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Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository
Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:
Grosfils, K. (1997). Etude de la fonction acinaire pancréatique à l'aide d'agents pharmacologiques (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté de Pharmacie, Bruxelles.
Disponible à / Available at permalink : https://dipot.ulb.ac.be/dspace/bitstream/2013/212129/1/acc58785-f2e1-4787-b6b9-79f30df711de.txt
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B.PAH.
INSTITUT DE PHARMACIE UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES FACULTE DE MEDECINE ET DE PHARMACIE
Laboratoire de Biochimie Générale et Humaine Professeur J.P. DEHAYE
ETUDE DE LA FONCTION ACINAIRE PANCREATIQUE A L’AIDE D’AGENTS PHARMACOLOGIQUES
Katrina GROSFILS
Thèse présentée en vue de l’obtention du grade de Docteur en Sciences Pharmaceutiques
1997
UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES FACULTE DE MEDECINE ET DE PHARMACIE
INSTITUT DE PHARMACIE
Laboratoire de Biochimie Générale et Humaine Professeur J.P. DEHAYE
ETUDE DE LA FONCTION ACINAIRE PANCREATIQUE A L’AIDE D’AGENTS PHARMACOLOGIQUES
Katrina GROSFILS
Thèse présentée en vue de l’obtention du grade de Docteur en Sciences Pharmaceutiques
1997
INSTITUT DE PHARMACIE UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES FACULTE DE MEDECINE ET DE PHARMACIE
Laboratoire de Biochimie Générale et Humaine Professeur J.P. DEHAYE
ETUDE DE LA FONCTION ACINAIRE PANCREATIQUE A L’AIDE D’AGENTS PHARMACOLOGIQUES
Katrina GROSFILS
Thèse présentée en vue de l’obtention du grade de Docteur en Sciences Pharmaceutiques
1997
REMERCIEMENTS
Je tiens à exprimer ma profonde gratitude à Monsieur le Professeur J.P. Dehaye, chef du service de Biochimie Générale et Humaine, pour sa précieuse et indispensable contribution à l'accomplissement de ce travail.
Malgré des débuts techniquement difficiles et dignes de l'époque mésolithique, son enthousiasme coimiunicatif, sa bonne humeur, sa volonté et ses formidables compétences scientifiques ont permis de franchir les âges afin d'atteindre le 21’^ siècle et permettre l'accomplissement de cette thèse. Qu'il trouve ici l'expression de mes sincères remerciements pour son soutien et son enthousiasme.
Je tiens à remercier mon "sponsor" principal. mon cher père;
Monsieur Jacques Grosfils, pour son soutien constant, sa générosité, et sans qui la rédaction de cette thèse n'aurait pas été possible.
Je voudrais remercier mes collègues et membres du service de Biochimie Générale et Humaine ainsi que tous mes collègues de l'Institut de Pharmacie pour leur bonne humeur et leur soutien tout au long de ce travail.
Je remercie Paul-Olivier Dehaye pour le temps qu'il a passé à la réalisation des beaux modèles présentés dans ce travail.
Je remercie le Professeur J. Nève ainsi que les membres du service de Chimie Pharmaceutique Organique de l'Institut de Pharmacie pour m'avoir permis une utilisation prolongée de leur spectrophotomètre. Je remercie le Fonds National de la Recherche Scientifique, le Ministère de la Communauté Française de Belgique et la Société Belge des sciences Pharmaceutiques pour les bourses qu’ils ont bien voulu m’accorder au cours de mon doctorat afin de me permettre de participer à des réunions scientifiques et je remercie la firme Sopar Pharma pour le généreux don du compteur à scintillation Minibeta.
Je remercie tous les membres du corps académique et le
personnel technique, anciens ou actuels, de l’Institut de Pharmacie de
l’U.L.B. pour l’aide qu’ils ont pu m’apporter au cours de ce travail.
Qu’11 me soit Ici permis de remercier mon cher mari pour son
soutien attentif, sa patience et son dévouement, mes parents et mes soeurs,
mon grand-père et ma tante en Norvège et mes nombreux amis qui ont toujours
su trouver les mots justes pour m’encourager et me soutenir tout au long de
ce travail.
