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Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository
Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:
Flamion, B. (1992). Apport de la vidéo-microscopie et de la microscopie à fluorescence à l'exploration des mouvements d'eau dans le tube collecteur rénal (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté de Médecine – Médecine, Bruxelles.
Disponible à / Available at permalink : https://dipot.ulb.ac.be/dspace/bitstream/2013/212972/1/6aabc9d1-3b5e-475e-a50e-5fbacec0bb85.txt
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2C
UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES Faculté de Médecine et de Pharmacie
APPORT DE LA VIDEO-MICROSCOPIE ET DE LA MICROSCOPIE A FLUORESCENCE A L’EXPLORATION DES MOUVEMENTS D'EAU
DANS LE TUBULE COLLECTEUR RENAL
BRUNO FLAMION
1992
Faculté de Médecine et de Phar'mac i e
Laboratoire de Physiologie et de Physiopathologie Département de Recherche Métabolique
APPORT DE LA VIDEO-MICROSCOPIE ET DE LA MICROSCOPIE A FLUORESCENCE A L'EXPLORATION DES MOUVEMENTS D'EAU
DANS LE TUBULE COLLECTEUR RENAL
BRUNO FLAMION
1 lil présenté pour l'obtention du grade d'agrégé de l'Enseignement Supérieur
1992
Allison et Kim
Ce travail restera associé à une période extraordinaire de ma vie, à un tournant décisif que je dois avant tout au Dr. Ken Spring, Chef de la Section des Transports Epithéliaux dans le Laboratory of Kidney & Electrolyte Metabolism, aux National Institutes of Health (Bethesda, MD, USA). Il m'a plongé dans le monde de la vidéo-microscopie et a su révéler au clinicien que j'étais une optique différente, systématique, dans l'appréhension des multiples problèmes qui ont surgi au cours de cette étude. Grâce à lui, aucun ne s'est avéré insoluble, et je le soupçonne de les avoir attendus avec délectation. Je le remercie pour son enthousiasme, et en même temps pour son insistance à respecter les limites de temps fixées. Pour les heures passées avec lui à l'atelier de tournage, pour son humour et ses contacts humains. Grâce à Ken Spring, ce travail me rappellera aussi, d'une certaine façon, un peu de la baie de Chesapeake.
Mais cette entreprise n'aurait jamais vu le jour sans le Professeur Abramow. Dès mon arrivée dans son service, il m'a appris à canaliser par la rigueur les engouements précoces, les hypothèses vite avancées, et il a suscité en moi un intérêt permanent pour la physiologie rénale. C'est lui aussi qui m'a aidé à globaliser ce travail, qui l'a animé par des discussions constantes, et qui m'offre dans son laboratoire des conditions uniques pour approfondir plusieurs des questions que soulève le présent travail. Pour tout cela, et pour son soutien dans les différentes étapes de ma carrière scientifique, je le remercie le plus vivement possible.
J'y associe le Professeur Elie Cogan, qui a eu la perspicacité de me pousser dans ce chemin difficile et le don de m'inculquer les premières notions de la microperfusion in vitro.
Je tiens à remercier également le Dr. M. Burg, qui m'a accueilli dans son laboratoire aux N.I.H.; le Dr. Mark Knepper, qui n'a pas manqué de suggestions et d'encouragements lorsque la manipulation des tubules se faisait rebelle (et c'est un euphémisme); "Joe" Chou, pour ses conseils pratiques; Tim Furlong, pour sa présence enrichissante; Pete Bungaye, pour son aide irremplaçable dans la résolution des équations de flux; et enfin Carter Gibson, dont l'approche "down- to-earth" a fait merveille dans mon initiation à la prograiranation, à certains
Je n'oublie pas Mme Suzanne Foulon, depuis longtemps aguerrie à la technique de microperfusion, dont la participation laisse présager une collaboration efficace.
Lors de la rédaction de ce travail, j'ai été soutenu par des bourses de recherche du Fonds Solvay et de la Fondation Van Buren, dont je remercie les responsables pour leur confiance.
INTRODUCTION ...
CHAPITRE 1...
1.1. PRESENTATION DES OBJECTIFS ...
1.2. PERMEABILITE HYDRIQUE (Pq^J DU TUBULE COLLECTEUR ...
1.2.1. Fonction hydroosmotique ...
1.2.2. P„„ du canal collecteur médullaire interne (IMCD) . . 1.2.3. P„, membranaire ...
1.3. CHOIX DES METHODES OPTIQUES ...
1.3.1. Introduction ...
1.3.2. Contraste interférentiel différentiel (CID) ....
1.3.2.1. Pourquoi le CID ? ...
1.3.2.2. Théorie du CID ...
1.3.2.3. Restrictions du CID ...
1.3.3. Vidéo-microscopie ...
1.3.4. Microscopie à fluorescence ...
1.3.5. Méthodes optiques pour l'étude du transport d'eau à travers les épithéliums ...
1.3.6. Méthodes optiques appliquées à la microperfusion in vitro ...
TABLE DES MATIERES
PREMIERE PARTIE: METHODOLOGIE ...
CHAPITRE 2. DESCRIPTION DES METHODES DE BASE ...
2.1. MICROPERFUSION DE TUBULES IN VITRO ...
2.1.1. Introduction ...
2.1.2. Choix et manipulation des animaux ...
2.1.3. Dissection des tubules ...
2.1.4. Perfusion des tubules ...
2.1.5. Chambre à flux laminaire ...
2.1.6. Contrôle de la température et du pH ...
2.1.7. Composition des solutions ...
2.1.8. Agents pharmacologiques ...
2.2. MONTAGE OPTIQUE ET ELECTRONIQUE ...
2.2.1. Système optique ...
2.2.2. Vidéo-microscopie ...
2.2.3. Photométrie ...
2.2.4. Contrôle informatisé ...
2.3. MESURE DU P„. MEMBRANAIRE ...
2.3.1. Introduction ...
2.3.2. Mesure du volume cellulaire et des surfaces
membranaires ...
2.3.3. Détermination du rapport volume / surface
membranaire ...
2.3.4. Flux hydrique transmembranaire ...
2.3.5. Calcul du P„, membranaire ...
2.4. MESURE DU TRANSEPITHELIAL PAR MICROSCOPIE A FLUORESCENCE 2.4.1. Introduction ...
2.4.2. Choix de la surface membranaire pour l'expression du
Po...
