représente le premier d’une série d’événements cellulaires constituant l’effet biologique d’une hormone. Un récepteur hormonal est une macromolécule cellulai­

re présentant une stéréocomplémentarité vis-à—vis d’une hormo­

ne particulière et présente en quantité appréciable uniquement dans les cellules-cibles de l’hormone correspondante^*^.

Une différence notable entre le mode d’action des stéroï­

des et des hormones polypeptidiques réside dans la localisation des récepteurs hormonaux,

a) Cas des hormones polypep t'idiques,

A la suite d’études relatives au mécanisme de la glycogé—

nolyse induite par 1 ’ épinéphrine et le glucagon, Sutherland (I960; 1965) a proposé un modèle de l’action des hormones po­

lypeptidiques dont la validité a été vérifiée dans de nombreux cas (Robison, 1968),

Selon ce modèle, en se liant à un récepteur présent au ni­

veau de la membrane cytoplasmique, les hormones polypeptidiques amorcent un enchaînement de réactions stimulées en cascade. Le déclic est, en 1 ’ occurlfence, la stimulation d’une enzyme mem—

(x) Dans son acceptation stricte, le terme de ré­

cepteur implique nécessairement que la molécule qui lie l’agent (hormonal ou pharmacologique) intervient ensuite directement dans l’action qu’il exerce. C’est donc improprement (ou du moins prématurément) que la protéine — liant - l’oestrogène „

(estrogen - binding - protein) est appelée "récepteur". Dans la suite du texte, nous nous conformerons cependant à l’usage en cette matière, le terme impropre étant d’application géné­

rale.

branaire, l^adénylate cyclase, ciui catalyse la conversion d’ATP en AMP cyclique et pyrophosphate. L’accumulation de cAMP ainsi provoquée serait, par des réactions de phosphorylation, pléio- typiques oii en cascade, responsable de l’effet physiologique final CKuo, 1969; Krebs, J972; Greengard, 1978),

Sutherland établit différents critères devant être respec­

tés pour assurer qu’une hormone agit par l’intermédiaire du cAMP :

- augmentation, par interaction de l’hormone avec son tissu cible, de la concentration intracellulaire du cAMP, précédant l’effet de l’hormone,

- activation, par l’hormone, de l’adénylate cyclase en pré­

paration acellulaire de tissus cibles,

- reproduction,dans un tissu-cible, des effets physiologi­

ques spécifiques de l’hormone par du cAMP exogène (ou un déri­

vé plus perméant et moins hydrolysable tel que le dibutyryl - CAMP).

- imitation ou potentialisation de l’effet hormonal par des inhibiteurs d’activité phosphodiestérase (enzyme d’hydrolyse du cAMP),

En raison de ce rSle d’intermédiaire de l’action hormonale, le cAMP a reçu le nom de second messager,

b) Cas des hormones stéroïdes.

Conceptuellement, les stéroïdes n’ont pas besoin d’inter­

médiaire du type cAMP, En effet, tandis que les hormones poly­

peptidiques déclenchent une série de réactions en cascade, par l’intermédiaire du système producteur de cAMP intracellulaire lié à la membrane, sans devoir pénétrer eux-mêmes dans la cel­

lule-cible, les évidences s’accumulent prouvant que les hormo­

nes stéroïdes agissent en pénétrant à l’intérieur du cytoplas­

me des cellules j ils s’y lient à des protéines réceptrices, qu’ils modifient en une forme transférable dans le noyau, en un complexe qui accède au support de l’information génétique lui- même,. où un rôle actif du récepteur transformé dans la réponse

4.

kormonale est fortement suggéré (voir détail

Si différents travaux, ont montré que certaines des conditions nécessaires pour conclure à un rôle de second messager du cAMP dans le mécanisme d^action des oestrogènes étaient effective­

ment remplies (voir p, ^2 ), ils n’ont pas apporté à cet égard de preuves suffisantes. On ne peut exclure, toutefois, que

l’effet hormonal final résulte de lâ coopération des effets de l'interaction (simultanée ou séquentielle) de l'hormpne avec différents sites cellulaires indépendants. En effet, si l'action des complexes stéroïde-récepteur nucléaires semble un facteur nécessaire de la réponse hormonale, rien ne prouve qu’elle en soit un élément suffisant. Il n’est pas exclu que certains ef­

fets à long terme (croissance, par exemple,) nécessitent, dans le cas des polypeptides aussi, la pénétration intracellulaire de l’hormone, A cet égard, des récepteurs insuliniques intra- nucléaires ont récemment été mis en évidence (Goldfine, 4977), L’existence de récepteurs intranucléaires aux hormones thyroï­

diennes a aussi été rapportée, dont la spécificité reste ce­

pendant discutée (Tata, 1975),

C, Modèle de régulation biolog.ique l’hypothèse du Y.in—Yang : rôles régulateurs du cAMP et du cGMP (dans l,’_a.ctio^i_ ,des hormones et des autres agents actifs sur les processus bio­

logiques ,

L’homéostasie d’un tissu implique l’influence de forces positives et de forces négatives, qui, en réponse aux change­

ments des conditions du milieu, ramènent le système vers un état, d’équilibre autour duquel il oscille sous l’influence de ces forces. Un tel système, soumis à l’influence de forces opposées, a été qualifié de bidirectionnel (Goldberg, 1973;

Go Idberg, 197 5)«

Alternativement, la réalisation de processus cellulaires complexes (tels que biosynthèse, stockage et sécrétion d’hor—

mones) peut nécessiter la synergie de différents signaux, qui concourent à sortir les cellules considérées d’un état de re­

pos, Un tel système, soumis à l’influence stimulante de diffé­

rents signaux, a été qualifié de monodirectionnel CGoldberg, 197J; Goldberg,

1911)

Ce concept de régulation biologique par action de forces opposées, a reçu le nom d’Hypothèsc Yin—Yang (Goldberg, 4973;

Goldberg, 4975), par référence à la philosophie orientale où ce terme symbolise le dualisme entre forces naturelles oppo­

sées qui, en certaines circonstances, peuvent interagir pour réaliser un événement synthétique.