TABLE DES MATIERES
Chapitre 1: Introduction générale 1
1. Organisation du pancréas 1
1.1. La cellule acineuse 1
1.2. Le système ductal 2
1.3. Organisation de la circulation sanguine au sein du pancréas 3
1.4. Innervation du pancréas exocrine 3
2. Modulateurs de la sécrétion du pancréas exocrine 4
3. Les récepteurs membranaires 5
3.1. Principaux récepteurs retrouvés sur les acini pancréatiques 7
3.1.1. Les récepteurs cholinergiques 7
3.1.2. Les récepteurs à la cholécystokinine 8
3.1.3. Les récepteurs à la bombésine 12
4. Les protéines G 14
4.1. Définition et classement 14
4.2. Mode de fonctionnement des protéines G 15
4.3. Fonctions cellulaires régulées par les protéines G 17
5. Les effecteurs enzymatiques 20
5.1. L’adénylate cyclase 20
5.2. La phospholipase C 21
5.3. La phospholipase Aj 32
5.4. La phospholipase D 35
5.5. La guanylate cyclase 37
5.6. Les canaux ioniques 37
6 . Conclusion 38
But du travail 41
Chapitre 2: Matériel et Méthodes ^3
1. Matériel 43
1.1. Animaux 43
1.2. Produits 43
2. Méthodes 44
2.1. Préparation des acini 44
2.2. Dosage de l’amylase 48
2.3. Mesure de la libération de la lacticodéshydrogénase 51
2.4. Mesure du calcium intracellulaire 52
2.5. Dosage de l’inositol 1,4,5-trisphosphate 57
2.6. Etude de la fixation de la N-méthyl-pH]-scopolamine 59
2.7. Statistique 60
Chapitre 3: Caractérisation de la préparation cellulaire 61
3.1. Introduction 61
3.2. Résultats 62
3.2.1. Préparation des acini 62
3.2.1.1. Sécrétion d’amylase par des acini pancréatiques préparés avec
les collagénases A et P 62
3.2.1.2. Effet de différentes concentrations de sécrétagogues sur la sécrétion
d’amylase 63
3.2.1.3. Mesure de la [Ca^^jj: mobilisation du calcium intracellulaire en réponse
aux divers agents sécrétagogues 65
3.2.1.4. Comparaison de l’effet du carbachol et du CCK sur la sécrétion d’amylase
et sur la [Ca^'^Jj 70
3.2.2. Perméabilisation des acini 73
3.2.2.1. Effet de la concentration en calcium libre sur la perméabilisation
par la streptolysine O 73
3.2.2.2. Effet de différentes concentrations de SLO en présence de 0,26 pM
de calcium libre dans le milieu 76
3.2.2.3. Effet de deux sécrétagogues sur la sécrétion d’amylase par des
acini perméabilisés 76
3.3. Discussion 79
3.4. Conclusion 86
Chapitre 4: Interaction entre les sécrétagogues et des agents pharmacologiques 87
4.1. Introduction 87
4.2. Résultats 88
4.2.2. Effet de l’isobutylméthylxanthine (IBMX) 88
4.2.2.1. Effet de l’IBMX sur la sécrétion d’amylase 88
4.2.2.2. Effet de l’IBMX sur la sécrétion d’amylase en réponse aux sécrétagogues 89 4.2.3. Effet de l’IBMX et de la forskoline sur la réponse au carbachol 95 4.2.4. Effet du vérapamil et du diltiazem sur la réponse au carbachol 95 4.2.5. Effet du vérapamil et du diltiazem sur la réponse au fluorure 101
4.3. Discussion 107
4.4. Conclusion 110
Chapitre 5: Caractérisation de la réponse au fluorure des acini pancréatiques de rat 112
5.1. Introduction 112
5.2. Résultats 115
5.2.1. Effet du fluorure sur la sécrétion d’amylase 115
5.2.2. Effet du fluorure sur la sécrétion d’amylase en réponse au carbachol 116 5.2.3. Effet du fluorure sur la sécrétion d’amylase en réponse au CCK 116
5.2.4. Effet du fluorure sur la [Ca^^^li 120
5.2.5. Effet du fluorure sur la [Ca^'^Jj en absence de calcium extracellulaire 120 5.2.6. Effet du CCK sur la [Ca^"^]! 10 minutes après la réponse au fluorure 124 5.2.7. Effet du carbachol sur la 10 minutes après la réponse au fluorure 124 5.2.8. Effet du fluorure sur l’élévation de la [Ca^"^]! en réponse à la thapsigargine 124