2.4.3. Choix du fluorochrome ...
1 2 2 5 5 7 8 9 9 10 10 12 13 14 15 16 18 20 21 21 21 21 23 25 26 27 27 28 29 29 31 33 33 34 34 35 36 37 37 38 38 40 40
2.4.4. Fluctuations du volume luminal ... 41
2.4.5. Mesure du débit de perfusion ... 43
CHAPITRE 3. MISE AU POINT EXPERIMENTALE DE NOUVELLES TECHNIQUES ... 44
3.1. SYSTEME D'ECHANGE RAPIDE DES PERFUSATS ... 44
3.1.1. Description des méthodes utilisées jusqu'ici .... 44
3.1.2. Montage des pipettes ... 45
3.1.3. Evaluation hydrodynamique du montage ... 46
3.1.4. Mesure de la vitesse d'échange des perfusats .... 47
3.2. MESURE SIMULTANEE DU P,„ MEMBRANAIRE ET DU P„. TRANSEPITHELIAL ... 47
3.2.1. Introduction ... 47
3.2.2. CID et épifluorescence combinés ... 48
3.2.3. Conduite des expériences ... 49
3.2.4. Comparaison du P„, basolatéral et du P,„ transépithélial ... 50
3.3. MESURE DU DEBIT DE PERFUSION PAR PHOTOLYSE... 52
3.3.1. Récupération de fluorescence après photolyse (FRAP) 52 3.3.2. Application du FRAP au tubule perfusé ... 54
3.3.2.1. Montage opto-électronique ... 54
3.3.2.2. Choix du fluorochrome ... 54
3.3.2.3. Géométrie optique du tubule perfusé .... 55
3.3.2.4. Expérience type ... 55
3.3.3. Contrôle informatique ... 56
3.3.4. Analyse théorique des résultats ... 56
3.3.4.1. Base de l'analyse... 56
3.3.4.2. Profil du flux... 58
3.3.4.3. Analyse théorique de la récupération de fluorescence ... 58
3.3.4.4. Contribution du phénomène de diffusion et influence du profil des vitesses sur l'analyse des résultats... 60
3.3.4.5. Caractérisation de la photolyse ... 61
3.3.4.6. Variations de l'intensité de l'irradiation . 62 3.3.5. Résultats expérimentaux ... 63
3.3.5.1. Analyse des résultats ... 63
3.3.5.2. Expériences de calibration ... 63
3.3.5.3. Comparaison des mesures de débit dans l'IMCD 64 3.3.6. Influence d'une réabsorption d'eau ... 65
3.3.7. Risque de phototoxicité ... 66
3.3.8. Conclusions ... 66
DEUXIEME PARTIE: RESULTATS ... 69
CHAPITRE 4. OBSERVATIONS MORPHOLOGIQUES ... 70
4.1. ASPECT DES CELLULES... 70
4.1.1. Corrélation avec la position au sein de la médullaire interne... 70
4.1.2. Réponse à l'ADH ... 72
4.2. REACTIONS OSMOTIQUES ... 76
4.2.1. Comportement osmométrique ... 76
4.2.2. Régulation de volume en solution hypotonique .... 77
4.2.3. Régulation de volume en solution hypertonique ... 78
CHAPITRE 5. MESURE DES PERMEABILITES HYDRIQUES MEMBRANAIRES ... 81
5.1. Pos, DE LA MEMBRANE BASOLATERALE ... .... 81
5.1.1. Résolution de la méthode ... 81
5.1.1.1. Vitesse d'échange des bains... 81
5.1.1.2. Résolution temporelle de l'enregistrement . 82 5.1.1.3. Fiabilité de la méthode optique en coupe sagittale... 82
5.1.2. Expérience type ... 83
5.1.3. Calcul des P„... 83
5.1.4. Relation entre J, et AII... 84
5.1.5. Effet de l'ADH et d'un bain hypertonique... 86
5.1.6. P„. basolatéral dans l'IMCDj... 87
5.2. Pos, DE LA MEMBRANE APICALE... 87
5.2.1. Résolution de la méthode ... 88
5.2.2. Expérience type... 89
5.2.3. Calcul des P„, et effet de l'ADH... 89
5.3. DISCUSSION... 90
5.3.1. Fiabilité de la méthode de mesure des P„„ membranaires ... 90
5.3.2. Comparaison des P„, membranaires des cellules d'IMCD avec ceux de diverses membranes... 90
5.3.2.1. Expression de P„, en fonction du choix de la surface membranaire ... 90
5.3.2.2. Interprétation des P^^ exprimés par unité de surface membranaire réelle ... 94
5.3.3. Quel est le P„, de la cellule d'IMCD tout entière ? 96 5.3.3.1. P„„ transcellulaire (P^*^) par unité de surface apicale "lisse" ... 96
5.3.3.2. P„, transcellulaire (P^') par unité de surface apicale "réelle" ... 98
5.3.4. Conséquences d'un passage transcellulaire de l'eau sur le volume cellulaire... 98
5.3.5. Rapport P®*^ / P'^ dans les épithéliums sensibles à l'ADH... 100
CHAPITRE 6. EVALUATION DES VOIES HYDRIQUES TRANSEPITHELIALES DANS L'IMCD... 103
6.1. INTRODUCTION... 103
6.1.1. Valeurs de Posm transépithélial dans l'IMCD terminal perfusé... 103
6.1.2. Voie de passage hydrique paracellulaire ... 104
6.2. VALIDATION DES METHODES... 104
6.2.1. Mesure du P„„ basolatéral ... 104
6.2.2. Mesure du P„. transépithélial ... 107
6.3. ETAT D'HYDRATATION DES RATS... 108
6.4. EXPERIENCE TYPE... 108
6.5. RESULTATS... 108
6.5.1. Mesures de P„„ basolatéral et transépithélial dans les mêmes tubules... 108
6.5.2. Estimation du apical par mesure des volumes cellulaires à l'équilibre osmotique, et conclusions
concernant la voie hydrique transcellulaire ... 111
6.5.2.1. Estimation du P„, apical... 112
6.5.2.2. Le P„, apical estimé est-il compatible avec une voie hydrique purement transcellulaire ? . 114 6.6. INTERPRETATION... 114
6.6.1. Effet de l'état d'hydratation sur le P„, transépithélial ... 114
6.6.1.1. Rôles possibles d'une augmentation du P„, de l'IMCD en antidiurèse: 115
6.6.1.2. Quels peuvent être les mécanismes d'une augmentation du P„„ de l'IMCD en antidiurèse ? 118 6.6.2. Un passage d'eau paracellulaire dans l'IMCD est-il compatible avec les notions reconnues ?... 121
6.6.2.1. Aspects morphologiques... 121
6.6.2.2. Marqueurs ultrastructurels des canaux hydriques... 123
6.6.2.3. Arguments contre une voie hydrique paracellulaire ... 124
6.6.2.4. Arguments suggérant un P„. significatif des jonctions dans l'IMCD... 125
CONCLUSION... 129
CHAPITRE 7. RESUME ET PERSPECTIVES ... 130
POSTSCRIPT... 137
REFERENCES... 138
ANNEXES... 168
ANNEXE 1... 169
ANNEXE II... 175
ANNEXE III... 179
Page opposée:
1.1 Schéma du néphron... 2
1.2 Trajet optique d'un rayon lumineux en CID... 12
2.1 Coupe sagittale du rein de rat... 23
2.2 Schéma du montage de perfusion... 25
2.3 Chambre d'incubation à flux laminaire ... 26
