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Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository
Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:
Randoux, T. P. (1991). Isolement, détermination de structure, synthèse et biosynthèse de composés défensifs de chrysomelidae (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.
Disponible à / Available at permalink : https://dipot.ulb.ac.be/dspace/bitstream/2013/213044/3/862a720b-3742-420c-9d51-c7a67f9ffc70.txt
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Laboratoire de chimie Bio-Organique
THESE
présentée pour l’obtention du grade légal de Docteur en Sciences
ISOLEMENT, DETERMINATION DE STRUCTURE, SYNTHESE ET BIOSYNTHESE DE COMPOSES
DEFENSIFS DE CHRYSOMELIDAE
\r^ < X €-ï ci <• ^ -Q. C-o ^
RANDOUX THIERRY
1991
m'avoir accueilli dans leur laboratoire, de la confiance qu'ils m'ont témoignée mais également pour leur précieux conseils et pour 1'intérêt qu'ils n'ont cessé de manifester à ce travail.
Le Professeur J.M.Pasteels a maintenu en élevage les insectes et récolté les centaines de sécrétions nécessaires à la réalisation de ce travail. Il a également accepté de réaliser les expériences d'incorporation de produits radioactifs. Qu'il en soit ici infiniment remercié.
Je remercie Messieurs les Professeurs J.Nasielski et J.Reisse de m'avoir donné accès à l'équipement spectroscopique de leurs services.
Je remercie aussi Monsieur R.Ottinger, directeur du C.1.R.E.M., et Madame A.Ottinger pour le relevé des spectres de résonance magnétique nucléaire ainsi que Monsieur C.Moulard pour l'enregistrement des spectres de masse.
Je tiens également à remercier le Docteur M.Hérin (SEARLE European Development Center) pour avoir accepté de relever les spectres de masse FAB et D/CI.
Je souhaite également remercier tous les membres du laboratoire de chimie bio-organique anciens et nouveaux pour l'esprit de camaraderie et l'ambiance décontractée, parfois délirante, qu'ils font régner au sein de notre équipe.
Je remercie aussi très sincèrement Catherine et mes parents pour leur patience , leur compréhension et pour la confiance qu'ils me témoignent.
Enfin, je remercie l'Institut pour l'Encouragement de la
Recherche Scientifique dans l'Industrie et 1'Agriculture pour
son soutien financier.
RESUME i
I. INTRODUCTION GENERALE 1
1. DEFENSE CHIMIQUE CHEZ LES INSECTES 2 2. DEFENSE CHIMIQUE CHEZ LES CHRYSOMELIDÀE 3
2.1. Composés défensifs des larves 3
2.2. Composés défensifs des adultes 6
2.2.1.Sous-tribu Doryphorina 7
2.2.2.Sous-tribus Chrysomelina et Phyllodectina 8
2.2,3.Sous-tribu Chrysolinina 8
2.3. Composés défensifs des oeufs 16
II. BUT DU TRAVAIL 18
III. RESULTATS ET DISCUSSION 20
1.ETUDE DES SECRETIONS DEFENSIVES DES ESPECES DE LA SOUS- TRIBU CHRYSOLININA INFEODEES à Hypericum perforatum 21
1.1.Introduction 21
1.1.1.Squelettes stéroïdiques 22
1.1.2.Spectrométrie de masse FAB 24 1.1.3.Résonance magnétique nucléaire 27 1.2. Détermination de structure des composés défensifs de
Chrysolina varians, C.brunsvicensis et C.geminata 28
1.2.1.Structure de CV2 28
1.2.2.Structure de CVl 37
1.2.3.Structure de CGI 40
1.2.4.Structure de CBl 4 5
1.2.5.Structure de CB2 46
1.2.6.Structure de CG2 47
1.2.7.B-éthanolamine 48
1.3. Composés défensifs de Chrysolina guadrigemina 49
1.4. Conclusions 50
2.I.Introduction 55 2.2. Discussion des différentes étapes de 1'hémisynthèse 55
2.2.1. Dégradation de la chaîne latérale de la
diosgénine 57
2.2.2. Préparation du 5-bromo-2-méthyl-2-pentène 60 2.2.3. Réaction de Grignard sur le dérivé 2X 62 2.2.4. Protection du 1,3-diol 16(S),20(S) 22 66 2.2.5. Protection du système 36-hydroxyA^ 67 2.2.6.Oxydation de la double liaison A^4 par OsO^ 68 2.3. Deuxième schéma d'hémisynthèse du composé 22 72 2.3.1.Formation du cycle tétrahydrofuranique 74 2.3.2.Introduction de la cétone en C-6 77
2.3. Conclusions 83
3. ETUDE DE LÀ COMPOSITION DES SECRETIONS DEFENSIVES DE
Oreina cacaliae 84
3.1.Introduction 84
3.2.Structure de OCl 84
3.3. Conclusions 90
4. ETUDE DES SECRETIONS DEFENSIVES D'UNE ESPECE DE LA
SOUS-TRIBU DORYPHORINA: Zygogramma suturalis 91
4.1.Introduction 91
4.2. Détermination de structure 92
4.2.1.Structure du composé ZSl 92
4.2.2.Structure du composé ZS2 92
4.2.3.Structure du composé ZS3 93
4.3. Conclusions 94
5.1.Introduction 95
5.2.Structure du composé LLl 95
6. ETUDE DE LA BIOSYNTHESE DES GLUCOSIDES D'ISOXAZOLINE-5-ONE
CHEZ Chrysomela tremulae 97
6.1.Introduction 97
6.2. Elevage de C .tremulae et incorporation de l'aci’de
L-(
u-14
c)aspartique 97
6.3. Extraction, purification et mesure de la radioactivité
des composés 14. et 15 100
6.4. Hydrolyses 101
6.4.1 .Hydrolyse du composé 14. 101
6.4.2.Hydrolyse du composé 15 102
6.5. Distribution de l'activité 104
IV. CONCLUSIONS GENERALES 105
V. PARTIE EXPERIMENTALE 109
1. MATERIEL ET METHODES 110
2. ETUDE DES SECRETIONS DEFENSIVES DES ESPECES DE LA SOUS- TRIBU CHRYSOLININA INFEODEES à Hypericum perforatum 111
2.1.Sécrétions brutes 111
2.2. Fractionnement 111
2.2.1. Chrysolina varians 111
2.2.2. C.brunsvicensis 111
2.2.2. C.geminata 112
2.3. Réactions d'acétylation 112
2.4. Réaction d'hydrolyse pour l'identification des
sucres 112
2.5. Dérivatisation de CV2a par l'isocyanate de
trichloroacétyle 113
2.6. Préparation de 1'homoterpénylméthylcétone ^ 113
2.7.1. CV2 (51) 114
2.7.2. CV2a (52) 115
2.7.3. CV2b (^) 115
2.7.4. CV1 (M) 115
2.7.5. CB1 (61) 116
2.7.6. CBla (62) 116
2.7.7. CB2 (63) 116
2.7.8. CB2a (M) 117
2.7.9. CGI (60) 117
2.7.10. CG2 (mélange 1:1 de 61 et 65) 118 2.7.11. CG2a (mélange 1:1 de 62 et 66) 118 3.HEMISYNTHESE DU STEROÏDE MAJEUR DES SECRETIONS DEFENSIVES
DE Chrysolina varians 119
3.1. Dégradation de la chaîne latérale de l'acétate de
diosgénine 119
3.2. Réaction de Grignard sur le dérivé 71 120 3.3. Protection du 1,3-diol 16(S),20(S) 12 151 3.4. Protection du système 3B-hydroxy 122 3.5 .Oxydation par OSO4 du composé 12. 123
3.6.Acétylation du composé T2 123
3.7.Oxydation par OsO^ du composé 9X 124 3.8. Préparation du p-chlorobenzoate de
dihydroquinidine 94 125
3.9.Oxydation asymétrique du composé £1 par OsO^ 126 3.10. Formation du cycle tétrahydrofuranique 126 3.11. Hydroboration-oxydation de l'acétate de