5.3. Discussion 132
5.4. Conclusion 136
Chapitre 6: Effet d’un agent pharmacologique, la mépacrine, sur la sécrétion
du pancréas exocrine de rat 139
6.1. Introduction 139
6.2. Résultats 141
6.2.1. Effet de la mépacrine sur la libération d’amylase dans des acini intacts 141 6 .2.1.1. Effet de la mépacrine sur la sécrétion d’amylase en réponse à divers
sécrétagogues 141
6.2.1.2. Effet de la mépacrine sur la réponse au carbachol 143 6.2.1.3. Effet de la mépacrine sur la réponse au CCK 143 6.2.1.4. Effet de la mépacrine sur la réponse au TPA 143 6.2.1.5. Effet de la mépacrine sur la réponse au fluorure 147 6.2,2. Effet de la mépacrine sur la libération d’amylase par des acini perméabilisés 147
6.2.2.1. Interaction entre la mépacrine et le GTPrS 147
6.2.2.2. Effet de la mépacrine sur la sécrétion d’amylase en réponse à différentes
concentrations de GTP
tS 150
6.2.2.3. Effet de la mépacrine sur la sécrétion d’amylase en réponse au TPA 150 6.2.2.4. Effet du TPA sur la sécrétion d’amylase en réponse au GTP
tS 155
6.3. Discussion 157
6.4. Conclusion 162
Chapitre 7: La thapsigargine et la régulation du calcium intracellulaire
dans les acini pancréatiques de rat 164
7.1. Introduction 164
7.2. Résultats 167
7.2.1. Effet de la thapsigargine seule sur la [Ca^'^Jj 167 7.2.1.1. Réponse à la thapsigargine en présence de calcium extracellulaire 167 7.2.1.2. Réponse à la thapsigargine en absence de calcium extracellulaire 167 7.2.2. Interaction de la thapsigargine avec la mobilisation de calcium
intracellulaire en réponse aux agonistes 167
7.2.2.1. Effet de la thapsigargine sur la [Ca^‘^]j 2minutes après une
stimulation par le carbachol 167
1.2.2.2. Effet de la thapsigargine sur la [Ca^"^]!, 5 minutes après une stimulation
par le carbachol ou le CCK 170
1.2.2.2). Effet de la thapsigargine sur la [Ca^'^Ji 5 minutes après une stimulation par le carbachol, le CCK ou la bombésine en absence de calcium
extracellulaire 171
7.2.2.4. Effet de la thapsigargine sur la réponse au CCK en absence de calcium
extracellulaire 175
1.2.2.5. Effet de la thapsigargine sur la réponse à la bombésine 178 7.2.3. Effet de la thapsigargine sur l’influx de calcium 178 7.2.3.1. Effet de la thapsigargine sur l’équilibre d’influx de calcium extracellulaire 178 7.2.3.2. Effet de la thapsigargine et du carbachol sur l’équilibre d’influx de calcium
extracellulaire 182
7.3. Discussion 184
7.4. Conclusion 189
Chapitre 8: Effet de la caféine sur la réponse à des agents sécrétagogues
du pancréas exocrine de rat 190
8.1. Introduction 190
8.2. Résultats 192
8.2.1. Effet de la caféine sur la réponse au carbachol 192 8.2.1.1. Effet de la caféine sur la sécrétion d’amylase et sur la réponse
sécrétoire au carbachol 192
8 .2.1.2. Effet de la caféine 10 mM sur la sécrétion d’amylase en réponse
au carbachol 192
8.2.1.3. Effet de la caféine 10 mM sur la courbe dose/sécrétion d’amylase
en réponse au carbachol 195
8.2.1.4. Effet de la caféine sur la [Ca^"^]! 195
8.2.1.5. Effet de la caféine 20 mM sur la réponse à la thapsigargine 1 ^tM
en absence de calcium extracellulaire 198
8.2.1.6. Effet de la caféine 1,3 et 20 mM sur l’élévation de la [Ca^"^]) en
réponse au carbachol en présence de calcium extracellulaire 202
8.2.1.7. Effet de la caféine sur l’élévation de la [Ca^‘^]j en réponse au carbachol