2.4 Réservoir thermostatisé à circulation continue ... 27
2.5 Diagrairane du montage électro-optique... 29
2.6 Position des plans de mise au point dans le tubule perfusé ... 35
2.7 Courbe standard de la fluorescence du sulfonate de fluorescéine . 41 3.1 Schéma du montage des pipettes de perfusion ... 45
3.2 Courbes de transmission d'un miroir dichroïque ... 49
3.3 Géométrie optique du tubule perfusé ... 55
3.4 Expérience type de mesure du débit par "FRAP"... 56
3.5 Simulations de la récupération de fluorescence ... 59
3.6 Courbes typiques de récupération de fluorescence dans un IMCD . . 64
3.7 Comparaison des mesures de débit dans l'IMCD par deux méthodes . 64 3.8 Mesures du débit par FRAP à diverses positions axiales d'un tubule perfusé... 65
4.1 Sections optiques à travers une cellule d'IMCD^ ... 70
4.2 Volume des cellules d'IMCD en fonction de leur position dans la médullaire interne ... 71
4.3 Rapports volume/surfaces membranaires lisses des cellules d'IMCD 72 4.4 Réaction de l'IMCD^ à l'ADH et à une perfusion hypotonique ... 73
4.5 Comportement osmométrique des cellules d'IMCD^ ... 76
4.6 Evolution au cours du temps du volume des cellules d'IMCD^ exposées à un bain hypotonique... 78
5.1 Vitesse d'échange de la solution de bain... 81
5.2 Variation de volume initiale d'une cellule d'IMCD^ en réponse à une élévation de tonicité du bain... 83
LISTE DES ILLUSTRATIONS
page opposée:
5.3 Relation entre AH et J, à travers la membrane basolatérale ... 85 5.4 Vitesse d'échange de la solution de perfusion ... 88 5.5 Variation de volume initiale d'une cellule d'IMCD^ en réponse à une
élévation de tonicité du perfusât ... 89 5.6 Relation entre AH et J, à travers la membrane apicale... 90
5.7 Représentation des membranaires et du P„, transcellulaire d'une
cellule d'IMCDj, exprimés par unité de surface apicale lisse) 97 5.8 idem, exprimés par unité de surface apicale "réelle” ... 98 5.9 Changements de volume d'une cellule modèle après modification de
tonicité du bain... 100 5.10 Changement de volume d'une cellule d'IMCD^ après élévation de tonicité
de la solution luminale... 100 6.1 Voies de réabsorption de l'eau dans le tubule collecteur .... 104 6.2 Courbe standard du microfluoromètre à flux continu... 107 6.3 Expérience type de mesure des P„, basolatéral et transépithélial 108 6.4 Stratégie utilisée pour estimer le P„„ apical ... 112
En Annexe:
111.1 Relation entre l'intensité lumineuse et les coefficients de photolyse d'échantillons de sulfonate de fluorescéine ... 179 111.2 Evaluation de l'intensité lumineuse délivrée par le laser à chaque
section d'un tubule modèle ... 180 111.3 Représentation schématique de l'intensité de la photolyse dans un
tubule modèle ... 181
LISTE DES TABLES
Page opposée:
3.1 Mesures du débit dans des capillaires en verre par "FRAP" .... 63 4.1 Paramètres des cellules d'IMCD mesurés en CID ... 71 5.1 Comparaison de deux méthodes de mesure des modifications osmotiques de
volume... 82 5.2 Effets de l'ADH et d'un bain hypertonique sur les mesures de P„,
basolatéral... 87 5.3 Changements de volume induits par un gradient osmotique apical . 88 5.4 Effet de l'ADH sur les mesures de P„, apical ... 89 5.5 Données stéréologiques concernant les cellules d'IMCD de rat . . 91 5.6 P„j, membranaires des cellules d'IMCDj... 92
5.7 P„, de diverses membranes... 93
5.8 Evolution du rapport S^''/S"' le long du canal collecteur de rat . 101 6.1 Valeurs publiées de P„, transépithélial dans l'IMCD terminal de rat
... 103 6.2 Comparaison des mesures de P„, basolatéral par deux méthodes . . 106 6.3 Comparaison des mesures de P„j, transépithélial par deux méthodes 107 6.4 Comparaisons individuelles des mesures de P„, basolatéral et de P„,
transépithélial ... 109 6.5 Influence de l'état d'hydratation in vivo et de l'ADH in vitro sur les
mesures de P„... 110 6.6 Estimation des P„, apicaux individuels ... 113 6.7 Résistance transépithéliale de l'IMCD in vitro ... 126
LISTE DES ABREVIATIONS
ADH CIO
CCD (caméra) An
FRAP (ou FPR) IMCD
J, L.
Po«
P"
p»i ffC
pTC
pn SF VRD VRI
Hormone antidiurétique (ou vasopressine)
Contraste interfèrentiel différentiel (ou Nomarski)
"Charge-coupled device": caméra vidéo à support solide (par opposition aux caméras à tube)
Gradient osmotique
Récupération de fluorescence après photolyse Tubule collecteur médullaire interne
Flux hydrique (transmembranaire)
Coefficient de conductance hydraulique
Perméabilité hydroosmotique (ou hydrique, ou hydraulique) P„, de la membrane plasmique apicale
P„, de la membrane basolatérale (avec correction pour le rapport des surfaces membranaires apicale/basolatérale).
P„, paracellulaire P„, transcellulaire P„. transépithélial
Sulfonate de fluorescéine
Régulation (de volume) par diminution de volume Régulation (de volume) par augmentation de volume
INTRODUCTION
Fig. 1.1. Schéma d'un néphron juxta-médullaire à anse de Henle longue (à gauche) et d'un néphron à anse courte (à droite). En rouge, les glomérules. En bleu, le tube proximal: 1- contourné, 2- droit. En vert, l'anse de Henle: 3- branche grêle descendante, 4- branche grêle ascendante, 5- branche large ascendante médullaire, 6- branche large ascendante corticale. En violet: 7- Tube contourné distal, 8- Tubule connecteur. Non colorié, le canal collecteur: 9- initial, 10- cortical, 11- médullaire externe, zone externe, 12- idem, zone interne, 13- médullaire interne, partie 1, 14- idem, partie 2, 15- idem, partie 3. (Selon le schéma de Madsen et Tisher [1986] et les recommandations de la Commission Rénale de l'IUPS [Kriz et Bankir 1988]).
