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Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository
Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:
Oulad L'ghars, L. (1999). Identification et caractérisation d'un canal ionique de la membrane thylacoidienne des chloroplastes de Spinacia oleracea L.
(Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.
Disponible à / Available at permalink : https://dipot.ulb.ac.be/dspace/bitstream/2013/211858/1/4dff2696-07f3-4047-ac96-d8ba15ce7192.txt
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DBM 005G3
UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES Faculté des Sciences
Laboratoire de Chimie Physique des Macromolécules aux Interfaces
IDENTIFICATION ET CARACTERISATION D’UN CANAL IONIQUE DE LA MEMBRANE THYLACOIDIENNE DES
CHLOROPLASTES DE Spinacia oleracea L.
Thèse présentée en vue de l’obtention du grade de Docteur en Sciences
Directeurs de thèse : J-M. Ruysschaert F. Homblé
Loubna OüLAD L’GHARS
UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES Faculté des Sciences
Laboratoire de Chimie Physique des Macromolécules aux Interfaces
IDENTIFICATION ET CARACTERISATION D’UN CANAL IONIQUE DE LA MEMBRANE THYLACOIDIENNE DES
CHLOROPLASTES DE Spinacia oleracea L.
Thèse présentée en vue de l’obtention du grade de Docteur en Sciences
Directeurs de thèse : J-M. Ruysschaert F. Homblé
Loubna OULAD L’GHARS
Octobre 1999
Intitulé de la thèse annexe
La protéine Tye A de Yersinia Pseudotuberculosis pourrait être impliquée
dans les mécanismes d’interaction de cette bactérie avec la cellule
eucaryote et de translocation des protéines bactériennes YopE et YopH.
t Y
Y
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REMERCIEMENTS
Avant tous, je tiens à remercier le professeur Jean-Marie Ruysschaert de m’avoir accueilli A dans son laboratoire et pour l’intérêt constant qu’il a manifesté tout au long de ce travail. ^
Mes remerciements vont aussi à mon promoteur, le professeur Fabrice Homblé, pour m’avoir initié aux mystères de l’électrophysiologie. Sa disponibilité, sa patience ainsi que ses idées lumineuses m’ont permis de mener à bien cette thèse.
Je tiens également à remercier le Dr. S. Mauro et Françoise (Département de Physiologie Végétale, ULB) de m’avoir aimablement fourni l’anticorps anti-LHCb1.
Un énorme merci à Véro P, Carine, Florence, Isabelle, Delphine et Helge qui m’ont accordé un précieux soutient morale tout au long la rédaction de cette thèse.
Merci à tous les autres membres du LCPMI que J’ai côtoyé tout au long de ce travail (et désolé pour les oubliés) : Tartex, Najib, Michaela, Fred, Catherine, Marc, Nathalie, Xiao- Ming, Abdel, Sarah, Sandrine, Laurence, Marie-Claude, Michel VDB, Sunanda, Fabien, Guy, Pol, Vincent, Eric, Vero C, Nordine, Ariane, Bruno, Olivier, Patrick, Agnès,...
Toute ma gratitude va à mon mari Youssef pour son soutien inconditionnel et pour ses encouragements quotidiens, il a énormément contribué à la réalisation de ce travail.
Merci à Aouatif et lllias pour leur amitié et leur sympathie. Les soirées merveilleuses que nous avons partagées m’ont, souvent, permis d'oublier le stress de longues Journées de manipulations.
J’aimerais aussi remercier Naïma pour sa sympathie et son encouragement plein d’enthousiasme.
Je tiens à remercier mes parents et tous les membres de ma famille (Ouafae, Jalal, Zohra, ^
Bouchra, Rajae, Sanae, Hanae, Mohamed et Chaymae) qui ont fait preuve d’une grande y'
RESUME.
Les plastes sont des organites semi-autonomes qui sont présent dans chaque cellule des plantes. Ils contiennent les informations génétiques sous forme de DNA et toute la machinerie nécessaire pour la biosynthèse des protéines. Il existe une large variété de plastes ; les proplastes (petits plastes non différenciés), les leucoplastes (proplastes qui ont perdu la capacité de former des chloroplastes), les amyloplastes (riches en amidon), les étioplastes (se différencient en chloroplaste en présence de la lumière), les chromoplastes (riche en caroténoïdes) et les chloroplastes (riche en chlorophylles). Tous ces plastes contribuent au métabolisme de la cellule.
La photosynthèse est le mécanisme de la capture de l’énergie lumineuse et sa conversion en énergie chimique. Le chloroplaste représente le siège de la photosynthèse. Il est présent en grande quantité dans le cytoplasme des cellules des parties aériennes de la plante. Il est limité par une double membrane (l’enveloppe interne et l’enveloppe externe) et renferme un réseau membranaire, les thylacoïdes.
Le chloroplaste contient une proportion considérable d’ions et de métabolites cellulaires (Douce et Joyard 1990). Leur transport au travers les membranes du chloroplaste (les enveloppes interne et externe et la membrane thylacoïdienne) est vital pour le métabolisme de la cellule végétale.
Lors d’une illumination du chloroplaste, la capture de la lumière par les deux photosystèmes PS1 et PS2 induit une séparation de charge de part et d’autre de la membrane thylacoïdienne correspondant à un A'F de l’ordre de +200 mV (Junge 1977). Cette différence de potentiel est court-circuitée par un efflux de K’’’ et Mg^""
(Hind et coll. 1974, Chow et coll. 1976) et un influx de CI' (Vambutas et coll. 1984).
A l’état stationnaire, la valeur de A'P est de l’ordre de +10 à +30 mV (Junge et Jackson 1982) et de ApH est d’environ 3 unités (pH stroma = 8 et pH intrathylacoïdien = 6) (Heldt et coll. 1973). Parallèlement, la concentration en Mg^^
de 1 mM dans le stroma augmente d’environ 4 mM après illumination.
Depuis les années 88, l’étude des mécanismes de diffusion des ions à
travers la membrane thylacoïdienne, par des techniques électrophysiologiques, a permis d’identifier des canaux ioniques qui contribuent de manière considérable au mécanisme de transport à travers cette membrane. A nos jours, aucune protéine associée à Tactivité de ces canaux ioniques n*a été purifiée.
Au cours de ce travail, nous avons associé la propriété d’un canal ionique à une protéine que nous avons isolé de la membrane thylacoïdienne. Il s’agit du polypeptide LHCb1 du complexe LHCII. Pour étudier le mécanisme de transport au travers de ce canal, nous avons inséré la protéine purifiée dans une bicouche lipidique plane (BLM).
Les mesures des fluctuations de courant associées à l’activité du canal ionique nous ont permis de le caractériser par les propriétés suivantes : conductance, nombre de sous-états, sélectivité, effet de la concentration de KCI sur la conductance et la dépendance de la probabilité d’ouverture vis à vis du voltage.
L’identification, après la fusion de la membrane thylacoïdienne native avec la BLM, d’un canal qui a les mêmes propriétés (conductance, sélectivité et probabilité d’ouverture) que le canal LHCb1 (695 pS) montre que ce dernier n’est pas un artefact dû à la procédure de la purification.
Afin de vérifier si les charges des acides aminés interviennent dans les mécanismes d’ouverture et/ou de sélectivité du canal LHCb1, nous avons étudié les caractéristiques de ce canal à deux pH différents (pH 5.4 et 9.9) ou en présence d’un modificateur d’acides aminés (anhydride succinique).
Pour déterminer le rôle physiologique du canal LHCb1, nous avons étudié
les propriétés (conductance et probabilité d’ouverture) de ce canal en présence de
conditions physiologiques telles que le gradient de pH 6/8 et le magnésium. Nous
avons montré qu’en présence d’un gradient de pH 6/8 et aux potentiels
physiologiques (de l’ordre de +10 à + 30 mV), les propriétés du canal ne sont pas
modifiées. Par contre en présence du Mg^"" (1 mM ou 5 mM), le canal a une
conductance maximale de 101 pS au lieu de 695 pS en absence de Mg^^. Ces
résultats suggèrent qu’en conditions physiologiques, le LHCbl forme un canal
différence de potentiel électrique à travers la membrane thylacoïdienne.