en absence de calcium extracellulaire 202
8.2.1.8. Effet d’une préincubation de 5 minutes avec la caféine sur l’élévation
de la [Ca^"^]; en réponse au carbachol 208
8.2.1.9. Effet de la caféine sur la fixation du pH]-NMS 208 8.2.1.10. Effet de la théophylline sur la sécrétion d’amylase en réponse au carbachol 212
8.2.1.11. Discussion 214
8.2.2. Effet de la caféine sur la réponse aux autres sécrétagogues 217 8.2.2.1. Effet de la caféine 20 mM sur la réponse sécrétoire au CCK 217 8.2.2.2. Effet de la caféine 20 mM sur la réponse sécrétoire à la bombésine 217 8 .2.2.3. Effet de différentes concentrations de caféine sur la sécrétion d’amylase
en réponse à trois concentrations de fluorure 217
8 .2.2.4. Effet de différentes concentrations de caféine sur la sécrétion d’amylase
en réponse à trois concentrations de TPA 220
8 .2.2.5. Effet de la caféine sur la sécrétion d’amylase en réponse à différentes
concentrations de GTP
tS 220
8 .2.2. 6 . Effet de la caféine sur l’élévation de la [Ca^"^]) réponse à la bombésine 224 8 .2.2.7. Effet de la caféine 20 mM sur l’élévation de la [Ca^'^Jj en réponse
à la bombésine, en absence de calcium extracellulaire 228 8.2.2. 8 . Effet de la caféine sur l’élévation de la [Ca^'^Jj en réponse au CCK 228 8 .2.2.9. Effet d’une préincubation plus courte avec la caféine sur l’élévation
de la [Ca^^^li en réponse au CCK 232
8.2.2.10. Effet de la caféine sur les variations de la [Ca^^]j en réponse au CCK
en absence de calcium extracellulaire 235
8.2.2.11. Effet de la caféine sur l’élévation de la [Ca^^]j en réponse au CCK
ajouté à 5 minutes en absence de calcium extracellulaire 235 8.2.2.12. Effet de la caféine sur l’élévation de la concentration d’IPj cytosolique
en réponse au CCK et à la bombésine 235
8.2.2.13. Effet de la caféine sur la valeur d’équilibre d’influx en réponse au CCK 241 8.2.2.14. Effet de la caféine sur la valeur d’équilibre d’influx en réponse
à la thapsigargine 241
8.2.2.15. Effet de la caféine sur l’élévation de la [Ca^^]j en réponse à la thapsigargine ajoutée 5 minutes après une stimulation par le CCK et
en absence de calcium extracellulaire 244
8.2.2.16. Effet de la caféine sur la valeur de l’équilibre de l’influx en réponse
à une stimulation par le CCK suivie d’une stimulation par la thapsigargine 247
8.2.2.17. Discussion 249
8.2.2.18. Conclusion 255
Résumé du travail 257
Conclusion générale 259
Liste des abréviations utilisées 261
Bibliographie 263
(CIMJPITIRE 1
INTROniirTION GENERALE
Le pancréas est une glande digestive située dans le cadre duodénal entre l’estomac, la rate et le duodénum. Elle est constituée d’une tête enchâssée dans l’anneau duodénal, d’un col, d’un corps et d’une queue. C’est une glande à sécrétion mixte à la fois endocrine et exocrine.
Le pancréas est de couleur rosée et apparaît fortement divisé: ces divisions représentent les lobules macroscopiques au sein desquels existent les lobules microscopiques qui sont les unités fonctionnelles du pancréas exocrine. Chaque lobule microscopique est composé d’une large proportion de cellules acineuses qui synthétisent des enzymes digestifs et les emmagasinent dans des granules de zymogènes et d’une plus faible proportion de cellules ductales. Les acini déversent leur sécrétion dans des canaux. L’unité sécrétrice du pancréas exocrine est l’acinus, composé de cellules acineuses bordant la lumière d’un espace centro- acinaire.