CHAPITRE 1
1.1. PRESENTATION DES OBJECTIFS
C'est la nature polarisée des épithéliums (surface apicale ou muqueuse vs surface basolatérale ou séreuse) qui leur permet d'effectuer le transport dirigé des solutés et de l'eau, condition primordiale au maintien de la composition du milieu intérieur.
La première approche des propriétés absorptives et secrétoires des épithéliums a consisté à analyser ces transports de façon globale, en mesurant leur réponse à des modifications contrôlées du milieu séreux ou muqueux. Des méthodes ingénieuses ont été mises au point pour manipuler in vitro les divers tissus épithéliaux dans les conditions les plus naturelles possibles. L'étude des structures tubulaires rénales, en particulier, a franchi un pas décisif avec l'introduction de la technique de microperfusion in vitro de tubules isolés (Burg et coll. 1966). Cette méthode a servi au fil des ans à investiguer d'innombrables paramètres fonctionnels des tubules rénaux (Jacobson et Kokko 1982; Burg et Knepper 1986; Berry et Rector 1991) et à définir tout au long du néphron une quinzaine de segments aux caractéristiques propres' (Fig. 1.1) [Kriz et Bankir 1988; Wright et coll. 1990; Tisher et Madsen 1991]. De plus, la perfusion in vitro accorde l'accès simultané aux deux côtés de l'épithélium et permet, dans une certaine mesure, d'explorer les mécanismes intrinsèques de la polarisation épithéliale, c'est-à-dire les phénomènes qui dépendent des membranes plasmiques opposées.
Pourtant, comme en d'autres domaines de la recherche biomédicale, le centre d'attraction de la physiologie rénale s'est déplacé, ces dernières années, vers la biologie moléculaire. Celle-ci, associée à la culture cellulaire et à la préparation de vésicules membranaires, a débouché sur l'isolement et l'analyse structurelle de multiples protéines membranaires qui servent de
' La définition des différents segments peut varier légèrement selon que l'on considère l'approche par microdissection, par microponction in situ, ou l'étude histologique. Notons que, stricto sensu, le canal collecteur ne fait pas partie du "néphron" (Braus 1929), puisqu'il se développe au départ du bourgeon urétéral (mésonéphros) et pas du métanéphros (Tisher et Madsen 1991). Par facilité et convention, il est néanmoins englobé dans l'appellation "néphron".
transporteurs aux ions et aux solutés organiques (Alper et Lodish 1991),
Cet apport spectaculaire de la biologie cellulaire à la physiologie rénale ne doit toutefois pas faire oublier que la caractérisation biochimique des transporteurs membranaires n'est pas un but en soi, mais un moyen pour décrire le comportement physiologique des tissus vivants. Or, les techniques d'approche moléculaires ou subcellulaires, qui par nécessité détruisent l'intégrité de la cellule, peuvent donner lieu à des interprétations délicates^ Ceci est particulièrement vrai dans le domaine rénal, où de nombreuses structures sont composées de cellules hétérogènes et les activités de transport sont souvent coordonnées entre différentes cellules. Quant aux cultures cellulaires d'origine rénale, elles ont toutes tendance à se dédifférencier in vitro, quoiqu'à des vitesses et des degrés divers.
C'est pourquoi il est nécessaire de développer, à côté des techniques à visée moléculaire, des méthodes quantitatives les moins invasives possibles qui permettent d'étudier in vitro, à l'échelle cellulaire, la régulation des transports dans les tissus vivants intacts.
Nous avons appliqué ces concepts au tubule collecteur rénal. Nous allons montrer que la combinaison de microperfusion in vitro et de vidéo-microscopie à haute résolution remplit parfaitement les critères énoncés ci-dessus. Elle offre une approche à la fois morphologique et biophysique d'un épithélium vivant, examiné cellule par cellule. Elle nous a permis d'investiguer dans une optique nouvelle la fonction hydroosmotique du canal collecteur. Celle-ci est d'habitude envisagée globalement, sous l'angle des mécanismes de concentration urinaire; nous avons opté pour une vue "cellulaire". En particulier, nous nous avons cherché à répondre aux questions suivantes: quelles sont les conséquences, pour la cellule tubulaire, du flux hydrique transépithélial qui la traverse alors qu'elle est soumise à un gradient osmotique? Dans quelle mesure le cytoplasme se dilue-t-il (ou se concentre-t-il)? Quelles sont les voies de passage exactes à travers le tubule collecteur? Ces questions sont d'autant plus critiques pour les cellules du canal collecteur médullaire interne (#13 à 15 dans la Fig. 1.1) que celles-ci sont régulièrement exposées à une hypertonicité
* Elles peuvent également, selon un éditorial récent de la revue Nature, donner parfois l'image trompeuse d'une science qualitative de type "tout ou rien" ("Is molecular biology yet a science ?", John Maddox, 16/1/1992).
interstitielle intense, et parfois à des variations de tonicité très rapides (en cas de diurèse aqueuse, par exemple). Là plus qu'ailleurs, les retentissements cellulaires de la fonction hydroosmotique dépendront de la façon dont sont réparties les résistances hydriques entre la membrane plasmique apicale, la membrane basolatérale, et éventuellement le cytoplasme lui-même. Notre voie d'approche vers ces problèmes a consisté à mesurer directement les perméabilités membranaires individuelles dans le canal collecteur médullaire interne, puis à les comparer de la façon la plus adéquate possible aux mesures de perméabilité de l'épithélium tout entier.
Ce travail est donc constitué de deux parties:
1) La présentation des résultats des mesures évoquées ci-dessus, accompagnée d'une discussion des voies de passage de l'eau à travers les épithéliums en général, et le tubule collecteur médullaire interne en particulier. L'insertion de nos résultats dans les notions connues jusqu'ici ouvre la porte à plusieurs supputations, et nous suggérerons les étapes qui pourraient suivre les observations actuelles.
2) Avant cela, la première partie du travail consistera en une description théorique et des démonstrations expérimentales des techniques qui ont dû être maîtrisées pour réaliser les objectifs mentionnés. Le but de cette mise au point est double:
a) permettre une bonne compréhension des résultats obtenus et éviter les interprétations erronées qui pourraient résulter de la complexité des techniques;
b) établir une base solide pour l'application de ces nouvelles techniques à des situations similaires, voire à d'autres épithéliums, notamment les cellules en culture, toujours dans l'optique non invasive décrite ci-dessus.
