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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Kirsch-Volders, M. (1972, May). Contribution à l'analyse biochimique des plaquettes vitellines des oocytes de batraciens: caractérisation du DNA et étude des relations entre ce DNA et les protéines du vitellus (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.

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et

Embryologie moléculaires

Contribution à ^analyse biochimique des plaquettes vitellines des oocytes de batraciens :

caractérisation du DNA et étude des relations entre ce DNA et les protéines du vitellus

Thèse présentée pour l'obtention du grade légal de Docteur en

Sciences Zoologiques , o

0.^-^

L-

Micheline KIRSCH-VOLDERS Mai 1972

Titre de la thèse annexe présentée par Micheline KIRSCH-VQLDERS

"DIFFERENCIATION DES CELLULES DE VERTEBRES EN CULTURE"

Qu’il nous soit permis d’exprimer ici toute notre grati­

tude envers Monsieur le Professeur J. BRACHET, qui, tout au long de notre travail, n’a pas cessé de nous manifester son intérêt et son at­

tention.

Une très grande partie de nos recherches a été effectuée en collaboration avec Elyane BALTUS, Jacqueline HANOCQ-QUERTIER,

Françoise HANOCQ et Gilberte STEINERT. De nombreux problèmes théoriques et pratiques n’ont été résolus que grâce à leur aide et leurs encoura­

gements. J’aimerais qu’elles trouvent ici l’expression de ma reconnais­

sance.

Nous tenons également à remercier tous les chercheurs et les membres des laboratoires de cytologie et embryologie moléculaires, de chimie biologique, de génétique et de radiobiologie pour les discus­

sions qu’ils nous ont accordées dans une ambiance de parfaite camarade­

rie. Nous remercions plus particulièrement Alex BOLLEN et A. HERZOG dont la coopération nous a grandement facilité le travail.

Enfin, nous remercions l’Institut pour l’Encouragement de la Recherche Scientifique pour l’Industrie et l’Agriculture dont le soutien financier nous a permis de réaliser cette thèse de doctorat.

9 C O O 7 A

«) O O O

R E

s

Nous avons montré que les plaquettes vitellines des oeufs de batraciens contiennent effectivement 50% de l’abondante réserve de ONA présent dans l’oocyte de Xenopus laevis.

Nous avons pu isoler ce DNA vltellln à partir des pla­

quettes vitellines d’oocytes ayant ovulé in vitro sans qu’il soit con­

taminé par le DNA nucléaire ou le DNA mitochondrial. De plus, chez l’axolo 1, le DNA extrait, cette fois, des oeufs pondus, possède une densité de flottaison en gradient de CsCl, qui le distingue nettement des DNA nucléaire et mitochondrial de la même espèce.

Une caractérisation du DNA vltellin de Xenopus laevis a été réalisée; à cette fin, nous en avons déterminé le poids molécu­

laire, le coefficient de sédimentation ainsi que les densités de flot­

taison en gradient de CsCl à l’état natif, dénaturé et renaturé.

Nous avons analysé l’association DNA vltellin - protéines vitellines, association qui est suggérée par les nombreux résultats ob­

tenus par différents auteurs et par nous-même. Nous avons ainsi pu démontrer que la protéine vitelline qui est extraite "associée" au DNA vltellin est la phosvltlne.

Sur colonne d’albumine méthylée, cette association n’est pas spécifique du DNA vltellin. Par contre, des filtrations sur colonne de Séphadex G-200 nous ont permis de démontrer que le DNA vltellin forme in vivo ou in vitro avec la phosvitine des liens plus résistants que le DNA nucléaire et la phosvitine n’en forment in vitro.

L’flclstence d’une association réelle DNA vltellin -

phosvitine rend de plus en plus probable l’hypothèse formulée par BRACHET selon laquelle le DNA vltellin trouverait son origine dans le foie de la femelle vitellogénique. Il serait transporté dans le sérum sanguin, associé à la phosvitine et absorbé par les oocytes en vole de croissance.

TABLE DES MATIERES

INTRODUCTION GENERALE

A) Etude du DNA vltellln I. Introduction

a) Présence d'un excès de DNA dans l'oocyte mûr de batracien b) Localisation intracellulaire du DNA en excès :

1) DNA Mitochondrial 2) DNA vitellin c) Rôle du DNA vitellin

d) Conclusion et objet du travail

II. Matériel

a) Présentation du matériel biologique utilisé b) Abréviations utilisées

c) Matériel particulier

III. Méthodes

a) Préparation des oocytes et des oeufs en vue des extractions b) Méthode d'extraction du DNA

1) DNA nucléaire 2) DNA vitellin

i) Isolement des plaquettes vitellines ii) Isolement du DNA des plaquettes vitellines 3) DNA mitochondrial

i) Isolement des mitochondries li) Isolement du DNA mitochondrial c) Dosage du DNA

d) Méthodes utilisées dans les expériences de contrôle de la pureté du DNA vitellin

1) Extraction de la chromatine des érythrocytes 2) Culture de cellules de reins de Xenopus laevis

3) Coloration à 1’actinomycine tritiée de préparations cytologi­

ques d'oocytes de batracien e) Caractérisation du DNA vitellin

1) Centrifugation préparative en chlorure de caesium 2) Centrifugation analytique en chlorure de caesium 3) Dénaturation et renaturation

4) Microscopie électronique 5) Coefficient de sédimentation

f) Méthodes utilisées dans l’étude des liaisons DNA-protéines 1) Chromatographie sur colonne d'albumine méthylée CM.A.K.l 2) Dissociation et réassociation DIMA-protéines

3) Chromatrographie sur colonne de DEAE et CMC-cellulose (diethylaminoéthyl-cellulose et carboxyméthyl-cellulose) 4) Electrophorèse sur gel de polyacrylamide

5) Dosage de protéines, de phosphore et d'azote

6) Détermination du profil de sédimentation sur gradient de saccharose

7) Filtration sur colonne de séphadex G-2DÜ

IV. Résultat

a) Estimation quantitative par la méthode de Keck du DNA présent dans les oeufs vierges et les oocytes de Xenopus laevis

1) Spécificité et précision de la méthode rie dosage

2) Matériel dosable è l’indole, contenu dans les oocytes et les oeufs vierges de Xenopus laevis

3) Sensibilité à différents enzymes du matériel coloré à l’indole

4.-

b) Isolement du DMA contenu dans les plaquettes vitellines des oeufs de batraciens

1} Extraction du DNA vitellin des oeufs vierges ou d’oeufs indivis

i] chez Xenopus laevis ii) chez Ambystoma mexicanum

2} Extraction du DNA vitellin des oocytes ovariens débarrassés manuellement de leurs cellules folliculeuses chez Xenopus laevis

3) Extraction du DNA vitellin à partir d’oocytes ayant subi la maturation in vitro chez Xenopus laevis

c) Caractérisation du DNA vitellin de Xenopus laevis

1) Dénaturation et renaturation du DNA vitellin en centrifugation analytique

2) Etude au microscope électronique de la longueur des molécules de DNA vitellin et de DNA nucléaire de Xenopus laevis

3) Coefficient de sédimentation du DNA vitellin et du DNA nucléaire de Xenopus laevis

4) Limitation de l’étude

d) Arguments contre la contamination du DNA vitellin par le DNA mitochondrial ou le DNA nucléaire chez Xenopus laevis

1) Par le DNA mitochondrial I 2) Par le DNA nucléaire

j - méthode de coloration du DNA à 1’actinomycine tritiée I - contamination artificielle des oocytes ovulés par de la

I chromatine exogène radioactive

- traitement in toto des oocytes ovulés à la DNAase

i

e) Essais de marquage du DNA vitellin chez Xenopus laevis I

1

!

t I

V. Discussion

a) Présence d’une quantité excessive de DNA dosable dans les oeufs de batraciens

b) spécificité de la méthode de dosage utilisée dans ce travail

c) Présence d'une quantité importante de DNA dosable dans les plaquet­

tes vitellines des oeufs de Xenopus laevis

1) Oocytes de Xenopus laevis ayant ovulé in vitro

2) Oeufs vierges de Xenopus laevis et d’Ambystoma mexicanum

3) Rendement de l’extraction du DNA vitellin a partir d’oocytes ovulés in vitro

f) Essais de marquage du DNA des oocytes chez Xenopus laevis

VI. Conclusions

B) Etude des liens éventuels existant entre le DNA vitellin et les protéines vitellines

I. Introduction

a) Etude du vitellus chez les batraciens 1) Composition et structure du vitellus 2) Origine du vitellus

b) Origine du DNA vitellin c) Etude dos phosphoprotéines d) Conclusion et objet du travail

II. Natériel et méthodes : L’ensemble a été décrit dans la section Matériel et méthodes du Chapitre A.II et A. III

6.