cholestéryle 102 par BH3*DMS/H202 128 3.12. Hydroboration-oxydation de l'acétate de
cholestéryle 102 par BH3*DMS/PCC 129 3.13. Hydroboration-oxydation du composé 76
par BH3*DMS/PCC 130
3.14. Préparation du diméthylcyclopropylcarbinol 84 131
3.15. Préparation du 5-bromo-2-méthyl-2-pentène £5 131
4.1.Isolement et purification du composé OCl 133 4.2. Réduction de la fonction N-oxyde 133 4.3. Caractéristiques spectroscopiques des composés
isolés 133
4.3.1.OCl (N-oxyde de sénéciphylline) 133 4.3.2.OCl réduit (sénéciphylline) 134 5. ETUDE DE LÀ COMPOSITION DES SECRETIONS DEFENSIVES DE
Zygogramma suturaiis 135
5.1.Isolement et purification de la fraction Fl 135 5.2. Hydrogénation catalytique de la fraction Fl 135 5.3. Propriétés spectroscopiques des composés isolés 135
5.3.1. Composé ZSl (41.) 135
5.3.2. Composé ZS2 (109) 136
5.3.3. Composé ZS3 (110) 136
5.3.4. Norleucine 111 136
6. ETUDES DES SECRETIONS DEFENSIVES D'UNE ESPECE DE LÀ
SOUS-FÀMILLE CRIOCERINÀE: Lilioceris lilii 137 6.1.Isolement et purification de LLl 137 6.2.Caractéristiques spectroscopiques du composé LLl 137 7. ETUDE DE LÀ BIOSYNTHESE DES GLUCOSIDES D'ISOXÀZOLINE-5-ONE
CHEZ Chrysomela tremulae 138
7.1. Elevage de C.tremulae et incorporationde l'acide
L-(U-^^C)aspartique 138
7.2. Extraction, purification et mesure de la radioactivité
des composés 14. et 15 138
7.3. Hydrolyse du composé 14 139
7.4. Hydrolyse du composé 15 139
7.5. Propriétés spectroscopiques des produits
d'hydrolyse 140
7.5.1.Pentaacétylglucose 116a 140
7.5.2.3-nitropropanoate de p-bromophénacyle 117 140
7.5.3.Pentaacétylglucose 116b 140
VI.BIBLIOGRAPHIE 141
RESUME
Au cours de ce travail, nous avons poursuivi l'étude structurale, synthétique et biosynthétique des composés défensifs de Chrysomelidae adultes.
Six glycosides stéroïdiques polyoxygénés originaux (^,^,40,61,^ et 65) ont été isolés des sécrétions défensives de trois espèces de la sous-tribu Chrysolinina inféodées à Hypericum perforatum: Chrysolina varians, C.brunsvicensis et C.geminata. Les structures ont été déterminées principalement par l'utilisation de méthodes spectroscopiques telles que la spectrométrie de masse FAB, la RMN^H, la RMN , la RMN de corrélation l'infrarouge et l'ultraviolet. Ces composés se caractérisent par la présence de substituants oxygénés en C-6, C- 16, C-20 et C-25 et dans certains cas C-24, C-28 et/ou C-29 du squelette stéroïdique. A l'exception du produit 61 qui est un glucoside, ces dérivés ont une chaîne glycosidique identique: le 6-sophorose (6-glucopyrano(l->2)-B-glucopyranose).
La structure du composé 51 a été confirmée par une hémi- synthèse de la partie stéroïdique de cette molécule au départ d'acétate de diosgénine 70a suivant un schéma comportant sept étapes (figure 20 page 73).
Les sécrétions défensives de Oreina cacaliae (sous-tribu
Chrysolinina), collectée près de Briançon, contiennent un
alcaloïde de type pyrrolizidine: le N-oxyde de sénéciphylline 108
qui a été identifié par comparaison de ses spectres RMN^H et
RMN^^C avec ceux décrits dans la littérature. Cette
identification a été confirmée par réduction de la fonction N-
oxyde et comparaison des propriétés spectrales et physiques du
produit réduit et de la sénéciphylline.
Zygogramma suturalis est une chrysomèle originaire du Canada appartenant à la sous-tribu Doryphorina. Ses sécrétions défensives sont constituées de dérivés d'acides aminés. En effet, nous en avons isolé la 6-éthanolamine la N-(y-glutamyl)- éthanolamine 109 ainsi qu'un acide aminé non protéinique, l'acide 2-amino-3(Z),5-hexadiénoïque 110. Ces composés ont été identifiés par leurs propriétés spectroscopiques (SM-FAB, RMN^H et 2D ^H-
"H).
Lilioceris lilii, parasite bien connu du lys et appartenant à la sous-famille Criocerinae possède des sécrétions défensives complexes. Le dérivé majeur, également de type acide aminé, contient de la phénylalanine. Etant donné son instabilité, sa structure n'a pu être entièrement déterminée.
L'étude de la biosynthèse du glucoside d'isoxazoline-5-one
14 et de son dérivé estérifié en position 6 du glucose par
l'acide 3-nitropropanoïque 15, caractéristiques des sous-tribus
Chrysomelina et Phyllodectina a été entreprise chez Chrysomela
tremulae. Nous avons montré, par des expériences d'incorporation
d'acide aspartique marqué uniformémént au ^^C, que ce dernier est
incorporé à la fois dans l'entité 3-nitropropanoate et dans
1'isoxazoline-5-one.
1. DEFENSE CHIMIQUE CHEZ LES INSECTES.
La survie d'une population animale ou végétale est étroitement liée aux possibilités qu'elle a de se reproduire, de s'approvisionner en énergie et de se défendre vis-à-vis des prédateurs, des compétiteurs et des parasites. Cette dernière condition est à l'origine de l'apparition chez de nombreuses espèces de modes de défense très diversifiés.
Les mécanismes de défense utilisés peuvent être passifs et opérer en l'absence du prédateur sans qu'il y ait danger immédiat d'attaque de ce dernier. Leur fonction est de diminuer la probabilité de rencontre entre le prédateur et sa proie. On inclut dans cette catégorie l'habitat dans des endroits abrités, le camouflage, 1'aposématisme (signaux caractéristiques avertissant le prédateur de la non comestibilité de l'animal) ou encore le mimétisme batésien (ressemblance d'un animal non protégé avec un individu aposématique d'une espèce protégée) [1].
La seconde catégorie comprend les mécanismes actifs qui sont déclenchés en présence du prédateur. Leur fonction est d'accroître les chances de survie de la proie lors d'une attaque et s'illustrent par des comportements aussi variés que le repli vers un abri, la fuite, la thanatose, la déviation de l'attaque vers une partie non vitale de l'animal, la défense agressive au moyen d'armes physiques ou chimiques [1].
Ces différents types de mécanismes défensifs se rencontrent chez les insectes qui les utilisent souvent sous forme combinée. Par rapport aux autres animaux terrestres, la défense chimique y est largement répandue et atteint probablement son plus haut degré de diversification. Aussi, de nombreuses études tant chimiques que biologiques ont été consacrées à ce sujet [2,3].