Nous avons en particulier développé trois méthodes originales, qui seront présentées séparément au Chapitre 3: l'une servant à réaliser la mesure directe de la perméabilité de la membrane apicale des cellules à l'intérieur du tubule perfusé, en modifiant en une fraction de seconde la composition du perfusât;
l'autre, pour mesurer dans les mêmes conditions optiques le débit instantané de perfusion; la dernière, pour combiner, dans le même montage microscopique, l'observation en contraste différentiel interférentiel (CID, ou Nomarski) et en fluorescence.
Au cours de cette présentation des techniques, il apparaîtra rapidement que la poursuite de l'approche vidéo-microscopique en général, et en particulier combinée à la microperfusion, nous a menés à l'interface de domaines parfois inattendus: optique, électronique, informatique, biophysique, associés bien sûr à la morphologie et à la physiologie. De la confrontation de ces domaines ont surgi des hypothèses également inattendues.
1.2. PERMEABILITE HYDRIQUE {P^) DU TUBULE COLLECTEUR
1.2.1. Fonction hydroosmotique
Le tubule (ou canal) collecteur occupe une place privilégiée le long du néphron de par son rôle dans l'économie de l'eau partagée par tous les animaux terrestres. C'est le seul épithélium de vertébré qui soit capable de moduler sa perméabilité osmotique à l'eau (ou perméabilité hydrique; de façon rapide et réversible.
Il est apparu très tôt que le régulateur hormonal principal de ces variations était l'hormone antidiurétique (ADH)^ (Wirz 1956), et plus tard, que sa cible d'action finale était la membrane plasmique apicale (Peachy et Rasmussen 1961; Ganote et coll. 1968). Les particules intramembranaires qu'y induit l'ADH (Chevalier et coll. 1974; Harmanci et coll. 1978) sont les témoins vraisemblables de la présence de pores, ou canaux aquifères, dont il existe de multiples preuves biophysiques (Koefoed-Johnson et Ussing 1953; Finkelstein 1976b; Gluck et Al-Awqati 1980; Hebert et Andreoli 1980).
Depuis lors, un domaine particulièrement actif des recherches en
^ Nous utiliserons la même abréviation, Po„, pour désigner toute perméabilité osmotique à l'eau, qu'il s'agisse de l'épithélium en général (P„, transépithélial ou global) ou d'une seule membrane ou portion de membrane (p.ex.
P„, apical et P„, basolatéral), car ces notions recouvrent les mêmes mécanismes biophysiques (osmose).
^ Par simplicité, nous utiliserons le terme ADH tout au long de ce travail, bien que ce soit l'hormone antidiurétique naturelle du rat (et de l'Homme), la vasopressine (ou AVP, arginine-vasopressine) qui ait été utilisée comme agent pharmacologique.
physiologie rénale consiste à tenter de caractériser ces canaux aquifères, et en particulier à isoler chimiquement les molécules qui les constituent (pour les revues les plus récentes, cf. Finkelstein 1987; Hays et coll. 1987; Harris et Handler 1988; Verkman 1989; Harris et coll. 1991; Brown 1991; Verkman 1992). Les difficultés de cette approche biochimique sont évidentes, eu égard à la rapidité des mouvements de l'eau, à l'absence de ligand spécifique, et au P„, naturellement élevé des membranes lipidiques artificielles (Verkman 1989). Deux voies semblent à ce stade les plus prometteuses:
a) l'identification de polypeptides membranaires dans des vésicules d'endocytose ayant préférentiellement incorporé des canaux aquifères fonctionnels (Harris et coll. 1988 et 1991);
b) l'expression du(des) transporteur(s) hydrique(s) dans l'oocyte de Xénope par microinjection de mRNA extrait de la papille de rein (Zhang et coll.
1990) .
Il fait peu de doute que l'une ou l'autre de ces méthodes portera ses fruits à moyen ou à court terme®, mais il est essentiel de les compléter par des explorations physiologiques.
Dès son introduction, la technique de perfusion du tubule isolé a joué un rôle primordial dans l'élucidation des fonctions hydroosmotiques du canal collecteur; elle a surtout servi, dans le collecteur cortical de lapin,
(1) à préciser les étapes biochimiques de l'action cellulaire de l'ADH (Grantham et Burg 1966), ainsi que l'influence, parfois subtile, d'innombrables hormones, drogues ou conditions d'environnement (Abramow et coll. 1987; Hays
1991) ;
(2) à y confirmer biophysiquement la présence de pores aqueux membranaires (Hebert et Andreoli 1980, 1982 et 1985).
(3) Ajoutons-y, plus récemment, la recherche de la spécificité cellulaire des récepteurs à l'ADH (Kirk et coll. 1987).
Par contre, les modifications morphologiques associées aux flux d'eau transépithéliaux n'ont pas souvent été étudiées de façon quantitative dans le tubule collecteur perfusé, et jamais, d'ailleurs, dans le canal collecteur
® Une approche identique au point b) vient d'aboutir à l'expression moléculaire d'une protéine membranaire du globule rouge (CHIP28) qui semble posséder les caractéristiques attendues d'un canal aquifère (Preston et coll.
1992).
médullaire interne (ou IMCD, pour conserver l'abréviation anglaise originale), qui présente pourtant des particularités étonnantes.
1.2.2. du canal collecteur médullaire interne (IMCD)
L'IMCD est cette portion du canal collecteur qui traverse la médullaire interne, y compris la papille (cf. Fig. 2.1), dont l'osmolalité interstitielle peut atteindre plus de 3000 mOsm/kg HjO chez le rat en antidiurèse (Schmidt- Nielsen et O'Dell 1961). Certaines de ses caractéristiques structurelles et fonctionnelles seront détaillées plus loin (cf. p.ex. 2.1.3 et 4.1.1); pour
l'instant, signalons les points suivants concernant sa perméabilité hydrique:
(1) Le P„, global de l'IMCD du rat in vitro, que ce soit en absence ou en présence d'ADH, est extrêmement variable d'un groupe d'investigateurs à l'autre (cf. Table 5.10), voire dans les mains d'un seul individu. Chez Nadler (1990) par exemple, les valeurs en présence d'ADH vont de 150 à 1700 /zm/s)®. Les causes de cette variabilité sont peu claires, même si l'on peut parfois évoquer le point (3) ci-dessous.
(2) En présence d'ADH, le P„, peut atteindre des valeurs extrêmement élevées (de l'ordre de 1500 /zm/s [p.ex. Nadler 1990, Han et coll. 1992]), proches de celles rencontrées dans le tubule proximal. Comme la "quantité de membrane" d'une cellule de l'IMCD est largement inférieure à celle d'une cellule proximale, il faudrait en conclure que les membranes des cellules de l'IMCD présentent un des P„, par unité de surface les plus élevés de toutes les cellules, pour autant bien entendu que les flux d'eau mesurés soient exclusivement transcellulaires. Cette conclusion justifie à elle seule une mesure directe des P„, membranaires dans les cellules d'IMCD.