III. Résultat

a} Mise en évidence de 1'"association" DNA vitellin - matériel proté­

ique chez Xenopus laevis 1] Etude du spectre

2) Etude de la sédimentation en bandes

1) Chromatographie sur colonne d’albumine méthylée

2} Analyse enzymatique du matériel éluant précocement sur colonne de MAK.

b) Nature du matériel protéique "associé" au DNA vitellin extrait d’oocytes ovulés in vitro

1) Etude du spectre

2) Chromatographie sur colonnes de CMC- et DEAE- cellulose 3) Electrophorèse en gels de polyacrylamide

4) Analyse des acides aminés de la fraction protéique

5) Analyse du poids moléculaire de la protéine "associée" au DNA vitellin

6) Détermination du contenu en phosphore total de la protéine

"associée" au DNA vitellin

7) Détermination du rapport azote/phosphore de la protéine

"associée" au DNA vitellin c) Rôle de ce matériel protéique

1] L’élution précoce observée sur colonne de MAK est-elle une propriété réservée au DNA vitellin ?

i} recherche de la présence éventuelle de DNA nucléaire dans la fraction précoce d’ovaires totaux de Xenopus laevis il) Association artificielle DNA-phosvitine réalisée in vitro

2) Analyse du comportement de la phosvitine et du DMA nucléaire en gradient de chlorure de caesium et de saccharose

i) Centrifugation en gradient de chlorure de caesium iil Centrifugation en gradient de saccharose

3) Etude de 1'"association” DNA-phosvitine sur colonne de Séphadex G-200.

IV. Discussion

a) Mise en évidence d’une "association DMA cytoplasmique-nrotéines"

dans l’oocyte de batracien

b] Mature de l’association DMA vitellin-phosvitine 1) Spécificité de l’association

2) Cette association est-elle réelle ou fortuite ?

V. Conclusion

b.-

INTRODUCTIQIM GENERALE

1

Un embryon différencié nait de la fusion, au sein du cyto­

plasme de l’oeuf, d’un pronucleus mâle et d’un pronucleus femelle: il est capable de se développer, de se mouvoir, de se nourrir et de donner nais­

sance à un adulte. Cette constatation soulève l’un des problèmes les plus fascinants de l’embryologie moléculaire : comment, avec au départ le bagage génétique d’une seule cellule, peut-on expliquer les spécialisations acquises par les cellules des différents tissus de l'embryon ?

La grande complexité et la variabilité des processus de régulation génétique sont telles, au cours de l’embryogénèse, qu’une

approche directe est difficile. Une collaboration étroite entre les cyto- logistes, les généticiens et les biochimistes sera, donc, nécessaire pour fournir une réponse satisfaisante et complète.

Actuellement, les embryolon'istes se sont surtout attachés à l’étude des premiers stades du développement tels que l’oogénèse, la maturation, la fécondation, le clivage, la gastrulation et 1’organogénèse primaire.

Nous nous sommes orientée plus particulièrement vers l’étu­

de du DNA présent dans l’oocyte mûr et l’oeuf récemment fécondé des am- phibiens. L’un des faits les plus marquants dans ce domaine, est la pré­

sence, dans l’oocyte de batracien, d’une quantité de DNA nettement su­

périeure à la quantité diploïde attendue. Nous avons de ce fait, entre­

pris l’étude de la nature, de l’origine et du rôle de ce DNA présent en excès dans l’oocyte des batraciens. Cette étude sera présentée en 2 par­

ties correspondant aux chapitres A et B du présent travail : A : étude du DNA vitellin

B : étude des liens éventuels existant entre le DNA vltel- lin et les protéines vitellines.

10

A) Etude du DNA vltellin

I INTRODUCTION

Les stades Initiaux du développement (segmentation) d'un oeuf se caractérisent par une succession très rapide de mitoses. En guise d'exemple, rappelons qu'il ne faut que 3 heures 30 minutes è l'em­

bryon de l'anoure Xenopus laevis pour passer du stade 2 blastomères au stade blastula moyenne. (500 à 1000 cellules), alors qu'une mitose dans une cellule hépatique dure environ une heure 30 minutes.

Cette accélération du rythme des mitoses est accompagnée par un raccourcissement de l'interphase, période située entre 2 mitoses successives. En effet, si le cycle cellulaire normal comporte une pha­

se G^. une phase S de synthèse du DMA et enfin une phase de post-synthè­

se G^. on constate que les phases G^ et G^ sont extrêmement raccourcies dans les oeufs en voie de segmentation.

Il était intéressant de déterminer, si dans ces condi­

tions de multiplication cellulaire rapide, on peut observer une augmenta­

tion importante de la teneur en DNA de l'embryon. Différents laboratoi­

res ont étudié cette question. En ce qui concerne les amphibiens, qui constituent notre matériel, ils sont arrivés aux conclusions suivantes :

1. La quantité de DNA contenu dans l'oeuf non fécondé d'am- phibien excède largement la valeur haploïde théorique calculée.

2. Durant la segmentation, il n'existe pas de relation sim­

ple entre le nombre de cellules d'un embryon d'amphibien et la quantité totale de DNA qu'il possède.

a) Excès de DNA dans l'oocyte et l'oeuf de batracien

Ainsi que HOFF-J0RGENSEN et 7ENTHEN (1952) l'ont montré en premier lieu, la teneur en DNA d'un oocyte entier d'amphibien (Rana tem- porarla) est bien plus élevé que prévu. Malheureusement, l'estimation de la quantité moyenne de DNA acido-insoluble d'un oeuf de batracien est ren­

due difficile par la présence d'une énorme quantité de matériel de réser­

ve qui interfère avec les m thodes de dosage.

TABLEAU I

ETUDE COMPAREE DES DOSAGES DE DNA DANS LES OOCYTES ET LES OEUFS DE BATRACIENS

Auteur Matériel Méthode Matériel dosé Résultat en/cgr/oBuf

1) Méthode microbioloç'ique

microbiologique acido-soluble +

acido-insoluble

0.065 HOFF-J0RGENSEN E.

ZEUTHEN E.

1952

Rana temporaria Coocyte ou oeuf

vierge) GREbG J•R•

L0VTRUP S.

1955

Rana pipiens (oeuf fécondé)

microbiologique acido-soluble

acido-insoluble+ Q.0B3 0.002

GRANT P.

1953

Rana pipiens (oeuf fécondé)

microbiologique acido-soluble acido-insoluble

0.020 0.022 KURIKI Y.

et OK.AZAKI R.

1959

Bufovulgaris (oeuf fécondé) Tuturus pynhogaster

(oeuf fécondé)

microbiologique microbiologique

acido-insoluble acido-insoluble

0.0318 0.0274

L0VTRUP S.

1959

^mbystoma mexicanum (oeuf fécondé volumi­

neux)

microbiologique acido-insoluble 0.1 j

I

dosage de P.

SZE L.C.

1953

Rana pipiens (oeuf fécondé]

Extr : Schmldt- Thannhauser dosage de P.

acido-insoluble 1 .2

3] riéthodes fluoromét]niques

BALTUS E. Pleurodeles waltlil DABA acido-insoluble 0.069

ERACHET J, (oeuf fécondé) 1962

HANOCg-QUERTIER J. Xenopus laevis DABA acido-insoluble 0.038

BALTUS E. (oocyte ovarien) 1960

HAGGIS A.J. Rana pipiens DABA ( acido-insoluble 0.5

1964 (oeuf fécondé) ( acido-insoluble 0.2

(, DNAose sensible

AMBA £ acido-insoluble 0.2

l acido-insoluble 0.2 ( DNAose sensible

4) Autres méthodes , ■ ... —

BIEBER S. Rana pipiens Extr : Schneider acido-soluble 1 .75

(oocyte) Dosage : Cériotti

SPENCE J.A. acido-insoluble 0.175

HITCHINGS G.H.