Dans cette optique, il était raisonnable de considérer l’hypothèse de l’existence, face au cAMP, d’un (au moins) autre régulateur de l’activité cellulaire, agissant dans un sens op­

posé sur les mêmes processus cellulaires. Un autre aboutisse­

ment logique d’une réflexion "cybernétique" sur la cellule con­

duisait rapidement, dans le contexte de ce qui était connu pour le cAMP, à concevoir l’existence d’autres messagers inter­

venant dans des processus radicalement différents de ceux qui répondent au cAMP (Goldberg, 1975)

c’est ainsi que grandit rapidement l’intérêt suscité par la découverte du cGMP (Ashman, 1963),

Arguments_favorab le s_à_l2,Hy£o thése_Yin—Yang,

Il apparut que des hormones et autres agents qui augmen-^

tent la concentration tissulaire en cGMP ont, dans divers sys­

tèmes, des effets opposés à ceux des agents qui augmentent la concentration en cAMP (voir tableau

\

De plus, il est apparu que les 2 nucléotides cycliques joueraient des rôles régulateurs opposés dans des processus de prolifération et de différenciation cellulaire. En gros, le cGMP paraît favoriser la croissance, le cAMP semble favoriser l’état de quiescence en inhibant la croissance et promouvoir la différenciation. En effet.: a) la concentration des deux nu—

li

'1

Type îllulaire

Agent actif

Effet biologique

Taux en cGMP ou cAMP

Ré f érences

is c le irdiaque

Acétylcholine relaxation cGMP CAMP Isoprotéréno1 contraction \ cGMP

George,1970 L e e , J 97 2

^ S ■' ^

;le-utérus Metacholine contraction Z’ cGMP Lee,J 972 te -veines PGF^ »C contraction cGMP Schultzyj 9 73

cAMP Goldberg,4 975

- ^ ^.

aque ttes Collagène aggrégation cGMP revue dans nguines Phorb 01“

myris tate

Goldberg,J 975 Acide

as corbique

PGEj aggr éga tion i r> h i t é e

CAMP

- -s -v. \ N. -N. « \ X \ . V . ^ ^ ophiles

phonu- éaires

Agents

cholinergi- que s

libération enzymes lysosomiaUjt

X' cGMP

...

Ignarro ,1973 Zurier,J 973 Ignarro ,1976 Agents

-adrénergi que s

inhibition libération enzyme s lysosomiaUj par stimulus- phagocytiques

CAMP Go Idb.er g , J 977

ucocy tes agents cho—

linergiques agents o6~

adrénergiques PGF206

chémotaxie /^cGMP Estensen,1973

GoIdberg,1975 agents fi -

adrénergiques PGEj,PGE2

chémotaxie i n K 1 k < €

y*

leau

h

ndition de culture Taux de Taux de cAMP Taux de cGMP croissance (+ références) (+ références)

N / N

rivation de sérum

aute densité cellulaire Seifert, 1971 Rudland, 1974 résence d'hormones > KramV^1973 Moens, 1975

nhibant la croissance Oey, 1974

(PGE,)

‘ > Rudland, 1974

Moens, 1975

^ N. ^

idition de sérum frais idition de facteurs de cois sance

[ÎF^ ^ + insuline

Rudland, 1974 Rudland, 1974 Mo en s, 19 75 S e i f er t^^ 1 9 7 4

Rudland, 1974 Moens, 1975 De Asua, 1975

action par virus 3gène thermosensible

Sb^C (virus actif) 40'’C (virus

inac tif)

N.

Otten, 1972

3-

eau 3 Effet de nucléotides cycliques ou de dérivés exogènes sur la croissance cellulaire (de fibroblastes)

4

éotide cyclique té au milieu de ur e

Effet sur la croissance Références

butyryl cAMP inh-ibition de la croissance de :

theophylline - cellules embryonnaires de rats Frank.,4 972 - cellules CHO(d ’ ovaires de Ro zengur t ,-J 97 2

hamster chinois)

- fibroblastes de peau Froehlich,4972 inhibition de la transformation 0tten,4972 cellulaire par virus thermosen­

sible ^

inhibition de la "réponse Kram,J973 pléiotypique" (ensemble de

réactions biochimiques stimulées ou inhibées de façon coordonnée en fonction de l^état de croissance )

MP stimulation de la repense Kram,4973

MP stimulation de la réponse Pléiotypique

g

eau Effets différenciateurs- du cA_MP (ou du dibutyryl cAMP)

V. .--v. . .•

cellulaire Effet du cAMP ou de DB cAMP

Références

'v-v. >v V V V. -V •N.'xx'v.

3b las tes rétabliss ement 3 f orme s — d’une morphologie

fibroblastique

Hsie,4 97.1 Johnson,-! 974

— des propriétés

d’adhésion au substrat

Porter,4 974 Wiltingham,4 975 3blastones différenciation

- morphologique

Prasâd,4 974 Furmansk.i,4 974

— biochimique Prasad,4 97 2

Waymir e ,4 97 2

Las tes fusion Aw, 1 97-3

Ep s tein,4 97 5

lome s - dépôt de mélanide Wong,4 97 3

- stimulation de l’activité de tyrosinase

ir de la inhibition de la croissance Masui,4974 male altération morphologique

stimulation de la stéroïdo­

gène s e les épithélia—

e la lentille

- potentialisation de la croissance accompagnant la différenciation

Creighton,4974

- accélération de l’appa­

rition de-cris tallin

. - . ---

b 1 b I \ O c|^ r d 11 T-v « V a.' K i ,■

r' <-\ 2i t' vt â' C-c I'A. lu 1 >i â U

t r à >/ A 1 \ J

r e r ou

cléotides varie dans un sens conforme à ces rôles, respectifs sous l’effet d’agents prolifératifs ou diffêrenciateursr b) dans certaines cellules transformées, ni le titre en cAMP, ni le taux de croissance ne sont sensibles à des conditions du mi­

lieu extérieur qui modifient les deux paramètres dans les cel­

lules normales COtten, J97J); c) l’addition exogène de cAMP ou de cGMP à certains systèmes induit ou potentialise l’effet obtenu par les agents qui y provoquent leur accumulation res­

pective.. Ges types d'arguments sont - illus trés dans les

tableaux Z et !> , qui de manière non exh-austive, regrou­

pent des travaux essentiels sur les relations entre croissan­

ce et nucléotides cycliquesj effectués sur des cultures de fi­

broblastes. Le tableau 4 résume plus particulièrement des effets différenciateurs du cAMP sur des cellules transformées ou embryonnaires. Prolifération et différenciation étant des processus souvent considérés comme mutuellement exclusifs, on accepte aisément les effets du. cAMP à la fois différencia­

teurs et inhibiteurs de la croissance.

Arguments^contredisant l’hypothèse Yin—Yang.

