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Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository
Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:
Dupont, E. (1987). Contribution à l'étude des mécanismes d'action des immunosuppresseurs utilisés en greffe d'organes (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté de Médecine – Médecine, Bruxelles.
Disponible à / Available at permalink : https://dipot.ulb.ac.be/dspace/bitstream/2013/213507/1/3dfca5d2-75b3-426c-9dfd-c0cd171df602.txt
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UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES DEPARTEMENT D'IMMUNOLOGIE, HEMATOLOGIE ET TRANSFUSION
HOPITAL ERASME
CONTRIBUTION A L'ETUDE DES MECANISMES D'ACTION DES IMMUNOSUPPRESSEURS UTILISES EN GREFFE D'ORGANES
THESE PRESENTEE EN VUE DE L'OBTENTION DU GRADE D'AGREGE DE L'ENSEIGNEMENT SUPERIEUR
ETIENNE DUPONT 1987
A MON EPOUSE ET
A MES DEUX FILLES
AVANT PROPOS ET REMERCIEMENTS
Les premières greffes d'organes humaines furent pratiquées il y a 30 ans. Depuis, elles ont connu un développement remarquable et des succès sans cesse croissant à un point tel qu'elles font maintenant partie intégrante du traitement de diverses maladies qui détruisent de façon irréversible des parenchymes vitaux comme les reins, le coeur, le foie ou le pancréas. Des facteurs multiples expliquent l'amélioration des résultats observée. Cependant, le rôle des médicaments immunosuppresseurs utilisés pour lutter contre le rejet est considérable. Chaque introduction en transplantation
humaine d'une substance nouvelle - l'azathioprine en 1961, les corticostéroïdes en 1963, les sérums antilymphocytes en 1966, la cyclosporine A en 1978 - a toujours coïncidé avec un gain très significatif des résultats. Efficaces, ces médicaments sont également toxiques et le clinicien pourrait tirer bénéfice de tests immunologiques ayant la simplicité et la rapidité du radioimmunoessai utilisé pour doser la cyclosporine, pour ajuster les posologies des divers
immunosuppresseurs couramment utilisés. C'est dans cette optique que ce travail a commencé. L'extrême complexité des mécanismes d'activation lymphocytaire sur lesquels agissent les médicaments nous apparaît chaque jour rendant indispen
sable une approche de plus en plus fondamentale dans le but d'apporter des réponses utiles à la clinique.
Cette étude a été conçue dans le service du Professeur
Charles TOUSSAINT d'abord à l'Hôpital Brugmann puis à l'Hôpital
Erasme. C'est grâce à l'esprit de recherche qu'il a entretenu
dans son service, à son soutien et ses encouragements constants
qu'elle a progressivement abouti. Je voudrais lui adresser ici
l'expression de toute ma gratitude.
Si le concept du présent travail a largement été inspiré par les problèmes de l’immunosuppression en clinique, c'est au laboratoire que les réponses ont été élaborées. Les éléments d'immunologie de transplantation m’ont été apportés dans le laboratoire du Professeur J.P. REVILLARD à Lyon puis dans celui du Professeur P.I. TERASAKI à Los Angeles où ont été réalisées les premières expériences de ce travail. Je tiens à les remercier.
La création à l’Hôpital Erasme d’un département d’Immuno-
Hématologie et de Transfusion disposant d'un large éventail de techniques d’immunologie a fourni une impulsion importante à ce travail en permettant de répondre rapidement â de multiples questions. J'adresse au Professeur J. WYBRAN tous mes
remerciements pour le rôle déterminant qu'il y a joué. Ce travail n'aurait certainement pu aboutir sans les échanges fructueux que j'ai eus avec Monsieur M. ANDRIEN et Madame L. SCHANDENE dont les remarquables connaissances en histocompatibilité et en immunologie cellulaire m'ont été d'un grand apport. L'aide très efficace
de Mesdames M.C. SERVAIS, M. VANDERCRUYS, C. DENYS et de Messieurs ROMASCO et CRUSIAUX m'a été particulièrement utile. Que tous reçoivent l'expression de mes chaleureux remerciements.
Enfin, je remercie Madame G. BASILE qui a dactylographié ce
texte et Monsieur BEAURIR pour l'aide apportée â l'élaboration
de ce manuscript.
GLOSSAIRE
ADCC ADN AET ANK ARN AZA CCL CMH
CML
Con A CTBC CTL CTLL Cy A DG DR EA HLA HR
la
IL-1, 2, 3 IP3
LAK LED LGL LMC LPS MLR MPD 6 -MP MTT
antibody-dependent cell-raediated cytotoxicity acide désoxyribonucléique
2 -amino-ethylisouronium (bromure de) activated NK
acide ribonucléique azathioprine
cultured cell line
complexe majeur d’histocompatibilité ou MHC (major histocompatibility complex)
cell-mediated lympholysis (lympholyse à médiation cellulaire)
concanavaline A cytotoxic TBC
cytotoxic T lymphocyte
cytotoxic T lymphocyte line cyclosporine A
diacyl glycerol D related
érythrocyte anticorps human leukocyte antigen hypersensibilité retardée
immune associated (équivalent de l'antigène DR) interleukines 1, 2, 3
inositol triphosphate
lymphokin activated killer lupus érythémateux disséminé large granular lymphocyte
lymphocyte-mediated cytotoxicity lipopolysaccharide
mixed lymphocyte reaction méthylprednisolone
6 -mercaptopurine
3 (4, 5 dimethylthiazol-2-yl)-2-5 dyphenyltetrazolium
(bromure de)
NK natural killer
PFC plaque forming cell PHA phytohémagglutinine
PMA phorbol rayristate acetate ou TPA (12-0-tetradécanoyl phorbo1-13-acétate)
PKC protéine kinase C PRED prednisolone
SAL sérum antilymphocytes
SIDA syndrome d'immunodéficience acquise TBC target binding cells
TC T cytotoxique
TCGF T cell growth factor
TH T helper
Th3H thymidine tritiée
SOMMAIRE
I . 1 .
1 . 2 .
1.2.1
1.3.
1.4.
1.4.1
1.4.2
1.4.3
1.5.
1 . 6 .
II .
II. 1 .
INTRODUCTION. BUTS DU TRAVAIL.
INTRODUCTION SUR LES INTERACTIONS ENTRE IMMUNOSUPPRESSEURS ET SYSTEME IMMUNITAIRE DANS LE CADRE DES ALLOGREFFES.
Induction de la réponse immune.
a. Relation entre les processus de présentation antigénique, d'immunogénicité et antigènes d'histocompatibilité.
b. L'activation lymphocytaire.
LA RIPOSTE EFFECTRICE.
MECANISMES DES IMMUNOSUPPRESSEURS AU NIVEAU CELLULAIRE.
Azathioprine.
Costicostéroïdes.
Cyclosporine A.
ROLE POTENTIEL DES IMMUNOSUPPRESSEURS DANS LE PHENOMENE DE TOLERANCE DE TRANSPLANTATION.
INFLUENCE DES IMMUNOSUPPRESSEURS SUR LES MOUVEMENTS ("TRAFIC") DES LYMPHOCYTES ET DE MOLECULES IMMUNOLO- GIQUEMENT ACTIVES.
MATERIEL ET METHODES-
ISOLEMENT DES LEUCOCYTES.
2
II .2. MARQUEURS LYMPHOCYTAIRES.
II .3.
II .4.
II .5.
III .
III . 1.
TESTS DE PROLIFERATION LYMPHOCYTAIRE.