1959

(

DAWID I.D.

1965

Rana pipiens Coeuf vierge)

diphénylamine CBURTON)

acido-soluble acido-insoluble

Ü.0456 0,0084 acido-insoluble en

gradient de CsCl 0.0036 Xenopus laevis

Coeuf vierge)

acido-insoluble en

gradient de CsCl 0.0031 KONG Y.C. et al.

1971

Megalobatrachus Cespèce géante) Long : 1 m

Poids : 3 à 4 kg [oocyte ovarien)

acido-insoluble en gradient de CsCl

43

I

De nombreux auteurs ont cependant effectué des estimations de DNA par diverses méthodes sur les oeufs de plusieurs espèces d’amphi- biens. Leurs données sont reprises dans le Tableau I.

Les idées essentielles qui se dégagent de ce tableau peu­

vent se résumer comme suit :

- la méthode microbiologique qui est certainement la plus spécifique, mais d’un emploi malaisé, donne les valeurs les plus faibles : 0.02^gr de matériel acido-insoluble par oeuf d’anoure (HOFF-J0RGENSEN et al. 1952). Les chiffres proposés par BALTUS et BRACHET (1962). HANOCQ, QUERTIER et al. (1960) se rapprochent fort de cette valeur. La méthode fluorométrique utilisée semble donc valable dans ce cas-ci, mais il est indispensable qu’elle soit accompagnée d’un test de spécificité.

- Les autres laboratoires présentent des valeurs nettement plus élevées :

HAGGIS (1966) : Q.2^gr de matériel acido-insoluble par oeuf.

KUTSKY et SZE (1953) : l^gr de matériel acido-insoluble par oeuf.

- DAWID, d’autre nart, a proposé une valeur pour le maté­

riel acido-insoluble oarticulièrement faible (O.OOO^gr/oeuf ). tandis que la quantité de matériel acido-soluble qu’il trouve se situe dans la moyenne des résultats obtenus par la méthode microbiologique.

De cet ensemble de données, il semble raisonnable de con­

clure qu’un oocyte ou un oeuf non fécondé d’amphibien anoure contient de l’ordre de 0.025^gr de DNA.

Si l’on admet qu’un jeu diploïde de chromosomes de Xenopus laevis contient environ 6 picogrammes de DNA (BROWN et al. 1968), on cal­

cule aisément qu’un oocyte mûr de batracien contient au moins 4.000 fois plus de DNA qu’une cellule somatique. Il semble assez séduisant d’établir un parallèle entre l’excès de DNA (4.000 X2n) présent dans les ceufs de batraciens et le nombre des cellules (environ 4.000) qui forment la blas- tula avancée, stable embryologique qui marque la fin de la segmentation.

16.-

et qui ssrait atteint sans modification sensible de la quantité de DNA contenu dans l’embryon entier. Cela suggérerait que le DNA surnuméraire serait utilisé sous forme intégrale ou partielle par les noyaux nouvelle­

ment formés.

b) Localisation du DNA extrachromosomial des oocytes de batraciens

La réalité de l’existence du DNA cytoplasmique a été démon­

trée par CHEVRENONT dès 1956-1957. Il a pu mettre en évidence du DNA dans le cytoplasme de fibroblastes cultivés in vitro dans certaines con­

ditions expérimentales (traitement A la désoxyribonucléase ou par le froid par exemple). Dans ces conditions, les mitochondries deviennent sphériques et donnent une réaction de FEULGEN de plus en plus intense.

Enfin, elles deviennent capables de réaliser une synthèse nette de DNA : elles incorporent en effet, activement un précurseur radioactif spécifi­

que de cet acide nucléique, la thymidine.

Des travaux plus récents ont montré qu’en règle très gé­

nérale, les mitochondries des plantes supérieures, des levures et des animaux contiennent du DNA.

De nombreux auteurs ont mis aussi en évidence la orésence d’une grande quantité de DNA dans les Kinétoplastes des trypanosomes.

(SINPSON et al. 1971; LAURENT et al. 1971; Revues générales DORST, 1970:

BÜRST et al. 1971).

Un cas assez similaire se présente dans les chloroplastes d’acétabularia (BALTUS et BRACHET, 1963; GIBOR et I7AWA 1963) : ces algues peuvent fa­

cilement être anucléées et constituent donc un matériel de choix pour étudier le DNA extra-nucléaire. Des expériences récentes ont montré que le DNA chloroplastique oeut, tout comme le DNA chromosomial, se répliquer HEILPORN-POHL et al. (1966) ont observé, en effet, une synthèse nette de DNA dans les fragments anucléés d’Acetabularia méditerranea.

Passons enfin au cas dss oeufs. Le principal argument en faveur de la présence de DNA cytoplasmique dans les oeufs d’oursins provient des travaux de BALTUS et al. (1365). Ces auteurs ont effectivement mon­

tré que les fragments anucléés d’oeufs vierges d’oursins contiennent autant de DNA que leurs contreparties nucléées. La présence de DNA cytoplas­

mique en quantité nettement supérieure à celle du DNA nucléaire n’a pas été observée uniquement dans les oeufs d’oursins. C'est ainsi que FRAENKEL- CÜNRAT et al. (1952) ont isolé du DNA des réserves cytoplasmiques de l’oeuf de poule et que SHMERLING (1964) a extrait du DNA cytoplasmique de haut poids moléculaire A partir des oocytes d’esturgeon. Les oeufs de lézard

(GURAYA - 1969), d’Ilyanassa obsoleta (COLLIER et al. 1962) et de droso­

phile (BRIGGS et al. 1959) possèdent également des réserves de DNA cyto­

plasmique. Dans le même ordre d’idée, PAINTER (1969) a fait une constata­

tion curieuse : la gelée royale secrétée par les jeunes abeilles contient du DNA.

Venons en, enfin, aux oocytes de batraciens, objet princi­

pal de notre travail. Les résultats énumérés dans le tableau I établis­

sent que ces oeufs contiennent un grand excès de DNA, mais ils ne démon­

trent pas la localisation cytoplasmique de ce DNA. Il en existe cependant des preuves. Une étude récente réalisée par NAC GREGOR (1968) a, par exemple, montré que la teneur en DNA de la vésicule germinative d’un oocy­

te de Xenopus laevis s’élève à environ 43 picogrammes (7 x 2 n) : plus de 90% du DNA total d’un oocyte de batracien se trouverait dès lors dans le cytoplasme. SZE (1953), à la suite d’un calcul assez spéculatif basé sur les volumes respectifs d’un noyau d’hépatocyte et d’une vésicule germinative d’amphibien, estime qu’une vésicule germinative peut contenir au maximum 200 fois la valeur diploïde de DMA. Puisqu’un oocyte contient en réalité 4000 fois la valeur diploïde de DNA, le cytoplasme de l’oocyte doit nécessairement contenir le restant du DNA. (3.800 x 2 n). Enfin DAWID (1965 et 1966) et BALTUS et al. (1968) ont pu respectivement extrai­

re du DNA des mitochondries et des plaquettes vitellines de Xeropus laevis.

Ifl.-

S1 le DNA mitochondrial a été étudié de manière approfon­

die par DAWID (1965, 1966. 1967, 1960 et 1970) et WOLSTENHOLMEC1967 et 1968). il n’en va pas de même pour le DNA vitellin. En effet, le DNA dans les expériences de BALTUS et al. (1968) a été extrait à partir de plaquettes vitellines d’oocytes ovariens, dont il n’est pas exclu qu’elles fussent contaminées par des noyaux de cellules folliculeuses. Ces résul­

tats demandaient donc à être vérifiés.

Les paragraphes suivants analyseront en détail les données bibliographiques qui concernent le DNA mitochondrial et le DNA vitellin des oocytes do batraciens. Il est évident que d’autres localisations du DNA cytoplasmique ne sont pas à exclure.

1) DNA mitochondrial

DAWID (1965) a pu extraire des oeufs non fécondés de

Rana pipiens et de Xenopus laevis, un DNA de haut poids moléculaire, ayant des propriétés identiques à celles du DNA du foie de la même espèce.