Cependant, au fil des travaux cherchant à vérifier l’h.y — pothèse simplificatrice et séduisante des rôles opposés du cAMP et du cGMP dans des processus biologiques, le rôle des nucléotides cycliques et du cGMP, en particulier, reste ou re­

devient obscur : (*)

(*) : Rappelons ici que, dans les différents systè­

mes mentionnés, l’un, et non des moindre^V^ritères du rôle de

second messager hormonal définis par Sutherland pour le cAMP, n’a pu ôtre satisfait pour le cGMP : il s’agit de la stimulation de

la guanylate cyclase (l’enzyme catalysant la formation du cGMP à partir de GTP) dans des systèmes acellulaires de tissus, par les hormones qui augmentent le titre en cGMP dans ces tissus.

Cet insuccès pourrait s’expliquer par l’absence ou la détério­

ration en système ace 1lu laire, d’éléments intermédiaires entre le récepteur hormonal et l’enzyme qui, contrairement à l’adé—

nylate cyclase membranaire, est en grande partie cytoplasmique ( Kl mu J 1 9 7 Ç ),

4>1.

— D*une part, le rôle du cGMP dans des processus tvormonaux est fortement remis en question du fait que, dans certains sys­

tèmes, des réponses diamétralement opposées sont l’une et l’au­

tre accompagnées d’accumulation en cGMPo Ainsi, les premières observations avaient associé à l’action d’agents contractiles des élévations du taux en cGMP et des diminutions du taux en cAMP dans les muscles lisses Cvoir tableau i et Lee, 1972;

Schu1tZ®1973), Mais des études plus récentes ont associé des élévations du taux en cGMP à l’action de certains agents re­

laxants (qui ne modifient pas, par ailleurs, le taux en cAMP) dans ces tissus (Katsuki, 1977; Diamond, 1976; Schultz, 197é;

S c U ^ . Le rôle du cGMP, s’il en est, dans la mobilité du muscle lisse est donc à présent indéfini. D’autre part, dans le muscle cardiaque, il existe une dissociation nette entre la concentration de carbamyIcholine qui diminue la con­

tractilité et celle qui élève le taux en cGMP (Brooker, 1977).

Un autre système encore où le rôle du cGMP comme intermédiai­

re hormonal est remis en question, est celui des plaquettes

sanguines où^contrairement aux agents mentionnés dans le tableau q. , l’ascorbate élève le taux en cGMP sans favoriser l’accu-

b «r p-f > l'-ri ^ 1)

mulation des p laque tte"slG^ L’imp Ir cation de différents comparti­

ments subce 1lulaires de cGMP peut évidemment être invoquée dans ce cas O

- D’autre part, il semble qu’on ne peut généraliser à, tous les types cellulaires les rôles régulateurs respectifs du cAMP et

(je) du cGMP sur la croissance et la différenciation

(*) : A cet égard, aucune explication certaine n’est encore fournie pour rendre compte des résultats contradictoires selon les auteurs quant au rôle positif soit du cGMP (iladden,

1972 ; Hadden, 1 973; Johnson, 1 975, (&) ; Johnson, J 975 , (p ) soit du cAMP (Hirschorn, 1970; Krishnaraj, 1973; Parker, 4974), dans la prolifération de lymphocytes. On considère généralement que l’hétérogénéité cellulaire des populations de lymphocytes considérées est responsable du manque d’homogénéité des répon­

ses observées, (voir revues dans Past^n ^ 4 975; Friedman, 4 976) ; les deux signaux (accumulation de cAMP; accumulation de cGMP) pourraient provenir de types cellulaires distincts qui coopèrent à l’accomplissement de la réponse immunologique et proliférati­

ve (Watson, 1975),

a) Dans un système biologique au moins, le foie en régénération, on n’a pu détecter aucune élévation du taux en cGMP tandis que deux vagues d’augmentation en cAMP semblent jouer un rôle posi­

tif dans l’hyperplasie compensatrice ( Mac Ma—

nus, J973; Bailey, J975; Short, J975), Une explication à ces divergences apparentes entre systèmes, quant au rSle des nu­

cléotides cycliques dans le contrôle de leur état de croissan­

ce, pourrait être le fait que l’état de repos de différents ty­

pes cellulaires n’est pas identique; dès lors, la stimulation de la prolifération signifierait la levée d’une inhibition à différents stades du cycle cellulaire selon les tissus CFried—

man, 1976); selon la période du cycle, le cAMP pourrait soit fa­

voriser soit inhiber la progression de la crois sance» Une au­

tre explication serait qu’il y a effectivement une variabilité tissulaire dans les réponses de croissance aux nucléotides» On peut aisément comprendre que différents tissus aient à fournir des réponses différentes, voire opposées, à des changements de conditions du milieu, annoncées par des hormones circulantes, dont le message serait transmis à l’intérieur des cellules par les nucléotides cycliques,

b) Des élévations du taux en cGMP semblent accompagner des pro­

cessus de différenciation :

■ ■ ■ ■ ■ , ■ . ■ - ■ . I. I, ^ l ■ L. I 1. ■ L I . 1. ■ I m ■ ■■ ■ ■■ I I ■ I. 1 I. . I, I. 1^ ^ ^ ,

(*) ; Les variations de taux en cGMP et en cAMP au cours du cycle cellulaire ont été suivies dans différents types de cellules synchronisées sans apporter jusqu’à présent de ré­

sultats absolument homogènes CSeifert, J974, @ ; Seifert, 1974, ; Zeilig, 1972; Zeilig, 1977), Il ressort toutefois de ces différentes études, que le taux en cGMP semble augmen­

ter et le taux en cAMP diminuer au cours de la mitose; au cours de Gj,par contre, le taux en cAMP paraît maximal et présente selon certains auteurs, un pic en début et un pic en fin de cette phase.

>13

- le taux en cGMP s’élève, dans, différents systèmes, en répon­

se à l’érythropoïétine, préalablement à la différenciation éry- throïde de ces tissus (Rodgers, 1 976) , Cette situation particu­

lière pourrait toutefois ne pas contredire l’hypothèse du rSle du cGMP dans la croissance et celui du cAMP dans la différencia tion dans la mesure où, dans ce cas précis, le phénomène de différenciation ne se réalise qu’au cours d’une prolifération accélérée» D’autres situations se concilient moins avec ce schéma :

- Une forte augmentation du taux en cGMP accompagne la pha­

se de cytodifférenciation qui, alors qu’il y a arrSt de la croissance, conduit à la sporulation du champignon Blastocla—

diella emersonii (Silverman, 1975),

- Dans l’oviducte de poulet immature, le titre en cGMP aug­

mente en réponse à une première injection d’oestradiol, tandis qu’il n’augmente pas s’il s’agit de la stimulation secondaire d’un oviducte différencié (Schumacher, 1977), Ceci contredit le schéma originel des rSles attribués au cGMP et au cAMP dans la mesure où, précisément, seule la stimulation oestrogénique

primaire d’un oviducte immature correspond à un réel processus de différenciation : un épithélium indifférencié se spécialise, en effet, irréversiblement en trois types cellulai­

res distincts qui sécréteront ultérieurement trois types de protéines spécifiques différentes (0’ Malley, 1969), Les sti­

mulations oestrogéniques ultérieures ont pour effet d’induire la production intense de ces protéines et la multiplication de cellules déjà différenciées,

A supposer qu’ils jouent des rSles régulateurs dans le mé-?

tabolisme cellulaire, il faut donc admettre, qu’au stade actuel on ne peut établir un schéma général de l’action des nucléoti­

des cycliques. Des considérations contradictoires, comme celles rapportées ci-dessus, tendraient même à- rejeter un rSle impor­

tant du cGMP dans la régulation de l’activité cellulaire.