Le tissu endocrinien du pancréas occupe une partie des lobules et les îlots de Langerhans sont dispersés dans le tissu exocrine. Les îlots de Langerhans sont composés de cellules a, 6 , ô et PP. Les cellules a sécrètent le glucagon, les cellules 6 l’insuline, les cellules ô contiennent de la somatostatine et les cellules PP le Polypeptide Pancréatique. Environ 11 % des cellules du pancréas sont ductales et les îlots occupent 1 à 2 % du volume de la glande. Chaque îlot est composé d’environ 5000 cellules endocrines.
L ORGANISATION DU PANCREAS
1.1. La cellule acineuse
De son origine épithéliale, la cellule acineuse a conservé sa polarité. La polarisation des acini
pancréatiques est fondamentale pour leur fonctionnement. La partie infra et para nucléaire
est occupée principalement par le réticulum endoplasmique rugueux, tandis que l’appareil de
Golgi et les granules de zymogènes sont localisés principalement au pôle apical. Le pôle
basal de la cellule reçoit les signaux extérieurs hormonaux ou neuro-hormonaux émis en
réponse à la prise de nourriture, ce qui déclenche au pôle apical la sortie des grains de sécrétion. Au pôle apical, les granules de zymogènes se présentent comme de petites vacuoles remplies de protéines. C’est par ces grains de zymogènes que le contenu enzymatique de la cellule est véhiculé vers le milieu extracellulaire, dans la lumière de l’espace centro-acinaire.
L’exocytose est un événement par lequel les granules de zymogènes se rassemblent au niveau de la membrane plasmique du pôle apical et ensuite par un système de reconnaissance inconnu, la membrane plasmique et la membrane du grain de zymogène fusionnent.
1.2. Le système ductal
Les cellules ductales forment un système tubulaire de cellules épithéliales par lequel les sécrétions exocrines arrivent au duodénum. Ces cellules sécrètent un fluide riche en bicarbonate qui permet le drainage des enzymes digestifs jusqu’au duodénum (Case et Argent, 1993). Le système ductal est composé de trois parties majeures:
- les canaux intralobulaires - les canaux interlobulaires - le canal pancréatique majeur
Les canaux intralobulaires
La partie initiale de ces canaux est formée par les canaux intercalaires, composés de cellules centroacineuses. Une des caractéristiques de ces cellules est de pouvoir élaborer des interdigitations aux membranes latérales et basales. Elles ressemblent donc à ce point de vue aux cellules striées des canaux des glandes salivaires.
Les canaux interlobulaires
Ils sont formés par des cellules pyramidales qui projettent des microvillosités du côté luminal et qui contiennent de nombreux granules sécrétoires dans leur cytoplasme apical. Ces cellules sécrètent des mucoprotéines mais on sait peu de choses des fonctions de ces protéines.
Canal pancréatique principal ou canal de Wirsung
Les cellules de ce canal ont les mêmes caractéristiques que les cellules des canaux
interlobulaires. Cependant, elles ont une particularité: il existe un grand turnover des cellules
avec un remplacement continu des cellules mortes. Ce phénomène peut être dû soit au reflux
de sels biliaires et d’enzymes hydrolytiques provenant du duodénum qui détruit les cellules,
soit cette partie du système ductal est spécialement sensible aux facteurs de transformation
cellulaire. C’est dans le canal de Wirsung que sont déversées les sécrétions enzymatiques.
Le principal canal de drainage de la sécrétion exocrine commence dans la queue du pancréas par une confluence des canaux interlobulaires, passe ensuite dans le corps puis dans le cou et enfin dans la tête du pancréas, y recevant les canaux secondaires. Finalement le canal principal se termine par l’ampoule de Vater et le sphincter d’Oddi aboutissant dans le duodénum. Le canal cholédoque arrivant de la vésicule biliaire est en relation directe avec l’ampoule de Vater. Le canal pancréatique pénètre dans le duodénum en oblique, parallèlement au canal biliaire.