Cet "egg DNA”, ainsi qu’il l'appelait alors, a la même densité en gradient de chlorure de caesium, les mêmes profils de fusion et la même teneur en (G + C), 42% que le DNA du foie. Il est en double hélice.

Des expériences d’hybridations moléculaires en gel d’agar (DAWID et WDLSTENHDLME 1968) ont prouvé que le "egg DNA" n’entre pas en compétition avec le DNA des érythrocytes. Il n’existe donc que peu ou pas d'homologie de séquences entre le "egg DNA” et le DNA nucléaire de la même espèce.

Ainsi que l’a montré le Tableau I, la quantité de ”egg DNA” dosée et purifiée par DAWID est nettement inférieure a celle esti­

mée par tous les autres auteurs (lODD x 2 n au lieu de 40DD x 2 n).

Se basant sur une méthode de dosage (modification de la méthode à la diphénylamine - BURTON 1956) que nous estimons sujette à caution et que nous discuterons plus loin, il conclut ;

1. que 50% du matériel dosé dans l’oeuf par la méthode à la diphénylamine représente du DNA de faible poids molécu­

laire, puisqu'il ne forme pas de bande en gradient de CsCl.

2. que 65 à B0% du DNA total extrait d'un oocyte provient des mitochondries.

3. que le rendement de l’extraction du DNA mitochondrial à oartir des mitochondries est excellent (80%).

4. que le DNA nucléaire pourrait être formé, au cours de la segmentation, aux dépens du DNA de faible poids molécu­

laire, mais qu'il n’y a aucune indication en faveur de l’utilisation d'un stock de DNA de haut poids moléculaire pour former le DNA nucléaire.

Au cours de travaux plus récents, WOLSTENHOLNE et DAWID (1967 et 1968) ont réalisé une étude remarquable du DNA mitochondrial d’amphibien. Ce DNA mitochondrial est circulaire et présente une lon­

gueur caractéristique de l’espèce ; il existe en effet une nette diffé­

rence de taille entre le DNA mitochondrial des urodèles (4.8/t) et celui des anoures (5.8^. Enfin. DAWID (1972) et DAWID et al. (1972) ont pu démontrer l’absence de synthèse de DNA mitochondrial dans l’oeuf de ba­

tracien jusqu’cà un stade assez avancé (têtard nageant).

2) DNA vitellin

A la suite de ces travaux, DAWID est donc arrivé à l'idée que le DNA cytoplasmique des oeufs d'amphibiens est localisé princioalement dans les mitochondries. Cette conclusion est essentiellement basée sur le fait que la quantité de DNA qu’il extrait de la fraction mitochon­

driale correspond en gros à la quantité de DNA qu’il dose dans l’oeuf entier par une modification de la méthode à la diphénylamine.

20.-

Par contre, en utilisant une technique fluorométrique (Tableau I), HANOCQ-OUERTIER et al. (196Ü) trouvent, pour la teneur en DNA de l'oeuf, des valeurs nettement plus élevées que celles indi­

quées par DAWID : 0.02yU.gr a 0.09^Ugr de DNA oar oeuf au lieu de

0.003 gr par oeuf chez Xenopus laevis. De plus, ces auteurs estiment que 63% de ce DNA est lié aux plaquettes vitellines. Ces données bio­

chimiques confirment les résultats de BRACHET et FICQ (1965), qui ont observé une forte "coloration" à 1’actinomycine C des plaquettes 14 vitellines, ainsi que ceux de BALTUS et BRACHET (1962) qui ont montré que 65% du DNA cytoplasmique sédimente avec le vitellus et le pigment chez Pleurodeles waltlii. En 1962, également, WALLACE notait la présen­

ce probable de DNA dans les plaquettes vitellines d’amphibiens.

La première extraction en gradient de CsCl du DNA vitellin a été réalisée par BALTUS et al. (1968) à partir des plaquettes vitel­

lines isolées de fragments d’ovaires ou d’oocytes ovariens de Xenopus laevis. Selon ces auteurs, et contrairement aux résultats de DAWID et al. (1966), il semble y avoir 10 fois plus de DNA dans les plaquettes vitellines que dans les mâtochondries. Nalheureusement, chez Xenopus laevis, le DNA vitellin, le DNA mitochondrial et le DNA nucléaire ont tous la même densité en g^radient de CsCl. Il est donc impossible d’éta­

blir par cette méthode que est le degré de contamination éventuelle d’un type de DNA par les 2 autres. Cette situation est aggravée par le fait que les extraits de DNA vitellin ont été réalisés, dans ces pre­

mières expériences, sur des oocytes ovariens et que ces oocytes sont entourés de nombreuses cellules folliculeuses dont il est difficile de se débarrasser. Les résultats concernant l’isolement de DNA vitellin à partir d’oocytes ovariens doivent donc être mis en doute et nous ne tiendrons donc pas compte de ces données.

Le second problème posé par l’extraction du DNA vitellin est lié à la présence d’une très faible quantité de DNA au sein d’une énorme quantité de protéines vitellines. Ces protéines compliquent l’extraction et la purification du DNA vitellin.

Les deux problèmes qui viennent d’être mentionnés fe­

ront l’objet du présent travail.

c) Rôle du DNA vltellin 1) Hypothèses proposées

Deux rôles possibles sont à envisager pour le DMA vitel- lin.

- MOORE pense (1962) que le DMA cytoplasmique pourrait remplir un rôle génétique : on sait que le DNA mitochondrial peut servir de template pour la synthèse du RNA ribosomial des mitochondries, mais en CB qui concerne le ONA vitellin on ne possède aucune preuve valable de ce genre. En effet, ainsi que nous l'avons déjà dit, les résultats observés par BALTUS et al. (1968) sont sujets à caution du fait de la présence de cellules folliculeuses autour des oocytes ovariens que ces auteurs ont utilisés pour isoler le DNA vitellin. On peut cependant imaginer que le DNA vitellin puisse servir de template pour des RNA impliqués dans la synthèse des enzymes responsables de la vitellolyse.

Ces idées trouvent une confirmation possible dans les travaux de BRACHET et SIX (1971) et de BRACHET (1966). qui ont observé que des agents

qui modifient le DNA, tels que le bromure d'éthidium et la formamide, ralentissent fortement la résorption du vitellus dans les embryons d’amphibien. Malheureusement, ces auteurs n'ont pu déterminer

jusqu’à présent si le bromure d’éthidium, en plus de sa fixation sur le DNA nucléaire, se lient au DNA mitochondrial et/ ou au DNA vitellin,

- Le DNA vitellin pourrait également servir de matériel de réserve (BRACHET 1962, DURAND 1961), ainsi que le suggère l'étude de la synthèse du DNA au cours de la segmentation de l'oeuf amphibien.

Dans ce cas, le ONA vitellin emmagasiné dans l'oocyte serait soit utili­

sé en gros fragments, soit hydrolysé en nucléotides qui seraient employé au fur et à mesure des besoins de l'embryon.

On peut se demander alors dans quelle proportion le DNA vitellin con­

tribue à l’édification des DNA nucléaires des cellules nêoformées et dans quelle mesure les noyaux sont capables d'utiliser les précurseurs qui leur viennent du cytoplasme.

22.-

Fig. 1 : Synthèse du DNA durant la segmentation de l’embryon d'amphibien

Fig. 2 : Evolution de la quantité de DNA par cellule chez l’embryon de Rana pipiens

//*grDNA cellule embryonnaire -

\/«grDNA noyau de cellule hépatique

24.-

Ces différents problèmes seront discutés dans les para­

graphes qui vont suivre.