TESTS DE CYTOTOXICITE.
MESURE DE LA PRODUCTION D’INTERLEUKINE 2.
RESULTATS. INFLUENCE DES IMMUNOSUPPRESSEURS SUR L'ACTIVATION LYMPHOCYTAIRE.
MODIFICATION DE LA PROLIFERATION MESUREE PAR L’INCORPORATION DE THYMIDINE TRITIEE.
III. 1.1. Etudes in vitro avec la cyclosporine, la méthyl
prednisolone et la 6 mercaptopurine.
III.1.2. Etudes in vivo chez les patients transplantés.
III.2. MODIFICATION DE LA PRODUCTION D’INTERLEUKINE 2 ET DES LYMPHOCYTES "HELPER" (AUXILIAIRES - INDUCTEURS) CD4+.
111.2.1. Etudes in vitro de la cyclosporine, de la méthylpredni
solone et de la 6 -MP sur la production d’IL2.
111.2.2. Influence des corticostéroides sur la production d’IL2 et
sur les lymphocytes CD4+ in vivo.
a. Effets de 1’hydrocortisone chez les sujets sains.
b. Etude sur les patients porteurs de greffe rénale.
IV. EXPRESSION DES ANTIGENES HLA DE CLASSE II.
IV. 1 . ETUDE IN VITRO DES DROGUES SUR L'EXPRESSION DE L'ANTIGENE la APRES ACTIVATION LYMPHOCYTAIRE PAR LECTINE.
IV.2. EXPRESSION DES ANTIGENES HLA DE CLASSE II SUR LES LYMPHO- CYTES B ET LES MONOCYTES CHEZ LES PATIENTS TRANSPLANTES.
V. INFLUENCE DES IMMUNOSUPPRESSEURS SUR LES FONCTIONS LYMPHOCYTOTOXIQUES.
V. 1 . ACTION SUR LA LYMPHOLYSE A MEDIATION CELLULAIRE (CML).
V.1.1. Etude in vitro avec la cyclosporine, la methylpredni-
solone et la 6 -mercaptopurine.
V.1.2. Etude in vivo : effets de 1'hydrocortisone chez des
volontaires sains.
V.2. MODIFICATIONS DES CYTOXICITES NK (NATURAL KILLER) ET K (ADCC).
V.2.1. Etudes in vitro avec la cyclosporine, la méthylprednisolone
et la 6 -mercaptopurine.
V.2.2. Etude in vivo : effets de 1’hydrocortisone chez des
volontaires sains.
4
V . 2.3 . Analyse de la cytotoxicité NK chez les transplantés.
VI .
VII .
RESUME.
CONCLUSIONS GENERALES.
INTRODUCTION
1 . 1 . INTRODUCTION ET BUTS DU TRAVAIL
La démonstration de mécanismes immunologiques dans le rejet des allogreffes cutanées fut apportée il y a quarante ans par Medawar (Medawar, 1944). Elle a été confirmée grâce aux
expériences classiques de transfert adoptif (Billingham, Brent et Medawar, 1954) et de thymectomie néonatale (Miller, 1962) qui ont permis de préciser le rôle prépondérant de l'immunité cellulaire et plus précisément de la sous-population lymphocytaire T ou thymodépendante. Les mécanismes du rejet des greffes d’organes vascularisés se sont révélés complexes. Outre les importantes réactions cellulaires déjà mentionnées, les rôles de l’immunité humorale (alloanticorps, complément), de l’inflammation (poly
nucléaires, macrophages, prostaglandines) et de la coagulation intravasculaire ont été documentés. Les phénomènes de tolérance immunologique étudiés dans le cadre des allogreffes (Billingham, Brent et Medawar, 1953) ont révélé leur extrême complexité. Les investigations qui visaient à transposer ces observations animales à la situation d’allogreffe humaine sont restées longtemps
fragmentaires. Les techniques explorant in situ les phénomènes d’activation et d’infiltration lymphocytaire précoce au cours de
l’agression immunologique ne se limitaient qu’aux données anatomo
pathologiques descriptives.
Les mécanismes qui assurent la survie prolongée des
allogreffes ont un caractère multifactoriel. Le rôle de facteurs génétique et plus particulièrement 1 ’histocompatibilité est
relativement bien défini en greffe expérimentale mais reste discuté en transplantation humaine. L’influence des transfusions sanguines favorisant la transplantation, établie en 1972 par Opelz et Terasaki est encore incomplètement comprise chez l'homme comme chez l’animal.
La contribution majeure de l’immunosuppression médicamenteuse au
succès des greffes humaines est la plus évidente. L’expérimentation
animale reste parfois d’un apport limité dans la compréhension des
mécanismes d’action des drogues Immunosuppressives car certaines
informations fournies par divers modèles animaux ne peuvent être
extrapolées à la greffe humaine, la sensibilité de beaucoup
d'animaux de laboratoire aux immunosuppresseurs étant souvent différente de celle de l'homme.
Durant deux décennies, la combinaison d'azathioprine et de corticostéroïdes a constitué ce qui a été appelé le traitement immunosuppresseur classique ou "standard". L'introduction récente de la cyclosporine en remplacement ou en combinaison avec
l'azathioprine a apporté des progrès notables. Son maniement reste cependant délicat principalement en raison de sa néphrotoxicité.
Néanmoins pour beaucoup d'équipes de transplantation, l'association cyclosporine et corticostéroïdes est devenue une nouvelle forme de traitement standard. De plus, l'introduction de la cyclosporine a révolutionné notre concept de l'immunosuppression médicamenteuse car ce médicament agit de façon très spécifique sur les mécanismes
cellulaires effecteurs Impliqués dans le rejet. La cyclosporine est aisément dosable dans le plasma par les radioimmunoessais et l’HPLC. Son avènement, qui a coïncidé avec l'explosion des
connaissances en immunologie, a permis d'établir les bases
théoriques d'une approche immunopharmacologique et d'une indivi
dualisation des thérapeutiques immunosuppressives assurant un effet thérapeutique optimal tout en réduisant les risques vitaux pour le patient. Pour parvenir à cet objectif, il nous a semblé nécessaire de définir les mécanismes d'action des médicaments immunosuppres
seurs chez 1 'homme.
L'objet du présent travail est de tenter de préciser certains mécanismes d'action de ces médicaments dans la situation très
particulière de la greffe rénale. Les résultats obtenus par deux méthodes d'approche complémentaires, l'expérimentation in vitro et des études in vivo portant soit sur des volontaires sains soit sur des patients transplantés à qui ces médicaments immunosuppresseurs étaient administrés ont été confrontées. Un certain nombre d’actions susceptibles de jouer un rôle à la fois dans l’induction et
l’entretien du phénomène de tolérance ou non-réponse immune spécifique vis-à-vis de l'allogreffe ont été déduites. L'expérimentation in
vitro d’un médicament est essentielle mais elle a fréquemment un côté artéfactuel. Celui-ci peut-être compensé et complété dans une
certaine mesure par des données obtenues in vivo. L'administration
7
d'un médicament à un volontaire sain est très informative. Les
informations qu’on en tire sont malheureusement limitées par le fait que le sujet normal ne se trouve pas dans le même état de stimulation antigénique que les patients transplantés. Cet état de stimulation pourrait être nécessaire pour que les médicaments immunosuppresseurs extériorisent certains de leurs effets. Bien que fréquemment
soumis à un double traitement immunosuppresseur susceptible de perturber les interprétations, l’étude du status immunitaire du patient transplanté peut préciser certaines modalités d’immuno
suppression non spécifique. Celles-ci peuvent participer à l’induction et à l’entretien d’un état de tolérance plus
spécifique caractérisant une greffe réussie ou encore favoriser l’éclosion de diverses infections virales et de certaines
néoplasies dont on connaît l’incidence élevée dans ce groupe de patients.