(3) Dans la partie terminale de l'IMCD in vitro, le P„, basal, indépendant de l'ADH, varie selon l'état d'hydratation de l'animal au moment du sacrifice (Lankford et coll. 1991). Ainsi, un IMCD provenant d'un animal en antidiurèse voit son P„„ basal se maintenir à des valeurs très élevées (300 à 500 /zm/s) durant plus de 90 minutes in vitro. Contrairement à ce qui s'observe sous
® Pour l'interprétation des valeurs de P„, transépithélial, prière de se rapporter au (6.1.1).
l'influence de l'ADH, la modulation par l'état d'hydratation ne fait pas intervenir la concentration intracellulaire en AMP cyclique (Lankford et coll.
1991)'. Les mécanismes qui sous-tendent cette modulation ne sont pas connus avec précision, mais impliquent un changement stable de l'épithélium, donc peut-être de sa structure cellulaire, et suggèrent l'existence d'une voie de passage de l'eau différente, qui pourrait coexister avec celle des canaux hydriques apicaux
"classiques". Il n'est pas exclu, à nos yeux, que cette voie additionnelle soit paracellulaire.
(4) Lorsque les rats Brattleboro, une souche génétiquement dépourvue d'ADH endogène, sont privés de boisson durant quelques heures, leur osmolalité
urinaire s'équilibre avec celle du tissu papillaire adjacent (Williamson et Edwards 1984), suggérant une augmentation du de l'IMCD, qui n'est cependant pas accompagnée d'une multiplication des particules intramembranaires apicales (Edwards et Harmanci 1983). Ces observations aussi peuvent suggérer une voie de passage hydrique différente, éventuellement paracellulaire; l'élévation des taux circulants d'oxytocine pourrait participer à sa modulation (Edwards et LaRochelle 1984).
Sur base de ces observations, il serait souhaitable de pouvoir mesurer, dans différentes conditions d'hydratation de l'animal, les des membranes plasmiques apicales et basolatérales des cellules de l'IMCD et d'y associer, dans le même tabule, la mesure du P„, transépithélial global qui est si variable d'un tubule à l'autre. C'est ce que nous avons réalisé, en plusieurs étapes, dans le présent travail. A notre connaissance, c'est la première fois qu'une telle approche ait été tentée dans un épithélium de marranifère.
1.2.3. membranaire
Le P„, d'une membrane plasmique est mesuré en suivant la variation du volume cellulaire en réponse à un choc osmotique externe (cf. 2.3.1). Cette variation de volume est extrêmement rapide, ce qui a limité jusqu'ici le développement d'une méthodologie adéquate. Bien qu'il existe de nombreuses méthodes de mesure du volume cellulaire absolu ou relatif, peu d'entre elles
' La perméabilité à l'urée de l'IMCD, qui dépend du même second messager, n'est d'ailleurs pas modifiée dans ces conditions.
remplissent les exigences de notre préparation biologique. On peut classer ces méthodes en deux catégories, selon qu'elles sont basées sur le changement de concentration d'un marqueur intracellulaire ou sur une mesure directe du volume par diverses méthodes optiques. Dans le premier cas, le marqueur peut être une espèce ionique, mais la vitesse de réponse des microélectrodes sensibles aux ions a limité jusqu'ici cette technique aux P„, relativement faibles des cellules d'amphibiens (Zeuthen 1982, Reuss 1985, Tripathi et Boulpaep 1988). Le marqueur de concentration pourrait aussi être une substance fluorescente, dont le signal s'enregistre très rapidement; cette technique, appliquée avec succès aux vésicules membranaires (Chen et coll. 1988, Verkman et coll. 1988), n'a pu s'envisager jusqu'ici dans un épithélium qu'au prix d'une perte de résolution temporelle inacceptable (Tauc et coll. 1990). Restent les méthodes optiques de mesure du volume cellulaire, dont la résolution spatiale et temporelle doit être affinée à l'extrême pour enregistrer des événements qui sont habituellement terminés en une demi-seconde®. Il parait donc important de justifier dans la présente introduction les méthodes optiques exactes que nous avons choisies.
1.3. CHOIX DES METHODES OPTIQUES
1.3.1. Introduction
Il n'est pas inutile de rappeler tout d'abord l'étonnante renaissance que connaît depuis quelques années la microscopie optique en général (Webb 1986), grâce aux possibilités nouvelles que lui offrent l'adjonction de la vidéo- microscopie (Allen et coll. 1981, Inoué et coll. 1981), de la microscopie à fluorescence (Taylor et Wang 1980) et de la microscopie confocale (Shotton 1987). Le caractère non invasif et l'excellente résolution temporelle (Inoué 1990b) de ces méthodes n'y sont pas étrangers.
L'étude des transports membranaires bénéficie dans ce contexte du développement de molécules fluorescentes spécifiques, véritables "sondes
® La méthode la plus rapide de mesure de volume cellulaire, la spectrophotométrie à flux interrompu ("stopped-flow"), n'est applicable aux épithéliums qu'au prix de prouesses techniques très contraignantes (Echevarria et Verkman 1992).
optiques" pour de nombreux paramètres cellulaires (Eidelman et Cabantchik 1989, Sachs et coll. 1990). Par ailleurs, la vidéo-microscopie permet d'explorer les phénomènes de transport en rapport avec des modifications de volume de la cellule. Mais l'application de ces méthodes aux épithéliums vivants, notamment rénaux, est encore peu pratiquée car techniquement plus exigeante (Spring 1979 et 1985, DiBona 1985, Foskett 1990, Spring et Jacobson 1991).
En ce qui concerne l'analyse des mouvements d'eau dans le canal collecteur rénal, la microperfusion in vitro et la vidéo-microscopie ont déjà été associées, quoique peu fréquemment (Kirk et coll. 1984, Strange et Spring 1986, DiBona et Walker 1988). Il subsistait d'ailleurs plusieurs difficultés d'ordre technique, que nous sommes parvenus à contrôler (cf. Chapitre 3).
1.3.2. Contraste interfèrent!e1 différentiel (CID)
1.3.2.1. Pourquoi le CID
Plongées dans une solution physiologique, les cellules épithéliales vivantes, non colorées, sont difficiles à distinguer sous le microscope car leur indice de réfraction est trop proche de celui du milieu pour que les méthodes conventionnelles d'illumination à fond clair ne génèrent un contraste suffisant.