Decouvertes, rëc&ntss relatives au mëtab o 1 Isme du c^P,

L^intërêt portë au cGMP s’est cependant justement ravivë par des dëcouvertes récentes» Différentes substances azotées, par ailleurs muta.gènes ou cancérigènes, sont capables de stimu­

ler l’activité guanylate cyclase d’homogénats totaux et de fractions purifiées de la plupart des tissus, par un processus incomplètement éclairci, indépendant du Ca^"*" (contrairement à la plupart des augmentations en cGMP hormono-dépendantes)

(De Rubertis, 1976; Kimura, 1976; Kimura, 1975; revue dans Mittal, 1977)» Ces différentes substances azotées partagent la

capacité de se transformer en oxide nitrique, NO, soit par ré-s*

duction (c’est le cas des nitrosamines, de la nitroglycérine, des nitrosurées, du nitroprussiate de sodium, de nitrites)

soit par oxydation, dans ce dernier cas, à l’intervention d’une activité de catalase ou de peroxidase en présence d’H202 (Miki, 1976; Mittal, 1977) (c’est le cas de l’azide de sodium, de

1’hydroxylamine)» L’oxide nitrique est effectivement apte s stimuler par lui-même,en quelques secondes,1’activité guanyla—

te cyclase (Arnold, 1977)»

Un autre radical libre, le radical h.ydroxyl, OH, stimule également l’activité guanylate cyclase par un mécanisme direct

(White,1976; Mittal, 1977).

La stimulation de l’activité guanylate cyclase par chacun de ces radicaux libres est inhibée par des antioxydants, notam­

ment des agents réducteurs des groupes thiols SH CUe Rub.er-^

tis, 1977) et correspond donc probablement à une activation allostérique de l’enzyme par modification de son état d’oxydo- réduction sous l’effet de ces radicaux libres. L’activation de

la guanylate cyclase par des acides gras (.Wallacl\, 4 976, Glass, 1977; Hidaka, 1977) résulte probablement de leur oxydation ou de leur transformation en peroxydes produisant des radicaux hydroxyl (Hidaka, 1977),

Une activation spontanée de l’activité guanylate cyclase de différents systèmes biologiques maintenus in vitro se pro­

duit également jpar altération des conditions d’oxydo—réduction du milieu (Chrisman, 1975; White, 4976; Kraska, 4977),

Certains auteurs pensent même, actuellement, que 1 a né—

^5 .

cessité du çalcium dans l’accumulation de cGMP produite par de nombreux agents résulte de l’effet de ce cation sur l’acti­

vité ph-osplrolipasi que CDerksen, 1 975), qui libère des acides gras, producteurs potentiels de radicaux hydroxyl CEgan, 1976),

Ce mécanisme d’activation de la guanylate cyclase par des radicaux libres pourraient donc bien constituer un processus physiologique de régulation du taux en cGMP et représenter une voie nouvelle d’étude du rôle de ce nucléotide. Le caractère cancérigène des composés azotés actifs donne aussi un regain d’intérêt au rôle potentiel du cGMP dans la régulation de la croissance cellulaire.

Cependant, il faut reconnaître que le rôle précis du cGMP reste jusqu’à présent essentiellement une énigme.

L’étude de systèmes où l’on peut faire varier en parallè­

le ou indépendamment certaines réponses biologiques précises en comparant les fluctuations en cGMP dans les mêmes conditions reste donc d’un intérêt certain pour cerner le ou les rôles physiologiques de ce nucléotide cyclique.

Mécanisme moléculaire d^action du^cAMP_ et du CGMP,

Le cGMP, comme le cAMP, semblent agir par la régulation de l*activité de protéines-kinases. Des protéines—kinases dont l*activité dépend spécifiquement du cGMP ont en effet été déce­

lées à présent dans différents tissus de mammifères (Hofmann, 1972; Nakazawa, 1975; Takai, 1975; kuo, 1976; Gill, 1976; De Jonge, 1977; Gill, 1977), Des substrats protéiques endogènes de kinases cGMP-dépendantes ont été mis en évidence dans le mus­

cle lisse (Casnellie, 1974) et l'épithélium intestinal (De Jonge, 1976).

Les deux types de kinases (cAMP et cGMP-dépendantes) at­

teignent cependant parfois des substrats semblables en des sites identiques (Hashimoto, 1976; KLoo, 1977; Lincoln, 1977), ce qui a suggéré à certains auteurs (Lincoln, 1977; Gill, 1977)

qu^elles dériveraient d’un gène ancestral commun. Leur structu­

re quaternaire diffère cependant ; les protéines-kinases cAMP- dépendantes sont constituées de 2 sous—unités catalytiques et de 2 sous-unités régulatrices dont la liaison au cAMP provoque la séparation. Des études récentes indiquent que les protéines- kinases cGMP-dépendantes sont constituées de 2 polypeptides portant chacun une unité régulatrice et une unité catalytique;

chaque cha'ine présente toutefois un point d’hydrolyse facile, responsable probablement de leur inactivation rapide (Gill;

197 6 ; Gill , •. 1 977) .

II. BUT D U TRAVAIL

Ao. Intérêt^ de exp,érlmeiv.tal ahoLsi.

' ' ». '■ ' I. . i. 1.^ ^ ^ - V ■ k ■ ' ■ I ■■ ■■ I ■ I . I n

Dans la foulée des travaux visant à comprendre les rSles régulateurs du cAMP et du cGMP, KUeh.1 et collab, (K'^eh-1, J 974) mirent en évidence une augmentation progressive et nette du

taux en cGMP dans l^utérus de rats traités aux oestrogènes, en même temps qu’un abaissement plus modeste du titre en cAMP, Ce système présente des intérêts évidents pour recbercber un rêle physiologique du cGMP :

— L’utérus de rats traités aux oestrogènes est un système phy-?- siologique, évitant les inconvénients éventuels des situations non physiologiques de certaines conditions artificielles telles les cultures de tissus (nous avons rappelé, par exemple, l’oh~

servation récente que l’activité guanylate cyclase peut augmen­

ter spontanément in vitro, en fonction des conditions d’oxydo-^

réduction) (Chrisman, 1975; White, 1 976; Kraska, J 977),

— L’utérus répond à l’influence oestrogénique par une stimula­

tion de la croissance et de la différenciation, et donc devrait permettre d’examiner l’hypothèse que le cGMP et le cAMP inter­

viennent causalement dans ces processus.