L’étude des médicaments immunosuppresseurs sur la réponse immune montre qu’ils agissent de façon prépondérante à un niveau situé très en aval de la phase afférente des réactions cellulaires et que la phase effectrice (cytotoxicité, production d’anticorps) est relativement peu modifiée. Cette constatation justifie
l’importance apportée dans ce travail à la phase précoce d'acti
vation lymphocytaire. Un autre concept plus intriguant et dont toutes les implications ne sont pas encore bien comprises est le rôle très complexe des drogues sur le trafic cellulaire. Il justifie la place accordée dans ce travail à la cinétique des
sous-populations et leur relation avec la production de lymphokines notamment sous l’effet des corticostéroïdes. Enfin le rôle très complexe dans la régulation immune des antigènes HLA de classe II a été envisagé.
Depuis longtemps, les cliniciens utilisent de façon très
empirique les drogues immunosuppressives. Ils craignent les effets dangereux d’une immunosuppression tisop agressive. Des tests
permettant l’ajustement correct de ces médicamenta>'tout en limitant
leur toxicité seraient donc utiles. Le présent travail tente de
définir certains mécanismes d’action des trois médicaments les plus
utilisés en greffe d'organes, l'azathioprine, la cyclosporine et les corticostéroïdes et d'évaluer les essais immunologiques les plus utiles pour en mesurer l'activité.
1.2. INTODUCTION SUR LES INTERACTIONS ENTRE LES IMMUNOSUPPRESSEURS ET LE SYSTEME IMMUNITAIRE DANS LE CADRE DES ALLOGREFFES.
Le fil conducteur suivi dans le présent travail est dans les grandes lignes le schéma actuel de la réponse immune. Bien établi en ce qui concerne la réactivité vis-à-vis d'antigènes comme les virus ou les antigènes solubles, celui qui régit le rejet des
allogreffes reste plus mystérieux et il est possible que certaines extrapolations doivent être considérées avec prudence. Par ailleurs certains aspects importants n'ont pas été abordés comme les
influences des immunosuppresseurs sur les lymphocytes B et la production d'anticorps et d'autres ont été, peut-être un peu arbitrairement hypertrophiés. Les modes d'action des immunosup
presseurs sont en effet d'une telle complexité qu'un choix, qui peut paraître parfois subjectif a été effectué dans certains mécanismes.
1.2.1. Induction de la réponse immune.
a. Relations entre processus de présentation antigénique, immunogénicité et antigènes d'histocompatibilité dans le contexte de l'alloréactivité (fig. 1 et 2 ).
L'activation des lymphocytes par des antigènes étrangers comme des virus ou certains peptides immunogéniques est un processus complexe nécessitant leur "présentation" aux lymphocytes T par une catégorie de cellules mononuclées appelées cellules présentatrices ou "antigen-presenting cells" (APC) (Unanue, 1984). Cette fonction de présentation antigénique entre dans le cadre général des
coopérations cellulaires et est effectuée principalement par des cellules de la lignée macrophagique incluant les macrophages, les
monocytes, les cellules dendritiques et vraisemblablement les cellules endothéliales des vaisseaux. La fonction de ces APC est de modifier 1 'antigène en une molécule immunogénique reconnaissable par les
9
lymphocytes T. Celle-ci comporte une série d’étapes comprenant la fixation de l'antigène à la cellule présentatrice et son transfert dans des structures intracytoplasmiques appelées phagosomes ou réceptosomes. Ce processus est vraisemblablement suivi de sa
dégradation dans le complexe lysosomial et son extériorisation à la surface de la cellule. Pour que l'antigène ainsi transformé soit présenté aux lymphocytes T, son association avec les antigènes d'histocompatibilité de classe II autologues ("self") présents sur l'APC est indispensable. Ce phénomène a été décrit sous le nom restriction lié au MHC (Zinkernagel et Doherty, 1974).
Dans le cadre particulier des allogreffes, les antigènes d'histocompatibilité sont non seulement des molécules de guidance associative mais encore puissamment immunogéniques. Les antigènes de classe II activent in vitro la réaction lymphocytaire mixte.
Celle-ci mime assez fidèlement in vitro la phase de reconnaissance de la réaction de rejet. Les cellules dendritiques et vraisembla
blement les cellules endothéliales du greffon dans certaines
conditions d’activation sont riches en antigènes d'histocompatibilité de classe II et combinent ces fonctions de structures immunogéniques à une activité de cellules présentatrices. Pour expliquer le paradoxe propre à la situation de l'alloréactivité où le système immun est
activé par la disparité antigénique MHC, contrastant avec le complexe antigène X + MHC autologue, diverses hypothèses ont été proposées.
La molécule HLA de classe II allogénique pourrait par exemple être assimilée à un complexe antigène - molécule HLA de classe II
autologue constituant une forme de "soi altéré" qui deviendrait immunogénique.
Les antigènes HLA, codés par des gènes situés sur le chromosome 6 (Complexe Complexe Majeur d'Histocompatibilité ou CMH ou MHC) sont classifiés en antigènes de classe I et de
class'e II. Les antigènes HLA de classe I (antigènes -A, -B et -C) , glycoprotéines exprimées sur la quasi totalité des cellules nuclées sont composées d'une chaîne lourde de PM 44 Kd (kilodalton)
polymorphique, en liaison non covalente avec la ™i^^°Slobuline
de PM 12 Kd. Celle-ci constitue la partie non polymorphique ou
constante de la molécule.
Ces antigènes de classe I interviennent comme élément de restriction dans les phénomènes cytolytiques provoqués par les lymphocytes T cytotoxiques T 8 +/CD 8 +. Les antigènes de classe II subdivisés en antigènes DR, DP (ou SB) et DQ (ou DC) sont des glycoprotéines
présentes uniquement sur les lymphocytes B, les monocytes, les macro
phages et les cellules dendritiques. Les cellules de Langerhans de la peau en seraient une forme spécialisée. Les antigènes de
classe II sont composés d'une chaîne lourde ex de PM 34 Kd et d'une chaîne légère |3 de PM 29 Kd. Ils se caractérisent par leur
inductibilité sous l'influence de stimuli variés, notamment
immunologiques. Par exemple, l'activation par des lectines ou des lymphokines peut les faire apparaître sur des structures cellu
laires desquelles ils sont normalement absents ou augmenter en nombre (Kaufman et al, 1984). Outre leur participation dans la reconnaissance immune, les molécules HLA de classe II interviennent comme éléments de restriction dans les phénomènes cytolytiques médiés par des lymphocytes T helper-effecteurs T4+/CD4+. Cette constatation découle d'études faites avec des clones cytotoxiques. La structure du récepteur du lymphocyte T qui sert de réceptacle à l'antigène, en conjonction avec les antigènes HLA de classe II a été récemment
élucidée notamment par l'utilisation d'anticorps monoclonaux et de clones de cellules T. Il a pu être démontré que le récepteur T était composé de plusieurs sous-unités comprenant elles-mêmes deux sous- unités Ti clonotypiques (Ti alpha et Ti bêta), présentes sur des clones individuels spécifiques d'antigènes précis associées à la chaîne de 25 Kd de la molécule T3 à partir de laquelle l'influx calcique responsable de l'activation lymphocytaire, après contact avec l'antigène, diffuse vers le cytoplasme (Meuer, Reinherz et Schlossman, 1983; Imboden et al, 1985).
b. Mécanismes d'activation lymphocytaire (fig. 3)
Le processus d'activation lymphocytaire qui se déclenche in vivo au cours du rejet d'allogreffe est très complexe. Les mécanismes étudiés in vitro au moyen de mitogènes ou par la réaction lymphocytaire mixte doivent être extrapolés avec
11
prudence. L'activation lymphocytaire peut-être conçue entre premier lieu comme un enchaînement de signaux où interviennent l’antigène, les récepteurs membranaires, les molécules de
restriction et les lymphokines. De multiples modèles ont été proposés et ont fait l'objet de nombreuses synthèses (Klein, 1982;
Ashman, 1984; Revillard, 1985; Isakow, 1986). Ceux-ci restent
discutés principalement à propos des seconds messagers biochimiques qui vont transmettre le message d'activation à la cellule.