2) Contribution du DNA cytoplasmique à la formation des DNA nucléaires néoformés dans l’embryon d'amphibien en voie de segmentation

L'importance du rôle accordé au DNA cytoplasmique dans l’élaboration des DNA nucléaires, dans les embryons an voie de segmen­

tation, est basée sur deux observations intéressantes :

- Tout d'abord, on ne pense oas qu’il se produise une réelle augmentation de la quantité de DNA par embryon au cours des pre­

mières divisions de segmentation. RRACHET (1954), GREGG et LOVTRUP [1955), HOFF-J0RGENSEN et al. (1952) et L0VTRUP (1959) estiment tous qu’il n’y a pas d’augmentation de la quantité totale de DNA par embryon jusqu’au stade blastula. Toutefois. S7E (1953), GRANT (1956) et KUTSKY (1951)

(fig. 1) constatent que la quantité de DNA par embryon s’accroît dès la fécondation. Il est probable que l'éventuelle augmentation de la teneur en DNA au cours des premières mitoses de segmentation est faible et qu'elle se situe de ce fait dans les limites d'erreurs des méthodes de dosage utilisées.

- En outre. GRANT (1958) a observé qu'au début du développe­

ment embryonnaire, une division cellulaire n’est pas accompagnée d’un

doublement de la quantité de DNA cellulaire. Ce n’est qu'au stade gastula, que chaque division cellulaire se fait après un doublement de cette

quantité. En effet, (fig. 2) jusqu'au stade 17 (blastula de 1000 cel­

lules), on assiste à une diminution de la teneur en DNA par cellule de l’embryon. Après le stade 17, la quantité de DNA par cellule semble être égale à celle présente dans une cellule diploïde normale. Cette obser­

vation peut s’expliquer par le fait qu’au début de la segmentation, une très lente augmentation de la teneur en DNA par embryon est associée à un taux de division cellulaire très élevé. Le DNA dosé en excès dans l’oo­

cyte pourrait donc être utilisé pour l’élaboration du DNA nucléaire des nouveaux blastomères.

3) Synthèse nette de DNA nucléaire au cours du développement des amphibiens

L'existence d'une synthèse de DNA au cours du dévelop­

pement a été démontrée, chez les amphibiens, par l'incorporation d'isoto­

pes radioactifs et de précurseurs marqués dans les oeufs en sep,mentation.

En effet, KUTSKY C1950} et GRANT (195fl) ont montré que le nhosphate

radioactif injecté dans un crapaud est incorporé dans les noyaux des oeufs dès le début du clivage.

Après injection de thymidine tritiée, dans une femelle de Rana pipiens, MOORE (1959) a observé l'incorporation de ce précurseur dans les chromosomes durant le clivage et le stade blastula. Chez

l'hybride (Rana pipiens x Rana Sylvatica ), elle a observé que l'incor­

poration est plus faible que chez les témoins Rana pipiens.-

DIELIAVSKY et TEMCER (1960) ont constaté un autre fait important : l’uridine et la cytidine s'incorporent de manière préfé­

rentielle dans le DNA des noyaux au cours de la seg,mentation d'un embryon de Rana pipiens.

Si on fournit des précurseurs radioactifs appropriés à un embryon en segmentation, il y a donc incorporation de ces précurseurs dans le DNA de l'embryon.

Cependant, pour s’assurer qu'une synthèse de DNA se produit réellement in vivo, il faut s'assurer de la présence, dans l'oeuf de

batracien, des précurseurs de la synthèse de DNA.

- Dès 1947. BRACHET a démontré que les produits de l'hy­

drolyse du RNA peuvent servir de précurseur au DNA nucléaire. GRANT (1958) a constaté que le turn-over des RNA est très important dans les jeunes embryons, alors qu’il ne décèle aucune synthèse nette de RNA. Les ribonucléotides provenant du RNA seraient donc utilisés pour la synthè­

se du DNA.

26.-

- En 1956, GRANT constatait que. durant les 12 premières heures du clivage, le pool des désoxyribonucléotides libres double.

Ces désoxyribonucléotides sont utilisés ultérieurement jusqu'à leur énuisement, de telle sorte que, au stade gastrula. ils ne sont pratique­

ment plus décelables.

- KURIKI et al. (1959) ont décrit le pool de précurseurs comme un mélange de mono, di- et tri-désoxyribonucléotides : d’après eux, les nucléotides représentent moins de 10% du pool total.

- STEINERT (1952, 1955) a mis en évidence le rôle des nuclé­

otides et sourtout des bases puriques libres dans le développement des amphibiens. Ces bases puriques libres apparaissent dans l'oocyte au cours du grand accroissement. Il a pu démontrer que l'adenine C et l'hyoo- 14 xanthine-C sont incorporées rapidement dans l’A.T.P et les acides 14 nucléiques des gastrules de Rana fusca.

4) Conclusion

Le DNA vitellin pourrait soit servir de template pour des enzymes concernées par la vitellolyse, soit représenter un matériel de réserve pour l’em.bryon en voie de développement. Dans ce dernier cas, le DNA vitellin contribuerait, au mois partiellement, à la formation du DNA nucléaire des nouveaux blastomères. On peut en effet penser

qu’il existe deux sources possibles pour le DNA nucléaire synthétisé au cours du développement.

- un pool de précurseurs acido-solubles, existant déjà dans l'oocyte et accru par une synthèse éventuelle de ces précurseurs au cours des 12 premières heures du dévelop­

pement. Ces précurseurs fourniraient 40% du DNA nouvelle­

ment synthétisé (GRANT 1956).

- Le DNA trouvé en excès dans l’oocyte et qui serait épuisé après 20 heures de développement. Les 60% restant provien­

draient de ce DNA vitellin mis en réserve.

d) Conclusion et ob.jet du travail

Comme lo montrent les différents travaux cités, 1'oocyte d'amphibien accumule dans son cytoplasme une quantité importante de DNA.

Solon BALTUS et al. (1968], au moins 50% de ce DNA se trouve dans les pla­

quettes vitellines. Malheureusement, les oocytes ovariens que ces auteurs ont utilisés pour analyser le DNA du vitellin étalent certainement con­

taminés par les cellules folliculeurses qui entourent l’oocyte dans l'ovaire. Les observations décrites par BALTUS et al. sont donc sujet­

tes à caution et doivent, de ce fait être reconsidérées. A cette fin, nous avons entrepris la recherche d'un système oocytaire non contaminé, ce qui signifie l’obtention d'oocytes de Xenopus laevls débarrassés à 100% de leurs cellules folliculeuses.

Une fois ce système oocytaire trouvé, il s'agira de mettre au point une méthode d’extraction convenable du DNA vitellin.

La caractérisation du DNA vitellin constituera le dernier point de notre travail.

Cette étude a été réalisée en collaboration avec Elyane BALTUS, Jacqueline HANOCQ-QUERTIER, Françoise HANOCQ et Gilberte

STEINERT.

28.

A) Etude du DNA vitellln

II. MATERIEL

photos 2 et 3 : Xenopus laevls : vue ventrale après ouverture des muscles abdominaux.

I

L

3D

photo 4 Coloration au Feulf'en d'oocytes ovariens de Xenopus laevis.

I

t

photo 6 : Coloration au Feulgen d'oocytes de Xenopis laevis, ayant ovulé in vitro.

32

photo 7 : Coloration au Feulgen d’oocytes de Xenopus laevls. ayant ovulé in vitro.

Fig. 3 : Reprosentation schématique comparée de la constitution d'un ovaire, d'un oocyte ovarien, d’un oocyte débarrassé manuelle­

ment de ses cellules folliculeuses (S.D.S.), d’un oocyte ayant ovulé in vitro et d'un oeuf vierge de Xenopus laevis

M — • ■■■" ■ I II 1

FIG :

3 Xenopus laevis

34.-

°J- ^ovaire

oocyfe ovarien

^1_cjra__ ^

by oocyte ovarien

RA. vésicule germinative

ovarien traite

cellules folliculeuses P.V.

RV. dr î1.4mm

dypocyte ayant ovule in vi

^er I

Vitro

1 globule polaire

eypeuf vierge

RA.

1=îi;==

vjl:::::: iiiilliiiiiiiii^::::::::::::::iiiiiiiiii iiiii.

f useau de~

maturaf io n

/

V ^(langue

RV,

RV .

a} Présentation du matériel biologique utilisé

Deux espèces différentes d’amphibicns ont été utilisées au cours de cette étude :

1. Xénopus laevis est un crapaud originaire d’Afrique du Sud dont l’élevage et la reproduction sont assez aisément obtenus en laboratoire. La photo 1 et les photos 2 et 3 montrent une femelle de Xenopus laevis photographiée respec­

tivement en vue dorsale et en vue ventrale, après l’ouver­

ture des muscles abdominaux.

