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Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository
Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:
Pradier, O. (1995). Activité procoagulante de l'anticorps monoclonal OKT3: étude in vivo et in vitro (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté de Médecine – Médecine, Bruxelles.
Disponible à / Available at permalink : https://dipot.ulb.ac.be/dspace/bitstream/2013/212491/1/8b121eda-3267-4be5-a3d1-c11f2d4db046.txt
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FACULTE DE MEDECINE
C*' UNiVE?.GiTE im'. 0£ BribXEluü.
BIBUOTHEÜÜE DE MEDECIHE ^CAMPUS ERASK ù
Route de Lennik, 808 (Bât. E - CP 607) 1070 BRUXELLES
O 555-61-70
ACTIVITE PROCOAGULANTE DE L’ANTICORPS MONOCLONAL OKT3:
ETUDE IN VIVO ET IN VITRO
Olivier Pradier
DEPARTEMENT D’IMMUNOLOGIE-HEMATOLOGIE-TRANSFUSION HOPITAL ERASME
Thèse présentée en vue de l’obtention du grade d’Agrégé de l’Enseignement Supérieur
-1995-
J e remercie ma femme d’accepter d’être l’épouse d’un universitaire. Je la remercie pour le soutien sans faille qu’elle m’a toujours prodigué sans compter et avec gentillesse. Je remercie la chance de me l’avoir dormée.
• ••
J e suis fier que ce travail soit le fhxit d’une étroite collaboration entre le département de Néphrologie et notre département d’Hématologie-Immunologie-Transflision.
J e remercie Messieurs les Professeurs P. Capel et M. Goldman qui ont dirigé et structuré ce travail et m’ont toujours apporté leur aide et leur haute compétence. Ils m’ont toujours soutenue dans le travail de recherche, dans l’écriture des articles et jusque dans les plus petits détails. Leur dynamisme
J e remercie tout particulièrement D. Abramowicz qui fut l’indispensable organisateur des études cliniques et mon enthousiaste interlocuteur privilégié. Avec lui j’ai toujours eu de fhictueux et stimulants échanges d’idées. Je remercie pour leur aide les chirurgiens et anesthésistes du groupe de transplantation qui nous ont toujours soutenue durant les études cliniques.
J
’éprouve un souvenir émue pour Monsieur le Professeur J. Wybran qui m’a accueilli dans son département et qui aurait dû être mon directeur de thèse.
J e remercie Monsieur le Professeur JE Dumont. Dans son institut, j’ai appris ce qu’est un laboratoire de recherche et beaucoup de ce dont j’ai eu besoin pour mener à bien ce travail.
J e remercie M. Surquin et A Marchant pour l’énorme travail réalisé pendant les études cliniques. Je remercie L Schandene, F. Wilhem et C Bullens pour leurs discussions stimulantes et leur support constant.
J e remercie les candidats résidents pour m’avoir déchargé des impondérables journaliers qui
pèsent beaucoup
J Vanhouche et C. Habran à qui j’ai toujours tout pu demander comme support technique.
J e remercie mes parents ‘pour moi’ et mes enfants pour tout ce qu’ils sont pour moi et mes beaux parents pour ce qu’ils font pour nous.
nfin je remercie l’Education National, institution libre et laïque de la République j-H^Française et les facultés de médecine de Paris et de Lille. Un remerciement tout
particulier à l’Université Libre de Bruxelles pour m’avoir accueillit en son sein.
REMERCIEMENTS... Il
TABLES DES MATIERES... IV
INTRODUCTION... 1
A) Le syndrome associé à la première injection d’OKT3 ... 2
Les mécanismes de l’activation cellulaire liés à VOKT3
1) Le complexe CD3 et le récepteur à l’antigène des lymphocytes T (TCR)... 2 2) Mécanismes d’activation du lymphocyte T par l’association TCR/CD3... 3
B Les relations entre inflammation, immunité spécifique et activité procoagulante des cellules sanguines... 5
1) L’implication des cellules sanguines dans les phénomènes
thrombotiques ... 6 1) Implication des cellules sanguines: les relations avec l’inflammation et les réaction immunologiques spécifiques... 6
2) La nouvelle théorie de la coagulation, le rôle prépondérant du facteur tissulaire comme initiateur de la coagulation ... 8
1) La coagulation
Schéma classique de la coagulation... 8 Schéma révisé de la coagulation... 9 2) Le facteur tissulaire comme élément principal de l’activité procoagulante des cellules sanguines... 11
3) Le facteur tissulaire et sa régulation.
1) Le facteur tissulaire; une molécule transmembranaire... 11 2) La régulation du gène du facteur tissulaire dans le monocyte et la cellule
endothéliale... 12 A) La région régulatrice du gène.
B) La régulation de VARN messager
1) les facteurs humoraux, les médiateurs de l’inflammation... 13 2) Les facteurs cellulaires auxiliaires
A) Les lymphocytes T... 14 B) L’adhésion monoçytaire, le rôleparticulie du complexe CDllb-CD18
(Mac-1)... 15
LES OBJECTIFS... 17
METHODES
A) Les patients... i8 B) Les tests de coagulation:
A) La détection d’un état prothrombotique
1) La génération de la thrombine in vivo...18 2) La fibrinoformation... 18 3) L’activation endothéliale... 19
B) La procédure de coagulation en un temps (One stage clotting assay).
1) Détermination in vitro de l’activité procoagulante des cellules mononucléées du sang...19 2) La détermination ex-vivo de l’activité procoagulante des cellules du sang... 20
C) Le test de génération de thrombine à la surface des cellules
endothéliales de veine de cordon ombilical. ... 20
C) Les tests de cytofluorométrie de flux... 20
D) Evaluation du contenue cellulaire en ARNm par la méthode de la transcriptase inverse associé à la réaction de polymérisation en
chaine (RT-PCR)... 21
RESULTATS
chapitre 1: Induction of thromboses within rénal grafts by highdose prophylactic OKT3.
Article 2: Procoagulant effect of the OKT3 monoclonal antibody: Involvement
of tumor necrosis factor.
Article 4: Procoagulant properties of 0KT3 at the monocyte level: inhibition by pentoxifylline.
Article 5: interieukine-IO inhibits the induction of monocyte procoagulant activity by bacterial Upopiysaccharide.
Article 6: Monocyte Procoagulant Activity Induced by the OKT3 Monoclonal Antibody: In Vivo Observations and Strategies of Prévention.
Résultats préliminaire:Rôle des lymphocytes dans Vacivité procoagulante des monocytes induite par l’0KT3
Discussion 28
L
a transplantation rénale est actuellement le meilleur traitement de l’insufifisance rénale terminale. Dès les années 1980 l’introduction d’immunosuppresseur tel que la cyclosporine A a permis la survie de 80% des greffes rénales à un an. Peu après de nombreuses études ont montré que l’anticorps monoclonal OKT3 (Orthoclone®, Ortho Pharmaceutical) qui reconnait le complexe CD3 des lymphocytes T, pouvait induire une immunosuppression permettant le traitement du rejet cortico-resistant, tant en greffe allogénique rénale qu’en transplantation hépatique pancréatique ou cardiaque. (Ortho Multicenter Study Group 1985, Thistlethwaite JR 1984, Colonna JO 1987, Gilbert EM 1987).