1.3. Organisation de la circulation sanguine au sein du pancréas;
Le pancréas reçoit le sang des branches de deux larges troncs artériels provenant de la surface antérieure de l’aorte: le tronc coeliaque (par ses branches hépatique et splénique) et l’artère mésentérique. Au sein même du pancréas, le sang provenant des îlots passe par des capillaires irriguant le tissu exocrine; alors que le pancréas endocrine ne constitue qu’environ 2 % de la totalité de la glande, 20 % du flux sanguin intrapancréatique passent par les cellules 6 (Lifson et al., 1980). Les plus grosses cellules 6 se trouvent à proximité des vaisseaux sanguins. L’efflux veineux de ces cellules ne passe pas par la partie exocrine. Les cellules B plus petites et plus nombreuses sont localisées à proximité des plus petites artérioles. Le sang veineux provenant de ces artérioles passe par la partie exocrine formant une circulation intrapancréatique (Bonner-Weir et Orci, 1993). Lorsque le sang passe par les îlots, il s’enrichit des hormones des îlots qui peuvent alors diffuser par les capillaires dans les cellules acineuses. Chaque espèce animale possède sans doute un flux artériel direct vers les îlots et vers les acini, un drainage veineux direct des larges cellules des îlots et un système insulo-acinaire portai depuis les petites cellules des îlots.
Le système veineux du pancréas entre dans le système portai hépatique dans la région de formation de la veine portale hépatique par la veine splénique et la veine mésentérique supérieure.
1.4. Innervation du pancréas exocrine
L’innervation du pancréas se fait à partir du nerf vague et du nerf splanchique. Le vague
antérieur et postérieur envoie des branches au pancréas directement ou en passant par le
ganglion préaortique. Le nerf splanchique innerve les vaisseaux sanguins pancréatiques, le
ganglion et les îlots. Il existe trois plexus intrapancréatiques: le plexus périvasculaire, périacinaire et périinsulaire. Le pancréas est soumis aux mêmes peptides que ceux retrouvés dans le tractus gastro-intestinal (le Vasoactive Intestinal Peptide ou VIP, le Peptide Histidine Isoleucine ou PHI, le NeuroPeptide Y ou NPY et le Gastrin Releasing Peptide ou GRP).
Dans certaines espèces on retrouve également, comme neuropeptides, la galanine, la tachykinine, la substance P et la neurokinine A.
Le système parasympathique a une influence importante sur la sécrétion du pancréas exocrine tandis que l’effet de la transmission adrénergique est moins clair: une grande part des fibres postganglionnaires du sympathique se terminent sur les vaisseaux sanguins intrapancréatiques et donc provoquent une vasoconstriction.
2. MODULATEURS DE LA SECRETION DU PANCREAS EXOCRINE Ces modulateurs sont repris dans le tableau I qui suit.
Tableau I:
Hormones ou peptides
Neuropeptides
Stimulants Sécretine Vasoactive intestinal
peptide (VIP) Cholécystokinine
Neurotensine
peptide histidine
Motiline isoleucineamide (PHI)
Insuline Gastrin-releasing peptide
(GRP) Secretin-releasing peptides
dans le suc intestinal Substance P
CCK-releasing peptides dans Pituitary adenylate le suc intestinal cyclase activating
polypeptide (PACAP) CCK-releasing peptides dans
le suc pancréatique
Inhibiteurs Pancreatic polypeptide Calcitonine gene-related peptide (CGRP)
Peptide YY
Galanin Somatostatine
Enképhaline Glucagon
Neuropeptide Y Pancreostatine
Thyrotropin-
releasing hormone (TRH)
Certains de ces hormones ou peptides agissent sur les cellules acineuses via des récepteurs transmembranaires spécifiques situés sur la membrane plasmique des cellules acineuses. Ces récepteurs sont couplés à un système permettant le transfert du signal au compartiment intracellulaire. Dans le pancréas exocrine, il semble que tous ces systèmes soient composés d’une protéine G et d’un effecteur enzymatique. Le système de transduction complet est donc composé du récepteur, de la protéine G et d’un effecteur lié à la membrane plasmique.
3. LES RECEPTEURS MEMBRANAIRES
Les récepteurs ont la propriété de reconnaître avec une haute affinité un ligand, et ils ont la capacité une fois le ligand spécifique lié, de participer au processus d’activation cellulaire.
Ce sont des protéines qui traversent la membrane de part en part avec un versant extracellulaire relié à un versant cytoplasmique par une zone transmembranaire (Figure 1).
La majorité des récepteurs retrouvés sur les cellules acineuses appartiennent à une super famille de récepteurs possédant dans leur séquence d’acides aminés 7 zones d’une vingtaine d’acides aminés hydrophobes et qui sont susceptibles de traverser la bicouche lipidique membranaire (Boege et al., 1991).