Parmi les nombreuses méthodes d'accentuation du contraste, la plus répandue, et probablement la plus mauvaise, consiste à fermer le diaphragme du condenseur. La perte de résolution et l'augmentation de la profondeur de champ et de la lumière diffractée qui s'ensuivent ne sont que rarement acceptables.
De même, la microscopie à contraste de phase, dont la mise au point valut à son auteur le prix Nobel de physique en 1953 (Zernike 1955), est restée une méthode
® Pour expliquer correctement la formation de l'image microscopique et ses propriétés (résolution, visibilité, contraste...), il est indispensable de s'en référer à la nature physique des ondes lumineuses. C'est ce qu'Ernst Abbe avait découvert il y a plus de 100 ans en cherchant à comprendre pourquoi l'optique géométrique prédisait si mal les performances du microscope. En effet, ce sont les phénomènes de diffraction qui déterminent la taille et la forme exacte de l'image microscopique (parmi les articles et livres de référence consultés, les plus utiles furent: Zernike 1958, Françon 1961, Rochow et Rochow 1978, Born et Wolf 1980). Pour éviter les digressions, la présente introduction sera volontairement limitée aux notions optiques les plus intuitives.
populaire, en raison de sa commodité d'utilisation, notamment avec les objectifs à longue distance de travail, un atout non négligeable pour l'examen des cellules en culture, par exemple. Cependant, les anneaux de phase provoquent des halos autour des cellules, obscurcissent leurs limites, et restreignent l'ouverture numérique de l'objectif. Même après traitement informatisé (Walter et Berns 1981), le contraste de phase n'a guère d'intérêt dans l'étude des tubules rénaux in vitro.
Les mêmes critiques peuvent être adressées à la modulation de contraste selon Hoffman (Hoffman et Gross 1975), bien que sa résolution axiale soit meilleure et qu'elle ait trouvé quelque application dans la microperfusion de tubules (O'Neil et Hayhurst 1985). Finalement, une méthode ingénieuse, l'illumination asymétrique, qui n'éclaire qu'une partie de l'ouverture du condenseur, fournit des images à haute résolution à condition d'être couplée à une caméra vidéo avec ajustement de gain et de contraste (Kachar 1985). En effet, les rayons obliques produisent un tel degré de dispersion de la lumière dans les régions hors du champ que l'observation directe devient impossible, mais le traitement analogique du centre de l'image est capable d'en extraire des représentations tout à fait spectaculaires. Cette technique, comme celle de Hoffman, peuvent s'envisager si le spécimen contient une grande quantité de matériel biréfringent, comme suggéré pour les cellules amphibiennes A6 en culture (Kachar 1985).
En ce qui concerne les tubules rénaux, il ne fait pas de doute que la méthode de choix est le CID (Horster et Gundlach 1979; Kirk et coll. 1983, 1984a et 1984b; DiBona et coll. 1985; Strange et Spring 1986). Mis au point il y a une trentaine d'années (Nomarski 1955; Smith 1956; description détaillée par Allen et coll. 1969), le CID, aussi appelé Nomarski du nom d'un de ses inventeurs, produit des images très contrastées à haute résolution permettant de distinguer clairement les bordures cellulaires. Mais son avantage principal, du moins en ce qui nous concerne, est l'extrême minceur de la profondeur de champ*". Cette
*" Plusieurs acceptions du terme "profondeur de champ" sont possibles. On peut considérer qu'il représente la possibilité de distinguer deux points séparés de la préparation le long de l'axe optique du microscope, ou définir, selon Françon (1961), une précision de mise au point ("axial setting accuracy") qui est à peu près proportionnelle au carré de l'ouverture numérique de l'objectif. Pour un objectif à immersion huile d'ouverture numérique maximale (1.40), cette profondeur de champ théorique est de 0.29 /zm. En pratique, l'association de CID et de vidéo-microscopie a permis à Inoué d'obtenir des
PRW CSO WA
Fig. 1.2. Trajet optique schématisé d'un rayon lumineux en contraste interfèrentiel différentiel (CID). La séparation entre les deux rayons qui traversent le spécimen est largement accentuée. Les plans de polarisation ne sont pas indiqués. P- polariseur; R- retardeur de h de longueur d'onde (ou retardeur variable à cristal liquide, ou autre compensateur); W- prisme de Wollaston (ajustable dans le montage préconisé par Zeiss®); C- condensateur; S- spécimen; 0- objectif; A- analyseur.
propriété est mise à profit pour réaliser des "sections optiques" de cellules vivantes et pour en déterminer le volume et les surfaces membranaires avec précision.
1.3.2.2. Théorie du CID (Fig. 1.2)
Le CID est basé sur l'interférence entre deux ondes lumineuses qui ont traversé le spécimen toute proches l'une de l'autre. Pour dédoubler chaque rayon incident, le faisceau lumineux est d'abord polarisé puis passé dans un prisme de Wollaston. Pour chaque rayon entrant, deux rayons en émergent, déplacés de 45* de part et d'autre du plan de polarisation incident. Le prisme de Wollaston est situé dans le plan focal postérieur du condenseur"; aussi, ce dernier transforme les rayons divergents en deux rayons parallèles, séparés par une distance inférieure à la résolution optique du microscope (si la séparation était plus large, l'image apparaîtrait dédoublée). La paire de rayons traverse ensuite le spécimen et l'objectif, puis est recomposée dans le plan focal postérieur de ce dernier par un nouveau prisme de Wollaston ajustable.
Si les deux rayons ont traversé le spécimen sans altération, leur recombinaison ne produira aucune différence de phase. Le faisceau recombiné passe ensuite dans un analyseur orienté à 90° par rapport au polariseur. Ainsi, l'intensité lumineuse s'éteindra s'il n'y a pas de différence de phase entre la paire de rayons. Par contre, si les longueurs des trajets optiques des deux rayons diffèrent, la recombinaison produira une différence de phase, laquelle deviendra, après passage dans l'analyseur, une différence d'intensité lumineuse génératrice de contraste. Cette situation se présente si l'un des rayons a traversé un région d'épaisseur ou d'indice de réfraction différent. La qualité optique du montage peut être appréciée par son coefficient d'extinction, c'est- à-dire la différence d'intensité entre les régions les plus sombres et les plus claires de l'image.
Pour ajuster le contraste et la luminosité de l'image en fonction du
sections optiques de 0.20 à 0.25 /an (Inoué 1989).