LISTE DES ABBREVIATIONS.
aa ; acide aminé
APS : persulfate d’ammonium ADP : adénosine diphosphate ATP ; adénosine triphosphate BLM ; bilayer lipid membrane BSA ; bovine sérum albumine
CAPS : 3-cyclohexylamino-1 -propane-sulfonique acide CCCP ; carbonyl cyanide trichlorophénylhydrazone Chl : chlorophylle
(CH
3)
4N
0H : tétraméthylammonium hydroxide DGDG ; digalactosyldiacylglycérol
DMSO ; diméthylsulfoxide DTE ; dithioerythritol DTT ; dithiothreitol
EDTA ; ethylenediamine tetraacetic acid
HEPES : acide N-2-hydroxyéthylpipérazine-N’-2-éthanesulfonique HTP : hydroxyapatite
Kda ; kilo dalton
MGDG : monogalactosyldiacylglycérol
MOPS : acide 3-morpholinopropanesulphonique
NADPH : nicotinamide adénine dinucléotide phosphate PC : phosphatidylcholine
PE ; phosphatidyléthanolamine PG ; phosphtidylglycérol
PS : phosphatidylsérine
PVDF : polyvinylidine difluoride SDS : sodium dodécylsulfate
SDS-PAGE : sodium dodécylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis - — ~
Tricine : N-tris(hydroxyméthyl)méthylglycine
Tris ; Tris(hydroxyméthane)-aminométhane
TABLE DES MATIERES
UNTRODUCTION... 1
I. LE CHLOROPLASTE...1
1.1. ENVELOPPE...1
1.2. STROMA... 2
1.3. THYLACOÏDES... 2
1.3.1. Les lipides de la membrane des thylacoïdes...2
1.3.2. La nature de mosaïque de fluide de la membrane thylacoïdienne... 5
II. LA PHOTOSYNTHESE... 5
II. 1. LES COMPLEXES CHLOROPHYLLES-PROTEINES DE LA MEMBRANE DES THYLACOÏDES... 6
11.1.1. Le photosystème l... 6
11.1.2. Le photosystème II... 8
11.1.3. LHCII (Lhcbl et Lhcb2 >...11
11.2. LA PHOTOPHOSPHORYLATION... 15
11.2.1. Théorie de Mitchell... 15
11.2.2. Le facteur de couplage, l’ATPsynthase... 16
11.2.3. La différence de potentiel électrochimique... .18
11.3. LE TRANSPORT DES IONS A TRAVERS LA MEMBRANE DES thylacoïdes ...19
11.3.1. Les ions qui court-circuitent la différence de potentiel électrique...19
11.3.2. Les canaux ioniques de la membrane des thylacoïdes... 21
11.4. LE MECANISME D’ACTIVATION DES ENZYMES DU STROMA PAR LA LUMIERE...22
11.5. ROLE DE L’hT-ATPase ET DU CANAL K+ DANS LE MAINTIEN DU pH ALCALIN DU STROMA...23
III. IMPORT DES PROTEINES VERS LA MEMBRANE DES thylacoïdes ...24
III. 1. TRANSPORT DES PROTEINES DES THYLACOÏDES DONT LES DEUX DOMAINES DE LA SEQUENCE DE TRANSIT SONT CLIVES... 24
111.2. IMPORT DANS LES THYLACOÏDES DES PROTEINES QUI ONT UNE SEQUENCE DE TRANSITA UN SEUL DOMAINE CLIVABLE...26
111.3. TRANSPORT DES PROTEINES DE THYLACOÏDES
CODEES PAR UN GENOME CHLOROPLASTIQUE... 26
111.4. TRANSLOCATION DES PROTEINES DES THYLACOÏDES
II. OBJECTIF ET STRATEGIE DU TRAVAIL... 29
III. MATERIEL ET METHODES... 31
PRODUITS... 31
PROCEDURES EXPERIMENTALES... 34
III. 1. EXTRACTION DES CHLOROPLASTES INTACTS...-34
111.2. DOSAGE DE LA CHLOROPHYLLE-... 35
111.3. MESURE DU POURCENTAGE DES CHLOROPLASTES INTACTS...35
111.4. MESURE DE LACTIVITE DE LA CYTOCHROME C OXYDASE MITOCHONDRIALE...35
Il 1.5. PURIFICATION DES THYLACOIDES...36
III.6. PURIFICATION DES PROTEINES DE LA MEMBRANE THYLACOIDIENNE PAR L'HYDROXYAPATITE... 36
III. 7. PURIFICATION DU COMPLEXE LHCII (LIGHT HARVESTING COMPLEXE)... 37
III. 8. GELS DELECTROPHORESE... 38
III.9. SEQUENÇAGE DE LA PROTEINE...39
III. 10. '1MMUN0BL0TTING"DE LA PROTEINE...40
111.11. GEL DELECTROPHORESE A DEUX DIMENSIONS... 40
III. 12. ELUTION DES PROTEINES DU GEL... 41
III. 13. SOLUBILISATION PAR LE SDS DES PROTEINES NON ADSORBEES A l’HTP... 42
111.14. PROTEOLYSE ENZYMATIQUE... 42
III. 15. LES BICOUCHES LIPIDIQUES PLANES... 42
III. 16. RECONSTITUTION DES CANAUX IONIQUES DANS DES BICOUCHES LIPIDIQUES PLANES... 45
III. 17. ANAL YSE DES CANAUX IONIQUES...48
III. 18. ANALYSE STATISTIQUE... 50
III. 19. ANALYSE DE LA DEPENDANCE DE LA PROBABILITE D’OUVERTURE DU CANAL VIS A VIS DU VOLTAGE... 50
RESULTATS ET DISCUSSION... 52
I. PURIFICATION ET RECONSTITUTION D’UN CANAL IONIQUE DE LA MEMBRANE THYLACOIDIENNE DANS LES BICOUCHES LIPIDIQUES PLANES... 52
1.1. INTRODUCTION... 52
1.2. PURIFICATION DES PROTEINES DE LA MEMBRANE THYLACOIDIENNE...53
1.3. MISE EN EVIDENCE D’UN CANAL TRES CONDUCTEUR DANS
LE SURNAGEANT DES PROTEINES NON ADSORBEES - .. “ .
AL’HTP... 54
1.4. LA CONDUCTANCE DU CANAL EST UNE FONCTION LINEAIRE
DE LA CONCENTRATION DU KCL DANS LE MILIEU... 55
1.5. EFFET DE LA VARIATION DU POTENTIEL ELECTRIQUE TRANSMEMBRANAIRE SUR L’ACTIVITE DU CANAL DE 695 pS...55
DISCUSSION... 56
II. RECONSTITUTION DES MEMBRANES THYLACOIDIENNES DANS DES LIPOSOMES ET IDENTIFICATION DE LA PROTEINE QUI FORME LE CANAL DE695pa... 58
11.1. INTRODUCTION...58
11.2. FUSION DES THYLACOIDES ENRICHIS EN PHOSPHOLIPIDES...58
11.3. ELUTION DES PROTEINES NON ADSORBEES A L'HTP DU GEL SDS-PAGE...60
11.4. FUSION DES PROTEINES ELUEES DU GEL AVEC UNEBLM...60
11.5. EFFET DU SDS SUR LE CANAL DE 695 pS... 61
11.6. IDENTIFICATION DE LA SEQUENCE DE LA PROTEINE DE LA BANDE (1)...62
11.7. DETECTION DE LA PROTEINE PAR L’ANTICORPS MLH1... 62
11.8. DETERMINATION DU pl DE LA PROTEINE DE LA BANDE (1) (LHCbl)...63
11.9. PURIFICATION ET RECONSTITUTION DU COMPLEXE LHCII DANS DES BLM... 63
DISCUSSION... 65
III. REGULATION ET PROTEOLYSE DU CANAL LHCbl DE LA MEMBRANE DES THYLACOIDES DES EPINARDS... 70
III. 1. INTRODUCTION... 70
111.2. EFFET DU pH SUR LA SELECTIVITE ET LES PROBABILITES D’OUVERTURE MAXIMALE ET MINIMALE DU CANAL LHCbl... 70
111.3. EFFET DU GRADIENT DE pH SUR L’ACTIVITE DU CANAL DU LHCbl...73
Il 1.4. MODIFICATION CHIMIQUE DU CANAL DU LHCbl PAR L’ANHYDRIDE SUCCINIQUE... 73
III.5. EFFET DU MgCh SUR L’ACTIVITE DU CANAL LHCbl...75
III. 6. EFFET DE LA TRYPSINE... .75
DISCUSSION...77
V. CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES...84
VI. BIBLIOGRAPHIE 66
INTRODUCTION
Gr=num
Figure i.1. A ; Représentation schématique d’une coupe de chioropiaste
Chapitre I : Introduction
I. LE CHLOROPLASTE.
Dans les cellules des plantes photosynthétiques, deux organites sont responsables de la production de l’ATP : le chloroplaste et la mitochondrie. A l’obscurité, la cellule utilise de l’ATP mitochondriale produite au cours de la respiration. A la lumière, les chloroplastes convertissent l’énergie lumineuse en énergie chimique sous forme d’ATP et de NADPH.