Parmi les substances chimiques utilisées par les insectes
comme composés défensifs, on distingue les toxines provenant de
glandes exocrines [4] de celles d'origine non glandulaire. Le
premier cas est illustré par les chrysomèles dont nous parlerons
ci-après. Dans la deuxième catégorie, citons par exemple les
coccinelles qui possèdent des alcaloïdes dans leur hémolymphe et
peuvent contrôler l'écoulement de ce fluide aux articulations des
pattes et des élytres par un mécanisme connu sous le nom de
saignée réflexe [5]. L'hémolymphe possède une action fortement
répulsive sur les fourmis et les cailles.
2. DEFENSE CHIMIQUE CHEZ LES CHRYSOMELIDAE.
Les Chrysomelidae constituent une des familles les plus importantes de l'ordre des Coleoptera. Elle compte près de 25.000 espèces réparties en 19 sous-familles et plus de 200 genres [6].
Ce sont des insectes majoritairement phytophages formant des agrégats denses sur leur plante-hôte et susceptibles de représenter de véritables fléaux pour les cultures. C'est le cas notamment du doryphore Leptinotarsa decemlineata. Ces agrégats constituent une source potentielle importante de nourriture pour des prédateurs insectivores. Il n'est donc pas étonnant que de nombreux modes de défense soient apparus chez ces insectes, parmi ceux-ci, l'utilisation de substances chimiques est très importante.
La présence de glandes de défense a été démontrée chez des larves et des adultes de certaines Chrysomelidae de la sous-famille Chrysomelinae [7] ainsi que chez des adultes d'espèces appartenant aux sous-familles suivantes : Criocerinae, Galerucinae et Alticinae [8].
2.1 Composés défensifs des larves
L'existence de glandes défensives à l'état larvaire n'est connue que pour certaines espèces de la sous-famille Chrysomelinae [8]. Les composés isolés de ces glandes de défense (tableau 1 p 5) sont soit des monoterpènes méthylcyclopentaniques (i à 6) [9], soit des dérivés aromatiques tels le salicyladéhyde 7, le benzaldéhyde 8, divers esters de B-phényléthyle (par exemple 9), la juglone 10 ou encore des composés à longue chaîne comme l'acétate d'octadécyle ü ou l'acétate de (Z)-ll éicosényle 12 [ 10 ].
Les larves de Chrysomelidae sont de petite taille et extrêmement
fragiles, la moindre blessure peut leur être fatale. Elles
représentent donc des proies faciles pour les fourmis. La
sécrétion de petites molécules volatiles crée autour de la larve
une "zone de répulsivité" permettant d'éviter tout contact avec
le prédateur. En effet, il a été démontré que ces monoterpènes et
le salicylaldéhyde sont des produits irritants et de puissants
répulsifs vis-à-vis des petits arthropodes [11]. Signalons que le
salicylaldéhyde provient de la transformation par l'insecte de la
salicine 45 contenue dans la plante-hôte [14].
OH O
Ci7 H35- CH2OAC
11CH3- ( CH2 )7 - CH = CH - (CH2>9- CH2 OA
c12
Tableau 1; sécrétions larvaires des Chrysomelinae.
Tribu Chrysomelini M S P B J
Sous-tribu Chrysomelina
Chrysomela populi +
Chrysomela tremulae +
Chrysomela saliceti + +
Chrysomela 20-punctata + +
Chrysomela scripta +
Chrysomela aenicollis Chrysomela interrupta Gastrolina depressa
Gastrophysa atrocyanea + +
+
+
Gastrophysa cyanea +
Gastrophysa viridula + Hydrothassa marginella +
Linaeidea aenea +
Phaedon brassicae +
Phaedon cochleariae + Plagiodera versicolora + Prasocuris phelladrii
Sous-tribu Phvllodectina Phratora vitellinae
+ + Phratora laticollis +
Phratora tibialis +
Phratora vulgatissima Sous-tribu Paroosina Paropsis atomaria
+
+ Chrysophtharta variicollis +
Chrysophtharta amaena +
M=monoterpènes méthylcyclopentaniques; S=salicyladéhyde;
P=esters aromatiques; B=benzaldéhyde; J=juglone.
2.2 Composés défensifs des adultes.
La présence de glandes défensives a été mise en évidence chez les adultes de nombreuses espèces de Chrysomelidae appartenant aux quatre sous-familles suivantes: Chrysomelinae, Criocerinae, Alticinae et Galerucinae [8]. Les glandes défensives sont alignées en plusieurs rangées sur le pronotum et les élytres. Elles communiquent avec l'extérieur par l'intermédiaire de pores (figure 1) [8]. Lorsque l'insecte est perturbé, la sécrétion s'écoule par ces pores et se répand sur la surface du pronotum ou bien s'accumule dans le sillon latéral des élytres
[7].
Figure 1: distribution des glandes défensives de Chrysomèle A: Chrysolina polita
B: Leptinotarsa decemlineata
chaque point noir symbolise une glande
(d'après [8]).
Seules des espèces de la sous-famille Chrysomelinae ont fait l'objet d'études chimiques approfondies qui ont permis d'isoler de nombreux composés nouveaux. Cette sous-famille comporte cinq tribus: Chrysomelini, Phaedonini, Phratorini, Timarchini et Entomoscellini. Toutes les espèces étudiées jusqu'à présent appartiennent à la tribu Chrysomelini. Celle-ci est divisée en six sous-tribus: Doryphorina, Chrysomelina, Phyllodectina, Chrysolinina, Gonioctenina et Paropsina. On remarque de grandes différences structurales entre les substances défensives d'espèces appartenant à des sous-tribus différentes alors qu'au sein d'une même sous-tribu les toxines dérivent d'un même squelette. La composition des sécrétions défensives pourrait constituer un critère taxonomique supplémentaire pour le biologiste [12]. Cependant, cette information doit être considérée avec prudence car dans certains cas la plante-hôte peut influencer la composition des sécrétions défensives.
Examinons à présent les composés défensifs caractérisant chacune des sous-tribus de la tribu Chrysomelini. Le tableau 2 page 15 récapitule la répartition des différents métabolites secondaires identifiés dans ces sécrétions.
2.2.1 Sous-tribu Doryphorina.
Les sécrétions défensives d'une seule espèce de cette sous-
tribu ont été étudiées à ce jour. Il s'agit du doryphore
Leptinotarsa decemlineata. Leur constituant majeur est le
dipeptide 13. constitué d'acide glutamique et d'un nouvel acide
aminé non protéinique 6,V-insaturé: l'acide 2-amino-3(Z),5-
hexadiènoïque. Ce composé est toxique pour la fourmi Myrmica
rubra à une concentration de lO”^
m[13].
2.2.2. Sous-tribus Chrysomelina et Phyllodectina.
Dix espèces de la sous-tribu Chrysomelina et trois de la sous-tribu Phyllodectina ont été étudiées [7]. Elles se caractérisent par la présence dans leurs glandes de défense de deux glucosides d'isoxazoline-5-one: la 2-(6-D-glucopyranosyl)- isoxazoline-5-one il et la 2-(6'-(3”-nitropropanoyl)-6-D- glucopyranosyl)-isoxazoline-5-one 15. Le dérivé i5, estérifié en position 6 du glucose par l'acide 3-nitropropanoïque, est fortement répulsif mais peu toxique pour les fourmis tandis que le composé 14 n'est ni toxique ni répulsif [14]. L'origine biogénétique de ces dérivés reste encore à préciser.