De plus, chez les patients à risque, l’OKT3 améliore la survie à long terme des greffes rénales de plus de 10% par rapport à la cyclosporine A (Abramowicz D, 1992; Norman DJ, 1993).
Dans notre centre les patients sans contre indications reçoivent dès la transplantation 15 jours de trmtement préventif du rejet par injection de 10 mg/j d’OKT3 (actuellement ramené à 5 mg/j).
Plusieurs effets secondaires liés à la première injection d’OKT3 on été décrits associant un syndrome grippal avec malaises, maux de tête, fièvre, myalgies, troubles digestifs tel nausés, vomissements, et dans les cas les plus graves, oedème pulmonaire et méningite aseptique (). En outre, comme la cyclosporine A, l’OKT3 est aussi responsable d’altérations fonctioimelles du greffon (Goldman M, 1990).
Une incidence anormalement élevée de phénomènes thrombotiques précoces survenant dans les vaisseaux, artères et veines, ou dans la microcirculation du greffon rénal a été observée par notre équipe chez les patients recevant une transplantation rénale allogénique traité par OKT3 [article 1, Abramowicz D, 1992]. Des événements semblables ont été depuis décrits par d’autres équipes, au niveau du greffon rénal (Raasveld 1992) ou à distance tel un infarctus cérébral (Reiss R, 1993).
Dès lors nous avons entrepris d’étudier l’activation de la coagulation induite par l’OKT3, et
d’en comprendre les mécanismes notament en rapport avec la libération de cytokines asssociée
à son administration.
A) Le syndrome associé à la première injection d’OKT3.
Il a été montré dans notre institution que le syndrome grippal et la plupart des effets secondaires associés à la première administation d’OKT3 étaient la traduction clinique d’un passage sanguin massif de cytokines, dont rinterleukine-2 (IL-2), l’interleukine-ô (EL-6), et le facteur de nécrose tumoral a (TNFa) (Abramowicz D, 1989). Une grande part de cette
libération de cytokine est imputable à l’activation des lymphocytes T (Hirsch 1989). Toutefois certains faits suggèrent que l’expression des effets secondaires nécessite l’activation simultanée du lympho
cyte T et d’une cellule porteuse du récepteur Fcy Cette double activation est la conséquence de la co-liaison (cross-linking) des com
plexes CD3-TCR du lymphocytes T, médié par les recépteurs Fc du monocyte et des cellules endothéliales et du pontage des différents types cellulaires (Palacios R
1985; Ceuppens JL 1985, Rinnooy Kan EAR, 1986).
Les mécanismes de l’activation cellulaire liés à !’OKT3.
1) Le complexe CD3 et le récepteur à Tantigène des lymphocytes T (TCR)
L’OKT3 est un anticorps monoclonal d’origine murine développé au début des années 1980
par la firme Ortho dont le mécanisme d’action semble faire intervenir à la fois le monocyte et le
lymphocyte T. Le fragment cristallisable (Fc) de l’OKT3, d’isotype IgG2a présente une forte
affinité pour les récepteurs Fcyl et Fcyll humains. Dès son injection intravasculaire le Fc de
l’OKT3 se fixe sur les récepteurs Fcy des monocytes (et peut-être des cellules endothéliales)
qui le ‘présentent’ au lymphocyte T. La partie variable de l’OKT3 (CDR; Complementary
Determining Région) portée par le fragment (ab ’)2 reconnaît un épitope conformationnel
composé en majorité par les chaînes e et en partie par les chaînes y et Ô du complexe CD3
(Salmeron 1991).
Le CD3 est un complexe exprimé à la surface des lymphocytes T . Il est composé de 4 sous- unités, 2 chaînes s (non glycosylées de 20 kDa), une chaîne ô et une chaîne y (PM: 25-28 et 20 kDa). Il est étroitement associé au récepteur à l’antigène du lymphocyte T (TCR) ainsi qu’à des protéines transductrice C d
Les quatre sous-unités du CD3 sont composées:
• d’une région extracellulaire homo
logue à un domaine d’immuno
globuline
• d’une région transmembranaire qui assure une liaison non covalente avec la région trans-membranaire du TCR
• d’une région cytoplasmique, ce sont
ces régions cytoplasmiques des éléments du complexe CD3, en association avec les homodimères et hétérodimères Ç-r| qui assurent la transmission intracellulaire des signaux d’activation provenant du TCR.
Le TCR est un hétérodimère composé de deux chaînes polypeptidiques principalement a et P et accessoirement y et ô (2 à 5 %, (Raulet 1989)). Le TCR présente comme les immunoglobulines:
• une région hypervariable qui assure la reconnaissance du peptide antigènique associé au Complexe Majeur d’Histocompatibilité (Zinkemagel 1979).
• une région constante présentant une partie intracytoplasmique courte et sans activité transductrice.
2) Mécanismes d’activation du lymphocyte T par l’association TCR/CD3
Lors de l’initiation d’une réaction immunologique spécifique d’antigène, la cellule présentatrice d’antigène (APC) exprime plusieurs molécules du CMH qui présentent dans un sillon de leur molécule un peptide antigènique (Nature 1988). C’est le pontage du complexe moléculaire HLA-DR/peptide de l’APC avec le TCR du lymphocyte T, qui induit l’activation du lymphocyte T. Pour que le pontage soit activateur il faut non seulement la reconnaissance
TCR
“P(r8) CD3
HLA-DR/peptide/TCR, mais aussi l’intervention de molécules d’adhésion accessoires tel les groupements B7/CD28, CD2/LFA3, CD4/HLA-DR etc.
La transduction intralymphocytaire des signaux d’activation du TCR nécessite l’intervention des molécules du CD3. C’est la co-liaison (cross-linking) des complexes TCR/CD3 par les complexes HLA-DR/peptide qui, en induisant le contact serré d’au moins deux complexes CD3, déclenche physiologiquement la transduction des signaux d’activation générés par le TCR. (xxxx)
L’activation lymphocytaire complète aboutit:
1) à 1a prolifération des lymphocyte T soutenue par la synthèse d’IL-2 et l’expression simultanée de l’IL2-R (Tac CD-25).
2) de cytokines dont l’interféron y (et l’IL-3, l’IL-4, l’IL-5, l’IL-10).
Une réaction spécifique d’antigène n’intègre qu’un faible pourcentage d’APC et les quelques
lymphocytes T spécifiques de l’image moléculaire HLA-DR/peptide. Par contre, lors de
l’injection de l’OKT3, la presque totalité des cellules porteuses des FcyRI et FcyRII (dont les
monocytes) et l’ensemble des lymphocytes T sont activés. C’est ce qui explique l’ampleur de la
libération des cytokines qui survient après la première injection d’OKT3.
B Les relations entre inflammation, immunité spécifique et activité procoagulante des cellules sanguines.
L’apparition d’un thrombus est classiquement considéré comme le résultat d’un déséquilibre entre les mécanismes procoagulants et anticoagulants qui aboutit à la génération de thrombine.
