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Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository
Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:
Hebrant, A. (2010). Pathologies thyroïdiennes et modèles in vitro: profils d'expression génique et phénotypes moléculaires (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté de Médecine – Sciences biomédicales, Bruxelles.
Disponible à / Available at permalink : https://dipot.ulb.ac.be/dspace/bitstream/2013/210139/4/fb7a7dad-e73f-49ea-a946-9af42d11e45f.txt
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BCM
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UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES
FACULTE DE MEDECINE
Institut de Recherche Interdisciplinaire en Biologie Humaine et Moléculaire (IRIBHM)
Promoteur de Thèse : Dr. C. Maenhaut Co-Promoteur de Thèse : Pr. J.E Dumont
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Pathologies thyroïdiennes et modèles in vitro : profils d'expression génique et phénotypes moléculaires
Thèse présentée en vue de l'obtention du grade académique de Docteur en Sciences Biomédicales
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Aline Hébrant décembre 2009
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Promoteur de Thèse : Dr. C. Maenhaut ■ . ; i
Co-Promoteur de Thèse : Pr. J.E Dumont - ^ ~ r
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Membres du jury : ■^ v ^
Pr. Pierre Bergmann (Président) . '/ V >■ :
Pr. Laurence Leenhardt ^
Pr. Marie-Christine Many '
RÉSUMÉ
La thèse s’inscrit dans un projet de recherche global visant à caractériser les tumeurs thyroïdiennes sur le plan moléculaire, afin de mieux comprendre leur physiopathologie et afin d’identifier des biomarqueurs (signatures moléculaires) qui pourront être utilisés pour le diagnostic, le pronostic et leur traitement. Parmi celles-ci, nous distinguons les adénomes autonomes (AA) et folliculaires (FTA) tumeurs bénignes encapsulées, et les carcinomes, tumeurs malignes. Ceux-ci sont eux-mêmes subdivisés en carcinomes différenciés, folliculaires (FTC) ou papillaires (PTC), et peuvent évoluer en carcinomes anaplasiques (ATC), totalement dédifférenciés. Un autre type de tumeurs bénignes différenciées, très rares, existe; l’hyperthyroïdie non auto-immune familiale (FNAH). Ces tumeurs sont causées pour la plupart par des mutations qui activent de manière constitutive des cascades de signalisation, essentiellement la cascade de l’AMPc et la cascade des MAPK. Le but de notre thèse était de valider un système expérimental in vitro des PTC, d’étudier les profils d’expression génique des FNAH et de les comparer avec ceux des AA, et de définir les profils ARNm et miRNA des ATC pour les comparer à ceux des PTC pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles. Pour réaliser ces objectifs, nous avons utilisé la technologie des microarrays qui permet d’analyser simultanément l’expression de milliers de gènes dans différentes conditions. Nous avons donc utilisé une approche multidisciplinaire alliant une partie expérimentale et une partie bioinformatique.
La première partie du travail a consisté à réaliser un modèle d’étude in vitro pour caractériser les PTC au niveau moléculaire. A cet effet, des cultures primaires de thyrocytes ont été traitées avec de F EGF et du sérum pendant différents temps (l,5h, 3h, 16h, 24h et 48h) ce qui stimule la cascade des MAPK, activée constitutivement dans les PTC. Nous avons hybridé sur des lames microarrays maison les différents échantillons et nous avons montré que les cultures primaires stimulées pendant des temps longs (24h et 48h) ont des profils d’expression génique qui ressemblent à ceux des PTC et constituent donc un bon modèle d’étude de cette tumeur.
La seconde partie a pour objectif de définir les phénotypes moléculaires et fonctionnels des FNAH et de les comparer aux AA. Ces deux pathologies résultent d’une mutation dans le récepteur de la TSH (TSHR) activant de manière constitutive la cascade de l’AMPc. Dans le cas des FNAH, la mutation est héréditaire et toute la glande est affectée eontrairement aux AA où la mutation survient plus tard, généralement à l’âge adulte, et où seule une partie de la glande est affectée. Nous avons comparé le profil d’expression génique des FNAH avec celui des AA, par hybridation sur des lames microarrays HEEBO. L’intégration de ces différentes données montre que les AA et les FNAH sont deux sous- types différents de la même maladie; l’hyperthyroïdie génétique. Les caractéristiques de chacun de ces sous-types dépendent de l’intensité de la mutation, du nombre de cellules initialement affectées et du stade de développement au moment duquel la mutation survient.
Dans la dernière partie de ce travail, nous avons caractérisé les ATC au niveau du profil d’expression des ARNm et des miRNA par hybridation respectivement sur lames Affymetrix ou sur lames miRNA maison et au niveau de leur état mutationnel du gène p53. Le profil d’expression génique des ATC a été comparé avec celui des PTC afin de mettre en évidence des gènes différentiellement exprimés entre les 2 types de cancers, que nous avons ensuite tenté d’invalider par siRNA, dans un modèle in vitro de lignée cellulaire thyroïdienne dérivée d’un ATC (8505C). Les résultats obtenus jusqu’ici ne sont malheureusement pas prometteurs. Le profil d’expression des miRNA nous a permis d’identifier une signature de 34 miRNA caractéristique des ATC.
1
de son laboratoire, le Pr. Dumont pour ses conseils, les discussions enrichissantes et son optimisme à toute épreuve et aussi ma promotrice de recherche, Dr. Carine Maenhaut, pour son attention, sa disponibilité et ses bons conseils scientifiques.
J’aimerais également adresser des remerciements particuliers à Chantal Degraef qui m’a appris, avec patience, la rigueur des techniques de laboratoire, Dr. Anne Lefort et Dr. Frédérick Libert pour leur expertise et pour nous avoir fourni une partie des lames microarrays.
Je remercie également tous les membres du laboratoire, pour leurs conseils scientifiques avisés et leurs attentions, qui ont fait de mon séjour à l’IRlBHM une expérience unique et inoubliable, soit Wilma, Sébastien, Sandra, Geneviève, Soetkin, Julie, Sheela, Sara, Vanessa et les bioinformaticiens, David et Vincent. Je remercie aussi Danièle, Joëlle, Yves, Claude et Christian de m’avoir apporté leur soutien logistique et informatique. Je tiens aussi à remercier toute ma famille.
Ce travail de recherche a pu être mené à bien grâce au soutien et au financement du FNRS (Télévie), de la bourse Van Buuren et de la Fondation de la Vocation qui m’a permis d’effectuer un stage dans le laboratoire du Pr. Patrick Brown, Université de Stanford.