Le premier signal sera l’antigène ou le mitogène, en conjonction avec la molécule HLA de classe II présente sur la cellule présentatrice. L’interleuki .ne 1 , médiateur soluble produit par celle-ci pourrait être le second signal qui va permettre l'activation et la différentiation du lymphocyte T.
Celle-ci est un polypeptide de 15 Kd, caractérisé par un
pléiotropisme considérable. Outre ses propriétés lymphocytotropes, elle cumule des activités biologiques extrêmement diverses
(Oppenheim et al, 1984) l'impliquant notamment dans la réaction inflammatoire, d’où son importance potentielle en greffe d'organe.
Sous l'influence de ces deux signaux, antigène et IL-1, des lymphocytes T précurseurs des lymphocytes T helper ou
auxiliaires prolifèrent, se différencient et produisent un autre polypeptide de PM 15 Kd, l'interleukine 2. D'autres lymphokines
comme 1 'interféron gamma ou interféron immun sont également élaborées.
Des récepteurs à l’insuline, à la transferrine ou antigène T9, à l’interleukine 2 ou antigène Tac pour T activé, aux globules rouges de mouton en conditions infraoptimales (rosettes actives) apparaissent en phase Gla-Glb. En phase S-Gl apparaissent l'antigène TIO présent normalement sur les thymocytes et l'antigène DR ou la like. Celui-ci est normalement absent ou présent seulement en très faible quantité sur les lymphocytes T au repos. L’interleukine 2 a d'abord été mise en évidence par ses propriétés de maintien en croissance continue de lymphocytes d'où son nom de TCGF ou T cell growth factor. Elle
contribue également à la différentiation et à l'activation des
précurseurs des lymphocytes T cytotoxiques et des lymphocytes NK en
effecteurs actifs (Smith, 1980). Sa production principalement assurée
par les lymphocytes T4+/CD4+ répond à des mécanismes régulateurs complexes^activateurs constitués par l'antigène et l'interleukine 1 et suppresseurs encore mal connus. La prostaglandine E2 formée par
les monocytes et les macrophages activerait des lymphocytes T suppresseurs qui élaboreraient un facteur suppresseur de la
production d'IL2 (Chouaib et al, 1984). Dans le SIDA et certaines affections autoimmunes, des facteurs bloquant ont été décrits.
Après l'interaction entre l'antigène qui peut être considéré comme un ligand avec son récepteur, une série de modifications physicochimiques affectant successivement la membrane, le cyto
plasme et le noyau est déclenchée. Tous les relais ne sont pas encore connus. Les concepts élaborés essentiellement à partir de l'utilisation de lectines comme la phytohémagglutinine et la
concanavaline A, glycoprotéines végétales se sont enrichis de
données plus spécifiques obtenues grâce à l'utilisation d'anticorps monoclonaux dirigés contre des antigènes définis de la membrane lymphocytaire comme l'anticorps 0KT3 et d’autres (Van Wauwe et al, 1981) et à deux types de substances dotées de propriétés mitogènes importantes comme les ionophores calciques et les esters du phorbol.
Le prototype des ionophores calciques, 1’ionophore A23187, anti
biotique extrait de streptomyces chartreusis, induit un influx calcique vers le cytoplas*©^ Parmi les esters du phorbol, par ailleurs promoteurs tumoraux potentialisant l'action des carcino
gènes sur les tumeurs cutanées, il faut retenir le PMA ou phorbol myristate acétate. L'importance de ces substances est liée en partie au fait qu'elles sont capables d'activer les lymphocytes sans passer directement par le récepteur T3-Ti d'activation lymphocytaire aux antigènes.
La cascade des réactions chimiques qui suivent 1'intéraction du mitogène ou de l’antigène avec son récepteur est très complexe.
Dans les secondes qui suivent leur contact, une série de réactions d'activation précoce sont observées. Le lymphocyte entre en cycle et passe de la phase repos GO à la phase G1. Des modifications des phospholipides membranaires s'opèrent dans les secondes qui suivent l'interaction entre le ligand et son récepteur. Un schéma
13
qui a été proposé (Klein, 1982) suggère que cette interaction active deux méthyltransférases agissant sur les phospholipides qui vont méthyler le phosphatidylethanolamine (PE) et la phosphatidyl N- monométhyl - ethanolaraine (PME) en phosphatidylcholine (PC). La translocation de cette dernière du versant cytoplasmique au versant externe de la membrane aboutirait à des variations de fluidité
membranaire, à l'influx calcique et potassique vers le cytoplasme et peut-être à l'activation de 1'adenylatecyclase qui convertit l'ATP en AMP cyclique. Ces trois dernières modifications ont été décrites dans les phases précoces d'activation lymphocytaires. Le rôle de la CAMP comme second messager de l'activation lymphocytaire de même que celui de la cGMP reste cependant controversé. D'autres seconds messagers ont été identifiés récemment. Les deux produits de
l'hydrolyse d'un phospholipide membranaire, le phosphatidyl inositol biphosphate (PI P2) par une phosphodiestérase, la phospholipase C qui libère de l'inositol triphosphate (IP3) et du diacylglycérol
(DG) sont décrits. Ce dernier a comme récepteur un enzyme important dans l'activation cellulaire, la protéine kinase C (Nishizuka, 1984).
Une observation décisive a été que les promoteurs tumoraux dérivés du phorbol comme le PMA ou phorbol rayristate acétate avaient également comme récepteur la PKC et qu'il était possible de mimer les effets d'activation du DG sur la PKC par ces agents. Par ailleurs, un des effets de l'autre médiateur, l'IP3 est une libération du Ca2+
intracellulaire avec augmentation du Ca2+ cytoplasmique, effet que les lonophores induisent également (Isakow, 1986).
Ces modifications dites précoces sont suivies d'une seconde vague de réactions plus tardives comprenant notamment les synthèses de protéines et de RNA, l'incorporation de glucose et la production de polyamines par décarboxylation de l'ornithine. Au plan du cycle cellulaire, la prolifération entraîne le passage de G1 en S-G2-M.
Vers la 36è heure commencent les modifications qui vont conduire à la mitose (M), précédée par la phase de synthèse du DNA (S)
mesurable par l'incorporation de thymidine tritiée. Celle-ci commence 24 heures après l'addition du mitogène à la culture
cellulaire et atteint un maximum à 72h pour décliner graduellement
sauf si les lymphocytes sont restimulés.