Le chloroplaste représente à la fois le site de réduction du dioxyde de carbone et son assimilation en sucre, en acides aminés, en acides gras et en terpénoides et le site de réduction de nitrite et de sulfate en acides aminés.
Chez les plantes supérieures, le chloroplaste a une forme ovoïde de 2 à 3 micromètres de diamètre. On le trouve dans le cytoplasme des cellules des feuilles et des tiges. Il présente trois régions structurales majeures (Figure 1.1.A et B) : l’enveloppe, le stroma et le thylacoïde.
1.1. ENVELOPPE.
Elle est composée d’une double membrane, une membrane externe et une membrane interne. Les galactolipides sont les lipides prédominants, la phosphatidylethanolamine est totalement absente de l’enveloppe (Douce et Joyard 1979). Les seuls pigments présents dans une préparation pure d’enveloppe sont les caroténoïdes (0.2% des lipides totaux de l’enveloppe) et les prenylquinones (plastoquinone-9, , a-tocophérol et phylloquinone) (Lichtenthaler et coll. 1982, Soll et coll. 1985) ). Les enveloppes membranaires du chloroplaste contiennent une faible quantité de stérol (7 pg/mg protéine). Le stigmast-7-enol est le stérol majeur des enveloppes membranaires du chloroplaste des épinards (Douce et Joyard 1990).
Comparées aux thylacoïdes, les enveloppes contiennent peu de protéines (rapport protéines/lipides = 0.5-0.8 pour les enveloppes et rapport protéines/lipides = 2 pour les thylacoïdes (Douce et Joyard 1979)).
1
Classe de lipides Composition lipidique (% mol)
Composition en acides gras
^16:0 ^16:1 ^16;3 ^18:1 ^18:2 ^18;3
MGDG 57 1
-25 1 2 72
DGDG 27 4
-5 2 2 87
PG 7 11 32
-2 4 47
SQDG 7 39 tr. tr. 1 7 53
PI 1
Tableau 1.1. Composition lipidique des membranes thylacoïdiennes d’épinards.
D’après Douce et Joyard (1990) pour la composition lipidique et Harwood et coll.
(1994) pour la composition en acides gras. MGDG : Monogalactosyldiacylglycerol,
DGDG Digalactosyldiacylglycerol, PG Phosphatidylglycerol, SQDG
Sulphoquinovosyldiacylglycerol, PI : Phosphatidylinositol.
Chapitre I : Introduction
protéines/lipides = 2 pour les thylacoïdes (Douce et Joyard 1979)).
1.2. STROMA.
Il contient des acides nucléiques (ARN et ADN), de nombreux ribosomes et les enzymes nécessaires à la fixation du CO
2et à la biochimie du chloroplaste.
1.3. THYLACOÏDES.
Ils sont organisés sous forme de vésicules membranaires aplaties (Figure 1.1. B). Les thylacoïdes des chloroplastes des plantes supérieures peuvent s’empiler pour former des grana. Ces grana sont reliés entre eux par des
lamelles stromatiques ou lamelles intergranaires.
Les membranes thylacoïdiennes contiennent l’ensemble des protéines nécessaires pour assurer les réactions photochimiques de la photosynthèse.
1.3.1. Les lipides de la membrane des thylacoïdes.
Les membranes thylacoïdiennes sont constituées de lipides particuliers : les galactolipides (Tableau 1.1) (Douce et Joyard 1990). Les galactolipides prédominants dans cette membrane sont le MGDG (monogalactosyldiacylglycerol) et le DGDG (digalactosyldiacylglycerol). Ils représentent 84 % des lipides thylacoïdiennes (respectivement 57 % et 27 %).
Cette membrane contient également 7 % de lipides anioniques, le SQDG (sulfoquinovosyldiacylglycerol). La phosphatidylcholine (PC) a été souvent détectée en faible quantité dans les préparations purifiées des thylacoïdes (Siegenthaler et coll. 1989). Cependant, les travaux réalisés par Dorne et coll.
(1990) ont montré que la PC détectée dans la membrane des thylacoïdes résulte d’une contamination par les membranes extra-chloroplastiques ou de l’enveloppe du chloroplaste.
2
T .-.viandes
Figure 1.2. A et B ; Coupe transversale de la membrane thylacoïdienne. C ;
Localisation probable des MGDG et DGDG dans cette membrane (Murphy,
Chapitre I : Introduction
1.3.1.1. Les glycerolipides.
1. MGDG : Les lipides membranaires adoptent des modes d’organisation différentes qui dépendent du rapport volume occupé par les chaînes carbonées hydrophobes/volume occupé par les têtes polaires hydrophiles (Cullis et De Kruijff 1979, Gruner et coll. 1985).
En raison du degré d’insaturation élevé de sa chaîne carbonée et du petit volume occupé par sa tête polaire, le MGDG adopte une forme conique (Figure I.2.C). Cette dernière ne favorise pas la structure en bicouche de type La mais plutôt la structure hexagonale de type Hn (Kreutz 1970, Shipley et coll.
1973) (Figure I.2.D). In vitro, le MGDG peut s’organiser en bicouche lipidique en présence de décane (Fuks et Homblé 1994). Une structure en bicouche dans la membrane thylacoïdienne est stabilisée par la présence d’autres lipides qui adoptent une structure cylindrique (Fuks et Homblé 1994).
Il a été proposé que le MGDG serait préférentiellement localisé en bordure des thylacoïdes granaires (Figure I.2.C) et ceci afin de faciliter et de stabiliser la courbure élevée de la membrane (Murphy 1986, 1982). Cependant, cette hypothèse n’a jamais été vérifiée.
Dans les années 80, il a été suggéré que le MGDG pourrait jouer un rôle dans l’organisation optimale des complexes protéiques de la membrane des thylacoïdes (Israelachvili et coll. 1980, Gounaris et Barber 1983). Récemment, De Kruijff (1997) a proposé que les lipides qui ne forment pas de bicouche (comme le MGDG) exercent une pression latérale sur la surface externe des protéines membranaires. Cette pression contribuerait au maintien de l’activité biologique de ces protéines (Figure I.3.). Les travaux récents réalisés par Simidjiev et coll. (1998) corroborent cette hypothèse. En effet, ces auteurs montrent que l’addition du MGDG aux macroaggregats multilamellaires du complexe LHCII (cf. paragraphe 11.1.3.) favorise les modifications structurales réversibles induites par la lumière.
3
Functional
m mm m m
HIH
Less functional
Lipidesqui ne forment pas debicouche(l).
(ex: MGDG)
Lipidesqui s’organisent enbicouche (2).
= Pression exercée par les lipides (1).
Figure I.3. Explication moléculaire du rôle probable des lipides qui ne
s’organisent pas en bicouches (comme le MGDG) dans la préservation de la
structure fonctionnelle des protéines membranaires (De Kruijff, 1997).