LISTE DES SYMBOLES ET ABRÉVIATIONS
AA : autonomous adenoma
AMPc ; cyclic adenosine monophosphate ARNdb: double-stranded RNA
ATC : anaplastic thyroid carcinoma DAG : diacylglycérol
DIT : diiodotyrosine
EGF : epidermal growth factor
EMT ; epithelial-mesenchymal transition
EPAC: exchange protein directly activated by cAMP ERK: extracellular signal-regulated kinase
FBS: fêtai bovine sérum FGF: fibroblast growth factor FTA: follicular thyroid adenoma FNAB: fine needle aspiration biopsy
FNAH: familial nonautoimmune hyperthyroidism FTC: follicular thyroid carcinoma
GDP : guanosine diphosphate GTP : guanosine triphosphate HGF; hépatocyte growth factor IGF-1: insulin-like growth factor IP3: inositol-1,4,5-triphosphate IP: inositol phosphate
Lowess: locally weighted scatter plot smoothing MAPK: mitogen-Activated Protein kinase MDS: multidimensional scaling
miRISC: miRNA-containing RNA-induced silencing complex miRNA : microRNA
MIT : monoiodotyrosine NIS : Na"^/r symporter
3
PI3K: phosphoinositide 3-kinase
PIP2 : phosphatidylinositol-4,5-biphosphate PKA : cAMP dépendent protein kinase
PKC : protein kinase C PLC : phospholipase C
PTC: papillary thyroid carcinoma
PTEN: phosphatase with tensin homology qRT-PCR: quantitative RT-PCR
RISC: RNA-induced silencing complex RT-PCR: reverse transcription PCR SAM: significant analysis of microarrays
SCNAH: sporadic congénital nonautoimmune hyperthyroidism siRNA : small interfering RNA
T3: triiodotyronine T4: thyroxine Tg: thyroglobulin
TPO: thyroid peroxydase
TRH: thyrotropin releasing hormone
TABLE DES MATIERES
CHAPITRE I : INTRODUCTION 8
1. Le cancer 8
1.1 Introduction 8
1.2 Génétique et cancer 8
1.3 Morphologie des cellules cancéreuses 9
1.4 Caractéristiques des cellules cancéreuses 9
1.5 L’angiogénèse 10
1.6 La lymphangiogénèse 11
2. La thyroïde 11
2.1 La thyroïde normale 11
2.1.1 Introduction 11
2.1.2 Synthèse des hormones thyroïdieimes 12
2.1.3 Régulation des cellules thyroïdiennes 14
2.1.4 Cascades de signalisation principales impliquées dans la prolifération
thyroïdienne normale. 14
2.2 Tumeurs thyroïdiennes 18
2.2.1 Introduction 18
2.2.2 T umeurs bénignes 19
2.2.3 Tumeurs malignes 22
2.3 Modèles expérimentaux in vitro des tumeurs thyroïdiennes 26 2.3.1 Cultures primaires de cellules thyroïdiennes humaines 26
2.3.2 Lignées cellulaires 27
3. Régulation post-transcriptionnelle des protéines : les nüRNA 27
3.1 Introduction 27
3.2 Biosynthèse des miRNA 28
3.3 miRNA et Cancers 29
4. Analyse de l’expression génique par microarrays. 29
4.1 Principe général 29
4.2 Microarrays double canaux 30
4.3 Microarrays simple canal: les lames Affymetrix 31
5. Analyse des données microarrays 31
5.1 Correction du bruit de fond 31
5.2 La normalisation 32
5.2.1 La normalisation par rapport à la moyenne globale des intensités 32 5.2.2 La normalisation par rapport à des gènes de contrôle externes 32
5.2.3 La normalisation «Lowess » 33
5.3 La mesure de l’expression différentielle : SAM 33
5.4 Visualisation des données 34
5.4.1 Le clustering hiérarchique 34
5
CHAPITRE II : BUT DU TRAVAIL 37
CHAPITRE III : RESULTATS 39
1. Validation d’un modèle expérimental des carcinomes papillaires : les
thyrocytes humains en culture primaire stimulés par de l’EGF et du sérum. 39 2. Caractérisation moléculaire de deux tumeurs thyroïdiennes bénignes : les adénomes autonomes et l’hyperthyroïdie non auto-immune familiale 51 3. Caractérisation moléculaire des carcinomes anaplasiques (ATC) 61
3.1 Analyse des mutations p53 61
3.2 Analyse fonctionnelle par SiRNA 62
3.3 Etude de l’expression des miRNA dans les ATC par microarrays. 67
CHAPITRE V : MATERIELS ET METHODES 76
1. Matériels 76
1.1 Lignées cellulaires 76
1.2 Milieux de culture 76
1.3 SiRNA 76
1.4 Agent de transfection 76
1.5 Solutions pour la manipulation des protéines 77
1.5.1 Lyse des cellules 77
1.5.2 Quantification des protéines 77
1.5.3 Séparation des protéines 77
1.5.4 Immunodétection (Western blotting) 77
1.6 Anticorps 78
1.6.1 Anticorps primaires 78
1.6.2 Anticorps secondaires 78
1.7 Amorces pour le séquençage de p53 78
2. Méthodes 79
2.1 Analyse de l’expression génique sur lames Affymetrix 79
2.1.1 Hybridation 79
2.1.2 Traitement des données pour l’analyse ATC et PTC 79 2.2 Analyse de l’expression des miRNA sur lames « maison »Lames microRNA
79
2.2.1 Hybridation 79
2.2.2 Traitement des données pour l’analyse miRNA 80 2.3 Transfection des siRNA dans les lignées cellulaires 80
2.4 Analyse des protéines 81
2.4.1 Lyse des cellules 81
2.4.2 Quantification des protéines 81
2.4.3 Séparation des protéines par électrophorèse 81
2.4.4 Immunodétection (Western blotting) 82
2.5 Séquençages d’ADN 82
CHAPITRE VI : BIBLIOGRAPHIE 83
7
CHAPITRE I : INTRODUCTION
1. Le cancer
1.1 Introduction
Le cancer est une maladie caractérisée par une prolifération incontrôlée des cellules au sein d’un tissu normal de l’organisme. Ces cellules dérivent toutes d’une seule cellule qui a acquis certaines caractéristiques lui permettant de se diviser indéfiniment. Au cours de l’évolution de la maladie, certaines cellules peuvent se détacher de la tumeur, migrer et former des métastases. Le nombre de cancer est en augmentation, probablement dû à des facteurs environnementaux, au mode de vie, au vieillissement de la population et à de meilleures méthodes de détection. De 1980 à 2005, le nombre de cancers a augmenté de 35 % pour les hommes et de 43 % pour les femmes. Le nombre de décès par cancer en France, en 2004, est de 241 pour 100 000 habitants. C’est donc la première cause de mortalité juste avant les maladies cardio-vasculaires. Les 3 cancers les plus fréquents chez l’homme sont celui de la prostate, du poumon et du colon-rectum et chez la femme, celui du sein, du poumon et du colon-rectum (Figure 1).
1.2 Génétique et cancer
Trois grandes catégories de gènes sont associées aux pathologies cancéreuses : les oncogènes, les gènes suppresseurs de tumeurs et les gènes de réparation de F ADN
(
1).
1. Les oncogènes (appelés proto-oncogènes dans leur version normale) sont les régulateurs positifs de la prolifération cellulaire. Des mutations activatrices dominantes leur confèrent une activité constitutive (la mutation d’une seule des deux copies du gène est suffisante).
Actuellement plus de 100 oncogènes ont été identifiés, dont les plus connus sont les gènes ras, myc, ou abl.
8
Vessie 6%
Mélanome 5%
Lymphome non-hodgkinien 4%
Rein 3%
Cavité orale 3%
Leucémie 3%
Pancréas 2%
Autres 18%
6% Utérus
4% Lymphome non-
hodgkinien
4% Mélanome
3% Thyroid
3% Ovaire
2% Vessie
2% Pancréas
22% Autres
Introduction
2. Les gènes suppresseurs de tumeurs sont des régulateurs négatifs de la prolifération cellulaire. Des mutations récessives les rendent inactifs (les deux copies de ces gènes sont inactivées dans les cancers).
3. Les gènes de réparation codent pour des protéines capables de détecter et de réparer les lésions de l’ADN et sont également souvent inactivés dans les cellules cancéreuses.
1.3 Morphologie des cellules cancéreuses
Les cellules tumorales acquièrent des propriétés nouvelles lors de la transformation maligne. La cellule tumorale est souvent plus grande, avec une augmentation du volume nucléaire. Elle présente généralement un noyau d’aspect irrégulier. Le cytoplasme est souvent peu abondant avec un réseau de filaments d’actine désorganisé et une augmentation du nombre de ribosomes. Le nombre de mitochondries est réduit. Celles-ci sont parfois fragmentées et présentent un nombre de crêtes inférieur à celui des cellules non cancéreuses. Le génome mitochondrial peut se révéler anormal avec une quantité d’ADN augmenté. Les membranes cellulaires ont un aspect irrégulier, une structure épaissie et présentent des microvillosités. Les desmosomes sont également altérés ce qui rend les cellules moins cohésives.
1.4 Caractéristiques des cellules cancéreuses
• La division des cellules cancéreuses est incontrôlée: elles prolifèrent et leur multiplication cause l’accumulation d’un grand nombre d’anomalies génomiques, ce qui est un événement précoce et fréquent dans la progression tumorale.
• L’autonomisation de la fonction cellulaire: les cellules cancéreuses perdent une partie des capacités de relation cellule-cellule et deviennent moins sensibles aux régulations transmises par les cellules voisines.