14 :R = H
1R — CO CH 2 CH
2NO
22.2.3. Sous-tribu Chrysolinina.
Les espèces appartenant à la sous-tribu Chrysolinina se caractérisent par la présence de mélanges complexes de cardénolides, aussi appelés glycosides cardiaques, dans leurs glandes de défense. Une vingtaine d'espèces ont été examinées dans notre laboratoire [15,16] et 21 cardénolides différents isolés (16 à 37). Ils sont constitués de six aglycones stéroïdiques ; la sarmentogénine 16, la périplogénine 17., la bipindogénine 18, la digitoxigénine 19, la 4^^-digitoxigénine 34.
et enfin 1'oléandrigénine 38. Cinq sucres ont été identifiés dans
les chaînes glycosidiques. Il s'agit de trois pentoses: le
ribose, le xylose et le lyxose et de deux hexoses: le glucose et
l'allose. Tous existent sous la forme pyranose. Il est à
remarquer qu'à l'exception du glucose, ces sucres sont rarement
rencontrés chez les métabolites secondaires.
A : xylose G : lyxose
HO OH
Les glycosides cardiaques sont des composés gui ont déjà été isolés de nombreuxs végétaux, dont les plus connus sont certainement la digitale pourpre Digitalis purpurea et le muguet Convallaria majalis [17], Ils sont utilisés en thérapeutique humaine depuis bien longtemps. Leur activité physiologique est liée à la faculté d'altérer les fonctions cardiovasculaires en provoquant une augmentation de la force de contraction du myocarde. Ce phénomène est connu sous le nom d'effet inotrope positif [18]. Ces composés ont un indice thérapeutique faible. En effet, leur toxicité qui se traduit par 1'apparititon d'arythmies, se manifeste à des concentrations proches de celles nécessaires pour obtenir un effet thérapeutique [19].
Actuellement, les cardénolides utilisés dans le traitement des insuffisances cardiaques sont toujours extraits de source végétale.
Les propriétés cardiotoniques et cardiotoxiques du B-D- xylopyranoside de sarmentogénine 20 isolé des sécrétions défensives de Chrysolina coerulans, ont été évaluées [20]. Elles sont légèrement supérieures à celles de la digoxine 39 et équivalentes à celles de la ouabaïne 40./ ce qui range ce cardénolide d'origine animale au niveau des cardénolides d'origine végétale les plus actifs.
40
La distribution des cardénolides dans le inonde vivant ne se limite pas à quelques familles de végétaux ou à la peau de certains crapauds. En effet, en plus des Chrysomèles de la sous- tribu Chrysolinina dont il est question dans ce paragraphe, de nombreux insectes contiennent des substances de ce type dans leur tissus [3], ce qui leur confère une protection contre leurs prédateurs. Mais contrairement aux Chrysomèles, tous les autres insectes possédant des cardénolides sont inféodés soit au stade larvaire uniquement soit aux stades larvaire et adulte à des végétaux toxiques contenant des glycosides cardiaques. Ils n'en assurent donc pas la biosynthèse mais les séquestrent à partir de leur plante-hôte.
Les Chrysolinina, quant à elles, vivent sur des plantes dépourvues de glycosides cardiaques [21]. Van Oycke et al. ont montré par des expériences d'incorporation de [4-^^C]-cholestérol et [1,2-^H,23-^^C]-cholestérol qu'elles biosynthétisent leurs cardénolides à partir du cholestérol [22]. Le schéma proposé est analogue à celui de la biogénèse des cardénolides chez les végétaux. Il implique la formation d'un intermédiaire à 21 atomes de carbone par coupure de la liaison entre les carbones 20 et 22, les deux atomes nécessaires à la formation de la buténolide provenant d'une unité acétate (figure 2).
Figure 2: schéma proposé pour la biosynthèse des cardénolides chez les Chrysolinina.
L'origine des sucres utilisés par les Chrysolinina pour constituer leurs chaînes glycosidiques n'est pas connue.
Cependant, des travaux préliminaires ont permis de montrer que
ces sucres sont différents de ceux présents dans les plantes-
hôtes [23].
En plus des cardénolides, les sécrétions défensives des espèces de la sous-tribu Chrysolinina contiennent de la 6- éthanolamine Ce composé n'est pas toxique et son rôle biologique n'est pas clairement établi. Cependant, ses propriétés tensioactives suggèrent qu'il pourrait accroître la solubilité des glycosides au sein de la glande [16] où des concentrations supérieures à 10“^ M peuvent être atteintes [24].
HO - CH2-CH2 - NH2 11
Cinq espèces de Chrysolinina: Chrysolina hyperici, C.varians, C.hrunsvicensis, C.geminata et C.quadrigemina sont inféodées à la même plante-hôte: le millepertuis Hypericum perforatum qui contient de l'hypéricine une quinone toxique pour les vertébrés herbivores [25]. Contrairement aux autres Chrysolinina, ces cinq espèces ne produisent pas de cardénolides.
De plus, elles ne séquestrent pas d'hypéricine dans leurs glandes de défense [24]. Les sécrétions défensives d'une seule de ces cinq espèces, C.hyperici, ont été étudiées. Deux glucosides polyoxygénés nouveaux 43 et 44 ont été isolés. Le composé 43. est répulsif à des concentrations de 10“^ M et toxique à 10“^ M pour la fourmi Myrmica rubra [26].
OH 0 OH
OH3 OH 3
42
44 : R = Ac
Enfin, les espèces du genre Oreina sont extrêmement
intéressantes. La composition des sécrétions défensives semble
varier d'une population à l'autre. Ainsi, chez Oreina
speciosissima, on a pu détecter la présence de cardénolides dans
certaines populations alors que d'autres en sont systématiquement
dépourvues. Il est plus que probable que l'influence de la
plante-hôte soit également responsable de ces variations.
Tableau 2: composés défensifs d'adultes de Chrysomelinae.
Tribu Chrysomelini C S E P L I
Sous-tribu Doryphorina
Leptinotarsa decemlineata + +
Sous-tribu Chrysolinina
Chrysolina americana ++ +
C.tanksi ++ +
C.Garnifex
-C.cerealis ++
C.coerulans ++ + +
C.diversipes ++
C.dydimata +
C.fastuosa ++ +
C.grossa ++ +
C.haemoptera ++
C.herbacea ++ +
C.polita ++ +
C.sanguinolenta ++
C.staphylaea ++
C.hyperici
—++ +
C.brunsvicensis
-C.geminata
-C.quadrigeminata —
C.varians
—Oreina speciosissima ++ +
O.tristis ++ +
O.gloriosa ++ +
Sous-tribu Chrysomelina
Chrysomela populi ++ ++
C.tremulae ++ ++
C.20-punctata ++ ++
C.saliceti ++ ++
Gastrophysa viridula ++ ++
G.cyanea ++ ++
Hydrothassa marginella ++
Pbaedon brassicae ++
Phaedonia circumcincta ++
Plagiodera versicolora ++
Sous-tribu Phvllodectina
Phratora vitellinae ++
P.laticollis ++
P.tibialis ++
C=cardénolides ;S=stéroïdes polyoxygénés;E=éthanolamine;
P=peptides;L=lipides;I=glucosides d'isoxazoline-5-one.
Les oeufs de Chrysomelidae sont généralement disposés en agrégats sur les feuilles de végétaux et donc fortement exposés aux prédateurs. Tout comme les larves et les adultes, les oeufs sont chimiquement protégés. La répartition des ' substances défensives trouvées dans les oeufs des espèces de la tribu Chrysomelini est présentée dans le tableau 3 page 17.
On a observé la présence de cardénolides dans les oeufs de Chrysolina coerulans et C.polita [15,21]. Chez Gastrophysa cyanea, on trouve d'importantes quantités d'acide oléique, composé répulsif pour les fourmis [27].
Les espèces qui utilisent les glucosides d'isoxazoline-5-one (14 et 15) à l'état adulte et du salicylaldéhyde 7 à l'état larvaire pour assurer leur protection stockent dans leurs oeufs ces glucosides ainsi que la salicine 45, qui provient de leur plante- hôte ( Salix et Populus ) [14]. La salicine protège aussi les larves juste après l'éclosion en étant transformée en salicylaldéhyde.