" Dans le système mis au point par Nomarski, les prismes de Wollaston sont modifiés de telle sorte qu'ils ne doivent pas occuper exactement le plan focal postérieur de l'objectif (ou du condenseur).
spécimen investigué, il faut encore ajouter un certain retard de phase entre les deux rayons incidents, soit en faisant glisser latéralement l'un des prismes de Wollaston par rapport à l'autre (système adopté par Zeiss®), soit en introduisant un compensateur, par exemple un retardeur de ^ de longueur d'onde associé à la possibilité d'effectuer une rotation manuelle du polariseur. Nous avons choisi cette seconde solution, en réglant en général le retard de phase effectif au minimum‘% ce qui a pour effet de réduire la diffusion de la lumière mais exige des objectifs de haute qualité optique, voire rectifiés, car la surface des objectifs usuels produit une certaine dépolarisation (Françon 1961;
Inoué 1986). De nombreux autres utilisateurs préfèrent augmenter le retard de phase effectif jusqu'aux alentours de ^ de longueur d'onde; le contraste s'en voit bonifié aux dépens du bruit de fond, qui est alors corrigé par le traitement analogique du signal vidéo (cf. 1.3.3 et Allen et coll. 1981).
Les images en CID sont surtout contrastées dans la direction du plan de séparation des rayons incidents, et paraissent donc éclairées par une lumière oblique. Les ombres donnent la fausse impression d'un relief (monts et vallées) qui ne traduit que les sauts d'indices de réfraction au sein du spécimen (cf.
Fig. 4.1 par exemple). L'interprétation des images doit en tenir compte.
1.3.2.3. Restrictions du CID
Tout objet fortement biréfringent, ou tout composant optique qui provoque une rotation du plan de polarisation, réduira le coefficient d'extinction du système et donc la gamme de contrastes disponibles. Il en est ainsi de nombreux objectifs à longue distance de travail (ce qui restreint considérablement les possibilités du CID en présence d'un système de microperfusion, cf. 1.3.6), des supports de culture cellulaire en plastique, ou des spécimens comprenant un tissu conjonctif épais (biréfringence du collagène).
De plus, le CID requiert par définition une illumination intense. Pour
** Lors de certaines expériences, nous avons utilisé un retardeur de longueur d'onde variable à cristal liquide, commandable électroniquement, qui évite de devoir manipuler le polariseur lors de l'ajustement optique et qui permet de renverser rapidement la direction du contraste, par exemple pour mieux faire ressortir l'une ou l'autre membrane.
éviter les lésions photodynamiques, essentiellement liées aux ultraviolets, il faut insérer des filtres interférentiels de haute qualité qui donneront un caractère monochromatique à l'illumination; pour compenser la perte de visualisation qui résulte de l'ouverture maximale du condenseur, il faut se tourner vers la vidéo-microscopie.
1.3.3. Vidéo-microscopie
Bien que la microscopie ait d'emblée tiré parti des premières expériences de télévision en circuit fermé, surtout pour étendre son spectre vers l'ultraviolet (Flory 1951), puis pour capturer, grâce aux intensificateurs d'image, des événements invisibles à l'oeil nu ou aux émulsions photographiques (Reynolds 1964), il fallut attendre l'amélioration de l'équipement vidéo et de l'électronique, dans les années soixante-dix, pour que la vidéo-microscopie fasse son apparition dans le domaine biologique, d'abord sous forme de "ciné- microscopie"'\
Mais il serait naïf de croire que la vidéo-microscopie consiste simplement à filmer une scène que l'on observe sous le microscope. La vidéo-microscopie est une technique à part entière, avec des règles quelque peu différentes de celles de la microscopie optique "ordinaire". La capture vidéo de l'image permet d'en augmenter le contraste et la résolution, d'en corriger certains défauts optiques, et d'en filtrer les informations pour faire ressortir les éléments recherchés. La photographie pourrait théoriquement aboutir à des résultats similaires, mais au prix d'une perte de temps incalculable. En vidéo, le traitement de l'image, qu'il soit analogique ou numérisé, est relativement simple (quoiqu'en théorie très difficile à expliquer!) et s'effectue souvent en temps réel.
Pour comprendre pourquoi la vidéo améliore tellement le contraste, il faut savoir que toute image microscopique est constituée d'une quantité plus ou moins grande de lumière diffuse ("straylight"), distribuée à travers toute
Le 28 février 1975, la couverture de la revue Science exhibait les images spectaculaires de l'invasion d'un globule rouge par un mérozoïte de la malaria, filmée en temps réel (Dvorak 1975). L'extrême sensibilité du parasite à la lumière avait jusque là privé l'oeil "nu" de cette observation.
l'image mais qui ne contribue aucunement aux détails; autrement dit, il s'agit d'un bruit de fond. Or le signal vidéo, contrairement aux réactions photochimiques à réponse logarithmique de notre rétine, reflète linéairement l'intensité lumineuse. Il devient donc possible de soustraire électroniquement un signal qui corresponde au bruit de fond (le voltage négatif qu'il faut appliquer s'appelle "offset" ou "pedestal", et aboutit à modifier la luminosité ou "brightness"), et ensuite d'amplifier ("gain") le signal résiduel. Le contraste est manipulé par des ajustements répétés de ces deux fonctions (Inoué 1986; Weiss et coll. 1989). Ces ajustements sont inclus dans les commandes de contrôle qui accompagnent les caméras destinées à la vidéo-microsocopie. Si nécessaire, l'image ainsi obtenue peut encore être améliorée par un traitement numérisé (Castleman 1979; Walter et Berns 1981; Allen et coll. 1981; Russ 1990), que nous n'avons pas utilisé systématiquement,
La résolution de l'image augmente parallèlement à l'amélioration du contraste'^ si bien que les limites de la microscopie optique sont en quelque sorte repoussées (Mizushima 1988; Inoué 1989), Cependant, nos applications n'ont pas tant exigé une "super-résolution" qu'une grande vitesse d'exécution. C'est l'enregistrement à vitesse vidéo (30 images/seconde dans le standard américain NTSC; résolution - 33 ms) des modifications de volume cellulaire qui a servi de base aux mesures de P„, membranaire. Le traitement analogique du signal vidéo avant son enregistrement nous a aidé à distinguer les bordures des cellules du tube collecteur, mais les restrictions techniques liées à la combinaison du CID et de la microperfusion in vitro (cf. 1.2.6) ne nous ont pas permis d'exploiter toutes les possibilités qu'offre la vidéo-microscopie pour l'étude des épithéliums vivants.
1.3.4. Microscopie à fluorescence
Depuis 1978, lorsque Willingham et Pastan ont observé durant 24 heures la pinocytose et le transport de protéines marquées à la rhodamine dans des cellules en culture, la microscopie à fluorescence s'est imposée comme la technique de référence dans l'exploration de nombreux phénomènes physiologiques
Sans entrer dans les explications optiques, il devient possible de distinguer deux points adjacents de plus en proches, en accentuant la
"dépression" d'intensité lumineuse qui sépare leurs images.