9
• Perte d’inhibition de contact: les cellules cancéreuses poursuivent leur prolifération même lorsqu’elles arrivent en contact les unes avec les autres. Ce phénomène est à l’origine du développement d’ime hyperplasie et puis d’une tumeur.
• Capacité de migration dans les tissus voisins: Les cellules métastatiques peuvent se détacher du foyer tumoral, s’infiltrer au travers des tissus voisins grâce à la sécrétion de protéases et éventuellement rejoindre la circulation sanguine ou lymphatique. Les cellules métastatiques peuvent ainsi se déplacer, tout en poursuivant leur prolifération, et peuvent alors coloniser de nouveaux organes. La disposition d’une tumeur primitive à métastaser dépend principalement de l’instabilité génomique et de l’incapacité du système immunitaire à détruire les cellules tumorales au cours du processus métastatique.
• Perte de la nécessité d’ancrage: les cellules cancéreuses acquièrent la capacité de se développer selon des conditions variables et de poursuivre leur prolifération en milieu semi-fluide ou fluide.
1.5 L ’angiogénèse
L’angiogénèse est le processus par lequel se forment de nouveaux vaisseaux sanguins à partir du réseau vasculaire pré-existant. En effet, afin d’assurer leur prolifération, les cellules tumorales ont besoin d’un apport en oxygène et en nutriments proportionnels à leur forte consommation énergétique et d’éliminer les déchets provenant de leur métabolisme. Tant que le volume de la tumeur est inférieur à 1 ou 2 mm^, la simple diffusion à travers la paroi des vaisseaux à proximité suffit généralement à permettre ces échanges. La distance maximale entre le foyer et un vaisseau excède rarement 150 à 200 microns, au-delà, l’oxygène est consommé avant d’atteindre les cellules centrales. Pour poursuivre son développement prolifératif et répondre à cette nécessité de vascularisation, la tumeur doit donc synthétiser et sécréter des facteurs de croissance de vaisseaux destinés à stimuler l’angiogénèse à sa proximité immédiate. Les vaisseaux des
Introduction
tumeurs solides ne sont plus ordonnés en artères, capillaires et veines et n’ont plus de diamètres réguliers (2).
1.6La lymphangiogénèse
D’une manière analogue au processus angiogénique, les tumeurs ont la capacité d’induire la formation de néo-vaisseaux lymphatiques en direction du tissu tumoral, à partir de vaisseaux préexistants. Ceux-ci permettent d’assurer le drainage du tissu tumoral. Certains cancers, comme ceux du sein, de la thyroïde, du poumon, de la peau, des testicules, du col de l’utérus, ainsi que les tumeurs gastriques, ont un mode de dissémination métastatique qui s’effectue préférentiellement par l’intermédiaire des vaisseaux lymphatiques. En effet, ceux- ci irriguent tous les tissus (à l’exception du cerveau) et possèdent un endothélium très fin formé d’une couche unique discontinue de cellules aplaties bordée par une membrane basale interrompue voire inexistante. Leur paroi est plus souple que celle des capillaires sanguins et la dégradation de l’endothélium par les enzymes protéolytiques synthétisées par les cellules métastatiques est donc plus efficace.
Les capillaires lymphatiques présentent un diamètre plus important que les capillaires sanguins et offient ainsi une plus grande surface de contact pour l’intrusion des cellules malignes. De plus, le flux à l’intérieur des vaisseaux lymphatiques est significativement plus faible que celui du système sanguin et la différence de pression en résultant pourrait favoriser la pénétration à l’intérieur du réseau lymphatique.
2. La thyroïde
2.1 La thyroïde normale
2.1.1 Introduction
La thyroïde est une glande endocrine de 10 à 20 grammes, constituée de deux lobes unis par un isthme médian, et située à la base de la partie antérieure du cou (Figure 2). L’unité fonctionnelle de la thyroïde est le follicule, constituée
11
thyroïde la glande thyroïde
Trachée Isthme médian
Figure 2: la glande thyroïde
Cellule folliculaire thyrocyte
Vaisseau sanguin
Colloïde
Tissu conjonctif
Membrane basale Cellule parafollieulaire
Introduction
principalement de thyrocytes (70% des cellules de la thyroïde), cellules cubiques et polarisées entourant une lumière contenant la colloïde (Figure 3). Le principal constituant de cette colloïde est une glycoprotéine, la thyroglobuline, précurseur des hormones thyroïdiennes Tj (tri-iodothyronine) et T4 (tétra-iodothyronine ou thyroxine). T4 est l’hormone inactive et peut être désiodée en T3, l’hormone active ou en rTj, inactive, selon les besoins de l’organisme. Les hormones thyroïdiennes sont nécessaires à la croissance, au développement de tous les tissus (squelette, système nerveux et cardiovasculaire,...). Elles participent également au métabolisme des glucides et des lipides et stimulent les fonctions végétatives et le métabolisme général de l’organisme.
Outre les thyrocytes, la thyroïde est aussi constituée de cellules C ou parafolliculaires qui produisent la calcitonine, de cellules endothéliales formant la paroi des vaisseaux et de fibroblastes.
2.1.2 Synthèse des hormones thyroïdiennes
La synthèse des hormones thyroïdiennes peut être divisée en trois grandes étapes (Figure 4):
2.1.2.1 Captation et organification de Viodure
L’iodure est capté au niveau de la membrane basolatérale du thyrocyte grâce à un mécanisme de transport actif utilisant une pompe à iode, le symporteur Na+/I- (NIS). L’iodure est ensuite transporté du cytoplasme dans la lumière folliculaire à travers la membrane apicale par un transport passif Deux transporteurs potentiels ont été identifiés, la pendrine et FAIT (Apical lodide Transporter). Leur fonction de transporteur d’iode est néanmoins controversée.
12
HgOg
Figure 4: Synthèse et sécrétion des hormones thyroiïdiennes (N.Fortemaison, thèse). TSH:
Introduction
2.1.2.2 Iodation de la thyroglobuline
L’iodure est oxydée par la thyroperoxydase (TPO) en présence de H2O2. L’ H2O2 est produit au niveau de la membrane plasmique apicale par deux NADPH oxydases (THOXl et THOX2). Une fois oxydé, l’iodure se fixe sur les résidus tyrosines de la thyroglobuline (Tg) et forme des dérivés monoiodés (MIT) et diiodés (DIT). Des couplages, catalysés par la TPO, entre deux groupes DIT forment les hormones T4 tandis que des couplages entre un groupe DIT et un groupe MIT forment les hormones T3 (Figure 5).
Figure 5: Synthèse de T3 et T4
2.1.2.3 Libération des hormones thyroïdiennes
La thyroglobuline chargée d’hormones Tj et T4 est endocytée par micropinocytose et la fusion avec des lysosomes mène au clivage protéolytique de la thyroglobuline libérant T3 et T4 qui sont excrétées dans le flux sanguin. Les T4 sont désiodées en T3 en fonction de la nutrition et l’état fonctiormel de l’organisme et l’iodure est recyclé. En cas de déficience en iode, une augmentation relative de la synthèse de T3 par rapport à T4 est observée.
13
Introduction
2.1.3 Régulation des cellules thyroïdiennes
La fonction et la croissance de la thyroïde sont régulées par la TSH (thyrotropine ou Thyroid Stimulating Hormone) qui est produite par l’hypophyse en réponse à la TRH (Thyroid Releasing Hormone) produite par l’hypothalamus (Figure 6).
La sécrétion des hormones thyroïdiennes et leur régulation sont contrôlées par un mécanisme de rétro-contrôle négatif Lorsque la concentration sanguine d’hormones thyroïdieimes diminue, l’hypothalamus libère de la TRH qui va stimuler l’hypophyse entraînant la libération de la TSH. Cette dernière va induire la production d’hormones thyroïdiennes. Au contraire, lorsque les hormones sont abondantes dans le sang, elles inhibent la production de la TRH par l’hypothalamus et de la TSH par l’hypophyse ce qui interrompt la stimulation thyroïdienne et mène à l’arrêt de la sécrétion de T3 et T4.