Chapitre I : Introduction
2. DGDG : Le DGDG possède une tête polaire un peu plus volumineuse que le MGDG. Ceci lui permet d’adopter une forme cylindrique (Figure I.2.C) plutôt que conique. Ce galactolipide peut facilement s’organiser en bicouche lipidique stable en phase aqueuse (Webb et Green 1991).
Le DGDG est un lipide essentiel pour la formation de cristaux de LHCII (Butler et kühlbrandt 1988).
3. SQDG ET PG : Ils adoptent une forme cylindrique due d’une part à l’insaturation modérée de leur chaîne carbonée et d’autre part, à leurs tètes polaires volumineuses.
Le rôle de PG dans la trimérisation du LHCII a fait l’objet de nombreuses études. Il a été montré que le PG est important pour l’oligomérisation du complexe LHCII mais n’est pas indispensable à la formation de grana des thylacoïdes (McCourt et coll. 1985, Bolton et coll. 1978, Browse et coll. 1985).
La digestion enzymatique du PG d’une préparation purifiée de LHCII provoque la dissociation complète de l’oligomère LHCII en monomère (Krupa et coll.
1987). Des résultats similaires ont été obtenus en traitant les thylacoïdes par une phospholipase A
2(Remy et coll. 1982). Récemment, Nupberger et coll.
(1993) ont estimé que le PG est étroitement associé aux polypeptides de LHCII ce qui suggère son rôle dans la formation des trimères LHCII.
1.3.1.2. Les pigments.
i
La membrane thylacoïdienne contient une quantité importante de chlorophylle (150 pg/mg protéines). Les chlorophylles constituent 20-30% des lipides totaux de cette membrane. Toutes les chlorophylles des plantes supérieures sont associées à des polypeptides spécifiques pour former des complexes pigments-protéines (Murphy 1986). Le taux de chlorophylle dans les plantes varie en fonction des conditions écophysiologiques auxquelles est soumise la plante (principalement la qualité et l’intensité de la lumière).
4
Chapitre I : Introduction
En plus des chlorophylles, la membrane thylacoïdienne contient des caroténoïdes (essentiellement les p-carotènes) (Jeffrey et coll. 1974). Ces pigments interviennent surtout dans les phénomènes de photoprotection . Ils sont liés à des complexes pigment-protéine probablement via des liens spécifiques mais non covalents (Siefermann-Harms 1984). Le prenylquinone majeur dans La membrane thylacoïdienne est le plastoquinone-9 (soll et coll.
1985).
I. 3.2. La nature de mosaïque de fluide de la membrane thylacoïdienne.
En 1972, Singer et Nicholson ont proposé le modèle de structure dit : la mosaïque fluide. Selon ce modèle, les bicouches lipidiques représentent une phase fluide dans laquelle seuls les réarrangements bidimensionnels sont possibles. Ils permettent aux complexes protéiques et aux autres composants hydrophobes de diffuser librement.
En 1973, Wang et Packer ont suggéré que des complexes protéiques sont capables de diffuser latéralement dans la membrane thylacoïdienne. Des travaux ultérieurs (Staehelin et Arntzen 1979, Briantais et coll. 1983) ont prouvé la diffusion latérale du complexe LHCII (cf. paragraphe 11.1.3.1). Selon ces auteurs, la diffusion latérale des protéines de ce complexe permet un meilleur transfert d’énergie d’excitation entre le PSII et le PSI.
La présence dans les membranes photosynthétiques de lipides (cf.
tableau 1.1) riches en acides gras fortement insaturés rend la membrane extrêmement fluide et favorise évidement cette diffusion.
II. LA PHOTOSYNTHESE.
La photosynthèse est un processus commun aux algues eucaryotes, aux
plantes supérieures, ainsi qu’à un groupe de procaryotes photosynthétiques ; les
cyanobactéries. La membrane thylacoïdienne contient plus de 60 polypeptides
A
B
PSII-LHCII ATP
Cyt b/f PSI-LHCl Synthe tase
Grana thylakoids c
{ "
nd membraneMargms
S troma thylakoid
□ m
APPRESSED planar CURVED (aon-appressed) (non-appressed)
Figure 1.4. A ; Organisation des composantes de la chaîne du transport
d’électrons et de la translocation de protons dans la membrane thylacoïdienne
des plantes supérieures (Anderson et Andersson, 1988). B : Localisation de trois
régions fonctionnelles dans la membrane des thylacoïdes : région granaire,
région stromale et région marginale (Webb et Green, 1991).
Chapitre I : Introduction
différents. La plupart de ces protéines sont organisées en quatre complexes membranaires : le photosystème I, le photosystème II, le complexe cytochrome bef et l’ATP synthase (Figure 1.4.A).
II. 1. LES COMPLEXES CHLOROPHYLLES-PROTEINES DE LA MEMBRANE DES THYLACOIDES.
Une série d’étude basée sur la microscopie électronique (Armond et ai 1977), la séparation biochimique (Vernon et coll. 1966, Sane et coll. 1970) et le génie génétique (Staehelin 1986, Gerola 1981) ont démontré l’existence de deux régions différentes dans les thylacoïdes (Figure 1.4.B) :
- région granaire riche en photosystème II et en complexe majeur LHCII : complexe collecteur de lumière. Ces régions granaires forment des grana.
-région lamellaire riche en photosystème I et en complexe CF0-CF1 responsable de la synthèse de l’ATP (Andersson et Anderson 1980, Albertsson et coll. 1982).
La localisation du PSI dans les régions lamellaires pourrait être la conséquence de répulsions électrostatiques entre les protéines du PSI localisées sur la face externe de la membrane (Barber 1982).
Le complexe cytochrome bef est localisé équitablement entre les deux photosystèmes (Cox et Andersson 1981, Peters et coll. 1983, Alired et Staehelin 1986).
11.1.1. Le photosystème I.
Le photosystème I est un complexe pigment-protéine de la membrane
photosynthétique qui assure le transfert d’électrons de la plastocyanine à la
ferrédoxine. Le PSI contient 15 à 20 polypeptides distincts et environ 225
molécules de chlorophylles a et b (rapport chl a/chi b > 5) (Golbeck et Bryant
1992). Chez les plantes supérieures et les algues vertes, le PSI est composé
Figure 1.5. Représentation schématique du complexe du centre réactionnel du PSI (CCI) (GolbecK 1992).
Figure I.6. Organisation schématique du PSI. La sous-unité LHCIb correspond
aux antennes majeures du PSI. La stoechiométrie des pigments présents dans le
complexe du centre réactionnel (CCI) est reprise d’après Bassi et coll. (1990).
Chapitre I : Introduction
d’un centre réactionnel (CCI) et des antennes périphériques (LHCI) (Figure 1.6).
Le complexe protéique du centre réactionnel du PSI (CCI) (Figure 1.5) contient au moins 14 polypeptides distincts (PsaA à PsaN), 100 à 120 molécules de chlorophylle a, 14-15 molécules de p carotène pour un P700, trois protéines fer- soufre (4Fe-4S) et une ou plusieurs phylloquinones (Yamamoto et Bassi 1996, Brettel 1997). Parmi les différents polypeptides du CCI, deux sous-unités possèdent une masse moléculaire relativement élevée. Il s’agit de PsaA (83 kDa) et PsaB (82.4 kDa) (Kitmitto et coll. 1997). Elles sont présentes en une seule copie dans le PSI et s’organisent en heterodimère qui s’associe à P700 (dimère de chlorophylle a), à Ao (monomère de chlorophylle), à Ai (phylloquinone), à Fx (protéine fer-soufre) et à environ 100 molécules de chlorophylles (Melis 1991). Trois polypeptides du PSI sont exposés à la surface de la membrane orientée vers le stroma : PsaC, PsaD et PsaE (Figure 1.6). Le PsaC (9 kDa) est lié aux deux protéines fer-soufre F a et F b (Zilber et Malkin 1988). Le PsaD (15-18 kDa) et le PsaE (8-11 kDa) sont impliqués dans les interactions du complexe PSI avec la ferrédoxine (accepteur final d’électrons).