La thrombine en clivant les fibinopeptides A et B va transformer le fibrinogène soluble en fibrine insoluble, constituant principal du
caillot. C’est elle qui stabilise le clou plaquettaire en enserrant les éléments cellulaires sanguins et des protéines plasmatiques (fibronectine, vitro
nectine...). Les mécanismes procoagulants sont régulés d’une part par une série d’inhibiteurs des enzymes de la coagulation et d’autre part par le système
fibrinolytique. L’activation de ce dernier, va aboutir à la digestion du caillot de fibrine par la plasmine donnant des ‘produit de dégradation de la fibrine’ dont la famille des D-Dimères. (ref) La persistance du caillot et des dépôts de fibrine est donc la résultante des effets antagonistes de l’activation de la prothrombine en thrombine et de l’activation du plasminogène en plasmine.
Dans notre étude nous nous sommes limités à étudier les effets procoagulants induits par
rOKT3 mais d’autres équipes ont montré par ailleurs, que l’OKT3 avait aussi des effets sur la
fibrinolyse par la modulation du t-PA et du PAI-1 (Raasveld, 1993).
1) L’implication des cellules sanguines dans les phénomènes thrombotiques.
1) Implication des cellules sanguines: les relations avec l’inflammation et les réaction immunologiques spécifiques.
Le rôle des cellules sanguines dans le déclenchement des thromboses à longtemps été occulté par l’étude des anomalies des facteurs plasmatiques cependant les cellules (c’est à dire les
monocytes/macrophages et les cellules endothéliales) semblent jouer un rôle clé dans le déclencehement le contrôle et la modulation de protéines régulatrices situées à l’initiation des quatre voies de régulation de la fibrinoformation [Facteur Tissulaire, Thrombomoduline, Activateur tissulaire du plasminogène (t-PA), Inhibiteur de l’activateur du plasminogène (PAI-1)]. Les gènes de ces quatre protéines sont majoritairement régulés par les médiateurs de l’inflammation
, ... ...
...____ ...r Coagulation ^^Anticoagulation I
t-PA
Tt
r
I-l
Fibrinolyse
1 t tf •
Antifibrinolyse
De ce point de vue la coagulation fait partie intégrante de la réaction inflammatoire associé ou non à l’initiation d’une réaction immunitaire spécifique.
De nombreux arguments épidémiologiques, cliniques, et expérimentaux étayent cette relation.
spécifique I, ^Inflammation L
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1. Plusieurs études épidémiologiques ont montré sans ambiguïté, qu’à l’instar du taux de
fibrinogène, de cholestérol et de l’hypertension artérielle, le risque d’infarctus du myocarde
corrélait le mieux avec le taux des leucocytes circulants (Friedman 1974). Plus récemment
une étude prospective de 6.5 années comportant 7000 hommes a confirmé la haute valeur
prédictive du taux des leucocytes même si une part du risque pouvait être attribuée au
tabagisme (Zalokar, 1981). Etude confirmée par l’étude MRFIT montrant même qu’une
diminution de 1000 leucocytes/til était associé à une baisse de 14% du risque de maladie cardio-vasculaire (Grimm, 1985). D’autres études ont montré la relation entre accident vasculaire cérébraux et taux de leucocytes.
2. Les leucémies aiguës à composante monoblastique sont fréquement associées à des complications thromboemboliques et à des coagulopathies de consommations, (ref)
3. Le modèle expérimental de la réaction de Shwartzman montre parfaitement les relations qu’il y a entre les dépôts de fibrine et une inflammation non spécifique. Deux injections consécutives d’endotoxines déclenchent chez le lapin une réaction généralisée comportant des thromboses glomérulaires avec infiltration leucocytaire, des thromboses difiixses capillaires aboutissant la nécrose corticale et à la CIVD (Apitz K, 1935). Les endotoxines sont connues in vitro comme in vivo comme faisant partie des plus puissants activateurs procoagulants. Mais en rendant les lapins leucopéniques on abroge complètement les dépôts de fibrine (Lipinski B, 1974) et la réaction généralisé de Shwartzman (Stetson CA, 1951) confirmant le rôle prépondérant des leucocytes dans cette réaction (Müller Berghaus G,
1976; Niemetz J 1971).
4. En clinique le rôle d’une activité procoagulante générée par les leucocytes a été clairement démontré dans le syndrome de détresse respiratoire de l’adulte (ARDS). On retrouve une forte activité procoagulante dans le liquide de lavage bronchoalvéolaire ainsi qu’un net parallélisme entre fibrose pulmonaire et dépôts de fibrine ().
5. Le dépôt de fibrine lors d’une réaction spécifique d’antigène est caractéristique de l’hypersensibilité retardé (DTH). La présence de fibrine dans l’induration peut être détecter après une injection intradermique de tuberculine (Colvin RB, 1975), et les sujets afibrinogènémiques et sous anticoagulants oraux ne présentent que l’érythème mais pas l’induration. (Edwards RL, 1978).
6. Le rejet de greffe allogénique est accompagné de phénomènes thrombotiques dans les vaisseaux du greffon avec dépôt de fibrine, infiltration par des leucocytes activés exprimant une forte activité procoagulante ex vivo (Hattler BG Jr., 1973; Rothberger H, 1984, Cole EH, 1985) confirmée par la présence de facteur tissulaire sur les macrophages infiltrant l’organe rejeté (Hancock WW, 1985).
7. (Coagulopathies associé à l’infection...)
2) La nouvelle théorie de la coagulation, le rôle prépondérant du facteur tissulaire comme initiateur de la œaaulation.
1) La coagulation
Shéma classique de la coagulation
Historiquement la coagulation comporte deux voies d’activation, I
mVoie Intrinsèque qui s’initie de la phase contact. Le
contact du sang avec des surfaces chargées négativement induit l’adhésion des kinninogènes de haut poids moléculaire qui permet l’activation en cascade de la pré- kallikreïne puis des facteurs XII, XI, IX (VIII) avant d’aboutir à l’activation de la voie finale composée du facteur X (V) puis de la prothrombine. En routine cette voie est explorée par l’aPTT (activated Partial Thromboplastine Time ou TCK Temps de Céphaline Kaolin).
La Voie Extrinsèque part de la thromboplastine tissulaire ou facteur tissulaire (FT) coenzyme du facteur VII qui va directement activer la voie finale. En routine cette voie est explorée par le PT (Prothrombine Time ou temps de prothrombine).
Cette division en deux voies ne rend pas compte de certains phénomènes rencontrés en
clinique. 1) Un déficit majeur en élément de la phase contact n’est absolument jamais
responsable d’hémorragie même à des taux très bas et en situation chirurgicale (Hathaway,
1965; Kaplan, 1987) 2) les hémophiles A et B (déficit en FVIII et FIX) saignent malgré
l’activation directe possible du facteur X par le facteur VII indépendamment des facteurs
antihémophiliques.
Il y a quelques années, 0stemd et Rappaport ont montré que les deux voies n’étaient pas totalement indépendante et que le facteur VII pouvait activer non seulement le facteur X mais également le facteur IX de la voie intrinsèque (0stemd B, 1977). Cette observation associé à la découverte de l’inhibiteur du facteur tissulaire (TFPI) ) (Broze 1987 a et b) est à la base d’un modèle révisé de la coagulation proposé par Broze pour répondre aux paradoxes du modèle ancien (Broze GJ Jr, 1988, 1990).