Le lymphocyte activé devient effecteur, produit des lympho
kines et acquiert la capacité de détruire certaines cellules cibles.
Le mécanisme qui conduit à ces modifications fonctionnelles n'est pas totalement élucidé. Un pas considérable a été franchi lorsqu'on a pu associer des phénotypes à ces fonctions. Le premier a consisté à distinguer entre lymphocytes helper et suppresseurs grâce à des anticorps hétérologues (Cantor et Boyse, 1975; Reinherz et
Schlossman, 1977) puis par des techniques tirant parti de l'affinité différentielle du récepteur Fc de ces lymphocytes pour les immuno
globulines G et M. La classification en lymphocytes TM ou Tp dotés d'une activité helper et en lymphocytes TG ou dotés d'une activité cytotoxique et suppressive (Moretta et al, 1977) est techniquement fastidieuse et imparfaite. Elle a été profondément modifiée par l'introduction d’anticorps raonoclonaux qui permettent de définir des stades de différentiation intrathymiques, des phénotypes lymphocytaires rattachés à des fonctions et des molécules immunologiquement actives (Reinherz et Schlossman, 1979). Le recouvrement important entre les populations TM et T4+/CD4+
contraste avec l’absence de relation existant entre les lymphocytes T 8 +/CD 8 + suppresseurs-cytotoxiques et les lymphocytes T gamma
(Fichier et Broder, 1979). Une autre caractéristique de cette sous-population T4+/CD4+, impliquée dans l'induction de la réponse immune et la coopération notamment dans la production d'immuno
globulines est qu'elle joue également un rôle effecteur dans les réactions d'hypersensibilité retardée (DTH). En outre, l’étude de lignées T4+ a montré qu'elles étaient cytotoxiques vis-à-vis de cibles porteuses d'antigènes CMH de classe II.
1.3. LA RIPOSTE EFFECTRICE
La nature des processus de destruction impliqué dans le rejet des allogreffes n'est pas entièrement élucidée. Les travaux
pionniers de Brent et Medawar portant sur des greffes cutanées
(Brent et Medawar, 1962) ont pu mettre en évidence des mécanismes de type réaction d'hypersensibilité retardée (DTH) où des lymphocytes de type "helper-effecteurs" seraient activés et induiraient la production de diverses lymphokines dont le prototype est le MIF ou
15
macrophage inhibition factor. Celui-ci mobilise les macrophages qui détruisent les tissus voisins. Ce mécanisme de destruction a pu être également démontré de façon plus analytique sur un modèle de greffe de peau chez les rats et souris ATXBM. Les lymphocytes T sont préalablement détruits par thymectomie et irradiation, étape suivie de la restauration des lymphocytes B par injection de moelle.
Le rôle prépondérant du lymphocyte helper au phénotype Lyl et
l'absence paradoxale de participation des lymphocytes cytotoxiques Ly2-3 étalent également observés (Loveland et Mc Kenzie, 1982).
Des études effectuées par le groupe de Strom et Tilney sur des greffes vascularisées chez le rat ont montré que la coopération entre
lymphocytes T helper, lymphocytes T cytotoxiques et l'interleukine 2 était indispensable pour provoquer une destruction d'allogreffe
(Heidecke et al, 1984).
Depuis 25 ans, l'attention des investigateurs s'est focalisée sur le rôle des lymphocytes T cytotoxiques. Leur rôle, démontré pour la première fois dans un modèle d'activation in vivo où un
effet cytolytique spécifique dirigé contre les cellules rénales d'un chien donneur a pu être montré lorsque les leucocytes du chien
receveur étaient testés en phase de rejet (Govaerts, 1960). Il a été confirmé par divers modèles analogues. Celui de Brüner -et Cerottini
(Brüner et al, 1969; Cerottini et Brüner, 1974) utilisait des lymphocytes de souris C57BL/6, préalablement Immunisées contre le mastocytome P815 de souris DBA/2, puis testés in vitro contre les cellules tumorales marquées au chrome 51. L'induction de la
sensibilisation par culture mixte lymphocytaire (MLC ou MLR) peut être suivie d'une phase de cytotoxicité. La population A répondeuse présensibilisée contre les lymphocytes B est incubée en un second temps comme effecteur cytolytique avec les lymphocytes B marqués au chrome 51 (^^Cr). Cette réaction appelée lymphocytolyse à médiation cellulaire ou CML (Hayry et Defendi, 1970) a comme caractéristique principale sa spécificité pour la cellule cible.
Au cours de la culture apparaissent des lymphocytes dont l'aspect
morphologique évoque celui des large granular lymphocytes (LGL)
ou grands lymphocytes granuleux qui constituent les principaux
effecteurs de la cytotoxicité NK (Timonen et al, 1981) et sont
capables de lyser de façon non spécifique des cellules Issues de lignées tumorales comme les lignées K562 ou Molt 4. Le nom de cytotoxicité NK activée (activated NK ou ANK) est donnée à cette cytotoxicité non spécifique induite parallèlement à la cytotoxicité spécifique CML.
Le processus de cytotoxicité peut être mixte, cellulaire et humoral. Un anticorps antiallogreffe ou antiinfectieux de nature Ig G ainsi formé se fixera par sa portion Fc au récepteur Fc
correspondant de la population lymphocytaire K pour killer. La plupart des investigations récentes l'apparente à la population NK Cette coopération entre anticorps et lymphocytes cytotoxiques est appelée ADCC ou antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity.
Son rôle biologique est documenté principalement dans certaines infections virales (Quinnan et al, 1984) et parasitaires. La cytotoxicité NK ou natural killer souvent appelée cytotoxicité
spontanée représente la capacité des lymphocytes de lyser certaines cibles sans nécessiter de coopération avec un anticorps ni de
présensibilisation in vitro ou in vivo. Sa découverte a élargi le concept de surveillance immune qui fut proposé par Burnett en 1959 impliquant la destruction de tumeurs cancéreuses par le système immun. Aux lymphocytes T cytotoxiques conçus comme un sytème de seconde ligne serait associé un système de défense de première ligne capable de s’activer sans sensibilisation préalable. Les cellules effectrices de la cytotoxicité NK et K ont des caracté
ristiques très voisines voire identiques. Divers critères ont été utilisés pour les définir comme la présence d'un récepteur Fc gamma et l'absence de marqueurs conventionnels des lymphocytes T et B.
Leur morphologie est très caractéristique, comportant un cytoplasme de grande taille contenant des granules azurophiles riches en enzymes lysosomiaux d'où le nom de large granular lymphocyte ou LGL qui leur a été donné (Timonen et al, 1981). La cytolyse cellulaire est
considérée comme un processus indépendant du complément. Les granules présents dans les LGL contiennent des facteurs solubles parmi lesquels on trouverait le NKCF (NK cytotoxic factor) et la perforine, capable d'induire la formation de pores membranaires.
L'hypothèse d'un phénomène secrétoire participant à l’effet
17
cytolytique a été émise (Henkart, 1985).