Ils sont constitués de protéines glycosylées en chaînes de 460 à 590 acides aminés qui
traversent la membrane plasmique sept fois créant quatre domaines extracellulaires et quatre
domaines intracellulaires. Ils fixent le ligand sur le versant extracellulaire et traduisent leur
message en interagissant avec une protéine fixant la guanosine triphosphate.
Figure 1: La localisation transmembranaire et la séquence du récepteur muscarinique M2.
La protéine possède 7 hélices a constituant les 7 domaines transmembranaires (I à VII), 4 domaines extracellulaires (o-l à o-4) et 4 domaines intracellulaires (i-1 à i-4). L’aspartate marquée X (dans le domaine transmembranaire III) serait importante dans la fixation de l’agoniste ou de l’antagoniste, La séquence en acides aminés marquée XX indique un site probable de fixation de la protéine G.
(D’après Goyal et al., 1989).
En 1971, Rodbell et al. avaient observé que la présence de GTP était nécessaire pour
l’activation de l’adénylate cyclase. Les intermédiaires dans l’activation cellulaire par une
hormone ou un neurotransmetteur utilisent une protéine capable de fixer du GTP et qui a été
appelée protéine G. En 1976 Cassel et Selinger démontrent l’activité GTPase de la protéine
G. Le système de la protéine G est activé par la fixation de GTP et l’hydrolyse du GTP initie
la désactivation, (voir plus loin)
3.1. Principaux récepteurs retrouvés sur les acini pancréatiques
3.1.1. Les récepteurs cholinergiques
Les neurones cholinergiques libèrent l’acétylcholine à leur extrémité. Celle-ci stimule la cellule cible en se fixant sur un récepteur spécifique de la membrane cellulaire. Les récepteurs cholinergiques sont de deux types: soit nicotiniques soit muscariniques. Les récepteurs nicotiniques sont retrouvés dans les muscles striés, les ganglions autonomes, la médullo-surrénale et dans le système nerveux central. Les récepteurs muscariniques participent à des processus physiologiques tels que la transmission nerveuse, la contraction des muscles lisses et la sécrétion exocrine et endocrine. Différentes classes de récepteurs muscariniques ont pu être identifiées à ce jour. Le tableau II reprend ces différents classes.
Tableau II (d’après Alexander et Peters, 1997)
Acétylcholine receptors (muscarinic)
Nomenclature*' M, M, M, M, Ms
Sélective antagoniste MT-7 toxin (9.8) telenzepine (9.1) pirenzepine (8.0)
tripitramine (9S) himbacine (8.2) melhoctramine (7.9) AFDXn6(7J)
darifenadn (9.4) HHSiD(8.0) pFHHSiD(7.8)
MT-3 toxin (8.1) tropicamide (7.8) PD102807 (7J)
Radioligands* PHlpircnzepine - - - -
G protein etfector G./, G,/U G./0 G,/,|
Gene/Chromosomal localization
CHRMI/n CHRM2/7q35-36 CHRM3/Iq43-44 CHRM4/Upl2-n.2 CHRA45/15q25
Structure - 7TM h460 P11229 m460 P12657 r460 P08482
h466 P08172 r466 P10980
hS90 P20309 rS89P08483
H479 P08173
‘ m479 P32211 r478P08485
hS32 P08912 r531 P08911
*nomendAtxue *gre«d by the NC*IUPHAR Subcommiitce on Muscarinic Acétylcholine Receplon
VH)(->M>mrthyiacDpoUmineand pHK*')'3K)uinudldinylbvfuiUleafenunsclcctivcradk>ligand»i>fHi hâve values of U»s tlian lilnM al allsubtypvs
ft
Une nomenclature basée soit sur les caractéristiques pharmacologiques, soit sur la structure
moléculaire existe. Suivant les caractéristiques pharmacologiques, on a cinq types de récepteurs. Ils sont classés suivant leur spécificité pharmacologique et suivant leur affinité pour les antagonistes. On a le type Mj (haute affinité pour la pirenzepine), M 2 (haute affinité pour l’AFDX-116), M 3 (haute affinité pour rhexahydrosiladifenidol(HHSD)), M 4 et M 5 . Suivant les formes moléculaires on retrouve cinq classes: ml, m2, m3, m4, m5. Les formes pharmacologiques M,, M 2 , M 3 , M 4 et M 5 sont assimilables aux formes moléculaires m,, m 2 , mj, m 4 et mj. Les récepteurs de types M,, M 3 et Mj activent la protéine G,/„. Les formes Mj et M 4 sont couplées à une protéine Gj. Ce sont des récepteurs de type pharmacologique M 3 ou moléculaire m 3 qui sont retrouvés sur les cellules acineuses du pancréas exocrine (Louie et al., 1986).