Schéma révisé de la coagulation Dans ce shéma révisé
1. L’activation des cellules induit l’expression membranaire du facteur tissulaire qui s’associe au facteur VII pour former un complexe enzymatique capable d’activer le facteur X et le facteur IX.
2. Le TFPI se lie au facteur Xa généré par le facteur Vlla qui en retour inhibe en un complexe quaternaire le facteur tissulaire et le FVIIa. L’inhibition par le TFPI de l’activation initial du facteur X induit la cascade de la coagulation à passer par l’activation du facteur IX qui devient ainsi le premier élément de la cascade. Ceci expliquerait les hémorragies des hémophiles.
3. Ce modèle conserve le cadre biochimique du modèle classique, c’est à dire les concepts d’activation enzymatique en cascade et de fonctionnement des enzymes en groupement à quatre composants:
-Une enzyme de la famille des serines prothéases avec un domaine GLA riche en acide gamma-carboxylique.
-Un coenzyme régulateur accélérant la réaction enzymatique et cible de la voie anticoagulante de la thrombomoduline protéine C.
-Le cofacteur localisateur que sont les phospholipides de la face interne de la membrane plasmique des cellules activées (plaquettes, monocytes, cellules endothé
liales)
-Le calcium qui fait le pont entre les phospho-lipides et le domaine GLA.
Fragmentation memfaantre: action de la flipase Micronarticoles
. ^^pospholtpioes de la lacc mteme
7
rnnnnnfr rn a a rm n a BRfl-fl-R.fi a a a a
üyyyüy yy y « y w fcL^yiü
' phospholipides de la face externe ,GLA~chmaine
Complexe Enzymatique
Site actif
Le facteur tissulaire devient une molécule de toute première importance. C’est l’unique élément initiateur de la cascade de la coagulation, élément gâchette de la coagulation intravasculaire associé à l’inflammation et de la coagulation liée à une lésion vasculaire.
La phase contact n’appartient plus à la coagulation, mais reste un élément initiateur de l’inflammation (via les quinines), de l’activation du complément, et par un mécanisme mal connu, initiateur de la fibrinolyse. Ceci explique que les déficits de la phase contact n’entraînent pas de complications hémorragiques.
Tout au long de notre étude nous nous sommes basés sur ce shéma modifié de la coagulation
qui donne au FT un rôle pivot dans la modulation de l’activité procoagulante
Par alleurs des voies indépendantes du facteur tissulaire ont été décritent et jouent peut-être un certain rôle dans l’activation de la coagulation. De tels activateurs ont été montré u niveau de ceertaines cellules néoplasiques. De plus une activation au niveau du monocyte dépendante du facteur X et d’un récepteur spécifique de facteur X (localisé au niveau de l’intégrine CDllb- CD18, Mac-1) a été décrite (Altieri et Edgington 1988a, 1988b, 1989).
2) Le facteur tissulaire comme élément principal de l’activité procoagulante des cellules sanguines.
Le rôle central du facteur tissulaire dans le déclenchement d’une activté procoagulante associé à la survenue de phénomènes thrombotiques ou de dépôts tissulaires de fibrine à été décrit dans de nombreuses pathologies, le plus souvent inflammatoire. Le facteur tissulaire a été incriminé dans l’activité procoagulante des monocytes/macrophage infiltrant ces lésions inflammatoires.
La participation de l’activité procoagulante des cellules endothéliales dans la génése des phénomènes thrombotiques est nettement moins bien connu dans ces types de pathologie.
Mise en évidence ex-vivo du facteur tissulaire
Monocytes sanguins Macrophages tissulaires
Maladies auto-immunes Macrophages spléniques
lupus érythémateux disséminé lupus érythémateux disséminé Rejet de transplantation rénale Macrophages rénaux
Méningococcémie rejet de greffe allogénique
Réaction de Shwartzman glomérulonéphrite
Diabète Endocardites
Angor instable Plaques athéromateuses
Chirurgie orthopédique Lavages bronchoalvéolaires
Traumatisme sarcoïdose
Cancer ARDS
granulomatose asbestose Cancer
3) Le facteur tissulaire et sa régulation.
1) Le facteur tissulaire; une molécule transmembranaire.
Le facteur tissulaire est une glycoprotéine transmembranaire de 42 à 47 kDa, récepteur et
cofacteur des facteurs plasmatiques VII et Vlla. C’est une protéine ubiquitaire normalement
absente du compartiment sanguin (intravasculaire). Elle est liée aux phospholipides et cette
liaison est nécessaire à son fonctionnement (Chargaff, 1948; Nemerson, 1968). En 1987 trois
groupes ont isolé et établi la séquence du gène qui est formé de 6 exons, séparés par 5 introns.
Ce gène correspond à une protéine de 263 acides aminés glycosylée en trois sites asparagines.
L’analyse séquentielle suggère que le facteur tissulaire appartient à la superfamille des récepteurs aux cytokines et aux interférons (Bazin 1990a et b) et possède une forte analogie avec la thrombomoduline (Jackman 1986) et le récepteur aux lipoprotéines de basse densité.
Les relations entre FACTEUR TISSULAIREet FVII ont été bien étudiées par Ruff (Ruff W, 1991 a-e). 2) La régulation du gène du facteur tissulaire dans le monocyte et la cellule endothéliale.
A) La région régulatrice du gène.
Récemment la région promotrice du gène a été décrite. Elle possède une forte analogie avec la région régulatrice du gène du facteur de nécrose tumoral TNF-a , de l’ILl et du PAI-1. La région promotrice possède un élément de réponse au LPS (LPS-responsive element; LRE) de 56 pmres de base, possédant deux sites de fixation, l’un pour le facteur nucléaire de type Activator Protein-1 (AP-1) et l’autre pour un site de fixation de NF- k B (Mackman 1991). La liaison de NF- k B principalement et de AP-1 sur leur sites de liaison sur le promoteur induit la transcription du gène du facteur tissulaire. NF- k B est impliqué dans la régulation d’autre gène précoce de l’inflammation comme rinterleukine-6, l’interleukine-S, le TNF-a (Edgington 1991). De plus la région promotrice possède des régions consensus pour des facteurs nucléaires de type AP-2 (Mackman 1991). La réponse aux esters de phorbol est connue pour nécessiter la présence d’AP-1 et d'AP-2 (Lee 1987, Angel 1987, Imagawa 1987). Enfin un élément de réponse au sérum (certains sérum sont fortements activateurs) réside entre les paires de bases -111 et +14 (Mackman 1990) et il y a un site SP-1 (Kadonaga 1986). Ainsi le facteur tissulmre est actuellement intégré dans la famille des protéines précoces de l’inflammation et son gène peut être activé par les facteurs de croissance et superinduit par la cycloheximide est classé dans les ‘immediate-early gene’.