L’effet positif de la TRH d’une part et l’effet négatif des hormones d’autre part ont pour conséquence une grande stabilité du taux de TSH sanguin, et donc aussi des hormones thyroïdiennes. Un niveau anormal de TSH indique généralement la présence d’un désordre thyroïdien.
2.1.4 Cascades de signalisation principales impliquées dans la prolifération thyroïdienne normale.
La fonction thyroïdienne implique principalement quatre cascades de signalisation: la cascade de TAMPc, la cascade des inositols phosphates, la cascade des MAPK et la cascade des PI3K (Figure 7). Leur stimulation par des signaux extracellulaires comme les hormones, les facteurs de croissance ou les neurotransmetteurs va initier une série de réponses en se liant à des récepteurs membranaires spécifiques et activer un ensemble de gènes spécifiques du stimulus. La majorité de ces gènes sont des facteurs de transcription qui déclenchent alors l’expression de nouveaux gènes.
14
Introduction
2.1.4.1 Cascade de l’AMPc
L’activation de la cascade de l’AMPc stimule la prolifération et la différentiation des thyrocytes (3). La TSH active cette cascade de signalisation tout comme la forskoline (en activant Tadenylate cyclase), la choléra toxine (en activant la protéine Gs) et les analogues de TAMPc (4;5). La présence d’insuline ou d’IGF-I avec la TSH est requise pour un effet mitogénique (6-8). Les thyrocytes stimulés par la TSH présentent une morphologie d’épithélium cuboïdal (9). La TSH induit l’expression de gènes de différenciation spécifiques de la thyroïde tels que Tg, TPO, NIS, TSHR, THOXl et THOX2. La transcription de ces gènes de différenciation est régulée essentiellement par trois facteurs de transcription:
TTFl, TTF2 et P AXS qui agissent de manière coordonnée.
Le récepteur de la TSH (TSHR) est un récepteur à sept domaines transmembranaires. Lorsque la TSH se lie au récepteur, celui-ci, par l’intermédiaire de la sous-unité a de la petite protéine Gs (Gas) catalysant le remplacement du GDP par du GTP, active Tadénylate cyclase, provoquant une augmentation du taux intracellulaire d’AMPc (Figure 7 en mauve). L’AMPc se lie à la sous-unité régulatrice de la protéine kinase A (PKA). La sous-unité catalytique de PKA entre dans le noyau et phosphoryle des protéines nucléaires spécifiques. L’AMPc active également EPAC (Exchange Proteins directly Activated by AMPc) et par conséquent la petite protéine G, Rapl. La cascade de l’AMPc est aussi contrôlée par de nombreux rétro-contrôles négatifs, parmi lesquels les phosphodiestérases qui hydrolysent TAMPc en ATP, induisant ainsi l’arrêt du signal.
2.1.4.2 Cascade des inositols phosphates (IP)
L’activation de la cascade des IP induit également la prolifération mais inhibe l’expression de la différentiation des thyrocytes. Celle-ci est activée des agents comme le carbachol ou la TSH qui nécessite cependant une concentration 10 fois plus élevée que pour l’activation de la cascade de TAMPc (10-13).
15
L’interaction du ligand avec son récepteur provoque la stimulation de la phospholipase C (PLC) par l’intermédiaire de la sous-unité a de la protéine Gq (Goq) catalysant le remplacement du GDP par du GTP (Figure 7 en rose). La PLC hydrolyse le phosphatidylinositol 4,5-biphosphate (PIP2) situé dans la membrane plasmique, en inositol 1,4,5-triphosphate (IP3) et en diacylglycérol (DAG). L’IP3 peut alors se lier à un récepteur spécifique du réticulum endoplasmique et entraîner la libération de Ca2+. Le DAG active la protéine kinase C (PKC) qui à son tour va phosphoryler spécifiquement des protéines en aval. La PKC peut également être activée directement par les esters de phorbol et les analogues du diacylglycérol.
2.1.43 Cascade MAPK
La cascade des MAPK est généralement exprimée dans tous les types cellulaires et induit la prolifération, l’apoptose, la survie, la migration et le développement.
Dans les thyrocytes, la cascade des MAPK (ERKl/2) est activée par les facteurs de croissance comme l’EGF et l’HGF, et son activation induit la prolifération et inhibe l’expression de la différentiation des thyrocytes. Comme dans le cas de la TSH, la combinaison d’insuline ou d’lGF-1 et d’EGF est requise pour un effet mitogène (14;15). L’HGF, par contre, ne requiert pas d’insuline ou d’IGF-1 pour exercer son effet mitogène (16-18). Les thyrocytes stimulés avec de l’EGF présentent une morphologie fusiforme, similaire à des fibroblastes (19).
La liaison d’un facteur de croissance à son récepteur conduit à la dimérisation puis à r autophosphorylation de résidus tyrosine du récepteur et ensuite au recrutement de protéines adaptatrices comme Grb2-Sos (Figure 7 en vert). Ce complexe active la protéine Ras (en catalysant le remplacement du GDP par du GTP) qui recrute à son tour la sérine thréonine kinase Raf (ou MAPKKK) près de la membrane. Raf phosphoryle les MAPKK (ou MEK) qui phosphorylent à leur tour les MAPK (ERKl/2) qui migrent dans le noyau pour activer des facteurs de transcription spécifiques comme Elk-1, c-Jun et ATF-2.
Introduction
Trois sous-familles de protéines MAPK ont été caractérisées chez les vertébrés:
- les protéines ERX (Extracellular signal-Regulated Kinases) (ERKl/2 ou p42/p44), qui sont phosphorylées par MEKl et MEK2 sur la séquence Thr-Glu- Tyr. Elles sont activées par les facteurs de croissance, le sérum, les phorbol esters et cytokines (20).
- les protéines JNK (Jun N-terminal Kinases) (JNKl/2), qui sont phosphorylées par MEK4 et MEK7 sur la séquence Thr-Pro-Tyr. Elles sont activées par les cytokines et l’exposition à un stress environnemental comme les radiations ionisantes, le stress oxydatif et le dommage à T ADN (21).
- les protéines p38 qui sont phosphorylées par MEK3, MEK6 et MEK7 sur la séquence Thr-Gly-Tyr. Elles sont activées par l’exposition à un stress cellulaire comme la radiation aux UV, le choc osmotique, l’hypoxie et les cytokines (22).
2.1.4.4 Cascade des PBK/Akt
Les facteurs de croissance à récepteurs tyrosines kinases stimulent cette cascade en activant la PI3K directement ou via RAS.
La PI3K activée convertit le phosphatidylinositol 4,5-biphosphate (PIP2) situé dans la membrane plasmique, en phosphatidylinositol 4,5-triphosphate (PIP3) (Figure 7 en bleu). PIP3 recrute et active la PDKl (phosphatidylinositol- dependent kinase 1). PDKl phosphoryle et active la protéine kinase B (PKB ou Akt) qui, à son tour phosphoryle differents substrats. La phosphatase (PTEN (tumor-suppressor phosphatase with tensin homology), un suppresseur de tumeur, régule négativement la cascade PI3K en déphosphorylant PIP3 en PIP2.
2.1.4.5 Conclusion
Les cascades de l’AMPc, des MAPK et PI3K induisent la prolifération des thyrocytes. Toute mutation dans une de ces cascades peut donc avoir comme conséquence une prolifération anormale des thyrocytes et entraîner la tumorigénèse.
17
Introduction
2.2 Tumeurs thyroïdiennes
2.2.1 Introduction
Les tumeurs thyroïdiennes sont les tumeurs endocrines les plus fréquentes représentant environ 1% de l’ensemble des tumeurs. Environ 5 % de la population serait porteuse d’un nodule visible à l’œil nu ou détectable par la palpation du cou. Il est plus fréquent chez la femme que chez l’homme (2-3 :1), le sujet âgé, les sujets vivants en zone de carence iodée ou ayant subi une irradiation de la région cervicale durant l'enfance. Vingt à 40% des femmes de plus de 50 ans ont des nodules cliniquement détectables. L’incidence du cancer thyroïdien et particulièrement le cancer papillaire, croit de 8.1 et 6.2% par an respectivement chez la femme et chez l’homme depuis 1970 (23) (Figure 8). Les sujets jeunes sont plus exposés au développement du cancer du fait d'une plus grande sensibilité de leur thyroïde à l'irradiation.