L’étude de la sécrétion d’amylase en réponse à un agoniste muscarinique, le carbachol, montre une courbe dose/effet en forme de cloche. L’étude de la fixation du N-[^H]méthyl- scopolamine (pH]NMS) a permis de mettre en évidence deux composantes de la fixation de l’agoniste sur le récepteur et suggère la présence de deux classes ou d’états différents du récepteur: une classe à haute affinité et une classe à faible affinité pour l’agoniste muscarinique (Dehaye et al., 1984*’).
La fixation d’agonistes cholinergiques sur les récepteurs muscariniques du pancréas induit un turnover immédiat des polyphosphoinositides, une augmentation de la [Ca^"*^]! suivie de l’exocytose de granules de zymogènes. La sécrétion d’amylase est maximale après 5 minutes.
Une plus longue exposition à l’agoniste donne une réponse plus lente et moins grande ("désensibilisation"). Un troisième effet qui survient après plusieurs heures consiste
en une diminution de la population des récepteurs ("downregulation").
3.1.2. Les récepteurs à la cholécvstokinine
La cholécystokinine (CCK) est produite et sécrétée par un type de cellules endocrines de la muqueuse de l’intestin (Buffa et al, 1976) au niveau du duodénum et du jéjunum proximal.
Il semble que ce soit l’interaction de la nourriture ingérée avec la surface apicale de ces
cellules qui mettrait en route le signal de la production et de la sécrétion de cholécystokinine
et sa libération dans le sang par la surface basale de ces cellules. D’autres auteurs ont
suggéré la présence dans le suc intestinal et dans le suc pancréatique de peptides capables de
réguler la libération du CCK à partir des cellules de la muqueuse intestinale (Lu et al., 1989)
(Fushiki et al., 1984).
Le CCK fut purifié pour la première fois à partir de l’intestin de porc par Mutt et Jorpes en 1968 sous la forme d’un peptide de 33 acides aminés (Mutt et Jorpes, 1968). En fait cette forme comme d’autres formes circulantes, résulte du clivage enzymatique à de nombreux sites d’une préhormone de 115 acides aminés pour donner diverses formes nommées suivant leur nombre d’acides aminés (Deschenes et al., 1984). L’activité biologique est totalement contenue dans l’heptapeptide C-terminal. En effet une sulfatation du résidu tyrosine à la position 7 (comptée à partir du résidu C-terminal) et une alpha-amidation de la fonction carboxylique terminale de la phénylalanine sont nécessaires pour l’activité biologique du CCK. Toutes les formes actives du CCK possèdent donc cette séquence C-terminale.
Structure du CCK et des peptides apparentés (Williams et Blevins, 1993):
Peptide Structure
Porcine CCK-33 Lys-Ala-Pro-Ser-Gly-Arg-Val-Ser-Met-Ile-Lys-Aen-Leu-Gln-Ser-
so,
Leu-Asp-Pro-Ser-His-Arg-Ile-Ser-Asp-Arg-Asp-Tyr-Met-CIy-Trp-Met-Asp-Phe-NHf Haman gastrin-17 Glp-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Try-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH,
Câerulein
SO,
Glp-GIn-Asp-Tyr-Thr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH,
CCK-8
SO,
Asp-Tyr-Met-Gly-Trp-Mel-Asp-Pbe-NH,
JMV-180
SO,
t-BOC-Tyr-Nle-Gly-Trp-NIe-A8p-2-phenylethyl ester
OPE-CCK
SO,
D-Tyr-Gly-As|>-TVr-Nle-Gly-Trj>-Nle-A8p-2-phenylethy: ester CCK, choiccystokinin; t-BOC, tcrt-butoxy-carbonyl.