B) La régulation de VARN messager
La forme majeure de l’ARNm pèse 2.3 Kb (Morrissey 1987). La régulation de l’expression du
facteur tissulaire est essentiellement transcriptionnelle. La demi-vie de l’ARN messager après
induction de sa transcription par un facteur inflammatoire est courte d'environ ± 48 min. (après
induction par le TP A; Scarpati 1989) à Ih 30 (après induction par le LPS; Gregory 1989). La
région 3’ non traduite (3’-UTR) de l’ARNm du facteur tissulaire possède une large séquence
(± 600 nucléotides) nécessaire à sa stabilité dont une sous-région riche en Uracile+Adénine
(AU-rich région), semblable mais plus grande (400 nucléotides versus 100) à celle qui régule la
Stabilité de l’ARNm de rinterleuk:ine-2 du GM-CSF, de l’interféron-P et du proto-oncogène c- fos. La déstabilisation et la dégradation de l’ARNm dépendent de protéines dont la synthèse est bloquée par ractinomycine-D (inhibiteur transcriptionnel) et la cycloheximide (inhibiteur traductionnel). Ceux-ci induisent une superinduction par accumulation de l’ARNm du facteur tissulaire en raison de l’augmentation de sa demi-vie (Ahem 1993).
4) Les éléments inducteur d’une activité oroœaaulante dépendante de l’exoression du facteur tissulaire.
1) les facteurs humoraux, les médiateurs de l’inflammation.
La régulation du gène diffère dans les cellules du compartiment intravasculaire et dans les tissus. En contact avec le sang, seul le monocyte et la cellule endothélial sont capable d’exprimer le gène du facteur tissulaire. Les lymphocytes, les polynucléaires et les mégacarycocytes ne le peuvent pas (Gregory et Edgington 1985). Physiologiquement, le facteur tissulaire n’est pas présent en quantités significatives dans le monocyte et la cellule endothéliale. En particulier, il n’y a pas de réservoir (pool) intracellulaire préexistant et exprimé secondairement à la stimulation de la cellule. Par contre de nombreux facteurs induisent l’expression membranaire de la thromboplastine après une synthèse de novo de la protéine (Bevilacqua MP 1986, Nawroth PP 1986). Le tableau ci-après indique clairement le rôle prépondérant des médiateurs de l’inflammation et des facteurs humoraux.
Monocyte-Macrophage Cellule endothéliale
Interleukine-1 Endotoxines
Exotoxines staphylococciques OKT3
Esters de Phorbol Tuftsin
La stimulation allogénique dans la MLR C-réactive protéine
Formes d’albumines
Lipoprotéines de basse densité-oxydées (l’activation du complément?)
Infection viral
Interleukine-1
Facteur de Nécrose Tumoral-a Endotoxin
Thrombine Esters de Phorbol Phytohémagglutinine
C-réactive protéine Formes d’albumines
Lipoprotéines de basse densité-oxydées Les complexes Immuns
L’OKT3 est repris dans le tableau ci-dessus comme agent pouvant induire une activité
procoagulante directe sur le monocyte (Itaka M, 1987 et Pradier O, 1993 article 3) mais pas au
niveau de la cellule endothélial. Nous montrerons que l’activation procoagulante des cellules
endothéliales est induite in vitro en grande partie par le TNFa libéré par les cellules mononucléées sanguines activées par l’OKT3 (Pradier O., 1992; article 2)
En plus des facteurs inducteurs, une série d’agents ont montré des capacités d’amplification de la réponse monocytaire. Ainsi le facteur d’activation plaquettaire (PAF) pré-active les monocytes (priming) qui répondent de façon augmentée à la stimulation par les endotoxines (Kucey DS, 1991). Les fortes concentrations de glucose augmentent la synthèse et l’expression du facteur tissulaire par les cellules endothéliales stimulé par l’IL-1 et la thrombine (Boeri D, 1991).
2) Les facteurs cellulaires auxiliaires.
A) Les lymphocytes T
Alors que l’activation procoagulante des monocytes et des cellules endothéliales par les endotoxines a été montrée comme indépendante des lymphocytes (), plusieurs travaux ont impliqué la nécessité de la présence des lymphocytes T (particulièrement les T CD4) pour l’expression d’une activité procoagulante monocytaire (Rothberger H, 1977; Edwards RL, 1979, 1980). Cette activité s’exerce soit par l’intermédiaires de messagers solubles soit par le contact intercellulaire. Enfin l’activité procoagulante dépendante des lymphocytes T peut être associé à une restriction au système d’histocompatibilité (restriction syngénique) c’est la cas dans l’alloréactivité, la réponse immunitaire spécifique d’antigène et l’action des superantigènes bactériens (exotoxines staphylococciques) soit indépendante de la restriction syngénique, c’est la cas de l’activation lymphocytaire par les lectines mitogènes ou par l’OKT3.
Le groupe d’Edgington en Californie a nettement montré que lors de la réponse allo2éniaue.
un des tout premiers événements, contemporain de la synthèse de TNFa, est l’expression d’une activité procoagulante monocytaire dépendante du facteur tissulaire (Levy GA, 1980) induite par l’incompatiblité dans complexe majeur d’hidtocompatiblité de classe II (HLA-DR) (Helin H, 1983). Cette activité procoagulante associée à une réponse immunitaire est caractérisée par les faits suivants:
-le rôle prépondérant des lymphocytes T CD4 (Fan ST, 1990)
-cette activité se manifeste par la synthèse de facteurs humoraux mal définis nommés
‘Monocyte Procoagulant Inducing Factor (MPIF; Gregory SA, 1986) ainsi que des facteurs de
contact intercellulaire monocyte-lymphocyte (Gregory SA, 1985).
Lors de la réponse immunitaire T spécifique d’un antigène, van Ginkel a montré que l’activité procoagulante des monocytes était augmentée (van Ginkel JW, 1981).
Il en ressort, que durant la réponse immunitaire spécifique, lorsque la cellule présentatrice d’antigène (ici, le monocyte) présente le peptide antigénique en association avec le complexe majeur d’histocompatibilité de classe II elle fournit en plus une activité accessoire aux fonctions lymphocytaires T (prolifération clonale, synthèse de cytokines) en retour, le lymphocyte T4, stimule les fonctions monocytaires (telle l’activité procoagulante) grâce à des médiateurs solubles et par l’intermédiaire du contact intercellulaire.
Nous montrerons que l’activité procoagulante du monocyte induite par l’OKT3 nécessite également, l’intervention des lymphocytes bien que le pontage intercellulaire soit différent.
Pontage ‘monocyte-HLA-DR-antigène-TCR-lymphocyte’ dans le premier cas et ‘monocyte- FcyR-OKT3-CD3-lymphocyte’ dans notre étude.
OKT3
1 Modèle 2 Modèle
B) L ’adhésion monocytaire, le rôle particulier du complexe CDllb-CD18 (Mac-1).
Depuis longtemps on sait que l’adhésion du monocyte sur une surface étrangère engendre sa
préactivation (priming) et même d’emblée l’expression de son activation procoagulante (van
Ginkel, 1977). Plus récemment, le groupe d’Edgington a mis en exergue le rôle important de
l’intégrine Mac-1 (CDllb-CD18) dans la coagulation. Mac-1 possède de nombreuses
fonctions:
1) d’adhésion
• C’est le contre-récepteur d’ICAM-1 une des molécules d’adhésion les plus ubiquitaire (Diamond MS, 1990, Altieri DC, 1991)
• C’est le récepteur pour C3bi (rôle dans l’adhésion des particules opsonisées; Wright SD, 1983)
2) de coagulation
• C’est un récepteur au facteur X dont il permet l’activation (Altieri DC, 1988).