L'anticorps LDA ou lymphocyte-dependent antibody du phénomène ADCC joue un rôle de pont entre le récepteur Fc du lymphocyte K et sa cible. Parmi celles le plus couramment utilisées, on retiendra les globules rouges de poulet, certaines lignées tumorales et des lymphocytes préincubés avec des allô- ou des hétéroanticorps. Une condition essentielle du déclenchement du processus de cytotoxicité est le contact intime entre la cible et les effecteurs. Une phase de liaison (binding phase), précédant la phase de lyse (lytic phase) avec formation de canaux transmembranaires et lyse osmotique de la cellule est induite.‘ La destruction se traduit par un efflux de substances macromoléculaires, mesurable notamment par la libération de 51cr. Cette étape, très rapide, a été qualifiée'de "coup fatal"
ou léthal hit. Dans les conditions d'études standard de la cytolyse cellulaire faites en microtubes ou en plaques de cultures, le
contact intime entre les effecteurs et les cibles est facilité par une centrifugation préalable. On a pu montrer qu'une cellule
effectrice pouvait lyser séquentiellement plusieurs cibles. Ce phénomène a reçu le nom de recyclage (Ullberg et Jondal, 1981).
En réduisant le nombre d'effecteurs et surtout en les immobilisant dans un milieu solide comme l'agarose, il est possible d'inhiber
le recyclage (Grimm et Bonavida, 1979). Les deux phases de liaison et de lyse peuvent être distinguées visuellement en mesurant la proportion des lymphocytes attachés à la cible et de ceux qui effectuent une réaction lytique. Le pourcentage des lymphocytes effectivement engagés dans le processus lytique peut être mesuré.
1.4. MECANISMES D'ACTION DES IMMUNOSUPPRESSEURS AU NIVEAU CELLULAIRE.
1.4.1. L'azathioprine.
L'azathioprine est un dérivé nitroimidazole d'un antagoniste des purines, la 6 -raercaptopurine qui appartient à la classe des
thiopurlnes, analogues de l'hypoxanthine. Il s'agit d'antlmétabolites
spécifiques de phase comme le méthotrexate et la cytosine arabinoside
qui agissent pendant la phase S du cycle cellulaire correspondant à la phase de synthèse du DNA. Ils exercent donc potentiellement un effet maximal sur les lymphocytes en réplication rapide après contact avec
l’antigène. L’azathioprine est rapidement transformée au niveau intestinal en 6 -mercaptopurine. Cette dernière est métabolisée en acide 6 -thioinosinique sous l’influence d’une enzyme, 1 ’hypoxantine- guanine-phosphoribosyl-transferase (HGPRT). La synthèse d’acide inosinique, précurseur des acides adénylique et guanylique, est inhibée par compétition enzymatique, bloquant la synthèse d’ADN, d’ARN et de protéines des lymphocytes (Bach et Strom, 1985;
Winkelstein, 1979). L’azathioprine et la 6 -mercaptopurine peuvent bloquer in vitro de nombreuses réactions immunologiques. Le noyau imidazole a également un léger éffet immunosuppresseur. L’extrapo
lation des mécanismes observés in vitro aux effets biologiques
potentiels in vivo, doit tenir compte des taux plasmatiques atteints en thérapeutique usuelle, qui ne seraient que de l’ordre de 10 à
100 ng/ml (Haddocks, 1979; Lin et al, 1980). Ces concentrations inhibent efficacement les lymphocytes B dans un système de PFC
(plaque forming cells) (Dimitriu et al, 1978) alors que des
concentrations de l’ordre de 1 à 10 ug/ml d’azathioprine seraient nécessaires pour bloquer les cellules T suppressives induites par
la ConA ou le pokeweed mitogen. L’azathioprine et la 6 -mercaptopurine affectent les précurseurs médullaires des cellules hématopoïétiques, modifiant à la fois la proportion et le nombre de leucocytes
circulants. Chez les patients traités à l’azathioprine, la proportion des lymphocytes T et B est relativement respectée. La sous-population qui paraît la plus susceptible à l’effet de déplétion est la
population des grands lymphocytes granuleux responsables des
cytotoxicités NK et K. Un des effets les plus reproductibles chez l’animal est l’inhibition de la production d’anticorps thymodépendants comme les anticorps anti-globules rouges de mouton, puissamment
déprimés par l’administration IM ou IV de 6 -mercaptopurine et d’azathioprine chez la souris. L’effet paraît plus marqué sur la réponse primaire (Spreafico et al, 1973). In vitro, la culture mixte humaine et la formation de rosettes par les splénocytes de souris sont fortement inhibés. Ces tests ont été utilisés pour mesurer l’effet Immunosuppresseur du plasma de patients traités par
19
azathioprine (Bach et al, 1969). L'interprétation du phénomène d'inhibition des rosettes murines est restée conjecturale. Une des hypothèses émise au moment de sa découverte était que
l’azathioprine inhibait le récepteur lymphocytaire T à l'antigène.
L'inhibition par l'azathioprine de la production d'effecteurs cytotoxiques (Te) après culture mixte a pu être également montrée chez la souris (Rollinghof et al, 1973) et chez le babouin (Brown et al, 1976).
1.4.2. Les corticostéroides
Les corticostéroides traversent la membrane cellulaire et se fixent à des récepteurs cytoplasmiques. Ils y forment un com
plexe qui pénètre le noyau pour moduler diverses activités
enzymatiques (Baxter et Harris, 1975). Certains gènes sont activés comme ceux qui régissent l'activité de l'hormone de croissance, de la métalothionéine, du virus de la tumeur mammaire de la souris et vraisemblablement d'une importante famille de polypeptides appelée lipomoduline ou macrocortine (Hirata et al, 1980; Blackwell et al, 1980) et portant maintenant le nom générique de lipocortines.
D'autres sont déprimés comme ceux dont dépendent la proopiomélano- cortine et 1’alphafoetoprotéine. On a montré que les RNA messagers de l’interleukine 2 et de l'interféron étaient inhibés par la dexaméthasone (Arya et al, 1984). Un Inhibiteur des récepteurs intracytoplasmiques comme la cortéloxone inhibe la production d'un médiateur soluble, le MMF ou Macrophage Mitogenic Factor (Duncan et al, 1982). La démonstration de l'effet des corticostéroides sur la production d'IL-2 est étayée par une série d'observations très
nombreuses. Une corrélation entre la production de l’interleukine 2 et la densité de récepteurs cytoplasmiques en phase proliférative plus précisément la phase S de l'activité lymphocytaire a d'abord été montrée (Smith et al, 1977; Gillis et al, 1979). L'effet anti
prolifératif des corticostéroides démontré depuis longtemps (Nowell, 1961) a été étudié sur d'autres manifestations de prolifération lymphocytaire comme la captation du glucose, l'incorporation de précurseurs de DNA, de RNA ou de protéines (Gillis et al, 1979).
Ces effets ont été amplement confirmés*
De multiples facteurs influencent la corticosensibilité des cellules lymphoïdes. Le niveau de maturation ou d'activation et surtout l'espèce étudiée sont déterminants. Les prothymocytes
seraient plus sensibles à la lyse que les thymocytes mûrs (Galili et al, 1980). Les lymphocytes en phase de prolifération paraissent plus vulnérables aux effets inhibiteurs des corticostéroides que ceux effectuant une activité cytolytique ou synthétisant des immunoglobulines. L'espèce à laquelle appartient le donneur de lymphocytes conditionne en grande partie leur sensibilité à la lyse.
Claman a proposé une classification en espèces corticosensibles comprenant les rongeurs à l'exception du cobaye et espèces
corticorésistantes à laquelle appartient l'homme (Claman, 1972).
Les mécanismes cellulaires de la lyse comportent des modifications rapides de la chromatine appelées apoptose induite par l'activation d'une endonucléase (Cohen et al, 1984).
Lors de l'administration in vivo de corticostéroides, une des manifestations les plus nettes est la modification très rapide de la distribution des diverses populations leucocytaires (Fauci, 1978).