Le PsaF (9 kDa) est lié à la plastocyanine (donneur primaire d’électrons) (Golbeck et coll. 1988, Chitnis et coll. 1995). Le rôle physiologique des autres polypeptides du PSI (PsaG, I, J, K, L, M et N) n’est pas encore complètement élucidé.
Les antennes périphériques du PSI (LHCI) contiennent des chlorophylles
a et b (80 à 120 chl/complexe) et des caroténoïdes (lutéine et violoxantine)
(Siefermann-Harms 1985). Il existe au moins trois complexes chlorophylle-
protéine de type LHCI (LHCIa, LHCIb et LHCIc) (Welty et Thornber. 1992,
Preiss et coll. 1993). Chaque PSI est lié à environ 8 complexes LHCI (Boekema
et coll. 1994). Ces complexes s’organisent individuellement en dimère (Dreyfuss
et Thornber 1994). La structure tridimensionnelle du PSI des cyanobactéries a
été déterminée avec une résolution de 6 A°. Elle indique que les deux
polypeptides PsaA et PsaB possèdent 9 hélices a qui sont reliés entre elles par
un axe de rotation qui passe à travers la protéine fer-soufre Fx ( Krauss et coll.
Figure 1.7. Différentes sous-unités du complexe PSII et le chemin de transfert
d’électrons à travers ce complexe (Hankamer et Barber, 1997).
Chapitre I : Introduction
1993). Récemment, Kitmitto et coll. (1997) ont déterminé la structure des cristaux 2D du PSI des épinards. Selon ces auteurs, les structures du PSI des plantes supérieures et des cyanobactéries sont similaires.
II. 1.2. Le photosystème II.
11.1.2.1. Les polypeptides du PSII et leurs rôles dans le transfert des électrons.
Le PSII est une entité structurale capable d’absorber la lumière, d’oxyder l’eau, de réduire la plastoquinone et d’induire une asymétrie transmembranaire de potentiel électrochimique.
Un PSII typique (exemple chez les épinards) contient au moins 20 polypeptides (Andersson et Styring 1992), 100-200 molécules de chlorophylles (Hansson et Wydzynski 1990), 50 molécules de caroténoïdes, au moins trois plastoquinones (Q a , Q b , Z), un atome de fer, deux molécules de phéophytine, une ou plusieurs molécules de cytochrome b-559, quatre manganèses et une quantité indéterminée de chlorure et de calcium liés aux deux protéines périphériques de 23 (psbP) et de 16 kDa (psbQ) (Ort 1986).
La réaction réalisée par les cofacteurs et les protéines du PSII se résume en l’équation suivante :
2
H
2O + 2PQ PSII-Humière^ O
2+
2PQH
2Les molécules de chlorophylle a et b et de caroténoides (P carotène,
lutéine, néoxantine et violoxantine) associées aux protéines antennaires (LHCb)
du PSII (Bassi et coll. 1993, Kühlbrandt et coll. 1994) captent l’énergie
lumineuse responsable de l’activation de l’enzyme H20-Plastoquinone
oxidoréductase. L’énergie d’excitation est transférée vers le centre réactionnel
du PSII via les molécules de chlorophylles associées au CP47 (PsbB) et au
f SMr'Ti'!
“«'•* oj if.itU- tncnihr;inc
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PSII
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;'W»C Cf'-J .'fl Ohn(S) ty LtcMdtion CMcrç)' ir:in;fcr, hnuls 3' U3j 11 7 fi'l/ISl 1 riiotopnjiccîiun
!•’. prnic.n 7 :s.7fsi 1 PSII j-C'.CMihly, P.Sil «Ulnliiy Fui! PSII
t. -1 1 [fivnivcd in 0.\ rinicfnm core
/
mM/ M pn>ic:
m: 755(0 !
/M/-.-V N prtMem J 722(T) I •>
psiiO 33AÜJ exi. [KOictn :6.559(S) 0 .SiühilÎ7cs Mn clutlcr. C
j' C! bimJiny cxt. prulcin 'ü 2ll)(S) n C.i* ;if»d Cl btiidinc
Id Wy.T eu, proicni I6.5:5(S1 U C.t' Jnd Cf binding
R pfoierft K) :3('.(S) t) I3niior ;jnd .icceplur sidc Itmcttons ftshS .S prnfciM 21.705(5) 4 CId cluf>Çf('Min/;inicniia wcrniponent /n/’7' 1‘ prnicîo .' 2.53(S) n )
V prntsin * I5.I2USV) 0 Idnnor .tldc stjhiüiy
l>s!iW W proictn 5.92,S(S) 1 •?
Hj/l.V X nrotem ■1 22S(S) I 0 N funettun lin
Hu it ' Ihrhn
l.lithJ (CP29) Lhcb5 (CP:9) i.ii.-bô
iC
p:
ji29 1^,
3 3
L'.xpitütiorî energy (raiislcr Si dissiptnion Excitation energy transl'cr Sc tlixxipution Cxcitulion cr*crcv (ranxfcr Si dix.xinalion
PSII core &
minor CAB proteins p^hJ J prutem 4 I I6(P) 1 PSn is.xcmhly
Full PSII &
p\hU L1 proicin * lO(Cv)
Ihcb/ Lhcbl 25 3 Liglit li:mcxtii»g antenna
Ihlhl l.hcb2 '5 3 Licfd harvçstinc complex
Un h i 1 hüO 25 3 i .tylil liât vcMiMC
Tableau 1.2. Composition en polypeptides du PSII : Structure primaire, structure
secondaire et fonction. (S), épinards; (Sy), syneohoccus sp; (P), pois; (T), tabac. (*),
les sous-unités détectées uniquement dans les cyanobacteries (Hankamer et
Barber, 1997).
Chapitre I : Introduction
CP43 (PsbC) (Bassi et Dainese 1992, Satoh 1993, Trebst 1986) (Figure 1.7).
L’énergie absorbée oxyde le P680 (en P680'') qui cède son électron à une molécule de phéophytine formant ainsi un radical pair P680''pheo' (Barber et coll. 1987, Satoh 1996). Le P680 est composé de deux molécules de chlorophylle a liées aux deux protéines DI (PsbA) et D2 (PsbD) (Barber et coll.
1987, Nanba et Satoh 1987, Tang et coll. 1990). La réduction du P680'' est assurée par un électron fournie par la molécule d’eau via le complexe générateur d’oxygène (OEC) situé à la surface du PSII orientée vers l’espace interne des thylacoïdes (Babcock 1987, Britt 1996, Pecoraro et coll. 1995). La phéophytine cède l’électron donné par le P680 à une molécule de plastoquinone (Q a ) étroitement liée à la protéine D2 (Diner et coll. 1981, Lancaster et coll.
1996, McPherson et coll. 1994, Trebst 1986). Q a ' cède son électron à une autre molécule de plastoquinone (Q b ) qui est liée à la protéine DI (Dostatni et coll.
1988, Michel et Deisenhofer 1988, Paddock et coll. 1995). Chaque plastoquinone Q b peut accepter deux électrons de l’eau et deux protons du stroma pour former une plastoquinone réduite PQH
2.
Dans le noyau du PSII, on trouve également le complexe OEC (oxygène- evolving complexe) qui est composé de trois protéines extrinsèques de poids moléculaires : 33 kDa (psbO), 23 kDa (psbP) et 16 kDa (psbQ). Ces protéines sont localisées à la surface de la membrane et sont en contact avec l’espace interne du thylacoïde. Le complexe OEC contient aussi quatre atomes de manganèse (Andersson et Akerlund 1987, Britt 1996, Ghanotakis et Yocum 1985) qui sont stabilisés par La protéine de 33 kDa (Murata et Miyao 1985).
En plus de ces polypeptides qui contribuent à la réduction des
plastoquinones, d’autres polypeptides sont associés à la membrane des
thylacoïdes (Tableau 1.2). Ils ont un poids moléculaire inférieur à 10 kDa
(Erickson et Rochaix 1992), sauf la protéine S (psbS) dont la masse molaire est
de 21.7 kDa. La fonction de ces protéines ainsi que le nombre exact des petites
protéines présentes dans la membrane thylacoïdienne demeurent inconnus.
CP26 (LhcbS)
— ' ~rAtf ■--
V'.:. ■.