• C’est avec la glycoprotéine GPIIb-IIIa (Altieri, DC 1986), un récepteur pour le fibrinogène, important pour le dépôt de la fibrine à la surface du monocyte (Altieri DC, 1991).
• C’est une voie d’activation du monocyte. Sur le monocyte, l’engagement de Mac-1 par son contre récepteur ou par un anticorps anti CDllb/CD18 augmente à la fois l’activité procoagulante dépendante du facteur tissulaire et la synthèse de TNFa induite par le LPS.
De plus le LPS augmente l’expression monocytaire de Mac-1 d’un facteur 2 à 3 (Fan ST et EdgingtonTS, 1991-1993).
Nous montrerons, in vivo, que l’expression de Mac-1 augmente de façon significative quelques
heures après la première injection d’OKT3, et que cette augmentation est associée à celle
d’autres molécules d’adhésion, CD 29 (P 1-intégrine), CD 54 (ICAM-1), GP 150-90 (CDllc-
CD18). (PradierO. Submitted; Article 5)
objectif de ce travail était de déterminer l’origine d’une incidence élevé de
I complications thrombotiques survenant dans le greffon au décours immédiat de la transplantation. Nous avons voulu déterminer l’eventuel rôle de l’anticorps monoclonal OKT3 dans la survenue de ces complications. Pour répondre a cette question nous avons dévelloppé des études in vivo des marqueurs d’activité procoagulante puis des modèles in vitro d’activation des cellules endothéliales et des monocytes.
En ayant impliqué les phénomène thrombotiques comme étant l’une des complications associé
à la première administration d’OKT3 nous avons dans un second temps tenté d’établir le rôle
de facteur de risques associés, puis d’établir les différentes voies d’une stratégie visant à
réduire ou à annuler les effets secondaire de l’OKT3. Cela nous a ammené à étudier les effets
inhibiteurs de diverses médications ainsi que l’utilisation d’anticorps anti-CD3 dérivés de
rOKT3 et à faible pouvoir activateur. L’étude de ces anticorps a débouché sur la mise ne
évidence du rôle majeur des lymphocytes T dans la génése de l’activité procoagulante induite
par l’OKT3.
A) Les patients
Les patients adultes recevant une transplantation rénale allogénique, ont été étudiés juste avant et pendant les 24 premières heures post transplantation à des temps réguliers. Les patients traités par l’OKT3 reçoivent 5 ou 10 mg d’OKT3 en i.v. dès l’initiation de la narcose. Le traitement comporte aussi 2 mg/Kg d'azathioprine et 8 à 30 mg/Kg de méthyl-prednisolone donné trois heures avant l’injection d’OKT3. Les patients du groupe témoin se recrutent essentiellement soit dans le cadre des greffes compatibles intrafamiliales soit lors d’une contre- indication à l’OKT3 comme une immunisation préalable. Les différents groupes de patients ont toujours été comparables sur tous les plans, en particulier la compatibilité HLA et le temps d’ischièmie froide du greffon.
B) Les tests de coagulation:
A) La détection d’un état prothrombotiaue
1) La génération de la thrombine in vivo.
L’activation de la prothrombine par le facteur Xa génère des fragments 1.2 qui restent attacher par un pont disulfure. Le fragment 1.2 a une demi-vie plasmatique de ± 40 minutes et est dosable dans le plasma par au moins deux kits commerciaux (d’après Bauer 1985). C’est un bon reflet de la quantité de thrombine générée in vivo (Nesheim M, 1983).
2) La fibrino-formation.
La transamination par le facteur XIII crée de nouveaux épitopes différentiant le fibrinogène de la fibrine. La présence de D-Diméres et de produit de dégradation de la fibrine dans le plasma montre indirectement la fibrino
formation.
Les marqueurs plasmatiques d’un état prothrombotique.
(PAP; complexe plasmine anti-plasmine, TAT;
complexe thrombin-antithrombinelll, vWF: von
Willebrand Factor, D-DI; D-Dimères PDF produit de
dégradation de la fibrine, PDFgène; produit de
dégradation du fibrinogène)
3) L’activation endothéliale.
Lors de son activation la cellule endothéliale libère le contenu des grains de Webell-Palade. Un taux plasmatique élevé du facteur de von Willebrand (de l’activateur tissulaire du plasminogène et de son inhibiteur et aussi de la thrombomoduline soluble) indique une activation endothéliale.
B) La procédure de œaaulation en un temps (One staae clottina assav).
C’est un temps de prothrombine modifié. Il consiste à mélanger un pool de plasmas normaux humain décalcifié par le citrate et les cellules sanguines dont on veut mesurer l’activité procoagulante. On initie la coagulation en recalcifiant le mélange et on mesure le temps de gélification du plasma par une technique mécanique (KCIO Amelung, Germany). Dans ce test, le pool de plasma apporte 100% de tous les facteurs plasmatiques de la coagulation et les cellules apportent la thromboplastine tissulaire (FT). Le temps de coagulation d’un plasma étant proportionnel à la quantité de thromboplastine, l'activité procoagulante des cellules est établie par référence à une courbe de dilution d’une thromboplastine de référence (Simplastine Organon Teknica).
1) Détermination in vitro de l’activité procoagulante des cellules mononucléées du sang.
Les monocytes et lymphocytes sont isolés à partir de sang anticoagulé au citrate de sodium apyrogène par une centrifugation sur gradient de ficoll. Après lavage les cellules sont remises en suspension dans un milieu de culture composé de RPMI 1640, 20 mM Hépès, 5% de sérum de veau foetal, 5x10'* M j32 Mercapto-éthanol. La contamination plaquettaire est < à 40.000 p./|il et la contamination par les polynucléaires < à 1%. Les cellules mononucléées (PBMC) sont ajustées à 500.000 monocytes/ml puis cultivées pendant 6 ou 18 heures en présence des agents stimulants ou inhibiteurs. Usuellement les PBMC sont stimulés par 10 ng/ml d’OKT3, ou 100 ng/ml LPS. L’activité procoagulante est ensuite déterminée par le test de coagulation en un temps soit:
• Sur des cellules intactes, c’est la mesure de l’activité procoagulante physiologique de la surface cellulaire.
• Soit sur des cellules lysées par deux cycles de congélation décongélation et c’est la mesure
de l’activité procoagulante totale qui est généralement plus grande d’un facteur trois que
l’activité de surface.
2) La détermination ex-vivo de Tactivité procoagulante des cellules du sang.
Le sang est anticoagulé par de l’héparine ou de l’EDTA. Immédiatement, les PBMC sont isolés comme précédemment sur un gradient de ficoll puis ajusté à monocytes /ml et congelés à - 80°C.. L’activité procoagulante totale des cellules mononucléées du sang circulant est ensuite déterminée en absence de stimulation par le test de coagulation en un temps.
C) Le test de génération de thrombine à la surface des cellules endothéliales de veine de cordon ombilical.