Même si les nodules thyroïdiens sont habituellement asymptomatiques, un diagnostic est nécessaire si l’on soupçonne leur présence, car environ 5 % des masses palpables sur la thyroïde sont cancéreuses (23). De plus, un nodule toxique produit un excès d’hormones thyroïdiennes, ce qui cause un état d’hyperthyroïdie, avec des symptômes plus ou moins prononcés (palpitations, tremblements, nervosité, diarrhée). À long terme, l’hyperthyroïdie est néfaste pour le corps. Toutefois, un traitement adapté permet de rétablir un taux d’hormones normales.
Les tumeurs sont classées en tumeurs bénignes (adénomes) et tumeurs malignes (carcinomes). On distingue les carcinomes (>lcm) des microcarcinomes (<lcm) : ceux-ci sont beaucoup plus fréquents que les carcinomes (5 à 36% des adultes à l’autopsie) et ont un potentiel évolutif très faible. Des altérations génétiques causent et caractérisent les différents types de tumeurs thyroïdiennes ce qui les rend particulièrement intéressantes à étudier pour comprendre les mécanismes généraux de la carcinogénèse (Figure 9). Ces altérations peuvent être soit des
18
Introduction
mutations soit des réarrangements chromosomiques qui ont pour conséquence de donner un avantage prolifératif à la cellule concernée par rapport aux autres.
Une tumeur maligne est suspectée si le nodule est solide, irrégulier ou s’il ne capte plus d’iode à la scintigraphie. Une cytoponction à l’aiguille fine (Fine Needle Aspiration Biopsyou FNAB) permet de diagnostiquer les principaux types de tumeur. Pour les tumeurs malignes, la thyroïdectomie totale est souvent de rigueur avec un traitement complémentaire à l’i'^* pour les tumeurs qui captent encore l’iode afin de détruire d’éventuels restes de tissu cancéreux (les carcinomes anaplasiques et les carcinomes médullaires ne sont pas concernés par ce traitement). Les cancers thyroïdiens les plus fréquents (papillaires et folliculaires) sont guéris dans 80 à 90% des cas (23). Des métastases à distance sont observées dans 10% des cas, le plus fréquemment dans les poumons et les os (23).
Cependant, la classification et le diagnostic des différentes tumeurs sont compliqués et subjectifs, et dépendent très fort du pathologiste (24;25). En effet, dans 10 à 20% des cas, il n’est pas possible de poser un diagnostic précis entre adénome folliculaire et carcinome folliculaire. Dans le cas d’une lésion suspecte, les patients subissent une opération chirurgicale, mais seulement 8 à 17% des nodules se révèlent malins. Par conséquent, une amélioration des outils diagnostiques préopératoires permettrait d’éviter des résections chirurgicales qui se révèlent à posteriori inutiles (26;27).
2.2.2 Tumeurs bénignes
2.2.2.1 Adénomes autonomes
Les adénomes autonomes hyperfonctionnels (AA) ou nodules « chauds » sont des tumeurs monoclonales, bordées d’une capsule fibreuse. Elles sont constituées de cellules possédant une hyperactivité proliférative et fonctionnelle mettant le reste de la glande au repos. Elles sont diagnostiquées chez les patients âgés entre 30 et 60 ans et spécialement dans les régions où la consommation d’iode est moindre (47% des cas) (28;29).
19
• Aspect clinique:
• Volume normal (24/97)
• Goitre (73/97) (homogène (57/97) ou multinodulaire (15/97)
• 20/83 ophtalmopathie
• Seul traitement: thyroïdectomie totale seule ou combinée avec de l’iode radioactif.
• Pas de retard mental
• Dans 8/14 cas, hyperthyroïdie présente à la naissance Dans 4/14 cas, diagnostique clinique entre (5 et 11 mois)
• 8/10 ophtalmopathie
• Prématurité (10/14), faible poids à la naissance (12/14)
• Craniosynostosis fréquente (7/14)
• Retard mental (6/10)
Table 1 : caractéristiques cliniques des FNAH et des SCNAH
Introduction
Les AA sont caractérisés par une croissance lente (prolifération cellulaire principalement à la périphérie du nodule) (30) et un faible taux d’apoptose (31 ;32). Les patients ont un taux de TSH bas et un niveau de T4 et Tj normales ou élevées (33;34).
Les AA présentent des mutations activatrices du TSHR (70-80%) ou de Gas (8%) menant à une activation constitutive de la voie de l’AMPc qui induit la prolifération et la différenciation des thyrocytes (35). Dans 20-30% des adénomes autonomes, aucune mutation du TSHR ou de Gas n’a été trouvée ce qui suggère l’existence d’altérations génétiques dans d’autres protéines impliquées dans la cascade de l’AMPc.
2.2.2.2 Hyperthyroïdie non auto-immune familiale (FNAH) et hyperthyroïdie congénitale sporadique (SCNAH)
La FNAH et le SCNAH sont deux maladies thyroïdiennes rares apparaissant au cours de l’embryogenèse, causées par une mutation dans le récepteur de la TSH activant de manière constitutive la voie de l’AMPc et dans certains cas, la cascade des inositols phosphates. Dans le cas des FNAH, la mutation est héréditaire alors que dans le cas des SCNAH, elle survient pendant la gestation. Dans les deux cas, toute la glande est affectée contrairement aux AA où la mutation survient plus tard, généralement à l’âge adulte, et dans lesquels seule une partie de la glande est affectée. Ces rares cas de FNAH et de SCNAH doivent être différenciés de la maladie de Graves, forme bien plus courante d’hyperthyroïdie, causée par le passage d’anti-corps maternels qui stimulent le TSHR. Cette hyperthyroïdie est transitoire chez le foetus, la glande redevenant normale peu après la naissance, suite à la disparition des anticorps. Jusqu’à aujourd’hui, 31 mutations différentes ont été identifiées dans les FNAH et SCNAH. Celles-ci sont dominantes et principalement localisées dans le domaine transmembranaire du récepteur (exonlO) (36-59). La majorité des mutations affectant le TSHR est propre à chacune des deux pathologies : 73% des mutations du TSHR des SCNAH sont aussi trouvées dans AA alors que seulement 27% des mutations des FNAH sont communes avec les AA. La pathologie de SCNAH est plus sévère que celle de
20
FNAH ce qui laisse supposer que les mutations affectant les AA et SCNAH sont plus agressives que celles affectant FNAH (60-62). Les signes cliniques de ces deux pathologies sont reprises dans le tableau ci-contre (Table 1). Les patients présentent un taux de TSH bas et de Tj et T4 élevés (63). Contrairement aux AA, la thyroïdectomie est le seul traitement pour guérir les patients FNAH ou SCNAH. Du propylthiouracil est généralement administré. Son avantage par rapport au méthimazole ou au carbimazole, c’est qu’en plus de bloquer la synthèse des hormones thyroïdiennes, il diminue la conversion de T4 en T3 (64).
2.2.23 Adénomes folliculaires
A l’inverse des adénomes autonomes hyperfonctionnels, les adénomes folliculaires (FTA) froids ou nodules « froids », sont caractérisés par une diminution d’activité. Environ 5% d’entre eux peuvent évoluer en carcinomes folliculaires. Ils sont principalement caractérisés par des mutations activatrices de RAS et des réarrangements chromosomiques PAX8-PPARy (30%).
Les protéines RAS sont des protéines G qui hydrolysent le GTP en GDP et activent la cascade des MAPK et PDK/Akt. Il existe trois sous-types de RAS : H- RAS, K-RAS et N-RAS et des mutations activatrices dans les gènes correspondants sont détectées dans plus de 30% des cancers (dans le codon 61 pour H-RAS et N-RAS et dans le codon 12 pour K-RAS).