2.3 Composés défensifs des oeufs.
,0H
45
Tableau 3:composés défensifs des oeufs de Chrysomelinae.
Tribu Chrysomelini I S 0 c
Sous-tribu Chrvsomelina
Chrysomela populi + +
C.tremulae + +
C.saliceti + +
C.20-punctata + +
Gastrophysa viridula +
G.cyanea +
Plagiodera versicolora + Sous-tribu Phyllodectina
Phratora vitellinae + +
P.laticollis +
P.tibialis +
Sous-tribu Chrysolinina
Chrysolina poli ta +
C.coerulans +
I=glucosides d'isoxazoline-5-one;S=salicine;0=acide oléïque;
C=cardénolides.
Ce travail s'inscrit dans le cadre général de l'étude des systèmes de défense chimique des insectes menée depuis plusieurs années par le laboratoire de chimie bio-organique en collaboration avec le professeur J.M.Pasteels du laboratoire de biologie animale et cellulaire. Il vise plus particulièrement à mieux connaître ces mécanismes de défense d'une part et d'autre part à apporter de nouveaux critères pour la classification des Chrysomelidae.
A cet effet, nous nous sommes proposés de poursuivre l'étude stucturale, biosynthétique et synthétique des substances composant les sécrétions défensives de Chrysomelidae adultes.
Ainsi que nous l'avons mentionné dans l'introduction, plusieurs Chrysomelidae adultes (sous-famille Chrysomelinae) appartenant à la sous-tribu Chrysolinina se distinguent de la majorité des autres espèces de cette sous-tribu en ne produisant pas de cardénolides dans leurs sécrétions défensives. Nous étudierons donc la composition chimique des sécrétions de trois espèces de Chrysolinina inféodées à Hypericum perforatum:
Chrysolina varians,C.brunsvicensis et C.geminata ainsi que celle d'une population briançonnaise d'Oreina cacaliae.
D'autre part, nous analyserons les constituants des sécrétions glandulaires d'une espèce de la sous-tribu Doryphorina
(sous-famille Chrysomelinae): Zygogramma suturalis.
Enfin, nous étudierons la composition des sécrétions défensives de Lilioceris lilii, espèce appartenant à une sous- famille non encore étudiée, la sous-famille Criocerinae.
Afin de préciser l'origine biogénétique des glucosides
d'isoxazoline-5-one (14. et 15) caractéristiques des espèces des
sous-tribus Chrysomelina et Phyllodectina, nous réaliserons des
expériences d'incorporation d'un précurseur radioactif chez des
adultes de Chrysomela tremulae.
1. ETUDE DES SECRETIONS DEFENSIVES DES ESPECES DE LÀ SOUS-TRIBU CHRYSOLININÀ INFEODEES À Hypericuïïi perforatum.
1.1. Introduction.
Les sécrétions défensives de trois espèces inféodées à Hypericum perforatum: Chrysolina varians, C.brunsvicensis et C.geminata ont été récoltées par le professeur J.M.Pasteels sur de petits papiers filtres. Ceux-ci ont été extraits exhaustivement par le mélange dichlorométhane-méthanol 1:1 et ensuite par de l'eau. L'évaporation des solvants d'extraction fournit les sécrétions brutes, soit 38 mg de matière pour C .varians, 15 mg pour C .brunsvicensis et 25 mg pour C.geminata.
Ces quantités correspondent respectivement à 2500, 600 et 700 sécrétions. L'analyse de ces extraits bruts par chromatographie sur couche mince de silice (ccm; éluant: CH2CI2/CH3OH 8/2) indique que chacun d'eux est composé d'au moins deux produits majeurs. La combinaison de différentes techniques chromatographiques (détaillées dans la partie expérimentale) telles que la chromatographie en mode éclair sur silice [28] ou l'utilisation de colonnes LOBAR a permis d'isoler de ces trois espèces six glycosides stéroïdiques polyoxygénés de structure originale. Ces composés ont été numérotés en fonction de leur polarité décroissante en ccm sur silice (éluant: CH2CI2/CH3OH 8/2), (tableau 4).
Tableau 4: numérotation et masse des composés isolés.
C.varians C .brunsvicensis C.geminata CVl 1,5 mg
CV2 18,0 mg
CBl 2,0 mg CB2 1,5 mg
CGI 7,0 mg
CG2 6,0 mg
Comme le montre le tableau 4, ces produits sont obtenus en faibles quantités. Leur structure sera déterminée principalement par l'utilisation de techniques spectroscopiques comme la spectrométrie de masse FAB (Fast Atom Bombardment), la résonance magnétique nucléaire du proton et du carbone. Les informations structurales fournies par ces différentes méthodes seront résumées dans les paragraphes suivants.
1.1.1. Squelettes stéroidiques.
Ce chapitre étant consacré à la détermination de structure de stéroïdes défensifs de chrysomèles de la sous-tribu Chrysolinina, il paraît opportun à ce stade de présenter les différents squelettes stéroidiques, leur nom trivial et la numérotation adoptée pour les atomes de carbone.
Les stéroïdes sont des composés dérivés du système tétracyclique perhydrocyclopentanophénantrène. Les quatre cycles sont désignés par les lettres A, B, C, et D. Dans la majorité des stéroïdes naturels, les jonctions cycliques B,C et C,D sont trans tandis que la jonction cyclique A, B peut soit être cis, soit trans donnant naissance à deux séries: la série 5a (jonction A,B trans) et la série 56 (jonction A,B cis). Les principaux squelettes de base diffèrent par la structure de la chaîne latérale en position 17. Leur structure et leur nom sont repris à
la figure 3. '
R
Figure 3 : noms et numérotation des principaux squelettes
stéroïdiques.
1.1.2. Spectrométrie de masse FAB f29.30.311.
L'analyse des composés organiques par spectrométrie de masse
"classique” nécessite leur volatilisation dans la source d'un spectromètre où règne un vide de 10"® à 10"^ torr (impact électronique) ou 10"^ à 1 torr (ionisation chimique). Pour certaines substances non volatiles, l'apport thermique créé pour vaporiser l'échantillon provoque des transformations pyrolytiques qui ne permettent pas d'identifier la molécule sous sa forme originale. La faible volatilité de ces composés provient soit de l'existence d'interactions intermoléculaires telles que les liaisons hydrogène soit d'une masse moléculaire élevée et bien souvent de ces deux propriétés réunies. Jusqu'il y a peu,l' étude par spectrométrie de masse de ce type de substance n'était possible que par la formation de dérivés volatils (acétates, éthers méthyliques ou éthers de triméthylsilyle). Cependant, ces transformations chimiques ne sont pas sans risque pour l'intégrité moléculaire et d'autre part l'introduction de tels groupements provoque un accroissement important de la masse et déplace les ions moléculaires dans des zones de masse moins facilement accessibles pour les spectromètres. Aussi la recherche de techniques d'analyse directe des substances volatiles fait l'objet de nombreux travaux. En effet, cette extension du domaine d'utilisation permet d'employer la spectrométrie de masse dans l'analyse de molécules d'intérêt biologique (peptides, oligonucléotides, glycosides, divers types de médicaments et de drogues). De plus, les méthodes d'analyse ainsi mises au point peuvent se révéler applicables dans le couplage -chromatographie liquide-spectrométrie de masse. C'est ainsi que ces dernières années ont vu le développement de nouvelles techniques d'ionisation telles que la désorption par effet de champ (FD), la désorption suivie d'ionisation chimique (D/CI), la désorption sous l'effet des produits de fission du et l'ionisation par impact d'ions ou d'atomes accélérés d'énergie voisine du keV
(SIMS et FAB).