- Un grand nombre de processus biochimiques de la réponse hor­

monale y sont bien décrits.

- Des données de la littérature (Hisaw, 1959 ; Anderson1972) indiquaient la possibilité de disséquer la réponse de croissance en différentes étapes pour lesquelles différents oestrogènes ont des efficacités relatives différentes : une première étape, au cours de laquelle s'accumulent essentiellement les précur­

seurs; une deuxième étape de véritable anabolisme des macro­

molécules .

L’étude des variations de concentrations en nucléotides cycliques dans ce système devrait donc :

1) aider à mieux comprendre le rôle biologique des nucléo­

tides cycliques et plus particulièrement du cGMP dans la réponse oestrogénique et, par ce biais, à peut-être trouver une fonction générale précise pour le cGMP.

2) apporter, sur le mécanisme d'action des oestrogènes, des informations qui éclairent ce domaine encore mal connu de

l'endocrinologie. A l'intérêt fondamental de cette étude s'ajoute l'intérêt pratique évident par ses implications physiologiques et éventuellement cliniques.

B, But immédiat d.u travail.

Ce travail 'est 'un pas dans la direction résumée ci- dessus. Ses buts immédiats étaient les suivants :

- Vérifier les données existantes (obtenues jusqu’ici dans un seul et même laboratoire) sur l’augmentation du titre en cGMP

(et la diminution du titre en cAMP) dans l’utérus de rat sou­

mis à l’action des oestrogènes, et en étudier la cinétique, - Rechercher dans quelle mesure cet effet des oestrogènes re­

lève bien de leur action hormonale (impliquant notamment la mi­

se en jeu des récepteurs oestrogéniques) directe,

- Aborder l’étude de la signification biologique de cette va­

riation du titre en cGMP du point de vue

a, de son déterminisme, en considérant essentiellement sa dépendance éventuelle vis-à-vis d’étapes biosynthétiques préco­

ces (dont dépend la réponse utérotrophique globale aux oestro­

gènes) .

b, de son rSle possible dans l’ensemble des réponses oestro­

géniques ,

III. DESCRIPTION du SYSTEME

>I9-

EXPERI­

MENTAL : oestrogènes - tissus cibles

A ce stade, nous allons décrire les connaissances générales actuelles sur le mode d’action des oestrogènes, spécialement

dans l'utérus, afin d'éclairer comment les nucléotides cycli­

ques pourraient intervenir dans le déroulement de ces processus.

A. Généralités sur la physiologie de l'utérus.

Les oestrogènes ont, au niveau de l'utérus, un rôle trophique (accumulation de macromolécules : RNA, protéines, glycogène, DNA). Les 3 tissus constitutifs de cet organe, épithélium (luminal et glandulaire), conjonctif (stroma) et muscle lisse (myomètre) répondent à cette action mais c'est principalement l'endomètre (épithélium + stroma) et plus parti­

culièrement l'épithélium qui accumule les oestrogènes (Felsher, 1965; Jensen, 1966; Alberga, 1968) et subit une prolifération cellulaire (Martin, 1968), point culminant d'un ensemble de processus biochimiques qui débutent dans les minutes suivant

l'injection de l'hormone.

Outre cet effet d'hypertrophie générale, les oestrogènes exer­

cent, au niveau de l'épithélium, un effet que l'on peut quali­

fier de différenciateur : on observe un accroissement net de la hauteur des cellules, accompagné d'un déplacement des noyaux vers le pôle basal. Le sens physiologique de la réponse oestro­

génique de l'utérus est d'une part, de favoriser la fécondation (les oestrogènes provoquent la sécrétion dans la lumière uté­

rine d'un fluide particulièrement propice à la locomotion des spermatozoïdes); d'autre part, combiné à l'effet différencia­

teur d'une autre hormone ovarienne, la progestérone, de prépa­

rer l'utérus à la nidation efficace des b 1astocystes. Il semble que l'implantation nécessite notamment la sécrétion de protéi­

nases (par l'épithélium et le stroma) modifiant les interjections membranaires entre le blastocyste et 1'utérus^Denktr 137^)

10^

La modification de la réponse hyperplasique et morphogénétique induite par les oestrogènes traduit peut-être donc l'amplifi­

cation et le développement de la machinerie sécrétrice de l'or­

gane .

B. Mode d'action des oestrogènes.

^ mechanism.

On admet généralement actuellement que les stéroïdes agis­

sent dans leurs tissus cibles selon un processus schématisé

dans la figure 1 extraite d'un travail de Jensen : les stéroïdes se fixent dans le cytoplasme des cellules-cibles sur des récep­

teurs spécifiques qu'ils modifient en une forme translocable dans le noyau. Cette transformation est caractérisée, dans le cas des oestrogènes, par un changement du coefficient de sédi­

mentation des récepteurs (4 S cytoplasmique ---^ 5 S nucléaire).

L'interaction des complexes hormone-récepteur avec le génome activerait la transcription de RNA dont la traduction induirait des protéines spécifiques finalement responsables des effets morphogénétiques et physiologiques de l'hormone.

Le paragraphe suivant (p. 2o,11) décrit les démarches des princi­

paux travaux qui ont mis en évidence ces étapes successives de 1'inter^action des stéroïdes avec leurs tissus cibles.

Un pas important dans la connaissance du mode d'action des stéroïdes a été la mise en évidence, après injection d'hormone fortement marquée, de protéines à haute affinité pour les sté­

roïdes présentes seulement dans le cytoplasme des tissus cibles (Jensen, 1962). Des études autoradiographiques et des fraction­

nements cellulaires démontrèrent ensuite, après injection d'hor­

mone, son accumulation dans le noyau des tissus cibles (King, 1 966; Stumpj, 1968). Par des centrifugations en gradient de den­

sité de sucrose, on estime, à 8 S, le coefficient de sédimentation des récepteurs cytoplasmiques (Toft, 1966; Gorski, 1968) (disso­

ciables en fait en complexes 4 S dans des conditions de forte salinité) et à 5 S le coefficient de sédimentation des complexes récepteurs nucléaires (Jungblut, 1967). On constata que l'injec­

tion de l'hormone induit l'apparition de récepteurs dans le noyau, simultanément à la disparition partielle ou totale des récepteurs cytoplasmiques (Jensen, 1968). D'autre part, tandis que les

protéines cytoplasmiques peuvent lier l'oestrogène dans un sys­

tème acellulaire, la fraction nucléaire isolée ne montre aucune liaison spécifique dans de telles conditions (Jensen, 1972;

tion d'un "two-step mechanism", comprenant, sous l'effet de l'hormone, un transfert d'un récepteur du cytoplasme vers le noyau (Jensen, 1968; Gorski, 1968). La présence d'hormone dans le cytoplasme permet, en l'absence de noyau, la transformation du récepteur cytoplasmique d'une forme 4 S latente en une forme 5 S activée, caractéristique du récepteur nucléaire (Jensen, 1971).