LHC-II (Lhcb1&2)
CP29 (Lhcb4)
CP29 (Lhcb4)
LHC-II (Lhcb1&2)
, ■ --- -, ■ -—■■
•. .*<_ ■: - ___^ ■-.. *■
-LL^-3Li_r—7 (^- —- . .. dj - .^'-
CP43
■s=*.
CP26 (LhcbS)
- ^ - - --
Figure 1,8. Localisation proposée des sous-unités majeures du PSll dans le
supercomplexe LHCll-PSll (Barber. 1998).
Chapitre I : Introduction
11.1.2.2. Organisation et structure du PSII.
Le supercomplexe PSil-LHCII a été isolé en solubilisant la membrane des thylacoïdes par un détergent très peu dénaturant (n-dodecyl p-D-maltoside). La caractérisation structurale de ce supercomplexe montre que le PSII s’organise en dimère (Boekema et coll. 1995). Le dimère du PSII-LHCII a un poids moléculaire de 725 kDa (Hankamer et coll 1997).
Les informations fournies par l’étude des cristaux 2D des différentes formes isolées du PSII ont rendu possible la localisation des protéines majeures dans le super-complexe PSII-LHCII (Figure 1.8) (Barber 1998).
D’autre part, la comparaison des données structurales du PSII et de celles du PSI obtenues par la cristallographie au rayon X ( Krauss et coll. 1996) montre des similarités significatives des structures des deux photosystèmes (Rhee et coll. 1997).
11.1.2.3. Phosphorylation du PSII et régulation de dégradation-remplacement de la protéine DI.
L’activité du PSII est très sensible à l’intensité photonique. A forte intensité, l’altération du PSII entraîne une photoinactivation. Deux mécanismes de photoinactivation ont été identifiés (Barber et Andersson 1992) :
-L’altération du transfert d’électron à l’accepteur secondaire Qedu PSII provoque la formation à la fois du radical pair P680^Pheo‘ et d’un triplet ^P680 (Durrant et coll. 1990). En présence d’oxygène, le triplet ^P680 réagit avec celui-ci et libère un singulet d’oxygène (Hideg et coll. 1994, Telfer et coll. 1994) selon la réaction suivante :
3P680 + 3Q2 --- > P680 + *02
-L’inactivation du donneur primaire d’électron du PSII permet
l’accumulation des oxydants forts, P680^et Tyr*, qui oxydent les pigments et les
Figure 13. Schéma du rôle de la phosphorylation des protéines du PSII et de la
conversion dimère/monomère, dans la synchronisation du processus
dégradation-synthése de la protéine D1 suite à un stress lumineux (Kruse et al,
1997). G : région granaire, S : région stromale, P : groupe phosphate.
Chapitre I : Introduction
acides aminés les plus proches (Sharma et coll. 1997).
Ces deux mécanismes de photoinactivation aboutissent à une oxydation de la protéine DI (et, à un degré moindre, de la protéine D2) du PSII. En 1998, Barber a suggéré que l’oxydation de la protéine DI induit des changements conformationels qui provoquent l’inactivation de cette protéine. Afin de maintenir une photosynthèse optimale, un mécanisme de dégradation contrôlée et synchronisée de DI suivi de son remplacement par une nouvelle protéine DI se met en place (Barber et Andersson 1992). Il a été suggéré que le processus de dégradation-synthèse de DI implique d’une part, la dissociation du dimère PSII en monomère (Barbato et coll. 1992) et d’autre part, la diffusion latérale du PSII du grana vers la région lamellaire de la membrane des thylacoïdes (Melis 1991).
Selon ces auteurs, après l’inactivation de la protéine DI, le dimère PSII est dissocié en monomère qui migre vers la région lamellaire où la protéine DI sera dégradée et remplacée. Kruse et coll. (1997) ont montré que le dimère PSII phosphorylé est plus stable et résiste mieux à la monomérisation que le dimère PSII non phosphorylé. La région où la dissociation du dimère en monomère se réalise reste actuellement inconnue.
Bennett (1991) a montré la phosphorylation des protéines DI, D2, CP43 et psbH du coeur du PSII (Tableau 1.4). La phosphorylation réversible de ces protéines implique le résidu thréonine de la région N-terminale exposée à la surface de la membrane en contact avec l’espace interne du thylacoïde.
11.1.3. LHCII (Lhcbl et Lhcb2).
11.1.3.1 Composition et structure.
Les protéines du complexe LHCII de plusieurs espèces des plantes
supérieures ont une composition similaire en acides aminés. Elles sont riches en
prolines et en résidus hydrophobes et pauvres en histidines (Richter et Homann
1984, Thornber et coll. 1979).
'4'
''
r.'..•r-itn et ai. Thorneer et ai. Basa; et ai. Harr.aon i.aL .M e ! ; i
Lhca [ Type [ LHCI LHC Ib LHCI-'àO -
Lhcal Type [[ LHCT LHCI-obO -
Lhcuà Type III LHCI LHC la LHCI-obO -
Lhca^ Type IV LHCI LHC Ib LHCI-'30 -
Lncb l Type I LHCII LHC Ilb 28 kDa LHCII b Lhcb: Type II LHCII ' LHC Ilb 27 kDa LHCII c Lhcbj Type III LHCII LHC Ilb 25 kDa LHCI la dl’
Lhcb4 Type II CP29 LHC lia CP29 a
Lbccf Tvpe I C?:9 LHC Ile CP2b - >
Lhcbo CP24 LHC Ild CP 2^
Tableau 1.3. Différentes nomenclatures des protéines LHC (Jansson 1994).
stroma
Figure 1,10. Monomère LHCII. Le plan du monomère montre 4 hélices dont trois traversent la membrane thylacoïdienne (A, B et C), et la quatrième hélice reste exposée à la surface lumenale de la membrane (D) (Kühlbrandt et al , 1994).
T S
SLQ .T G ■
ATGTPSKA A D A A
3VAAKPVG FIS HSLLP E AN SR K ST
TYPEl RJCTATKAKPV'SSGSPWYGPDRVKYLGPFSGESPSYLTGErPGDYGWDTAGLSADPETFAKNRELEVIHCRWAMLGA I " ~ T I I I I I
TYPE2 RRTV KSVF QSIWYGEDRPKYLGPFSEQTPSYLTGEFPGDYGWDTAGLSADPETFARNRELEVIHCRWAMLGA
I RAAS E A F G AV K S
P
T
I Q VAE
S AL GLKAKDQSQI L TI I I QII L
TYPE! LGCVFPELLARNGVKFGEAVWFKAGSQIFSEGGLDYLGNPSLVHAQSILAIWACQWLMGAVEGYRVAGGPLGEWDP
! ! ~ ~ ! ! ! TYPE2 LGCVFPEILSKNGVTFGEAVWFKAGSQIFSEGGLDYLGNPNLVHAQSILAIWATQWLMGFVEGYRVGGGPLGEGLDK
ILVLK AOQAI C LI T P
A Q i A Q
TV Q T L
I N ERAD G E L K L I IGD IV SY R
TYPE! LYPGGSFDPLGLADDPEAFAELKVKEIKNGRLAMFSMFGFFVQAIVTGKGPLENLADHLADPVNNNAWAFATNFVPGK
I !
TYPE2 lYPGGAFDPLGLADDPEAFAELKVKEIKNGRLAMFSMFGFFVQAIVTGKGPIENLSDHIADPVANNAWAFATNFVPGK
LL D K Y L Y
Figure I.10.E. Comparaison des séquences des acides aminés des deux
polypeptides LHCbl (TYPE1) et LHCb2 (TYPE2) chez les angiospermes et les
Chapitre I : Introduction
Chez les plantes supérieures, les protéines du LHCII (Tableau 1.3) sont codées par une famille de vingt gènes nucléaires (Buetow et coll. 1988, Green et coll. 1991).