Des oeufs de cette espèce ont été utilisés A différentes étapes de la maturation :

- des ovaires entiers visibles sur les photos 2 et 3. On remarque que les oocytes ovariens sont disposés dans

des poches ovariennes et entourées par une paroi ovarienne assez souple, (fig. 3a).

- des oocytes ovariens. Les oocytes prélevés des ovaires sont entourés de nombreuses cellules folliculeuses (en­

viron 5.000) dont le rôle est de nourrir l’oocyte en cours de croissance (fig. 3b et photo 4). Après un

traitement au SOS, on peut débarrasser ces oocytes ovariens des cellules folliculeuses qui l’entourent A l’aide de fines pincettes (fig. 3c).

- Des oocytes ayant ovulé in vitro. Les oocytes ovariens peuvent être déposés dans du Rlnger contenant de la pro­

gestérone et un extrait hynophysiaire. Au contact de ces hormones, l’oocyte ovarien subit sa maturation et son ovulation in vitro; elles; semblent être oarfalternent identiques au processus existant in vivo. Ces oocytes, que nous appellerons oocytes ayant ovulé In vitro, ne sont plus entourés de cellules folliculeuses et se trouvent en mé- taphase de la seconde division de maturation (fig. 3d).

36.

- Oeufs vierges ou osufs fécondés. Ce sont les oeufs re­

cueillis après la ponte de la femelle. Les oeufs vierp.es (fig. 3e) et fécondés sont entourés d’une gangue dont il faut se débarrasser par un traitement chimique

(cystéine-papaïne ou mercapto-éthanol) ou à l’aide de fi­

nes pincettes.

2. Ambystoma mexicanum (photo 5) est un urodèle d'origine mexicaine dont nous n’avons Jamais utilisé que les oeufs vierges. La gangue a été éliminée a l’aide de fines pincettes.

b] Abréviations utilisées

AMBA = Méthode fluorométrique de dosage de DNA mise au point par ROBERTS et FRIEDKIN [1953).

A.M.S.

A. T.P.

B. E.

cpm

CMC-oellulose CsCl

DABA

□EAE-cellulose

Aminosalicylate de sodium Adénosine tri-phosphate Bromure d’éthidium coups par minute

carboxyméthyl-cellulose Chlorure de caesium

Méthode fluorométrique de dosage de DMA mise au point par KISSANE et ROBINS (1958).

di-éthyl-amino-éthyl-cellulose DNAose = désoxyribonucléase

E.D.T.A.

HOLFRETER

MAK PDPÜP PPO PVP

= acide éthylène-diamine-tétra-acôtique

= milieu utilisé pour les oeufs pondus de batraciens et dont la composition est la suivante :

0,35 gr CaCl^

5 mgr KCl pour 100 ml H^O 10 mgr CaCl^

= colonne d’albumine méthylée

= (1.4 bis 2-5 nhényloxaz lyl) benzène

= 2-5 Diphényloxazol

= Polivinylpyrrolidone

Ringer = milieu utilisé pour les oocytes de batraciens et dont la composition est la suivante :

0.66 gr MaCl 0.015 gr KCl 0.015 gr CaCl^

pour 100 ml H^O

38.

RNAase SBI SOS Sevag

SSC

TCA

TEAE-cellulose tpmn

Tris

ribonucléase

Inhibiteur de la trypsine provenant des graines de soja sodium dodécylsulfate

mélange déprotéinisant = chloroforme - alcool isoamy- lique (24/1)

milieu salin dont la composition est la suivante :

□ .15(1 NaCl

Ü.ni5d citrate de Na acide trichloracétique

tri-éthyl-amino-éthyl cellulose tours par minute

tri-hydroxyméthyl-aminométhane

e] Matériel particulier

- Le bromure d’éthidium nous a été généreusement offert par le Dr. G. WGOLFE (BQOTS PURE DRUG C° Ltd. Nottingham) - Le professeur GRUBER (Universiteit van Groningen -

Nederlanden) a eu la gentillesse de nous donner de la phosvitine de poulet purifiée dans son laboratoire.

- La souche de culture de cellules de reins de Xenopus laevis vient du laboratoire du Professeur BIRNSTIEL CEdimburg).

- La caséine utilisée est un produit DIEGO (bacto- isoélectrique].

14 14

- Formiate - C = formic acid - G Na Soit Amersham 59 mGi/mH poudre 0.25 mGi/SOD 1 Ringer Thymidine - H,3

Thymidine - i\l 43 Amersham

5 Gi/mfi ou 26 Gi/mN 1 .0 mCl/ml

Uridine - H3

Uridine - T - C6) Amersham 1.0 Gi/mri 1 mGi/ml , . ,J4

serine - G i\l F N

0.08B1 mg/0.1 mGi L

A) Etude du DMA vitellin

III. n E T H 0 D E S

) Préparation des oocytes et des oeufs en vue des extractions

Lss prsmiers isolements de DNA vitellin ont été réalisés à partir d’oocytes de Xenopus laevis traités pendant 15 minutes au S.D.S.

(sodium dodécylsulfate) 0.3% et débarrassés ensuite de leurs cellu­

les folliculeuses a l’aide de pinces fines.

La plupart des isolements de DNA vitellin ont été ensuite effectués cà partir d’oocytes ayant ovulé in vitro, ce qui élimine en principe les cellules folliculeuses attachées à l'oocyte ovarien. Pour ce faire, des fragments d’ovaires ont été prélevés à partir de femelles adultes de Xenopus laevis et les membranes des poches ovariennes ont été ouvertes. Les ovaires ont alors été placés dans une solution de Ringer, contenant, par litre, 10 mg de progestérone et un homo- génat de 4 hypophyses de xénopes. Ces 2 traitements hormonaux in­

duisent la maturation et l’ovulation. Après 5 heures, les ovaires ont été transférés dans une solution de Ringer stérile et laissés durant une nuit à 20°C, en chambre stérile et dans de grandes boites de Pétri ouvertes. Les oocytes tombés des ovaires et qui présentent une tacho de maturation ont été rassemblés et lavés 5 fois dans une solution fraiche de Ringer. Des contrôles microscopiques, après co­

loration au Feulgen, ont montré que les oocytes ovules recueillis sont î èrns

en métaphase, vraisemblablement de la 2 division de maturation qu’ils sont totalement débarrassés des cellules folliculeuses qui les en­

touraient dans l’ovaire (ohotos 6 et 7).

Une solution de cystéine (3%) - papaïne (0.2%) à pH = 7.0 ou de mercapho-éthanol 0.25N a été utilisée pour le dégangage chimique des oeufs vierges de Xenopus laevis. En ce qui concerne les oeufs

d’axolotl (Ambystoma mexicanum), la gangue a été éliminée manuellement à l’aide de pinces fines. Les 2 types d’oeufs ont toujours été main­

tenus dans du milieu de Holfreter dilué 10 fois.

42.-

b) Méthode d'extraction du DNA 1) DNA nucléaire

Le DNA nucléaire de Xenorus laevis.a, en général, été isolé à partir d’érythrocytes. Dans ce but, du san>7 a été recueilli dans du 2XSSC; les érythrocytes ont été recueillis par centrifugation à 5.000 tpmn pendant 5 minutes, puis lavés dans le même milieu. Les hématies ont alors été suspendues dans un tampon Tris O.D5M, E.D.T.A.

O.OIM [pH = 8) auquel on a ajouté du S.D.S. en concentration finale) et du perchlorate de sodium (IM en concentration finale).

Des extractions successives avec un même volume du mé­

lange de SEVAG (chloroforme -alcool isoamylique 24/1) ont été réalisées jusqu’A ce qu’il n’apparaisse plus d’interphase. Après la centrifugation à 10.000 tpmn, pendant 10 minutes, le dernier surnageant a été précipité par 2 volumes d’éthanol froid. Le précipité a été enroulé sur une

baguette et dissous dans du 0.1 X SSC.

Le précipité a été purifié ultérieurement par 2 centrifu­

gations successives de 48 h chacune à 40.000 tpmn en gradient de chlorure de caesium d’une densité moyenne de 1.7 et dans un rotor Spinco SW5Q.