Le gène PAX8 code pour un facteur de transcription requis pour la régulation de l’expression de gènes spécifiques thyroïdiens. PPARy est un membre de la superfamille des récepteurs hormonaux et a été décrit comme un suppresseur de tumeurs (65). Le réarrangement PAX8-PPARy est une translocation chromosomique qui génère une protéine à un effet dominant négatif sur PPARy.
La cascade de signalisation PI3K/Akt est dérégulée dans 31% des adénome folliculaire (66).
Alterations
génétiques PTC FTC PDC ATC
Sporadiques Radio-induits
RET/PTC 20-40% 50-80% 0% 9% 0%
TRK 0% 5-13% nd nd nd
AKAP9/BRAF 1% 11% nd nd nd
PAXS-PPARy <10% 25-50% 0% 0%
BRAF 40% ~5% 0% 15% 15-26%
RAS 15% 20-50% 35% 22-53%
p53 5% 7% 24% 59%
P-catenin 0% 0% 16-32% 38-66%
PI3KCA 2% 8-13% nd 12-23%
PTEN 2-36% 7-22% nd 12-41%
Table 2. Altérations génétiques principales et leur prévalence dans les tumeurs malignes PTC, TTC, carcinome pauvrement différencié (PDC) et ATC. nd: non disponible
2.2.3 Tumeurs malignes
L’organisation histologique et l’état de différenciation des thyrocytes permettent de distinguer les carcinomes différenciés (carcinome papillaire (PTC) ou carcinomes folliculaires (FTC)) et les carcinomes dédifférenciés (carcinomes anaplasiques (ATC)).
2.2.3.1 Carcinomes papillaires
Les carcinomes papillaires (PTC) représentent 85-90% des carcinomes thyroïdiens et 1% des cancers humains. Ils ont un bon pronostic avec un taux de survie de 80-90% sur 5-10 ans. Ils touchent toutes les tranches d’âges mais plus particulièrement les 30 à 40 ans (67). Les PTC métastasent souvent dans les ganglions par voie lymphatique mais peu dans les poumons et les os (5 à 7 % au moment du diagnostic). Les PTC sont reconnaissables par leur architecture en papille et l’aspect caractéristique de leur noyau (aspect vitreux « en verre dépoli » et irrégulier avec des inclusions). Différents sous-types de PTC existent dont la variante classique (la plus courante), la variante folliculaire (ressemblant à un FTC mais avec les caractéristiques nucléaires des PTC), la variante à grandes cellules (chez les patients plus âgés et de moins bon pronostic), la variante solide (très agressive). Les PTC sont caractérisés par l’activation constitutive de la voie des MAPK qui induit la prolifération et la dédifférenciation des thyrocytes.
L’altération d’un seul élément de cette cascade est suffisante in vitro pour induire la transformation cellulaire et in vivo pour induire un PTC chez la souris (68-72).
Ces résultats suggèrent que l’activation constitutive de la cascade des MAPK est un événement initiateur des PTC.
Les PTC présentent principalement des mutations ponctuelles activatrices dans la protéine BRAF (40%), des réarrangements chromosomiques RET/PTC (20-80%, principalement les réarrangements RET/PTC 1 et RET/PTC3) et plus rarement des mutations aetivatrices de RAS (H-RAS, K-RAS, N-RAS), des réarrangements de TRK ou le réarrangement AKAP9/BRAF (73) (Table 2).
Introduction
BRAF code pour une sérine/thréonine kinase cytoplasmique qui intervient dans la cascade de signalisation des MAPK/ERKl/2. Des mutations activatrices mimiquent la phosphorylation de la protéine menant à une activité kinase indépendante de RAS induisant la prolifération cellulaire (74). La mutation la plus fréquente est la mutation de la thymine en position 1799 en adénine (Tl 799A) qui résulte en une substitution de valine en acide glutamique en la position 600 (V600E).
L’oncogène RET/PTC résulte de la fusion du domaine tyrosine kinase intracellulaire du gène RET avec la partie 5’ d’un gène ubiquitaire possédant un domaine de dimérisation (par exemple, H4 pour le réarrangement RET/PTC 1 et RFG/ELEl pour le réarrangement RET/PTC3) (75). Le gène RET code pour un récepteur membranaire à activité tyrosine kinase qui est impliqué dans la régulation de la croissance, survie, différenciation et migration des cellules de la crête neurale. Ce gène n’est normalement pas exprimé dans les thyrocytes, mais le récepteur est présent dans les cellules C parafolliculaire. La protéine de fiision RET/PTC possède une activité tyrosine kinase constitutive. Au moins 15 partenaires différents ont été identifiés à l’heure actuelle.
Le réarrangement TRK résulte de la fusion du proto-oncogène NTRKl (récepteur au NGF à activité tyrosine kinase) avec la région 5’ promotrice d’un gène ubiquitaire (TPM3, TPR, TFG) (76). Comme pour les réarrangements RET/PTC, la protéine chimérique est caractérisée par une activité tyrosine kinase constitutive.
Le réarrangement AKAP9-BRAF résulte d’une inversion paracentrique du long bras du chromosome 7 menant à la fusion des huit premiers exons de AKAP9 avec la région C- terminale du proto-oncogène BRAF (77). Cette fusion génère une protéine à activité tyrosine kinase constitutive.
Les mutations activatrices BRAF sont principalement trouvées dans la variante classique des PTC ou les PTC à grandes cellules et sont associées à un mauvais pronostic (78;79). Elles concernent des patients plus âgés (au-delà de la cinquantaine) qui ne répondent plus au traitement à l’iode radioactif et qui présentent des extensions extrathyroïdiennes (80;81).
23
Les réarrangements RET/PTC sont principalement trouvées dans les PTC radio- induits (ex. Tchernobyl) (82), RET/PTC3 dans les PTC à variante solide, forme très agressive (83) et RET/PTC 1 dans les PTC à variante classique, forme moins agressive (84;85).
Les réarrangements de TRK et le réarrangement AKAP9/BRAF sont principalement trouvés dans les PTC radio-induits.
En plus des mutations décrites ci-dessous, les mutations RAS et des réarrangements PAX8/PPARy ont également été identifiés dans la variante folliculaire des PTC (86-88).
Ces mutations ou réarrangements sont détectés dans plus de 70% des PTC et sont mutuellement exclusives (89).
La cascade de signalisation P13K/Akt est également dérégulée dans 24% des PTC (90). La P13KCA, sous-unité catalytique de la PI3K, est mutée et constitutivement activée dans 2% des PTC et le gène correspondant est amplifié dans 12% des PTC.
2.23.2 Carcinomes folliculaires
Les carcinomes folliculaires (ETC) représentent 10 à 20% des carcinomes thyroïdiens et dérivent des adénomes folliculaires. Le taux de survie des patients est de 60% sur 10 ans. Ces tumeurs touchent toutes les tranches d’âge mais plus particulièrement les 50 à 60 ans (91). Contrairement aux PTC, 11-20% des ETC métastasent dans les poumons et les os. La distinction entre le carcinome et l’adénome folliculaire peut s’avérer extrêmement difficile. En effet, il n’existe aucun critère cellulaire ou architectural qui, à lui seul, permette d’en affirmer la malignité excepté la présence d’invasion capsulaire et/ou vasculaire. Les carcinomes folliculaires sont principalement caractérisées par des mutations RAS (N-RAS, K-RAS, H-RAS) (20-50%) et des réarrangements chromosomiques PAX8/PPARy (25-50%) (Table 2).
La cascade de signalisation P13K/Akt est dérégulée dans 55% des ETC (92). La PI3KCA est mutée dans 8-13% des ETC et amplifiée dans 28% des ETC.