Les LHCII isolés à partir des feuilles d’algues vertes (Apel 1977), des épinards (Ryrie et coll. 1980, Andersson et coll. 1982, Ryrie et Fuad 1982), de l’orge (Dunkley et Anderson 1979, Ryrie et Fued 1982, Simpson 1979) et des pois (Ryrie et coll. 1980, Bennett et coll. 1981) contiennent au moins deux polypeptides de 21-29 kDa. Larsson et coll. (1987) ont montré que le complexe LHCII est extrêmement hétérogène et composé en grande partie par deux protéines de 27 et de 25 kDa. Les protéines de 27 kDa seraient situées à l’intérieur du complexe LHCII où elles sont strictement liées au noyau du PSII.
Les protéines de 25 kDa enrichissent la face périphérique du complexe.
Actuellement, la contribution des deux polypeptides Lhcbl et Lhcb2 (Tableau 1.4) dans la formation du complexe LHCII est clairement établie. Les protéines Lhcb3, Lhcb4, Lhcb5 et Lhcb6 sont également des protéines LHC du PSII qui peuvent être détectées dans les préparations purifiées du complexe LHCII (Jansson 1994).
La structure du complexe LHCII a été déterminée par la cristallographie électronique à 3.4 A° (Kühlbrandt et coll. 1994). Le polypeptide du monomère LHCII (LHCbl ou LHCb2) (Figure 1.10) est composé de 232 acides aminés. Il est lié à au moins 12 molécules de chlorophylle a et b (Kühlbrandt et coll. 1994), à deux lutéines et une autre xantophylle (Bassi et al 1993, Juhier et al 1993) et à deux lipides différents le Digalactosyldiacylglycerol (DGDG) et Le phosphatidylglycerol (PG). L’analyse cristallographique du complexe LHCII (Kühlbrandt et coll. 1994) a révélé que chaque monomère est organisé en quatre hélices ; Deux hélices transmembranaires A et B (Figure 1.10. A, B) de 30 à 35 a.a., une hélice transmembranaire C (Figure I.10.C) de 20 a.a. et une petite hélice amphipatique de 10 a.a (Figure 1.10.D). Les deux hélices A et B s’inclinent selon un angle proche de 30° par rapport à la normale à la membrane. L’hélice C est légèrement inclinée par rapport à la normale à la
12
Figure 1.11. Vue d’au-dessus d’un trimère LHCII (Kühlbrandt et al, 1994).
Chapitre I : Introduction
surface membranaire (11°) et elle est séparée des deux autres hélices. L’hélice D est située du côté de l’espace interne des thylacoïdes et elle est orientée parallèlement à la surface de la membrane. Toutes les protéines du LHCII ont une structure similaire (Pichersky et coll. 1991, Jansson 1994).
11.1.3.2. Trimérisation du LHCII.
Dans les plantes supérieures, les polypeptides du LHCII sont codés par un gène nucléaire. Ils sont synthétisés sous forme de précurseurs dans le cytoplasme. Le précurseur (p)LHCII traverse d’abord l’enveloppe du chloroplaste, ensuite le stroma probablement sous forme de complexe soluble (Reed et coll. 1990, Payan et Cline 1991, Li et coll. 1995). Une fois que le LHCII est inséré dans la membrane des thylacoïdes, il est complexé sous sa forme mature avec les chlorophylles a et b et les xantophylles. Les complexes monomériques du LHCII sont assemblés en complexes trimériques (Dreyfuss et Thornber 1994) (Figure 1.11). Ces derniers sont groupés dans le PSII.
Des monomères fonctionnels de LHCII ont été reconstitués in vitro en absence des lipides (Plumiey et Schmidt 1987, Paulsen et coll. 1990). Les lipides sont essentiels pour la formation du trimère LHCII, en particulier le PG qui est directement impliqué dans la formation et la stabilisation du trimère LHCII (Rémy et coll. 1984, Trémolières et coll. 1994).
Nupberger et coll. (1993) ont montré que la digestion enzymatique des 50 premiers acides aminés de la région N-terminale du LHCII induit non seulement le détachement du PG du complexe, mais aussi la dissociation du trimère LHCII en monomère. Plus précisément, les acides aminés localisés en position 17 à 22 dans la région N-terminale constituent un motif essentiel à la trimérisation du LHCII (Hobe et coll. 1995). Il s’agit de la séquence WYXXXR. Elle contient les trois acides aminés TryplO, Tyr17 et Arg21, essentiels pour la formation du trimère LHCII.
Les complexes mineures chlorophylles-protéines des antennes du PSII
13
Protein Spectes Phosphorylation site Reference LHCII
Type I 27 kOa pea
spinach
?-{R,K)SAT(?P)T(7P)KK...
Ac-RKT(P)AGKPKN...
Ac-RKT(P)AGKPKT...
Ac-RKS<P)AGKPKN...
Mullet (1983) Michel et al (1989) Michel et al (1989) Michel et al (1989) Type II 25 kDa spinacti Ac-RRT(p)AKSVPQ... Michel et al (1989) PS II
psbH protein-SkDa spinach AT(P)QTVESSSR... Michel et al (1988)
DI 32 tcDa spinach Ac-T(P)AIL£RR... Michel et Bennett (1987)
D2-34 kDa spinach Ac-T(P)1AVGK... Michel et Bennett (1987)
CP43 43 kDa spinach Ac-T(P)LFNGTLTLAGR.. Michel et Bennett (1987) Stromal
PPDK94kDa Rubisco LS 54 kDa Rubisco SS 14 kDa GaL3-PDH 38 kDa
maize spinach spinach spinach
.. TERGG^rr(P)SH(P)AAWAR
Roeske et al (1988) Foyer (1985) Kaul et al (1986) Guitton et Mach (1987)Tableau 1.4. Les phosphoprotéines identifiées dans les thylacoïdes et le
stroma (Bennett 1991).
Chapitre I : Introduction
Lhcb4 (CP29), LhcbS (CP26) et Lhcb6 (CP24) (Tableau 1.3) forment des complexes monomériques (Peter et Thornber 1991, Hoizenburg et coll. 1993, Dunahay et Staehelin 1986, Bassi et coll. 1987).
On ignore actuellement, si les monomères Lhcbl et les monomères Lhcb2 (Tableau 1.4) s’associent en homo-trimères ou en hétéro-trimères et si la stoechiométrie de leurs associations est fixe ou variable (Spangfort et Andersson 1989, Allen et Staehelin 1992). On ignore aussi, si le monomère Lhcb3 appartient ou non aux oligomères LHCII (Peter et Thornber 1991).
11.1.3.3. Phosphorylation du LHCII et régulation de l’énergie lumineuse.
L’exposition d’une plante à un éclairage intense provoque une forte excitation du PSII de la membrane des thylacoïdes, suivie d’une réduction excessive de plastoquinone localisée entre les deux photosystèmes PSII et PSI.
La présence d’une grande quantité de plastoquinone réduite dans la membrane induit l’activation d’une kinase membranaire qui se met à phosphoryler les monomères du complexe LHCII (Larsson et coll. 1987).
Les charges négatives du groupement phosphate (PO4), localisées à la surface du LHCII après sa phosphorylation, provoquent la dissociation partielle du supercomplexe LHCII-PSII (Barber 1982). Le LHCII(P) libre migre latéralement vers le PSI où il agit comme une protéine antennaire (Allen 1992, Larsson et coll. 1987).
La dissociation du supercomplexe LHCII-PSII après phosphorylation est probablement provoquée par la perturbation des interactions spécifiques protéine-protéine et protéine-lipide (Bennett 1991, Allen 1992).
Dès que le stress photonique disparaît, la déphosphorylation du LHCll(P) est déclenchée. Le LHCII déphosphorylé migre de la région lamellaire vers la région granaire où il rejoint le PSII. L’exposition alternative des plantes à des cycles lumière/obscurité en présence de y^^P-ATP a révélé l’activation, dépendante de la lumière, d’une kinase fixée à la membrane des thylacoïdes
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Chapitre I ; Introduction
(Bennett 1979) qui catalyse la phosphorylation du polypeptide du complexe LHCII (Bennett 1977). Cinq séquences de site de phosphorylation ont été identifiées dans cinq LHCII : un site dans le LHCII des pois et quatre sites dans le LHCII des épinards (Tableau 1.4).