L'extrapolation des données fragmentaires dont on dispose à propos du trafic physiologique des leucocytes suggère que les variations circadiennes du cortisol plasmatique pourraient être responsables à l'état normal de certaines modifications. Des observations récentes suggèrent que des lymphokines pourraient jouer un rôle dans ces
modifications de trafic. L'interleukine 2 testée par chemoattractlon modifierait électivement la mobilité des lymphocytes T4+ (Kornfeld et al, 1985). L'interféron gamma et l'interleukine 1 augmentent
l'adhérence des lymphocytes T aux parois endothéliales (Yu et al, 1985;
Cavender et al, 1986). D'autres mécanismes pourraient être envisagés comme des effets sur les récepteurs lymphocytaires susceptibles
d'établir des contacts avec 1 'endothélium vasculaire et plus particulièrement avec des structures appelées veinules à haut endothélium (HEV) jouant un rôle important dans les migrations
lymphocytaires. Elles pourraient être modifiées par les cortico
stéroides tant endogènes qu'exogènes. L'administration de
corticostéroides induit un passage rapide des neutrophiles de la moelle vers le sang circulant ainsi qu'une redistribution des
21
lymphocytes, des monocytes et des éosinophiles vers les espaces extravasculaires comme la moelle osseuse, la rate et les ganglions
(Fauci et Dale, 1975; Cox et Ford, 1982). Ces modifications,
réversibles après 24 heures, culminent entre la 4ème et la 6 ème heure.
Elles s'extériorisent notamment par une lymphopénie qui affecte principalement les lymphocytes T (Yu et al, 1974) et plus particu
lièrement les lymphocytes au phénotype helper-inducer (auxiliaire)
porteurs d'un récepteur Fc p (Haynes et Fauci, 1978). Les lymphocytes E et les grands lymphocytes granuleux (LGL) ne paraissent guère affectés
(Cupps et al, 1984). Une hypothèse qui a été émise est un échappement de ces cellules à la recirculation, comme le suggère l'absence de
réactivité K-NK et de lymphocytes porteurs de récepteur Fc gamma dans le canal thoracique, zone de passage importante des lymphocytes
recirculants (Revillard et al, 1978; Forbes et al, 1981; Zôller et al, 1982; Fox et al, 1984).
La plupart des étapes de l'activation lymphocytaire sont affectées par les corticostéroïdes. La fonction de coopération entre monocytes et lymphocytes T, testée au moyen d'antigènes
solubles (Hirschberg et al, 1982; Gerrard et al, 1984) est bloquée.
Beaucoup d’auteurs suggèrent que l’action principale des
corticostéroïdes est l'inhibition de la production d'interleukine 1 . Le blocage de la production d'interleukine 2 constituerait un phénomène secondaire à l'inhibition de sa production. Les macrophages murins
(Snyder et Unanue, 1982) et les monocytes humains (Lomnizer et al, 1983) dont les surnageants sont recueillis après stimulation avec le lipopolysaccharide (LP£> présentent une inhibition de leur capacité d'induire la prolifération de thymocytes murins par 1 'hydrocortisone.
L'analyse critique des expériences étudiant l’influence des corticosté
roïdes sur la production d’interleukine 2 montre la complexité du du processus. Selon le système expérimental utilisé, la production d'interleukine 2 est influencée de façon variable. En culture mixte autologue, les lymphocytes T4 perdraient leur capacité d'être stimulés par l'interleukine 1 (Palacios et Sugawara, 1982). Des lignées
cellulaires capables de produire de l'interleukine 2 sans nécessiter de macrophages ni d'interleukine 1 sont inhibées par 1 'hydrocorti
sone (Morr et al, 1984). La production d’une protéine cytoplasmique
assurant le relais entre l'interleukine 2 et la synthèse du DNA, appelée ADR pour activator of DNA réplication serait bloquée par la dexaméthasone (Gutowski et al, 1984).
L'interaction in vitro entre divers corticostéroïdes et les granulocytes fait apparaître une famille de polypeptides appelés
lipomodulines ou macrocortines puis lipocortines (Hirata et al, 1980;
Maxwell et al, 1980) et pourvus d'un puissant effet inhibiteur de la phospholipase A2, responsable de la transformation de phospholipides membranaires en acide arachidonique. Cette inhibition leur confère peut-être une place dans les actions anti-inflammatoire des
corticostéroïdes. Ces polypeptides représentent des substances
intermédiaires agissant à la manière de seconds messagers. Ils peuvent modifier des fonctions immunes et inflammatoires par un mécanisme de transcription positive.
1.4.3. La cyclosporine A
La cyclosporine A est un undécapeptide cyclique à caractère hydrophobe extrait de la levure Trichoderma polysporum. Lors de l'administration in vivo à la souris, un effet immunosuppresseur beaucoup plus marqué que celui de la 6 -mercaptopurine sur la production d'anticorps anti-globules rouges de mouton a été observé par Borel en 1976 (Borel et al, 1976). Cet effet
immunosuppresseur puissant, accompagné d'un tropisme quasi exclusif pour les lymphocytes T, a pu être confirmé dans de nombreux modèles expérimentaux tels que l'inhibition in vitro de la capacité de
prolifération induite par les mitogènes (PHA, ConA) ou par la MLR et la prolongation in vivo de la survie de greffes de peau. Son efficacité a pu être démontrée également dans un très grand nombre de modèles animaux de maladies autoimmunes comme la polyarthrite induite par l'adjuvant de Freund ou 1'encéphalomyélite expérimentale allergique. Une différence fondamentale entre la cyclosporine et des substances comme la 6 -mercaptopurine et l'azathioprine réside dans son absence de toxicité médullaire et d'effet sur le nombre
ou les capacités prolifératives des cellules souches hématopoïétiques.
La découverte de ces propriétés a coïncidé avec 1'introduction du
23
concept de la cascade des lymphokines dans les mécanismes
d'activation lymphocytaire. Une première étude portant sur la
stimulation des splénocytes murins avait suggéré que la cyclosporine pouvait bloquer à la fois l'induction de récepteurs à l'interleukine 2
(Larsson, 1980) et la production d'interleukine 2 (Bunjes et al, 1981) Se basant sur le modèle de la culture mixte autologue, Palacios a émis l'hypothèse que la cyclosporine agissait au niveau de l'interaction entre les antigènes la et la partie du récepteur des lymphocytes T reconnaissant la molécule MHC de classe II (Palacios et Mbller, 1981).
Ultérieurement le mécanisme d'inhibition de la production de
l'interleukine 2 a été confirmé, principalement par des expériences démontrant la capacité de préparations d’interleukine 2 purifiée de restaurer l'activité proliférative préalablement inhibée par la cyclosporine (Dos Reis et Shevach,1982), observation que certains auteurs n'ont cependant pas pu reproduire (Van Oers et al, 1985).
Une autre lymphokine essentielle dans la réponse immune, l'interféron gamma, est également inhibée par la cyclosporine (Reem et al, 1983;
Kalman et al, 1983). Celle-ci bloquerait le RNA messager de
l'interleukine 2 et celui de l'interféron gamma. Cette démonstration a pu être faite par la technique de Northern blotting sur la lignée leucémique Jurkatt qui produit de 1'IL2 de façon autonome (Krbnke et al, 1984) et confirmée par le test de transfert aux oocytes de
grenouille (Granelli-Piperno et al, 1984). La production des deux lymphokines, l’interleukine 2 et l'interféron gamma essentielles dans la réponse immune paraît donc bien constituer une des cibles
privilégiées de l'action de la cyclosporine.