2) DNA vitellin

Dans certaines expériences, les plaquettes vitellines ont été isolées selon la méthode de OAWID (1965). Les morceaux d’ovaires, les oocytes ou les oeufs ayant ovulé in vitro ont alors ôté broyés dans un tampon Tris 0.G3M

(pH = 7.4), E.D.T.A.0.1M. sucrose 0.25M. L’homogénat a été filtré sur gaze puis centrifugé ^ 2.500 tpmn pendant 15 minutes. Le culot a été remis en suspension dans le même tampon avant de subir une nouvelle centri­

fugation .

Les purifications du DNA vitellin. avant de le caractériser ont été réalisées à partir de plaquettes vitellines iso­

lées selon la méthode de WALLACE et KARASAKI (1963). Cette méthode d’isolement a l’avantage de fournir des plaquettes vitellines très propres, dont on peut exclure toute conta­

mination par les autres fractions subcellulaires; malheu­

reusement, le rendement de cette méthode est nettement plus faible que celui de la technique de DAWID (1965).

L’isolement des plaquettes vitellines selon WALLACE (1963) a été effectué selon le processus suivant. Les oocytes ayant ovulé in vitro ont été homogénéises à pH 7 dans un milieu 0.25W en saccharose et 5% en polyvinylpyrrolidone

(P.V.P.); 10 ml de ce milieu ont été utilisés pour un millier d’oocytes. L’homogénat a été déposé sur un même volume de saccharose N - p.V.P. 5% (pH = 7) et centrifu­

gé pendant 20 minutes A 2.000 tomn. Le culot a été remis en suspension dans un milieu 0.25(1 saccharose, 5% P.V.P,

(pH = 7) et recentrifugs de la même manière.

ii) isolement_du_DNA_des_çlaguettes_yitellines

La méthode de KIRBY et COOK (1967) a été utilisée pour les premières extractions du DNA vitellin à partir

d’oocytes traités au S.D.S ou d’oeufs vierges de Xenopus laevis.

Au cours des expériences, nous avons été amenée a uti­

liser différentes méthodes et a mettre au point une nouvelle méthode propre à l’extraction du DNA vitellin

(modification de la méthode de KIRBY et COOK 1967).

Cette méthode qui sera décrite ci-dessous, a été aopli- quée surtout aux oocytes ayant ovulé in vitro.

44.-

Le culot de plaquettes vitellines a été mis en suspension dans le tamponà la glycine précisé ci-dessous (IGml

de tampon pour les plaquettes vitellines de 1.000 occytes ovulés).

glycine 0.114

E.D.T.A. 0.1(4 pH = 10.6 4 - aminosalicylate de sodium 6%.

NaCl 1%

Triton x 100 1%

Ce tampon alcalin dissout rapidement les plaquettes vitel­

lines sans dénaturer le DI4A. Après dissolution, un

volume égal du mélange suivant est ajouté aux olaquettes :

phénol 85%

crésol distillé 11%

hydroxyquinoléine 0.07

Après une agitation douce de 30 minutes à température ordinaire, le mélange a été centrifuté durant 10 minutes à 10.000 tpmn. Le surnageant a ôté précipité par

l’addition de 2 volumes d'éthanol glacé. Le précipité

a été laissé pendant une nuit à 4°C, puis récolté et dissous dans 1 X SSC. La solution a été centrifugée à 16°C pen­

dant 48 heures à 40.000 tpmn dans un rotor Spinco SW50, après l’addition de chlorure de caesium jusqu’à l’obten­

tion d’une densité moyenne de 1.55 et de bromure d’ethidium (BE) (150 gr/ml). La bande de DNA fluorescent a été recueil­

lie sous une lampe Allen A 405; ce DNA a été ensuite recen­

trifugé de la même manière dans un nouveau gradient de CsCL - BE. Le bromure d’éthidium a été éliminé par 3 extractions successives avec de l'alcool isoamylioue (C07- 7ARELLI et al. 1968]. La solution de DNA a alors été dia­

lysée pendant 5 heures contre du 0.1 x SSC ou du 1 x SSC.

31 DNA mitochondrial

i) I§9l§ni§nt_des_mitgchondries

Lgs mitochondries ont été isolées selon la méthode décrite par DAWID (1965]. Le surnageant des plaquettes vitel­

lines a été recentrifugé pendant 20 minutes à 10.000 tpmn.

Le culot de mitochondries obtenu a été remis en suspen­

sion dans un tampon 0.25(1 en saccharose. 0.03(1 en Tris et 0.1(1 en E.D.T.A. (pH = 7.4]. La suspension a été recentrifugée de la même manière.

ii] Isolement_du_DNA_mitochondrial

Les mitochondries obtenues ont été lysées dans le tampon à la glycine. Le DNA mitochondrial a ensuite été extrait selon la méthode décrite ci-dessus pour le DNA vitellin.

afin de pouvoir comparer le ONA mitochondrial et le.

DNA vitellin de manière plus rigoureuse.

46

c3 Dosage du DNA

Le dosage du DNA a ôté effectué selon une modification de la méthode de KECK (1956). Pour estimer la teneur en DNA de l'oocyte entier. 75 oocytes ayant ovulé in vitro ont été homogénéisés dans 2ml de saccharose 0.25N. Tris D.03N (pH = 7.4), E.D.T.A. n.lN. 2ml de TCA à 10% froid ont été ajoutés à l’homogénat. Après 15 minutes à 4°C, le précipité a été centrifugé et lavé au TCA à 5% à froid. Les lipides ont été éliminés par des lavages successifs de 10 minutes avec de l'al­

cool 94°C à froid, de l'alcool 94°C à 50°C, du butanol normal a 50°C, de 1'alcool-éther (3/1) à 50% et finalement avec de l'éther à tempéra­

ture ordinaire.

Le culot ainsi obtenu a été extrait durant 20 minutes a 100®C avec BÜOyUl de TCA à 5% avant d'être centrifugé. La teneur en DNA des culots a été estimé selon la méthode de KECK (1956) : 250^1 du réactif à l'indole (0.03% d’indole dissous dans HCl 1.25N) a été ajouté aux 250/41 de surnageant. Le mélange a été chauffé durant 10 minutes à 10°C. puis extrait 3 fois par un volume d'acétate d'amyle. Les lec­

tures ont été réalisées à 490 nm au spectrophotomètre de Deckman.

La courbe étalon a été obtenue en incubant d'une manière analogue 250/x,l d'une solution de DMA standard (0 à 20/4g/ml) avec 250^1 de réactif à l'indole.

La teneur en DNA des culots de plaquettes vitellines a été estimé selon un processus semblable, en partant de culots de plaquettes vitellines correspondant à 150 oocytes.

Pour certaines expériences de dosage, des traitements enzymatiques des différentes fractions d'oeufs de Xenopus laevis ont dû être faits. Dans ce cas. la fraction en question (homogénat total, pla­

quettes vitellines ou surnageant postvitellin) a été traitée durant

1 heure 30 minutes à 37°C soit à la ONAase (100/^gr/ml) soit à la trypsine (250/4gr/ml), soit après la trypsine (250/zgr/ml), au S.B.I. (inhibiteur

de la trypsine 250yUgr/ml) puis à la DNAase (150^gr/ml).

Les fractions d'oocytes témoins, ainsi que les fractions qui devaient être traitées à la trypsine ont été mises en suspension dans du tampon Tris 10 M -3 pH = 7.4

E.D.T.A. 10“^n Sacch. 2.5

Quant aux fractions d’oocytes devant subir un traitement a la DNAase, elles ont été mises en suspension dans le tamoon Tris

NgCl^ 10”^N, saccharose 2.5 10"^M pH = 7.4.

Après ces traitements enzymatiques, les fractions d’oocytes ont été remises dans le tampon normal et le dosage a été réalisé comme on l’a décrit ci-dessus.

Des tests de spécificité de la méthode seront présentés dans la partie expérimentale.

48.

DNA vitellln

1) Extraction de la chromatine d'érythrocytes

La chromatine d’f5rythrocytes de batraciens a été isolée selon la méthode de PAUL et GILNQUR (1968) par un choc osmotique en eau distillée.