La température représente un autre paramètre qui induit une organisation dynamique et réversible dans la membrane thylacoïdienne. In vitro, une augmentation de la température des thylacoïdes des épinards aux environs 40°C induit le détachement du complexe LHCII du PSII d’une manière similaire au LHCII(P). Le PSII libre migre vers la région lamellaire riche en PSI (Sundby et Andersson 1985, Gounaris et coll. 1983). La dissociation du complexe LHCII du PSII diminue fortement la capacité du PSII de convertir l’énergie lumineuse en énergie chimique (Anderson et Andersson 1988). Dès que la température diminue, le PSII migre vers la région granaire où il se fixe au LHCII.
La migration latérale du LHCII(P) vers le PSI après sa dissociation du PSII ou la migration latérale du PSII vers la région lamellaire après sa dissociation du LHCII est une stratégie que la plante utilise afin de minimiser les dommages causés par un brusque stress photonique ou thermique.
11.2. LA PHOTOPHOSPHORYLATION.
11.2.1. Théorie de Mitchell.
Mitchell (1961) fut le premier à proposer le modèle selon lequel la différence du potentiel électrochimique des protons créée à travers une membrane pourrait apporter l’énergie nécessaire à la synthèse de l’ATP. Le modèle de Mitchell est basé sur trois postulats :
1- dans la membrane, les réactions d’oxydoréduction sont vectorielles. Le transfert d’électrons à travers la membrane établit un gradient de potentiel électrochimique de protons (la force proton-motrice).
2- L’ATPsynthase qui assure le transport des protons et la synthèse de
ADP
^Pi
AT P + H,0
..
Stroma (out)
J membrane
lumen (in)
Figure 1.12. Structure schématique des deux sous-unités FO et Fl et du
mécanisme suggéré du catalyse rotationnel de l’AIPsynthase (Vik et Antonnio
1994, Duncan et coll. 1995). Les positions relatives des sous-unités a, b, b’ et c
sont spéculatives. Les sous-unités b, b’, c et a sont les homologues respectifs des
sous-unités I, II, lll et IV chez les cyanobactéries.
Chapitre I ; Introduction
l’ATP est insérée dans la membrane.
3- Les deux postulats 1 et 2 sont réalisés dans un système membranaire très peu perméable aux protons et aux anions hydroxydes. Par conséquent la
dissipation du potentiel électrochimique reste très faible.
D’autres expériences ont confirmé les hypothèses de Mitchell. En effet, Jaggendorf et Uribe (1966) ont montré que la création d’un gradient de pH artificiel à travers la membrane des thylacoïdes induit la synthèse de l’ATP en absence d’une chaîne de transport d’électron fonctionnelle (Miles et Jagendorf 1970). La production
de l’ATP a été aussi réalisée en absence d’un gradient de pH, mais en présence d’un potentiel de diffusion dans la membrane thylacoïdienne (Uribe 1973). En solution, des chloroplastes soumis à un champ électrique synthétisent également de l’ATP (Witt et coll. 1976).
11.2.2. Le facteur de couplage, l’ATPsvnthase.
La phosphorylation de l’ADP est catalysée par l’ATPsynthase.
L’ATPsynthase (Figure 1.12) est constituée de deux unités principales :
-F1 : est située à la surface externe de la région lamellaire. Elle est composée de cinq sous-unités (a, p, y, ô et s) dans des proportions bien déterminées : 3 a, 3 p, 1 y, 1 ô et 1 e (Grégory 1989).
Les deux sous-unités a (55 kDa) et p (54 kDa) sont organisées alternativement en une structure circulaire. La sous-unité y (36 kDa) est localisée au centre du cercle et elle est liée à la sous-unité III de FO (Watts et coll. 1995). La sous-unité 5 (21 kDa) est probablement liée à a-p (Lill et coll.
1996, Aggeler et coll. 1997). La sous-unité s (15 kDa) peut être localisée dans la
région qui lie le FO à Fl. La localisation des différentes sous-unités du Fl a été
déduite à partir des expériences basées sur des techniques de cross-linking, de
microscopie électronique (Boekema et coll. 1990) et de cristallographie
Chapitre I : Introduction
(Abrahams et coll. 1994).
-FO : est transmembranaire et elle est composée de quatre sous-unités I (17 kDa), Il (16.5 kDa), III (8 kDa) et IV (27 kDa) dont la stoechiométrie est : 1 copie I, 1 copie II, plusieurs copies III et 1 copie IV (Haraux et Kouchkovsky
1998). Les sous unités I, II, III et IV sont les homologues respectifs des sous- unités b, b’, c et a chez les cyanobactéries (Figure 1.12). FO conduit les protons de l’espace interne des thylacoïdes vers le stroma, la structure tridimensionnelle du FO n’a pas encore été déterminée. Il a été proposé que la sous-unité III est organisée en oligomères de 9 à 12 unités (Singh et coll. 1996).
11.2.2.1 Modèle du fonctionnement de l’ATPsynthase.
Le modèle le plus explicite est celui proposé par Vik et Antonio (1994), Duncan et coll. (1995). Ce pendant, il reste assez spéculatif en raison du manque de données structurales. Selon ce modèle. Les 9 à 12 sous-unités III forment un anneau qui constitue la partie mobile (rotor) de FO et les sous-unités I, Il et IV s’associent et constituent sa partie fixe (stator). La partie fixe contient deux canaux de protons dont un est tourné vers le stroma et l’autre vers l’espace interne du thylacoïde. La fixation continue d’un proton par la sous-unité III via le canal à proton tourné vers l’espace interne du thylacoïde et les fluctuations thermiques induisent une rotation unidirectionnelle de l’ensemble des sous- unités III. Ensuite, ce mouvement circulaire est transmis à la sous-unité y qui est étroitement associée à Fl. La rotation de y incite les sites catalytiques de p à adopter les configurations successives suivantes : une configuration qui lie l’ADP (et Pi), une configuration qui lie l’ATP et une configuration qui ne lie ni les nucléotides (ADP et ATP) ni le phosphate (Pi) (Boyer 1993, 1997).
La stoechiométrie du rapport H'^/ATP (proton transporté par ATP formé) a été estimée de 2-3 (Rathenow et Rumberg 1980). Actuellement, elle est considérée égale à 4 (Haraux et Kouchkovsky 1998). Cette différence est probablement due à la diversité du matériel (chloroplaste, mitochondrie.
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Chapitre I : Introduction
bactérie, liposome) et des techniques utilisées pour sa détermination. Bien que la valeur 4 de ce rapport est actuellement la plus probable, elle n’est pas considérée comme définitive.
11.2.3. La différence de potentiel électrochimique.
Lors de l’illumination, le transfert des électrons dans la membrane des thylacoïdes et le mouvement des protons vers l’intérieur des vésicules thylacoïdiennes contribuent à l’établissement d’une différence de potentiel électrique positive et d’une acidification à l’intérieur des thylacoïdes, autrement dit une différence de potentiel électrochimique ou force proton-motrice (PMF) (Mitchell 1978).
PMF = A^F = AY - 2.3 RT/F ApH
F est la constante de Faraday (96550 J mol'^ V^), R est la constante des gaz parfaits (8.3 J mol'^ KT^), A\\f est la différence de potentiel électrique membranaire (V), Ap est la différence de potentiel électrochimique membranaire (J mol'^).
Les ions H+ accumulés dans l’espace interne des thylacoïdes utilisent le gradient électrochimique pour traverser la membrane via l’ATP synthase. La fixation de H+ par la sous-unité C de l’ATPsynthase incite, via la rotation de la sous-unité y, la sous-unité p à adopter une configuration qui permet la synthèse de l’ATP.
II.2.3.1 Le potentiel électrochimique de protons lors d’une illumination continue du chloroplaste (Figure 1.13).
Une illumination continue des chloroplastes (30S) induit une
augmentation importante du potentiel électrique AT (de l’ordre de +200 mV)
A B
c-'-c-
exciting Ugnt
rate ot Imecr etecuon transpon
eiectric poieniici Citference
cnemjcal poientiCi :nierence o( the proton
Chemical pctentia; Ciderenco ot one counter lOn
- 30 sec
time