En spectrométrie de masse FAB, l'échantillon est dissous ou dispersé dans une matrice solide (en général du glycérol) et bombardé par un faisceau d'atomes rapides d'argon ou de xénon dont l'énergie est comprise entre 6 et 9 keV. L'emploi de la matrice solide est indispensable pour observer la désorption régulière et intense des ions. On collecte successivement les ions positifs et négatifs. Les informations concernant la masse moléculaire sont obtenues à partir des ions pseudomoléculaires (M+H)'*" en mode positif et en mode négatif. Ces ions sont formés par réaction de transfert de protons soit entre deux molécules de l'échantillon (éq.l) soit entre une molécule de l'échantillon et une molécule de glycérol (éq.2 et 3). Une troisième possibilité est l'ionisation par des ions primaires formés au sein de la matrice et agissant à la manière d'un gaz réactionnel en ionisation chimique (éq. 4 et 5).
M... . .M ---> (M+H)+ + (M-H)- éq. 1 M... . .G ---> (M+H)+ + (G-H)- éq. 2 M... . .G ---> (M-H)- + (G+H)+ éq. 3 (G+H)+. . .M ---> G + (M+H)+ éq. 4 (G-H)-. . .M ---> G + (M-H)- éq. 5
M=^échantillon; G==glycérol
Souvent, des oligomères de la matrice sont désorbés avec les ions
de l'échantillon. On observe alors des pics à m/z =
(nx92)+l en mode positif et (Gj^-H)“ à m/z =(nx92)-l en mode
négatif, ce qui est gênant lorsqu'ils coïncident avec des ions de
l'échantillon à analyser.
La méthode FAB, initialement utilisée dans l'analyse des polypeptides et des protéines a été récemment appliqué à l'étude structurale des glycosides cardiaques [32]. Comme le montre l'exemple du 6-D-xylopyrano-(l->4)-2',3'-di-0-acétyl-6-D- allopyranoside de digitoxygénine 20 (figure 4) [16], le mode négatif est très efficace pour déterminer la masse moléculaire du composé, l'ion pseudomoléculaire (M-H)” étant généralement le pic de base du spectre, ainsi que la séquence des liens glycosidiques (fragments (M-S2)“/(M-S2-S2)“). Le mode positif fournit quant à lui des informations sur la structure du sucre terminal, de la chaîne glycosidique et de l'aglycone par l'intermédiaire des fragments (S2)''', (S3^+S2)''’ et (M+2H-S2~S]
l)^ respectivement.
Figure 4: principaux modes de fragmentation observés en
SM-FAB ( modes positif et négatif ).
1.1.3. Résonance magnétique nucléaire.
Les stéroïdes présentent une série de signaux caractéristiques en RMN Il s'agit des singulets des méthyles angulaires 18 et 19 dont on peut calculer le déplacement chimique par application de la méthode de Zurcher, les incréments étant connus pour un nombre important de substituants [33]. Les déplacements chimiques et les multiplicités des groupements méthyles de la chaîne latérale (21, 26 , 27 et éventuellement 29) permettent de préciser la nature des substituants sur les carbones 20, 25 et 28. L'allure du proton 3a est caractéristique de la jonction entre les cycles A et B. En effet, dans le cas d'une jonction cyclique A,B cis, celui-ci est équatorial, il ne subit donc que des constantes de couplage de petite dimension (2 à 4 Hz) et apparaît sous la forme d'un singulet élargi. En revanche, pour une jonction cyclique A,B trans, ce même proton est axial et apparaît comme un multiplet dont la largeur à mi- hauteur avoisine les 25 Hz [34].
La RMN ^H est également une source importante de
renseignements concernant la structure des sucres. Cependant,la
formation de dérivés peracétylés est dans de nombreux cas
indispensable, car le déblindage subi par les protons en a des
groupements acétates permet de distinguer des signaux qui sont
superposés dans les spectres des produits naturels. Remarquons
que ces signaux ne peuvent être interprétés que si la
conformation préférentielle du sucre dans le solvant utilisé est
connue.
1.2. Détermination de structure des composés défensifs de
Chrysolina varians. C.aeminata et C.brunsvicensis ni?].
1.2.1. Structure de CV2.
Les spectres de masse de CV2 présentent des ions pseudomoléculaires (M+H)''' à m/z=815 en FAB+ et à m/z=813 en FAB-, compatibles avec la formule globale C42H55O26. La présence de fragments correspondant à deux pertes successives de 162 unités de masse en mode positif (pics à*m/z=653 et 491) et l^examen des spectres RMN (tableau 15 page 52) et RMN •
(tableau 17 page 54) suggère qu'il s'agit d'un diglycoside stéroïdique polyoxygéné dérivé du cholestane portant une fonction acétate et dont les sucres sont des hexoses.
L'acétylation par le mélange anhydride acétique/pyridine conduit à un octoacétate CV2a dont le spectre de masse relevé en impact électronique montre un fragment à 619 daltons correspondant à une chaîne dihexose heptaacétylée ainsi que la fragmentation caractéristique d'un hexose tétraacétylé terminal
(pics à m/z=331,289,271,229,211 et 169) [35].
La nature des sucres, soit deux unités de 6-glucose sous la forme pyranose, est déduite du spectre RMN du dérivé acétylé CV2a relevé dans le benzène hexadeutérié (tableau 16 page 53).
Tous les signaux compris entre 53,2 et 55,7 ont pu être attribués
de manière non équivoque à l'aide d'un spectre de corrélation
proton-proton à deux dimensions (figure 5). Les constantes de
couplage des deux protons anomères (J=7,5 Hz) sont
caractéristiques de glucoses de configuration 6.
Figure 5; spectre RMN 2D I
r-^H (63,2-5,7) de CV2a (CeDe).
La présence de glucose dans CV2 est confirmée après hydrolyse acide par le réactif de Kiliani [36], neutralisation de la phase aqueuse par percolation sur résine échangeuse d'ions base faible (Amberlite IR-45), silylation (chlorure de triméthylsilane / hexaméthyldisilazane / pyridine) et injection mixte en chromatographie gazeuse avec un échantillon authentique de glucose silylé (colonne OVl, 165°C isotherme).
Le lien interglycosidique est placé entre le carbone 1” du glucose terminal et le carbone 2' du glucose portant le stéroïde sur base du déplacement chimique du proton 2' de CV2a qui est caractéristique d'une position non acétylée (63,75;dd 7,5 et 9,7 Hz;lH). La présence de ce 6-glucopyrano-(l->2)-6-glucopyranoside (6-sophorose) est encore confirmée par comparaison des déplacements chimiques des atomes de carbone de la partie glycosidique de CV2 avec ceux mentionnés dans la littérature pour le B-sophorose 46 (tableau 5) [38]. La différence observée entre les glissements chimiques du carbone 1' de CV2 et du B-sophorose s'expliquent par le fait que CV2 est un glycoside tandis que le B-sophorose est un sucre réducteur. Les incréments de glycosidation pour le B-sophorose ne sont pas décrits dans la littérature . Cependant, nous avons observé sur des molécules analogues que la glycosidation influence essentiellement le déplacement chimique du carbone 1' qui subit un déblindage d'environ 7 ppm. Les déplacements chimiques des autres carbones sont peu influencés [39,40].
46
Tableau 5: comparaison des déplacements chimiques en RMN de la partie glycosidique de CV2 et du 6-sophorose 46 [38].
carbone CV2
CD3OD
B-sophorose D2O
1' 101,7 95,1
2' 83,5 83,5
3' 76,5 76,0
4' 71,6 70,0
5' 78,4 76,9
6' 62,8 61,0
l” 105,5 103,9
2” 76,2 74,2
3” 76,5 76,2
4" 71,5 70,1
5" 77,8 76,6
6” 62,8 61,2
Les quantités de produits étant trop faibles pour mesurer le pouvoir rotatoire des sucres issus de l'hydrolyse, la configuration absolue sera déduite de la règle de Klyne [41].