Introduction
2.2.33 Carcinomes anaplasiques
Les carcinomes anaplasiques (ATC) représentent 1-7 % des carcinomes thyroïdiens (93). Les ATC sont une des tumeurs humaines les plus agressives représentant plus de 40% des mortalités des cancers thyroïdiens (94;95). Malgré les thérapies telles que la chirurgie, la chimiothérapie et la radiothérapie, traitements auxquels ces cancers répondent très mal, le taux de survie moyen n’est que de 6 mois (96). Ces tumeurs touchent principalement les personnes au-delà des 60 ans (97) et métastasent dans les poumons, la plèvre, les os et le cerveau (98). Du point de vue histologique, ces tumeurs présentent de larges zones de nécroses et sont très vascularisées.
Une partie des ATC semble dériver des FTC et PTC (99-102) et un des éléments causal du passage des tumeurs différenciées à un état complètement dédifférencié est la perte de fonction du gène suppresseur de tumeur p53 dont les mutations sont retrouvées dans environ 59% des ATC (103; 104) (Table 2). La protéine p53 est un facteur de transcription qui agit comme suppresseur de tumeur en induisant T arrêt du cycle cellulaire, la sénescence, la réparation de T ADN et diminue Tangiogénèse (105-107). Les mutations p53 sont trouvées dans près de la moitié des cancers de la tête et du cou, des ovaires, de l’œsophage, du colon et du pancréas (108). La majorité des mutations p53 se situent dans la partie liant T ADN, l’empêchant de se lier à ce dernier (109; 110). Néanmoins, la progression de tumeurs différenciées à complètement dédifférenciées semble requérir la perte de fonction d’autres gènes suppresseurs de tumeurs qui régulent négativement la prolifération des cellules thyroïdiennes (111). L’agressivité des ATC est principalement liée à l’activation des protéines de la cascade des MAPK. Entre 22 et 53% des ATC présentent une mutation RAS. Etant dormé que les mutations RAS sont principalement présentes dans les FTC et la variante folliculaire des PTC, une fraction d’ATC dérive probablement de ces deux types de tumeurs (112). Entre 15 et 26% des ATC présentent une mutation BRAF et ceux-ci dérivent probablement des PTC (113;114). Par ailleurs, Aheme et al. ont démontré que certains ATC ne dérivent ni de PTC ni de FTC mais sont la conséquence d’une succession de mutations indépendantes (115). La P-caténine,
25
composante de la cascade Wnt et régulateur de l’adhésion cellule-cellule, est mutée dans 38-66% des ATC et dans 16-32% des carcinomes peu différenciés mais pas dans les carcinomes différenciés. Une localisation nucléaire anormale est retrouvée dans la moitié des échantillons contenant la mutation (116).
La cascade de signalisation PI3K/Akt est dérégulée dans 58% des ATC (117). La PI3KCA est mutée dans 12-23% de ces tumeurs et des amplifications du gène sont retrouvées dans 42% des ATC (118;119).
2.23.4 Carcinomes pauvrement différenciés
Les carcinomes pauvrement différenciés (PDC) regroupent les tumeurs intermédiaires entre les tumeurs différenciées et anaplasiques. Les mutations RAS, p53, BRAF et P-caténine sont principalement retrouvées dans ce type de tumeur (Table 2).
23 Modèles expérimentaux in vitro des tumeurs thyroïdiennes
2.3.1 Cultures primaires de cellules thyroïdiennes humaines
Les cultures primaires de thyrocytes sont un bon modèle d’étude thyroïdien étant donné qu’elles présentent une grande correspondance fonctionnelle et biochimique avec le tissu d’origine. Après une digestion enzymatique de tissu thyroïdien, les thyrocytes sont mis en culture pendant 4 jours. Ce modèle expérimental a permis d’étudier in vitro les mécanismes moléculaires impliqués dans la prolifération et la différenciation (120). Ces cultures primaires ont également permis de réaliser un modèle d’étude des adénomes autonomes hyperfonctionnels, caractérisés par une activation constitutive de la cascade de l’AMPc, en stimulant les thyrocytes en culture primaire avec de la TSH, pendant des temps longs (24h et 48h) (121).
Introduction
2.3.2 Lignées cellulaires
Une lignée cellulaire est une population homogène de cellules provenant d’une même cellule mère demeurant stable après des mitoses successives, et ayant en théorie une capacité illimitée de division.
Différentes lignées cellulaires thyroïdiennes sont disponibles dans le laboratoire : FTC-133 et WRO (provenant de carcinomes folliculaires), BCPAP et TPC-1 (provenant de carcinomes papillaires) et 8505C (provenant d’un carcinome anaplasique). Ces lignées cellulaires ont un profil d’expression génique similaire et sont plus près du profil d’expression génique des ATC que de celui de leur tumeur d’origine ce qui permet de supposer qu’elles ont évoluées vers un phénotype dédifférencié commun après avoir perdu toutes leurs caractéristiques de départ. De plus, contrairement aux carcinomes différenciés, ces lignées ont perdu l’expression de la plupart des gènes de différenciation de la thyroïde (TSHR, NIS, TG, TPO, THOX2) et ne répondent plus à la TSH. Elles conservent, néanmoins, l’expression de facteurs de transcription spécifiques dans la plupart des lignées (TTFl, TTF2, P AXS). Les lignées cellulaires sont donc un meilleur modèle pour les tumeurs dédifférenciées que pour les tumeurs différenciées (122).
3. Régulation post-transcriptionnelle des protéines : les niiRNA
3.1 Introduction
Une cellule humaine contient plus de 3 milliards de paires de bases pour coder plusieurs millions de polypeptides différents. On estime que le génome de mammifères contient environ 20.000 gènes codant pour des protéines. Une cellule fabriquerait à tout moment environ 5.000 polypeptides différents. La régulation de l’expression des gènes est donc très complexe. Seules 1 à 2 % des séquences d'ARN produites sont traduites en protéines. Il existe donc une multitude de phénomènes capables de réguler la synthèse des protéines, en agissant à toutes les étapes. Parmi les ARN non codants, les miRNA ont été identifiés comme des acteurs majeurs dans la régulation de l'expression des gènes au niveau post-
27
Transport vers le cytoplasme par l’exportine
Dicer
Duplex miRNA/miRNA*
Appariement mRNA avec complexe RISC/miRNA
complexe RISC/miRNA i
Introduction
transcriptionnel. On estime à 30% les gènes humains potentiellement régulés par des miRNA (123). Ils sont impliqués dans un grand nombre de fonctions physiologiques essentielles telles que la croissance cellulaire, la différenciation, l'apoptose, le métabolisme....
3.2 Biosynthèse des miRNA
Les miRNA sont des ARN simple brin d’une longueur de 21 à 25 nucléotides très conservés au travers de l’évolution (124). Ils régulent négativement l’expression génique à un niveau post-transcriptionnel en empêchant la traduction de l’ARNm ou en induisant sa dégradation (125). Jusqu’à présent environ 800 miRNA humains ont été identifiés (126). Ils sont transcrits majoritairement par l’ARN polymérase II. En effet, les pri-miRNA, transcrits primaires des miRNA, contiennent une structure CAP (7-méthyl-guanosine) en 5’ et une queue poly-A en 3’. Ils contiennent également une structure en forme d’épingle à cheveux qui est clivée par Drosha (Rnase III d’environ 160 kDa) pour aboutir au précurseur pre-miRNA d’environ 70 nucléotides (Figure 10) (127). Le pre-miRNA est ensuite exporté du noyau par l’exportine 5 et une fois dans le cytoplasme, il est clivé par Dicer (Rnase III) en un petit ARN double brin d’environ 22 nucléotides (un brin mature (miRNA) et un brin complémentaire (miRNA*)). Le miRNA* est rapidement dégradé (128) et le miRNA mature est incorporé dans un complexe effecteur, miRISC (miRNA-containing RNA-induced silencing complex), complexe multiprotéique d’environ 500 kDa. Une des protéines essentielles qui le compose est la protéine argonaute. Les miRNA, associés au complexe miRISC, peuvent inhiber l’expression génique par deux mécanismes post- transcriptionnels : par clivage de l’ARNm cible si le miRNA se lie à l’ARNm cible de manière parfaitement complémentaire ou par répression traductionnelle de celui-ci si la complémentarité est imparfaite. Cependant chez les animaux, les miRNA montrent généralement une complémentarité imparfaite.