La nature des récepteurs membranaires ou cytoplasmiques impliqués dans l'action intracellulaire de la cyclosporine reste mystérieuse. Le concept d'un récepteur membranaire spécifique, développé par Ryffel (Ryffel et al, 1980) sur base d'études de
fixation de cyclosporine tritiée sur les lymphocytes murins et humains a été fort contesté. Compte tenu du tropisme remarquable du médicament pour les lymphocytes T, l'absence de différence observée de densité de ces récepteurs tant sur les lymphocytes T
et B que sur les monocytes et les polynucléaires a été une constation
relativement inattendue. Elle a conduit Legrue et Kahan (Legrue et al
1982) à écarter l'hypothèse de récepteurs membranaires spécifiques et à suggérer que le médicament, de nature hydrophobe, s’intégrerait dans la membrane cellulaire où, à la façon d’anesthésiques locaux, il
modifierait la fluidité de la couche bilipidique membranaire.
En utilisant une lignée produite à partir du thymome BW51A7, d’autres investigateurs (Handschumaker et al, 1985) ont montré que la cyclosporine se fixait préférentiellement sur une fraction
cytosolique de poids moléculaire 15 Kd appelée cyclophiline. Borel a proposé l’hypothèse d’un récepteur intracytoplasmique qui pourrait être la cyclophiline, anologue à celui des cortlcostéroides. Il s’intégrerait dans le génome sous forme d’un complexe avec la cyclos
porine et modifierait la transcription de lymphokines comme l’inter
leukine 2 et l’interféron gamma. Un autre groupe (Colombani et al, 1985) a montré que la cyclosporine se fixait puissamment à la
molécule de calmoduline, récepteur intracellulaire du calcium considéré comme un des pivots de l’activation cellulaire. Les phosphodiestérases dépendant de la calmoduline seraient fortement inhibées par la
cyclosporine et l’activité proliférative bloquée par celle-ci serait enfin restaurée par l’adjonction de calmoduline exogène. Ces
observations qui s’accordent avec l’hypothèse de l’interférence de la cyclosporine sur le métabolisme calcique de la cellule, restent néanmoins contestées. La mitogénèse induite par 1’ionophore calcique A23187 est puissamment inhibée par la cyclosporine (Kay et al, 1983).
La visualisation de l’influx calcique par des marqueurs fluorescents a écarté l’hypothèse d’un effet de la cyclosporine sur l’influx
calcique transmembranaire (Metcalfe, 1984). Un nombre croissant d’observations suggèrent que les récepteurs lymphocytaires à la prolactine, dont on a pu montrer la participation dans l’activation de l’ornithine décarboxylase, consitueraient également des récepteurs pour la cyclosporine (Russel et al, 1985).
25
1.5. ROLE POSSIBLE DE L’IMMUNOSUPPRESSION MEDICAMENTEUSE DANS L’INDUCTION D’UNE TOLERANCE DE TRANSPLANTATION
L’un des objectifs majeurs en transplantation d’organe est d’induire l’acceptation de très longue durée d’un greffon allogé
nique par l’hôte grâce à une série de manipulations du système immunologique. Le phénomène de tolérance est défini comme un état de non-réponse immune à un antigène après une première stimulation par ce dernier. Les expériences de Billingham, où une tolérance de greffe cutanée de souris histoincompatible était obtenue par administration de moelle osseuse à la période néonatale ont montré l’importance d’un système immunologique immature. L’interprétation de ce phénomène était qu’à un stade critique de l’ontogénie
lymphocytaire, le contact avec l’antigène conduisait non pas à un état de sensibilisation mais à une délétion clonale par élimination du clone de cellules T cytotoxiques spécifiques. Schwartz et Daraesheck en 1959 ont proposé un modèle de tolérance sur des animaux adultes
en utilisant un antimétabolite, la 6 -mercaptopurine. Ultérieurement, d’innombrables investigations, utilisant les irradiations, la
thymectomie, le drainage du canal thoracique, l’administration d’agents cytotoxiques ou de sérum antilymphocytes, ont confirmé qu’il était possible de créer un état parfois durable de tolérance vis-à-vis d’antigènes de transplantation grâce à des manipulations
physiques ou chimiques du système immun.
Deux mécanismes sont habituellement invoqués, la délétion clonale et l’induction de cellules ou de facteurs suppresseurs qui pourraient constituer dans certains cas l’exagération d’un mécanisme de régulation physiologique. Les mécanismes de suppression agiraient préférentiellement sur l’arc afférant de la réponse immune. La
réaction lymphocytaire mixte qui représente un excellent modèle de
reconnaissance antigénique est souvent utilisée pour les tester in
vitro. Un effet suppresseur sur des mécanismes effecteurs comme la
CML ou la NK et sur la production d’anticorps par les lymphocytes B
est également objectivable. Les cellules suppressives sont des
lymphocytes au phénotype T 8 ou T gamma, ces derniers comportant la
majeure partie des grands lymphocytes granuleux (LGL). Les monocytes
et les macrophages ont également une activité suppressive in vitro, vraisemblablement par la production de PG E2 mais leur rôle
biologique reste incertain.
Récemment, Malkowski et Medawar (Malkowski et Medawar, 1985) ont émis une hypothèse conciliant les concepts d'immaturité du système immunologique observée pendant la phase néonatale et ceux résultant de manipulations du système immun. L'induction du phénomène de tolérance se produirait lorsque la reconnaissance antigénique se passe en phase de déficit d'interleukine 2. L'hypothèse est basée sur des expériences montrant la capacité de préparation
d'interleukine 2 purifiée de rompre l'effet tolérogénique d'un
antigène. L'incubation in vitro avec de l'interleukine 2 recombinante de lymphocytes autologues induit chez la souris le rejet de greffes de peau bien tolérées depuis longtemps (Loveland et al, 1986).
L'exposition antigénique se produisant en l'absence d'interleukine 2 serait donc paralysante (paralysie ou anergie antigénique) ou "fatale"
(délétion clonale) pour les réactions cellulaires ultérieures vis-à-vis de cet antigène. La modulation d'un signal suppresseur peut être
envisagée également. L'addition d'un anticorps monoclonal anti
interféron gamma à une réaction lymphocytaire mixte inhibe
1'induction de lymphocytes T cytotoxiques, grâce à la production de lymphocytes T suppresseurs (Londolfo et al, 1985). Cet effet peut être reproduit in vivo chez la souris CBA-J par l'injection
quotidienne d'anticorps anti-interféron gamma qui bloque le rejet de tumeurs allogéniques. La réaction allogénique peut être modulée au niveau des récepteurs idiotypique par des anticorps dirigés contre la portion de reconnaissance à l'antigène des immunoglobulines (Binz et Wigzell, 1978) ou du lymphocyte T (récepteur lymphocytaire T à l'antigène) par des lymphocytes reconnaissant cette partie du lymphocyte (Lancaster et Batchelor, 1985). Enfin, en utilisant des clones lymphocytaires, des investigateurs ont montré qu'un processus de tolérance spécifique pouvait s'accompagner de perte d'expression du récepteur à l'antigène (Zanders et al, 1983).
Ces divers mécanismes pourraient être invoqués dans la tolérance induite par les drogues immunosuppressives.
27
1 . 6 . IMPLICATIONS DES MOUVEMENTS ("TRAFIC") DES CELLULES
lymphoïdes et des