Les cultures de cellules endothéliales de veine de cordon ombilicale (HUVEC) expriment en réponse à certain médiateurs soluble du facteur tissulaire à leur surface. Les HUVEC sont isolées de la veine du cordon suivant la méthode de Jaffé () puis cultivé au maximum trois passages dans un milieu M 199 additionné de 20 % de sérum humain AB, 5x10‘* M P2 Mercapto-éthanol, héparine 100 U/ml et de l’endothélial cell growth factor (ECGF 40 pg/ml) avant d’être stimulé par des agonistes. Les cellules sont ensuite transférées dans des boites à 96 puits, cultivées jusqu’à confluence en absence d’ECGF et d’héparine, puis stimulées. La génération de thrombine est déterminée par un test chromogénique en deux temps.
• Premier temps, on ajoute 100 pl/puits d’un pool de plasma citraté qui apporte 100% des éléments de la voie extrinsèque sur la monocouche d’HUVEC. On recalcifie le plasma et on laisse incuber un temps suffisant pour que la thrombine soit générée, mais trop court pour induire la fibrino-formation.
• Deuxième temps, la thrombine générée est révélée par une incubation de 20 mn à 37°C.
avec 0.7 mM du chromogène spécifique S2238 (Chromogénix Nodia). La quantité de thrombine produite dans le système est déduite par référence à une courbe de dilution de thrombine standard purifié. La réponse est exprimée en mU de thrombine pour 10**
HUVEC.
C) Les tests de cytofluorométrie de flux.
Ils sont effectués parallèlement aux tests de coagulation sur des cellules isolées par les mêmes
procédures. Après le dernier lavage du gradient de Ficoll, les cellules sont incubées 30 à 60 mn
à 0°C, dans du tampon phosphate avec 0,5% d’albumine bovine et les anticorps monoclonaux
marqués (mAbs) à la fluoresceïne (FITC) ou à la phycoérythrine (PE). Après lavage les cellules
sont remises en suspension dans un colorant fluorescent vital le 7 AAD (5 pg/ml, 7-
aminoactinomycin D, Molecular Probes Inc., Eugene, OR) et analysées par un FACScan de
Becton Dickinson (Becton Dickinson, Mountain View, CA). La calibration est effectuée avec le kit Calibrite'^ (Becton Dickinson). Les monocytes sont ‘fenêtrés’ en combinant les critères morphologiques (side and forward scatter), l’expression forte de la fluorescence du CD 14 et l’expression de la viabilité par l’abcence d’incorporation du 7-AAD. L’acquisition porte sur au moins 1500 événements qui répondent à ces trois conditions. Les marquages non spécifiques sont évalués sur 1500 événements répondant aux mêmes conditions, à l’aide d’un mélange d’anticorps sans spécificité combinant les différents isotypes utilisés.
D) Evaluation du contenu cellulaire en ARNm par la méthode de la transcriptase inverse associé à la réaction de polymérisation en chaîne (RT-PCR).
Le contenue cellulaire en ARNm est évalué soit in vitro dans des PBMC stimulés pendant deux heures soit ex-vivo dans les cellules sanguines circulantes des patients greffés rénaux et traités par OKT3. Dans le premier cas l’ARNm est extrait de 10^ PBMC, dans le second cas, les cellules sanguines d’un ml de sang sont lysées par du surfactant (Catrimox 14, IBC, Oakdale, 10) et l’ARNm extrait. Dans les deux cas l’extraction utilise la méthode thyocianate/guanidine.
1 pg d’ARNm est ensuite transformé en ADN complémentaire par la transcriptase inverse du
virus leucémisant murin de Moloney (Mo-MuLV-RT) puis le génome du facteur tissulaire est
amplifié dans 28 à 32 cycles de PCR en utilisant des amorces spécifiques du FT placées de
chaque coté de l’intron 1. Les produits de PCR sont ensuite séparés par éléctrophorèse dans un
gel de 2.5 à 5 % d’agarose et colorés avec du bromure d’éthidium.
Chapitre 1 : Thromboses dans le greffon rénal induitent par l’OKT3.
Les cliniciens du département de néphrologie ont constaté l’apparition d’une fréquence anormalement élevée d’accidents thrombotiques survenant dans le greffon rénal dans les jours suivant l’intervention. La description initiale répertoriait 9 épisodes thrombotiques parmi les 93 patients ayant reçu une greffe rénale allogénique et de l’OKT3 comme prophylaxie du rejet de greffe. Les 13 épisodes thrombotiques que nous avons finalement observé sont apparus précocement entre le premier jour et le jour 11 postopératoire avec une médiane au cinquième jour. Dans 2 cas les thromboses entreprenaient les artères rénales, dans cinq cas les veines et dans 6 cas les capillaires glomérulaires à type de microangiopathies thrombotiques similaires à celles observées dans le syndrome hémolyse et urémie.
Dan les six cas de microangiopathie, confirmés par la diminution de l’haptoglobine, la thrombopénie et la présence de schyzocytes, l’analyse anatomopathologique des biopsies rénales montre la présence de thrombii fibrineux et plaquettaires dans les boucles capillaires des glomérules et dans les artérioles afférentes. Les cellules endothéliales enflent en envahissant la lumière capillaire et ont un aspect multivacuolisées (foamy cells). En immunofluorescence les glomérules et les vaisseaux marquent fortement avec un anticorps anti-fibrinogène mais pour le C3 ou les immunoglobulines.
Le dosage des fragments 1.2 de la prothrombine chez 7 patients, traités par l’OKT3 mais qui n’ont pas développé de phénomènes thrombotiques, montre un pic 4 heures. Chez quatre patients greffés qui n’ont reçu ni cyclosporine-A, ni OKT3, le taux des F 1.2 ne varie pas significativement par rapport au niveau de base.
Les observations que;
1. L’ injection de TNFa à des volontaires sains, induit une activation similaire de la coagulation avec augmentation des F 1.2.
2. Le TNFa est capable d’induire des dépôts de fibrine dans les tissus et de déclencher une coagulopathie de consommation dans des modèles animaux.
Et la libération de grandes quantités de TNFa à la suite de la première administration d’OKT3,
ont fait évoquer son rôle comme médiateur des effets procoagulants de l’OKT3.
^ 48 h
+ mifepristone Fig 2—lnterleukin-8 production in response to progestérone
and mifepristone.
induces not only cervical ripening and labour but also inflammatory reactions in other sertings.*’ The capacity of choriodecidual tissue to produce interleukin-8 would mean that such tissues could be destabilised by endogenous or exogenous prostaglandin.
Previously, the myometrium seemed the likely target tissue for prostaglandin E produced by the amnion, but it is not clear whether the prostaglandin can cross the chorion,’-®
which is rich in prostaglandin dehydrogenase (the main inaaivating enzyme). Our findings suggest, however, that access of the prostaglandin to the choriodecidual vasculamre is what matters, since this is where synergistic action with interleukin-8 would be expeaed. ImmunocyTOchemical studies hâve shown non-uniform distribution of prostaglandin dehydrogenase in the chorion,® so access to the vasculamre might be available.