28
RISC
Dicer iûillll Duplex
-^r—r-*™
■ititiïïïïr .luiïïir
Gêne Suppfèsseur deTutnev mIRNA
X,
l
Oncogène
î s-
Inhixtion traduction ou dégradation ARNm Diminulion protéines anti-oncogéniques
Augmentaéon protéines oncogéniques
Figure 11 : rôle des miRNA dans le cancer
(http://www.nature.com/nm/joumal/vl l/n7/images/nm0705-712-Fl .jpg)
Introduction
3.3 miRNA et Cancers
Depuis quelques années, les miRNAs ont été décrits comme dérégulés dans un grand nombre de tumeurs. Ils peuvent agir comme oncogène ou en tant que suppresseurs de tumeurs. La surexpression d'un miRNA contrôlant un gène suppresseur de tumeur aboutit à une diminution de la production d'une protéine anti-oncogénique (129;130). A l’inverse, un effet positif sur le développement tumoral est observé en cas de diminution de l'expression d'un miRNA contrôlant un oncogène (Figure 11). Par exemple, mir-21 voit son expression diminuer dans les gliomes, les cancers du colon, du foie et de la glande thyroïde. Les miRNA de la famille Let-7, inhibiteurs de la prolifération cellulaire contrôlant négativement l'expression du proto-oncogène RAS, sont également diminués dans de nombreux cancers.
Plusieurs études ont montré que la classification moléculaire des tumeurs basée sur les microRNA (miRNA) est plus précise que celle basée sur les ARNm (131- 137). Etant donné que les miRNA sont des éléments régulateurs qui interviennent en amont de la traduction des ARNm et peuvent donc réguler plusieurs gènes, l’analyse des microarrays miRNA est souvent moins lourde que celle des microarrays ARNm.
4. Analyse de l’expression génique par microarrays.
4.1 Principe général
Les microarrays permettent l’analyse simultanée de l’expression de plusieurs milliers de gènes dans différentes cellules et dans différentes conditions physiologiques, pathologiques ou toxicologiques. Le terme de « cible » (ou target) désigne l’ARNm que l’on cherche à identifier ou à quantifier, tandis que le terme de « sonde » (ou probe) correspond à une séquence nucléotidique connue et est soit greffée sur le support, soit synthétisée in situ. Le terme spot désigne l’ensemble des sondes identiques à un endroit précis de la lame de microarrays.
La cible marquée d’un fluorophore s’hybride sur la sonde et le signal en résultant
29
Cy 5
Éch. B > A
B. Génération d'ADNc C. Marquage
D. Hybridation
Introéuction
est proportionnel à la quantité d’ARNm présent dans la cellule dont il provient.
Deux technologies sont principalement utilisées pour analyser les ARNm : les microarrays double canaux et les microarrays simple canal. Les microarrays permettent également l’analyse simultanée de l’expression de miRNA dans différentes conditions.
4.2 Microarrays double canaux
Ces microarrays sont constitués de lames de verre sur lesquelles des milliers d’ADNc ou oligonucléotides sont déposés: chaque gène (de fonction connue ou inconnue) est représenté par un seul point sur la lame. Deux échantillons d’ARN, l’un issu d’une population cellulaire contrôle et l’autre issu de la population à étudier, sont réverse-transcrits en ADNc, et marqués par des fluorophores différents (cyanine-5, rouge et cyanine-3, vert). Les deux échantillons sont ensuite déposés simultanément sur le microarray de manière à s’hybrider avec les séquences complémentaires présentes sur la lame. Le microarray est ensuite analysé par un scanner à laser (microscope confocal). Selon la longueur d’onde émise par le laser, le scanner détectera le signal renvoyé par l’un ou l’autre fluorophore. Le rapport des fluorescences rouge/vert est ainsi déterminé pour chaque spot et permet de comparer le niveau d’expression relatif de chacun des gènes pour les deux échantillons de départ (Figure 12).
Cette technique a été adaptée à l’étude des microRNA : Les sondes déposées correspondent à l’ensemble des miRNA connus ou prédits. L’ARN n’est plus rétrotranscrit en ADNc mais directement marqué par les fluorophores (Hyanine 5, rouge et Hyanine 3, vert).
Les lames utilisées pour l’analyse des ARNm sont confectionnées par Frédéric Libert (IRIBHM). Elles contiennent 23.232 spots dont 7.541 ADNc différents identifiés provenant essentiellement de lymphocytes, de leucocytes et de cellules de cerveau foetal et des lames commerciales HEEBO contenant 48,958 oligonucleotides 70-mer représentant tout le génome. Les lames utilisées pour l’analyse des miRNA sont préparées à l’IRIBHM par l’équipe de F. libert et
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contiennent 1269 miRNA connus (banque Exiqon, pour description voir chapitre matériel et méthodes).
4.3 Microarrays simple canal: les lames Affymetrix
Dans le cas des microarrays simples canaux, nous avons utilisé la technologie Affymetrix, dans laquelle des oligonucléotides de petite taille (25-mers) sont synthétisés in situ. Chaque gène est représenté par 11 à 20 paires d’oligonucléotides: des oligonucléotides complémentaires à la séquence du gène qualifiés de « perfect-match » (PM), et des oligonucléotides différant du PM par une mutation du nucléotide situé en position centrale (position 13), et qualifiés de
« mis-match » (MM). L’objectif de ces doublons est de contrôler les hybridations non spécifiques. Le principe général est le même que pour les microarrays double canaux mais ici, un seul type de fluorophore est utilisé pour la cible (streptavidine couplée à la phycoérythrine).
5. Analyse des données microarrays
Trois considérations doivent être prises en compte en vue d’analyser les données:
1) Comment détecter un signal utilisable pour chaque gène? Voir paragraphe 5.1 et 5.2.
2) Comment utiliser ce signal pour trouver les gènes différentiellement exprimés? Voir paragraphe 5.3.
3) Comment regrouper des gènes ou des échantillons ayant un profil génique similaire? Voir paragraphe 5.4.
5.1 Correction du bruit de fond
Les spots sont préalablement localisés grâce au placement d’une grille. Une étape préliminaire à la normalisation consiste à soustraire l’intensité du bruit de fond à
Introduction
celle du signal. Les spots dont le rapport d’intensité signal sur bruit n’est pas assez élevé (SNR<2, critère arbitraire) sont alors supprimés (filtering).
5.2 La normalisation
La normalisation consiste à corriger les biais techniques qui tendent à déséquilibrer le signal de l’un des flurophores par rapport à l’autre. Ces biais techniques sont dus, en particulier, aux différences de caractéristiques des deux fluorophores cy3 et cy5 (à incorporation égale, cy3 émet un signal plus fort que cy5 et cy5 est plus sensible à la lumière et à l’ozone que cy3), aux différences d’incorporation des marqueurs lors de la synthèse des cibles (cy3 a un plus grand encombrement stérique), et aux paramètres de lecture au scanner (par exemple réglages de la puissance des lasers...). Il existe plusieurs méthodes pour normaliser les données :
5.2.1 La normalisation par rapport à la moyenne globale des intensités
Cette méthode suppose qu’il y a autant de gènes sur-exprimés que sous-exprimés.
Dans ces conditions, la moyenne géométrique des ratios d’expression Ri/Gi (où Ri est le niveau d’expression d’un spot i marqué par un fluorophore rouge et Gi est le niveau d’expression d’un spot i marqué par un fluorophore vert) de tous les spots devrait être égale à 1. Les ratios d’expressions sont donc corrigés par un même facteur de normalisation.
5.2.2 La normalisation par rapport à des gènes de contrôle externes
Cette méthode consiste à calculer le facteur de normalisation à partir de spots où s’hybrident de l’ARN ajouté artificiellement aux échantillons à étudier (spike- ins). Cette normalisation est préférable à la précédente s’il y a beaucoup de gènes exprimés de manière différentielle, si la distribution des ratios d’expression est asymétrique ou dans le cas de la normalisation de lames miARN, étant doimé un nombre plus restreint de spots par rapport aux lames ARNm. Les spike-ins
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