Cette transformation est accélérée par la température et certaines conditions de salinité (Jensen, 1971; Jensen, 1 97 2, .) . Il ressort de travaux sur l'utérus de veau que cette transfor­

mation implique l'intervention d'une protéase Ca^"*" dépendante (Puca, 1972; Puca, 1977). Les récepteurs cytoplasmiques trans­

formés par les conditions de température et de salinité adéquatej peuvent dès lors transiter dan^ des noyaux ajoutés à ce cytoplasme préparé ( Jensen^l 97 2 ; Jensen*^ 1 97 2) , et l'on observe, par la

même occasion, une stimulation de l'activité RNA polymérase, effet physiologique normal de l'hormone (Mohla, 1972, ;

Raynaud-Jarnmet, 1975). On admet donc généralement actuellement que c'est l'hormone qui sert à transférer le récepteur vers le noyau, et non l'inverse; l'hormone seule, ajoutée à des noyaux isolés, est en effet incapable d'induire la synthèse de RNA ob­

servée sous l'effet de l'addition de complexes hormone-récepteur à ce système acellulaire (Mohla, 1972).

). Des expériences de reconstitution de cytosol rempli d'hormone marquée et de noyaux vides conduisirent à la descrip-

■ i g U r e 'l Représentation schématique de 1a transformation et

la transTocation des récepteurs oestrogéniques sous

l'effet des oestrogènes (repris de Jensen, \Sli).

13

La relation directe qui existe entre la quantité de com­

plexes hormone-récepteur nucléaires (RE ) et l^intensité des n

réponses physiologiques (Anderson, J973), ainsi que Inexistence d*une relation semblable entre la cinétique d’apparition des complexes RE^ et la réponse (Hardin, 1976; Lan, 1976) étayent l’hypothèse que le complexe hormone—récepteur nucléaire serait effectivement le moteur de l’effet physiologique des stéroïdes.

Ceci a été montré pour les oestrogènes dans les réponses utéro—

trophiques (Anderson, 1973; Hardin, 1976; Lan, 1976) pour les effets des oestrogènes et la progestérone au niveau de la syn­

thèse de protéines et de RNA spécifiques dans le foie (Berg, 1974; Lazier, 1975) et l’oviducte de poulet (Palmiter, 1973;

Chan, 1973; Tsai, 1975), ainsi que pour les glucocorticoïdes dans des cellules d’eucaryotes (Tomkins, 1970).

Cependant, ni cette relation quantitative, ni le fait que les réponses oestrogéniques passent par des effets transcrip­

tionnels précoces (voir plus loin) ne sont des preuves suffi­

santes de l’action directe du complexe hormone—récepteur nu­

cléaire (RE^) au niveau génomique. D’autant moins que la quan­

tité globale de récepteurs nucléaires, déterminée par des ré­

actions d’échange dans des noyaux isolés, en présence d’hormo- nene marquée, ne donne pas d’indication sur la nature et la quantité des véritables sites accepteurs qui seraient réelle­

ment actifs^*^ . On sait notamment que à des concentrations

(*) . ; Différentes études ont montré que les récepteurs des stéroïdes pouvaient s’associer au DNA ( M u ^ e r ^ ] à des protéines acides (Spelsberg, 1971) ou basiques

(pu ta J ( 9 T, “f ) de la chromatine; à des ribonucléopro téines (Liang, 1974); à la membrane nucléaire (Jackson, 1974), Selon Yamamoto et Alberts (Yamamoto, 1974), toutefois, ces différents sites apparents de liaison correspondraient à des artefacts expérimentaux tandis que les véritables sites de liaison spéci­

fique seraient perdus dans la masse de liaisons non spécifiques.

de complexes identiques induites par différentes oestrogè­

nes (E) correspondent des réponses physiologiques d’intensités différentes suivant les hormones (voir revue dans Galand, 4978;

Katzenellenbogen, 1972; Ruh, 1973; Ruh,1974)« D’au­

tre part, différents laboratoires ont apporté des arguments en faveur de l’existence de sites récepteurs nucléaires différents, reconnaissables sur la base de leur résistance variable à l’ex­

traction en K Cl 0, 4 N, dont seuls les plus résistants seraient responsables des réponses oestrogéniques (Clark, 1976 ; Ruh, 1977 ; Mester, 1975 ), Des travaux plus récents imputent ces différents sites à des artefacts ex­

périmentaux (Traish, 1977; Muller, 1977; Barrack, 1977), mais il est trop tôt sans doute pour conclure que cela exclut l’exis­

tence réelle de sites différents» Il convient en tous cas de noter que la répartition proportionnelle entre ces différents sites diffère si l’on compare certains oestrogènes et antioes—

trogènes (oestradiol et nafoxidine) (Baudendistel, 1976) dont on conna1)t par ailleurs d’autres effets divergents» Plus récem­

ment, différents types de sites récepteurs aux oestrogènes ont aussi été mis en évidence dans le cytoplasme et le noyau par étude des affinités de liaison (Eriksson, 1978),

2, Effet direct, in vitro, des récepteurs à stéroîdes sur la syntl^se de_RNA»

Ce sont principalement les études de l’équipe de O’Malley (voir revue dans Chan, 1976) sur les effets de l’oestradiol et de la progestérone sur l’induction de synthèse d’ovalbumine dans l’oviducte de poulet qui ont montré une action directe du complexe hormone-récepteur sur la chromatine, à savoir une aug­

mentation du nombre de sites d’initiation pour les molécules de RNA-polymérase (Schwartz et coll», 1976 , .)• Les étu-^

des de cette équipe ont mis en évidence les rôles respectifs des 2 sous-unités du récepteur de la progestérone CO'Malley,