Cette règle empirique, établie pour des glycosides stéroïdiques,
stipule que si le sucre est de configuration anomérique B il
appartient à la série D et vice versa tandis que s'il est de
configuration anomérique a il appartient à la série L et
inversément. Les deux glucoses de CV2 sont donc de configuration
absolue D.
Compte tenu des petites quantités de matière disponible, la structure de l'aglycone a été déterminée essentiellement par l'utilisation de méthodes spectroscopiques.
On observe dans le spectre de masse FAB+ un ion fragment à m/z=491 correspondant à la perte de la chaîne glycosidique et compatible avec une masse de 490 daltons et une formule empirique
^29^46^6 pour l'aglycone. Elle comporte donc sept non saturations dont quatre sont justifiées par le système tétracyclique du stéroïde. D'après le spectre RMN (6213,3 et 6172,5), le spectre RMN (62,0;s;3H) et le spectre infrarouge (
doh*3350 cm“^;
i;
q_
q:1730 et 1705 cm“^;
pq_
q:1245 cm“^), la molécule contient deux fonctions carbonyles dont une est un acétate, l'autre étant une cétone. Il reste alors à préciser la nature d'une non saturation et de deux atomes d'oxygène.
La comparaison des glissements chimiques des carbones 1 à 12 de
CV2 avec ceux des carbones correspondants du 3B-hydroxy-5û!-6-oxo-
cholestane ^ [42] auquel sont ajoutés les incréments d'un 3B-0-
glucoside [40] (tableau 6) suggère la présence d'une telle
fonctionnalisation dans les cycles À et B du stéroïde. Le spectre
de dichroïsme circulaire de CV2 (287 nm; 4e-0,78;MeOH) est
également caractéristique d'un squelette 5a-6-oxo [43].
Tableau 6: comparaison des 6 en RMN de CV2 (C-1 à C-12) avec celles du 36-OH-5a-6-oxo-cholestane 4^ auquel sont ajoutés les incréments d'un 3B-0-glucoside [40,42].
carbone CV2
CD3OD
modèle CDCI3
1 37,7 36,6
2 30,0 28,3
3 77,9 77,9
4 27,3 26,1
5 57,7 56,7
6 213,4 210,6
7 47,2 46,6
8 38,4 37,9
9 55,0 53,9
10 42,2 40,9
11 22,2 21,5
12 40,7 39,5
Par ailleurs, on observe dans le spectre RMN de CV2 un double triplet à 5 5,46 (dt 4,2 & 6,7 Hz;lH) dont le déplacement chimique est compatible avec celui d'un proton au pied d'un groupement acétate. La position 16 et la stéréochimie 6 pour la fonction acétate sont proposées sur base de la comparaison des glissements chimiques des carbones 13 à 17 de CV2 avec ceux des mêmes carbones du guggulstérol M qui possède un acétate 166 [44]
(tableau 7). De plus, le déplacement chimique du méthyle 18 en RMN (51,06 ; s ;3H) est entièrement compatible avec cette hypothèse [33].
OH
48
Tableau 7: comparaison des 6 en RMN de CV2 (C-13 à C-17) avec celles du guggulstérol 48 [44].
carbone CV2
CD3OD
48 CDCI3
13 44,4 43,4
14 56,1 54,0
15 35,2 35,0
16 79,7 77,6
17 65,0 60,4
L'ensemble de ces éléments de structure justifie six des sept non saturations imposées par la formule brute. La chaîne latérale doit contenir la septième non saturation et deux atomes d'oxygène. Le spectre infrarouge de CV2a montre la présence d'une bande OH à 3 350 cm“^ attribuable à un ou deux alcools nécessairement tertiaires puisque l'acétylation de CV2 conduit à un dérivé octoacétate (CV2a), où seuls les sept hydroxyles du sophorose ont été acétylés.
Dans le but de déterminer le nombre d'alcools tertiaires, le dérivé acétylé CV2a est traité dans un tube RMN par un excès d'isocyanate de trichloroacétyle dans le benzène hexadeutérié [45]. Le carbamate obtenu ^ montre un signal à 69,79 correspondant à un seul proton du type -OCO-NH-CO-CCI3. Ceci indique la présence d'un seul alcool tertiaire dans CV2. Le dernier atome d'oxygène est donc nécessairement impliqué dans un lien éther. Les deux atomes d'oxygène sont placés en position 20 et 25 sur base du déplacement chimique des singulets attribuables aux méthyles 21 (51,31; s ;3H), 26 (51,14;s;3H) et 27 (1,16 ; s ;3H).
De plus la fonction éther doit être quaternaire-tertiaire car on
observe, dans le spectre RMN de CV2a, un seul proton au pied
d'éther à 53,55 dont la multiplicité et la valeur des constantes
de couplage (dd 6,4 et 7,4 Hz; IH) suggèrent qu'il est localisé
sur un cycle tétrahydrofuranique. A ce stade deux hypothèses sont
possibles (A et B, figure 6). Le choix en faveur de l'hypothèse
A est fait sur base des arguments suivants:
-la comparaison des valeurs RMN de CV2 avec celles de composés contenant un tel cycle tétrahydrofuranique comme l'oxydé de linalyle ^ [46] et le dictyol H ^ [47] (figure 7) .
-la présence d'un ion intense à m/z=431 (perte de 59 daltons à partir de l'ion à m/z=490) en spectrométrie de masse en impact électronique. Une mesure de masse précise a été réalisée sur l'ion à m/z=431 (C25H3g05,* masse calculée:
431,2799; masse mesurée: 431,2797), confirmant ainsi la perte de C3H7O par rupture de la liaison entre les carbones 24 et 25.
-la mise en évidence d'effets nOe entre les méthyles 26 et 27 et le proton au pied de la fonction éther (H-24) d'une part et entre ce même proton 24 et le méthyle 21 d'autre part. Cette dernière observation implique aussi que le méthyle 21 et le proton 24 sont cis l'un par rapport à l'autre (figure 8).
OH
B
Figure 6: hypothèses de structure pour la chaîne latérale de
CV2.
Figure 7: 6 en RMN des carbones de la chaîne latérale de CV2 et de molécules modèles.
Figure 8; effets nOe dans la chaîne latérale de CV2.
Si l'on fait l'hypothèse que le méthyle 21 est a comme dans
la majorité des stéroïdes naturels [48], on peut proposer pour
CV2 la stucture 51.
RO
R = Ac : R' = H
R =
Ac : R' = CO-NH-CO-CCI 3
RO
1.2.2. Structure de CVl.
Le spectre de masse FAB- présente un ion pseudomoléculaire (M-H)“ à m/z=755 compatible avec la formule globale C3gHg403^4 pour CVl. Deux pertes successives de 162 daltons (fragments à m/z=593 et 431) ainsi que l'examen du spectre RMN (tableau 15 page 52) suggèrent que CVl est un dihexoside stéroïdique polyoxygéné dérivé du cholestane. L'aglycone possède une masse de 432 daltons correspondant à la formule brute C27H44O4, soit six non saturations.
Dans le spectre RMN ^H, l'allure de singulet élargi du
signal à 64,07 attribuable au proton 3 de l'aglycone suggère que
la jonction entre les cycles A et B est cis. Des expériences de
double irradiation ont permis de localiser le proton 5 et le
proton 4 équatorial (tableau 8). La mise en évidence d'un effet
nOe entre le méthyle 19 et le proton 5 confirme la jonction
cyclique A,B cis.