Intrauterine infection is one of the commonest causes of premamre labour;’® our finding that baaerial lipopolysaccharide stimulated choriodecidual interleukin-8 produaion suggests how infection might aaivate the natural mechanism of paiturition. The synergy berween prostaglandin E and interleukin-8 could explain why non-steroidal anti-inflammatory drugs that inhibit prostaglandin produaion are only panly effective in preventing premamre labour. A fuller understanding of the processes that control the produaion of interleukin-8 could lead to more effective regimens for tocolysis.
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Induction of thromboses within rénal grafts by high-dose
prophylactic OKT3
D.
ABRA.MO’X’ICZ O. PradierA.
MARCH.ANTS.
FLORQUINL. DE
PALAX’P.
VEREERSTR.^TENP.
KINTv’AERT J. L. V-anhervcheghem m. GoldmanAmong 93 consecutive kidney-transplant patients who received prophylactic 0KT3 10 mg/day for 2 weeks, 9 had intragraft thromboses within 2 weeks of transplantation. The thromboses were in graft artery in 1 patient and veins in 3. The other 5 had thromboses in glomerular capillaries and thrombotic microangiopathy similar to that of haemolytic- uraemic syndrome. AH attempted treatments failed, and the 9 grafts had to be removed. The finding that plasma concentrations of prothrombin fragment 1 and 2 were higher 4 h after the first OKT3 dose in OKT3 récipients than in transplant patients who received other prophylaxie (mean 5-88 [SEM 0-76]
vs2'25 [0-59] nmol/l, p <0 01 ) confirme that OKT3 has procoagulant effects in vivo.
iancer 1992; 339:777-78.
OKT3, a murine monoclonal anribody that recognises the CD3 complex of T cells, is effective in the treatment of allograft rejection.' OKT3 given prophylactically to kidney- transplant récipients is associated with a lower frequency of early rejeaion épisodes and an apparent inaease in long-term graft survival.’'^ Since in many cases of rejeaion during prophylactic OKT3 administration the sérum OKT3 concentrations were low,^ we inaeased the dose to 10 mg day. We repxrrt an unexpeaed and severe complication of this treatment—namely, the induaion of intragraft thromboses.
From November, 1989, to May, 1991, 93 consecutive kidney- transplant patients received prophylactic OKT3 at a daily dose of 10 mg for 14 days. The first OKT3 injection was given during the cransplant operation. Patients also received azathioprine and steroids (an intravenous méthylprednisolone bolus before the first two OKT3 injections, then low-dose prednisolone from day 2 onwards). Cyclosporin (6 mg kg) was introduced on day 11. Plasma concentrations of prothrombin fragment 1 and 2 (Fl + 2), a sensitive marker of systemic activation of the common coagulation pathway, were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (Behringwerke, .Marburg, Germany).’
Intragraft thromboses developed in 9 of the 93 patients 1-11 days after transplantation.* None of these patients
•Tables giving full details of the patients with and M-iihout thromboses are available from The Lancet.
Fig 1—Rénal biopsy sample from patient with thrombotic microangiopathy.
There Is slight interstitial oedema with no cellular infiltrâtes; well- preserved tubular epithelium; thrombus in afferent arteriole; and thickeningof capillary walls with formation of double contours (arrow).
Stained with periodic acid/Schiff, reduced by 60% from x 400.
received cyclosporin at any time. The 9 patients with thromboses did not differ from the 84 without thromboses in any démographie or clinical charaaeristics,* including the proportions who had received kidney grafts previously
(3[33%] VS 9 [11%]) or who showed anti-HLAimmunisation (2 [22%] vs 13 [15%]).* Possible risk faaors for thrombosis were found in 3 patients: 1 had received a kidney from a child; 1 received a kidney large for his size; and 1 had haemoljiic-uraemic s\-ndrome as the initial nephropathy.
The thromboses were in the rénal arteiy in 1 patient and in rénal veins in 3. The other 5 patients had thromboses in glomerular capillaries and thrombotic microangiopathy similar to that of haemohme-uraemie s>’ndrome (fig 1).
Swelling of endothélial cells was prominent, and many capillaries were occluded by fibrin and platelet thrombi.
Only 1 patient showed associated discrète cellular rejection.
On immunofluorescence, glomeruli and vessels stained strongly for fibrinogen but not for IgG, IgA, IgM, or C3.
3 patients with glomerular thromboses had decreases in packed cell volume, platelet counts, and haptoglobin concentrations consistent with microangiopathic haemolvtic anaemia. Anempts to treat thrombotic microangiopathy with anti-aggregants, steroids, and plasmapheresis were unsuccessful, and the rénal grafts of ail
Fig 2—Mean (and SEM) plasma concentrations of F1-2 intraoperatively in 7 patients receiving first injection of 10 mg OKT3 to TO and in 4 control patients sampled at similar times.
9 patients were removed (2 to 55 days after transplantation).
3 of these patients hâve since undergone successful transplantation with cyclosporin prophylaxis.
OKT3 procoagulant effeas were studied by measurement of plasma Fl+2 concentrations in 7 subséquent transplant récipients, none of whom had thromboses, and in 4 other kidney-transplant; récipients immunosuppressed with azathioprine and steroids with or without c\’closporin (Controls). Fl +2 concentrations were significantly higher in the OKT3 récipients 4 h after the first dose than in the Controls tested at the same time (mean 5-88 [SEM 0-76] VS 2-25 [0-59] nmol/1; p<001, unpaired Student’s r test; fig 2).
Thromboses of main grafe vessels hâve become rare, and humoral graft rejection, which can lead to glomerular thromboses, is unlikely in these patients since none had immune glomerular deposits.“ In addition, 3 of the 9 patients with thromboses subsequently underwent successful transplantation with cyclosporin prophylaxis.
These findings suggested that OKT3 has intrinsic procoagulant effeas, and the substantial rise of Fl+2 plasma concentrations after OKT3 confirms that the antibody activâtes the common coagulation pathway in vivo.
Similar changes in Fl +2 were reponed after infusion in volunteers of recombinant tumour necrosis faaor-a,’ a cytokine that triggers fibrin déposition and intravascular coagulation.® Large amounts of this c\7okine are released into the circulation after OKT3,® ’ so it could be a mediator of OKT3 procoagulant effeas.
Lately we hâve seen similar thrombotic events in 3 patients receiving 5 mg day OKT3; thus, even with conventional OKT3 doses there is a risk of these complications. Vt’e conclude that OKT3, like cyclosporin,®
can promote thrombosis of graft artery or vein as well as haemoljuc-uraemic syndrome.
This snidy was supported by the Fonds de la Recherche Scientifique Medicale vEelgium) and by Cilag Benelux.
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ADDRESSES; Departmentsof Nephrology (D. Abramowicz. MD, L De Pauw, MD. P. Vereerstraeten, MD, P. Kinnaert, MD, J. L.
Vanherweghem, MD); Haematology (O. Pradier, MD, A. Marchant, MD). Pathology (S Florquin, MD), and Immunology (M Goldman.
MO), Cliniques Universitaires de Bruxelles. Hôpital Erasme, Brussels, Belgium. Correspondence to Dr D Abramowicz, Nephrology Department, Hôpital Erasme, 808 route de Lennik. B-1070 Brussels. Belgium.