1973, . ; Buller, 1976, ), L’une,(la sous- unité B) reconnaît le site chromatinien adéquat et sa liaison à celui-ci a pour résultat de démasquer le DNA» L’autre Cia

sous—unité A) cherche le site "effecteur" au voisinage des sites accepteurs reconnus par B; cette interaction favoriserait la déstabilisation de l'hélice de DNA et créerait, de ce fait, de

Lire

15 ^

1 Représentation schématique du mécanisme moléculaire de 1'action des hormones stéroTdes (repris de Chan et O'Malley, 1976).

sV e r O ( ■e o r rr\ O t

nouveaux sites d’initiation pour les chaines de RNA, Ce méca­

nisme moléculaire de l’action de récepteurs à hormones stéroï­

des est schématisé sur la figure 2 reprise d’une publication de l’équipe de O’Malley (Chan, 1976),

De manière semblable, encore que moins spécifique, peut- être, un effet du complexe oestrogène-récepteur isolé a aussi été observé dans l’utérus : le complexe oestrogène-récepteur sous sa forme activée 5 S (pas sous la forme 4 S, ni ses com­

posants isolés) stimule l’activité RNA polymérase de noyaux d’utérus isolés ou de chromatine (Mohla, 1972), La spécifici­

té de l’effet réside dans la fraction chromatinienne puisque aucune stimulation n’est observée en présence de chromatine d’autres tissus (Davies, 1973, @ j Davies, 1973, .)•

3, Origine mono ou pluri-génétique de l’action des stéroïdes (en particulier des oestrogènes).

Le même mécanisme d’action semble applicable pour tous les systèmes hormone stéroïde—tissu cible. En ce qui concerne notamment les oestrogènes, des récepteurs à propriétés similai­

res à ceux trouvés dans l’utérus au point de vue de leur affi­

nité pour les différents oestrogènes et de leurs propriétés de sédimentation, de leur capacité à transloquer du cytoplasme dans le noyau, ont été mis en évidence dans des cellules hypo­

physaires, l’hypothalamus (Vertes, 1971; Eisenfeld, 1970;

Baulieu, 1971), les glandes mammaires (Leung, 1 97 6) , lè> v-a-gin ( Kà.tztn^n J 19 ), les cellules de Leydig des testicules (Mulder, 1976)*des récepteurs aux oestrogènes existent aussi au niveau des éosinophiles de l'utérus (Tchernitchin, 1972) et du sang circulant (Tchernitchin, communication personnelle), l'ovi- ducte de poulet. L'action physiologique précise des oestrogènes dans ces différents types cellulaires n'est pas toujours déjà connue. Les réponses peuvent être de nature différente : les oestrogènes stimulent soit la croissance et/ou la différenciation morphologique de nouveaux types cellulaires (dans l'utérus, le vagin, l'oviducte) soit essentiellement l'état fonctionnel des cellules préexistantes (sécrétion d'hormones dans l'hypophyse^

DonCjles effets physiologiques diffèrent selon les tissus.

Comment concilier un modèle de l'action oestrogénique compatible avec ces réponses divergentes si l'on accepte que la translocation d'un complexe identique oestrogène-récepteur dans le noyau est un dénominateur commun aux différents types cellulaires à réponses variées. Différentes possibilités peuvent être considérées : le complexe oestrogène-récepteur pourrait par exemple être capable d'interagir lui-même avec différents types de sites génétiques

dans le noyau, par le simple jeu de la présence ou de l'absence de ces site^

sous une forme accessible; ce serait des lors l’état de diffé­

renciation de la cellule—cible qui réglerait la spécificité de la réponse. Cependant, la multiplicité des actions oestrogéni­

ques rend tout aussi plausible l’alternative où les oestrogènes influenceraient un seul type de gènes accessible dans toutes les ce 1lu le s—cibles et agissant sur la formation d’un régulateur de l’activité cellulaire. Celui-ci induirait ou déréprimerait cer­

tains gènes ou fonctions, en réprimerait d’autres, mettant ainsi en action les fonctions responsables de la différenciation fina­

le ou accélérant et contrôlant donc simplement des processus éteints ou fonctionnant au ralenti à l’état non stimulé.

Pour comprendre la ou les étapes clés qui enclenchent l’effet oestrogénique, il faut analyser l’ensemble des répon­

ses et remonter la chaire des relations cause—effet.

Considérons donc l’essentiel des processus biochimiques déclenchés en réponse à l’action des oestrogènes; certains im­

pliquent peut-être l’intervention du cGMP,

4. Rêsumé_de la séquence temporelle des principaux événements initiés_£ar les osstrogèneq dans l'utérus de rats.

La figure

5

Gorski ( Ka t z ene 11 enbo gen^l 97 5 ) représente la séquence des prin­

cipaux événements initiés dans l'utérus de rats castrés après l'injection d'oestradiol. L'examen de cette figure montre que l'accumulation nette de la teneur en macromolécules

(RNA, protéines totales, histones, DNA) qui correspond à l'effet trophique de l'hormone ne survient pas plus tôt que 7 à 8 heures après traitement oestrogénique. Le métabolisme des phospholipi­

des est assez précocement stimulé (vers 1 heure) (Aizawa, 1961).

La synthèse de RNA et la stimulation de l'activité des RNA polymérases figurent parmi les effets les plus précocement

stimulés. En outre, il existe des effets rapides sur la perméa­

bilité membranaire aux ions et aux précurseurs de macromolécules (Spaziani, 1958; Riggs, 1968; Bitman, 1967; Means, 1966) dont la précocité suggère qu'ils ne dépendraient pas d'une synthèse préa-

HOURSAFTERESTRADIOL

ZQ.

re Séquence temporelle des principaux événements initiés par les

oestrogènes dans Tutérus de rats (repris de Katzenellenbogen, 1975)

3 0 2 0

1 0

Water imbibition Protein synthesis

Nucleolar RNA pol.*** I

Phospholipid synthesis , Glucose metabolism

— IP synthesis 0 S

0,’

0 05

C e l l division H i Stone synthesis Net protein

Net RNA

Nucleoplasmic RNA pol. II IP RNA synthesis (Other RNA's )

Estrogen binding in nucléus c«troo(>n binding in cytoplasm 0,01 Estrogen

Inactivité RNA_£olimerase.

Il existe des divergences dans les résultats (Gorski, 1965;

Means, 1966; Billing, 1969) quant à la synthèse précoce de RNA (entre 2 minutes et 1 heure après traitement oestrogénique) . Elles s'expliquent probablement par la différence des voies d'injection des précurseurs utilisés et généralement par la négligence de modifications éventuelles du pool des précurseurs.