Tableau 8: expériences de double irradiation sur CVl.
proton irradié proton observé conséquences H-5 62,55;dd H-4e 62,24;dd simplification 3,75 & 12,5 Hz 3,75 & 10 Hz
H-4e 52,24;dd H-5 62,55;dd d 12,5 Hz 3,75 & 10 Hz 3,75 & 12,5 Hz
H-3 64,07;s.él. simplification
Les spectres infrarouge et ultraviolet présentent les bandes caractéristiques des ecdysones, c'est-à-dire des stéroïdes comportant un système 6-oxo- ( IR: '^c=0* 1635 cm“l, UV : Amax“2'^^ nm,e=7000, MeOH) . La présence d'un singulet élargi d'aire IH à 65,64, attribuable au proton 7, confirme l'existence d'un tel groupement [49].
La chaîne latérale comprend deux fonctions alcool tertiaire qui sont placées en position 20 et 25 en raison des déplacements chimiques des singulets attribuables au méthyle 21 (6l,28;s;3H) [26] et aux méthyles 26 et 27 (61,18;s;6H) [50], La configuration 20(S) est proposée par comparaison du glissement chimique du méthyle 21 de CVl avec ceux décrits pour le 36-acétoxy-20(R)- hydroxy-cholestérol M et le 3fi-acétoxy-20(S)-hydroxy-cholestérol 55 (tableau 9)[51].
OH OH
Tableau 9; comparaison des glissements chimiques du méthyle 21 du 3B-acétoxy-20(R) ^ et 20(S)-hydroxy-cholestérol ^ et CVl.
composé 62I-CH3
M 1,13
55 1,28
CVl 1,28
Enfin, la comparaison du spectre RMN de la partie glycosidique de la molécule avec celui du composé CV2 montre que la chaîne glycosidique est du type 6-glucopyrano-(l->2)-B- glucopyranoside (B-sophorose). La configuration absolue D des deux unités glucose est proposée sur base de la règle de Klyne
[41]. En conséquence, nous proposons la structure ^ pour CVl.
Remarquons que la jonction entre les cycles A et B influence les glissements chimiques des deux protons anomères du sophorose.
En effet, dans le cas d'une jonction A,B trans, H-1' et H-1"
apparaissent respectivement à 64,52 et 64,56 alors que dans le cas d'une jonction A,B cis, ces mêmes protons apparaissent à 64,47 et 64,68.
OH
1.2.3. Structure de CGI.
Les spectres de masse FAB de CGI présentent les ions pseudomoléculaires (M+H)'*' à m/z=857 en mode positif et à m/z=855 en mode négatif, compatibles avec la formule globale
^43^68^17* fragments à 533 daltons (M+H-2X162 ) "'■ et à 515 daltons (M+H-2X162-18)‘'‘ ainsi que l'examen des spectres RMN
(tableau 15 page 52) et RMN (tableau 17 page 54) suggèrent qu'il s'agit d'un diglycoside stéroïdique polyoxygéné portant une fonction acétate sur le stéroïde et dont les sucres sont des hexoses.
La partie glycosidique est une nouvelle fois identifiée au 6-sophorose (6-glucopyrano-(l->2)-B-glucopyranoside) par comparaison des valeurs RMN de CGI avec celles décrites pour le B-sophorose 46 (tableau 10) [38]. La configuration absolue D des deux sucres est toujours proposée sur base de la règle de Klyne [41].
Tableau 10; comparaison des S en RMN ^^C de la partie glycosidique CGI et du B-sophorose A6 [38].
carbone CGI
CD3OD
B-sophorose D2O
1' 101,7 95,1
2' 81,9 83,5
3' 78,5 76,0
4' 72,0 70,0
5' 78,5 76,9
6' 63,2 61,0
1" 105,1 103,9
2” 74,2 74,2
3" 78,0 76,2
4" 71,7 70,1
5” 78,1 76,6
6” 63,0 61,2
On observe dans le spectre de masse FAB+ un fragment à m/z=533 correspondant à la perte de la chaîne glycosidique et compatible avec une masse de 532 daltons et une formule empirique C31H48O7 (8 non saturations) pour l'aglycone, suggérant qu'il s'agit d'un dérivé du stigmastane portant un groupement acétate
(62,07;s;3H).
La comparaison des glissements chimiques des carbones 1 à 12 de CGI avec ceux des mêmes carbones du 36-hydroxy-5B-6-oxo- cholestane ^ [42] auxquels sont ajoutés les incréments d'un 36- 0-glucoside [40] (tableau 11) suggère la présence d'une telle fonctionnalisation dans les cycles A et B. Dans le spectre RMN^H, l'allure de singulet élargi du signal à 64,07 attribuable au proton 3 de l'aglycone est également compatible avec la jonction cyclique A,B cis. Cette dernière est définitivement prouvée par la mise en évidence d'un effet nOe entre le méthyle 19
(60,87;s;3H) et le proton 5 (62,56;dd 4 et 12 Hz;lH).
Tableau 11; comparaison des <5 en RMN de CGI (C-1 à C-12) avec celles du 36-OH-56-6-oxo-cholestane auxquels sont ajoutés les incréments d'un 3B-0-glucoside [40,42].
carbone CGI
CD3OD
modèle CDCI3
1 30,7 29,8
2 26,8 25,6
3 76,5 75,3
4 30,2 28,5
5 55,9 54,2
6 218,4
-7 39,2 39,9
8 36,1 35,4
9 43,5 42,3
10 37,4 38,0
11 22,2 21,5
12 40,8 39,9
Le glissement chimique du méthyle 18 (51,11 ; s ;3H), la présence d'un double triplet à 55,39 (dd 4 et 6,5 Hz;lH) et la concordance des spectres RMN de CGI (C-13 à C-17) et du guggulstérol £8 [44] (tableau 12) permettent de placer l'acétate en position 16, avec la stéréochimie B, comme dans le cas du composé CV2 56.
Tableau 12: comparaison des 5 en RMN ^^C de CGI (C-13 à C- 17) avec celles du guggulstérol M [44].
carbone CGI
CD3OD
48 CDCI3
13 43,3 43,4
14 56,1 54,0
15 35,6 35,0
16 77,9 77,6
17 63,0 60,4
Six des huit non saturations de l'aglycone sont ainsi justifiées. Il reste à déterminer la structure de la chaîne latérale qui doit nécessairement contenir deux non saturations et trois atomes d'oxygène. Le glissement chimique du méthyle 21 (5l,33;s;3H) est caractéristique de la présence d'une fonction alcool tertiaire en C-20, de configuration S [51]. Les deux derniers atomes d'oxygène appartiennent à une F-lactone ( IR:
^C=0’ 1760 cm~l;RMN <S178.7]. Ceci justifie aussi les deux non saturations restantes. La présence d'une F-lactone entre les carbones 25 et 29 est confirmée par comparaison des spectres RMN et l^C (tableau 13) de CGI avec ceux de 1'homoterpénylméthylcétone ^ préparée par oxydation de l'a- terpinéol M selon la méthode de Lemieux et von Rudloff [52]. Dès lors, nous proposons pour CGI la structure 60., la configuration en C-24 n'est pas déterminée.
58 59
Tableau 13: comparaison des S en RMN de CGl(C-23 à C-29) et de 1'homoterpénylméthylcétone 59.
carbone CGI CD3OD
carbone 59 CD3OD
23 24,2 1' 23,3
24 45,0 4 45,2
25 88,9 5 86,6
26 22,2 6 21,9
27 28,0 7 27,4
28 41,2 3 41,8
29 178,7 2 175,0
HO
OH