On a, en tout cas, décrit une augmentation de l'activité génétique de la chromatine dès les 10 premières minutes suivant l'injection d'oestradiol (Church, 1970; Barker, 1966). On admet généralement qu'une augmentation de la synthèse de RNA nucléaire de haut poids moléculaire hétérogène (H^RNA)^probablement précurseur de mRNA ^ survient tôt dans la première heure d'action oestrogénique

(Knowler, 1973). Le marquage des t RNA est augmenté après 1 heure de traitement (Knowler, 1971). La synthèse des RNA totaux,

intéressant principalement les RNA ribosomiaux^est stimulée vers 2-4 heures après l'injection d'oestradiol (Hamilton, 1968; Luck, 1 972). Dans une analyse récente de la q u e s t i o n^V ^ au 1 i e u ( 1 976) montre-^ après 1 heure de traitement oestrogénique, une augmen-

) _ 3

tation semblable de l'incorporation d'uridine- H dans les diffé­

rents types de RNA. Ces résultats n'excluent pas la stimulation préférentielle de la synthèse de H^RNA, dans la première heure de l'action oestrogénique puisque l'auteur n'a pas investigué (*) labié de RNA (Billing, 1969)*.

(*) : En même temps que cette stimulation d'activité biosynthé­

tique, l'activité de différents enzymes augmente après addition d'oestrogènes : c'est le cas de l'activité de l'ornithine décar- boxylase (Cohen, 1970; Kaye, 1971) (vers 2-4 heures); de t RNA méthyltransférases (Baliga, 1974) (vers 2-4 heures), de amino- acyl t RNA synthétases (Berg, 1977) (dès 1 heure); de la glucose -6- phosphate déshydrogénase (Moulton, 1971); de la peroxidase

(Jellinck, 1977).

igure 4

5o.

Evolution de l'activité des RNA poTytnérases I et II de 1'utérus de rats après traitement par T'Oestradio1

( E

) » 1 ' oestrioT ( E, ) Ou la nafoxidine (LIA), (repris de Hardin, 1976).

A, POLYMERASE H

cette période.

3 4-

Ces augmentations de synthèse de RNA, après administration d'hormone in vivo, coïncident avec des stimulations de RNA polymérase dans les noyaux de l’utérus d'animaux traités aux oestrogènes.

La figure ^ reprise d'un travail de Hardin et coll. (1976), représente les stimulations séquentielles^notamment par l'oes- tradiol^des activités RNA polymérase I (= RNA polymérase ribosomiale, insensible à l-amanitine) et RNA polymérase II (= RNA polymérase des messagers, spécifiquement inhibée par 1-amanitine) . Des résultats analogues (c'est-à-dire, une sti­

mulation biphasique de l'activité RNA polymérase II, entrecoupée de la stimulation de la RNA polymérase I) ont été obtenus aussi par d'autres auteurs (Classer, 1972; Bortwick, 1975).

Effet des oestrogènes sur la synthèse précoce d e p ro t éi — ne(s) spécifique(sj)o

Une constatation importante qui guida les recherches ulté­

rieures relatives au mécanisme d’action des oestrogènes est que la stimulation dans les quelques heures suivant l’injection hormonale de différents métabolismes (du glucose, des phospho­

lipides, la stimulation de RNA polymérase) sont sensibles à des inhibiteurs de synthèse protéique administrés dans les 2 premières heures d’action oestrogénique (Mueller, 1961; Ui,

1963? Gorski, 1965), Or, à ce temps, la synthèse protéique globale est inchangée. Leur stimulation est aussi inhibée par l’administration précoce d’inhibiteurs de synthèse de RNA (Bau—

lieu, 1972, ;Nicolette, 1966, ^ . La stimulation de l’activité de la RNA polymérase I, insensible à 1 ’ c:;^ -amanitine, est inhibée si cet agent est injecté préalablement, simultané­

ment ou dans les 30 minutes suivant l’injection d’oestradiol

Wi'r i ^ \ U

(Borthwick, 1975 ; Raynaud-Jamma.t, 197^>!rT Au-delà de ce temps d’action d’oestrogène, l’injection d’d~amanitine est sans ef­

fet, L’interprétation de ces expériences est que l’action de 1 ’ -amani tine avait porté indirectement sur la synthèse d’une protéine, via l’inhibition de la synthèse d’un RNA dépendant de la stimulation précoce de l’activité RNA polymérase des mes­

sagers (dont les Hn RNA précoces pourraient correspondre aux

31.

mRNA) (Baulieu, 1972,

@

A la recherche de cette KIP ("key induced protein"), des auteurs mirent en évidence la synthèse spécifiquement

induite par les oestrogènes de l'IP (induced protein) (Notides, 1966, ;Mayol,1970;De Angelo,1970). La synthèse de cette pro­

téine j^présente dans le surnageant JOSOOOg d*homogénats utérins et mise en évidence par électrophorèse de protéines marquées par des acides aminés précurseurs marqués), est induite dès 30 mi­

nutes après l’injection d’oestradiol à des rats castrés et mon­

tre un maximum de taux de synthèse vers 2h» Son induction peut aussi etre obtenue par incubation in vitro de cornes utérines d’animaux castrés ou immatures en présence de concentrations

"physiologiques" d’oestrogènes (Katzenellenbogen, J972; Baulieu,

■ b ■' ,

1 97 2 ;1> ups>nt. Miirtis e » Le marquage de 1 ’ IP dans un système acel- lulaire a aussi été testé avec succès (Somjen, 1974),

Notons qu’en quantité chimique, la fraction IP ne représen—

te que 2—3% des protéines utérines nouvellement synthétisées (Katzenellenbogen, 1974; Katzenellenbogen, 1974, ^

La spécificité oestrogénique de la réponse IP est étayée par la stricte corrélation entre la quantité de complexes RE^

et le taux relatif de synthèse d’iP (ceci a été démontré dans des expériences in vitro pour l’oestradiol (E2) , l’oestriol (E^) et l’oestrone (Ej) (Ruh, 1973), Différents androgènes sont aus­

si capables d’induire la synthèse de 1’IP mais ceci uniquement dans des conditions où ils sont capables de transférer les ré­

cepteurs cytoplasmiques vers le noyau (c’est-à—dire in vitro, et non in vivo) (Ruh, 1975 ; ScKmiJt, 1976), De plus, au cours du cycle oestral, la synthèse endogène d’iP fluctue, avec un tau;c

maximal en proestrus (Jacobelli,

'A-

1 9 7 5) correspondant bien avec la concentration plasmatique d’oestro­

gène maximale (Kobayashi, 1968; Yoshinaga, 1969) et le titrée (b ! plus élevé de sites de liaison nucléaires (“acoWelli, 19T5f Katzenellenbogen, 1975, dans cette phase du cycle.