2) Culture de cellules de reins de Xenopus laevis

Des cellules de reins de xénopes ont ôté cultivées in vitro durant 3 jours dans le milieu HANSE 12 en l'absence ou en la présen ce de thymidine tritiée C15^c/ml de milieu; 26 c/mM). Ensuite, une chasse de 1 jour a été effectuée dans les cultures radioactives au moyen de thymidine froide (4.6yugr/ml de milieu).

Quand il y avait lieu de broyer les cellules, elles ont été homogénéisées à l’aide d'alumine dans une solution de Ringer. La chromatine a été séparée des débris membranaires par une centrifuga­

tion à faible vitesse.

Les comptages ont été réalisés dans le liquide de scintillation suivant :

1/3 volume de Triton x 100 2.3 volume POPOP o.5 gr

PPO 5 gr Toluène IL

Le compteur à scintillation était un Packard modèle 3375 avec un ren­

dement d'environ 50% pour le tritium.

3) Coloration à 1'actinomycine tritiée de préparations cytologiques d’oocytes de batraciens

d] néthodes utilisées dans les expériences de contrôle de la pureté du

Des oocytes ovariens et des oocytes ayant ovulé in vitro

ont été fixés par la méthode de "freeze-substitution". Des coupes de 10 ont été plongées, pendant 60 minutes, dans une solution d'actinomy- cine H (20^c/ml,- 8.4 c/mH), lavées pendant 60 minutes dans une solu­3 tion d'actinomycine froide (3/Agr/ml) et rincées pendant une nuit dans l’eau courante. Avant d’être plongées dans 1’actinomycine radioactive, certaines coupes ont été traitées à la ONAase (0.1 mgr/ml) pendant 90 minutes à 37°C dans un tampon Tris 0.01M (oH = 7.4), flgSO^ ImM.

De l’émulsion Ilford a été déposée sur les prépara­

tions cytologiques et les autoradiogrammes ont été développés après 8 jours d’exposition selon la méthode de ficq (1955).

50.-

e) Caractérisation du DNA vitellin

1 ) Centrifugation préparative en p.radisnt de chlorure de caesium Les DNA extraits des plaquettes vitellines par la méthode de KIRBY et COOK modifiée ont été purifiés sur des gradients de CsCl dont la densité moyenne était de 1.700. La densité moyenne de ces gra­

dients a été abaissée à 1.550 lorsqu'ils contenaient du bromure d'éthi- dium ( 150^,gr/ml ) .

Les échantillons ont alors été placés dans un rotor Spin- co SW50 et centrifugés à 15°C pendant 4fl heures à 40.000 tpmn. L’em­

ploi du bromure d'éhidium dans les gradients de CsCl présente deux avan­

tages ; tout d'abord, un simple éclairage par uns lampe Allen A405 permet la visualisation et le prélèvement de la bande de DNA. Ensuite, cette technique de centrifugation sépare le DMA circulaire fermé

(DNA mitochondrial] du DNA linéaire (DNA vitellin, nucléaire ou mito­

chondrial ouvert). Le DNA circulaire fermé fixant moins de molécules de B.E. que le DNA linéaire est, de ce fait, moins allégé et présente donc en gradient de CsCl une densité de flottaison plus élevée que le DNA linéaire.

2] Centrifugation analytique en gradient de chlorure de caesium Les solutions contenant le DNA à analyser ont été dialy­

sées contre du 0.1 x SSC. Du CsCl Suprapur a ensuite été ajouté jus­

qu’à l’obtention d’une solution de densité moyenne de 1.700. Du DNA de Nicrococcus lysodeikticus (d = 1.731) a été utilisé comme référence.

La centrifugation a été réalisée à 44.770 tpmn pendant 20 heures à 20°C dans une ultracentrifugeuse analytique Spinco modèle E. Des Photographies ont été prises à 265rmet enregistrées grâce à un microdensitomètre Joyce- Loeb. La densité de flottaison du DNA a été calculée selon la méthode de SCHILDKRAUT et al. (1962).

31 Dénaturation et renaturation

De 1 à 3^gr de DNA ont été dissous dans 750^1 de 0.1 x SSC. Lors de la dénaturation thermique, les solutions ont été chauffées pendant 15 minutes à 100°C et ensuite immédiatement refoidies à -5‘’C.

Lors de la renaturation thermique, les solutions de DNA dénaturé ont été amenées, après le chauffage, à une concentration saline de 4 x SSC et incubées une nuit à 60°C.

Du DNA de phage a été traité de la même manière et utilisé comme contrôle de la validité des méthodes.

Les préparations obtenues après dénaturation et renaturation ont alors été étudiées par centrifugation analytique ainsi qu'il l'a

été décrit précédemment.

4) Microscopie électronique

L'étalement du DNA a été réalisé selon une modification de la méthode de KLEINSCHMIDT et ZAHN (1959). On a ajouté 25^1 de formol à 40% (pH = 7) à 75^1 de la solution de DNA à étaler (l^gr/mlî.

Au mélange précédent, on a ajouté 100^1 d'acétate d'ammonium 2M et en­

fin 200^1 de cytochrome C (0.02% dans de l’acétate d’ammonium molaire) au moment de l'étalement. L'hypophase utilisée était de l’acétate d’ammonium O.IM contenant 0.5% de formaldéhyde.

Après étalement et ombrage des grilles à l'oxyde d’ura­

nium, le DNA a été examiné au microscope électronique AEI modèle EM6B.

5) Etude des coefficients de sédimentation

Les estimations du coefficient de sédimentation du DNA ont été réalisées dans le laboratoire du professeur G. BERNARDI, auquel nous sommes très reconnaissante»

Les mesures ont été faites dans une ultracentrifugeuse de

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BecKman modèle E. On a appliqué la méthode de centrifugation de VINOGRAD et al. (1963]. A cette fin, un échantillon de DNA (25/à1 de Tris 0.01(1 (pH = 7.4) contenant O.S^gr de DiMA] a été déposé par cen­

trifugation sur un coussin de NaCl 11, Tris O.OIM (pH = 7.6). Des

cellules de VINOGRAD avec un système central K.E.L.F. ont été utilisées.

La plus grande partie des mesures a été faite à 30.000 tpmn.après une accélération initiale de 7.000 tomn. permettant le dépôt de la solution de DNA sur le coussin de NaCl 11.

Les estimations des densités optiques aux différents points de la cellule ont été enregistrées toutes les 4 minutes automatiquement.

Après une correction tenant compte de la vitesse de la centrifugation, de la température et de la viscosité de la solution, les coefficients de sédimentation ont été calculés à l’aide d'une calcula­

trice électronique.

L'étude des densités optiaues et des spectres des frac­

tions obtenues par chromatrographie a été réalisée au CARY modèle 15.

1) Chromatrographie sur colonne d’albumine méthylée (HAK).

Le DNA à étudier, mis en solution dans du tampon au phosphate O.DSN (pH = 6.7), 0.1(1 en NaCl, a été déposé sur une colonne de NAK CNANDELL et HERSHEY 1960} et élué à 20°C par un gradient linéaire d'une solution de NaCl dans le tampon phosphate 0.05N (pH = 6.7).

En général, des fractions de 2 ml ont été recueilliss.

2) Dissociation et réassociation DNA-protéines

Lorsqu’un matériel nucléo-protéique devait être dissocié en acides nucléiques et protéines, il a été dissous dans du tampon Tris O.IN (pH = 8). NaCl 311. Une centrifugation sur coussin de saccharose molaire durant 17 heures à 40.000 tpmn a permis ensuite de séparer le DNA des protéines qui l’accompagnaient.

Les réassociation Of'JA-protéines ont été réalisées selon la méthode d’OHLENBUSCH et al. (1967), qui ont préconisé le cycle suivant de dialyses en présence d’urée :

- dialyse d’1 x 12 heures contre NaCl 2N Tris 0.1(1 urée 511 pH = B

" 1x4 heures ” ” 0.8i1

’’ 1x4 heures ” " 0.611 ”

" 1x4 heures ” ” 0.4(1 ...

" 1x4 heures ” ” n,2N ...

- 3 dernières dialyses successives contre le tampon désiré (SSC ou 0.1 x SSC) : CBS dialyses étaient destinées à éliminer l’urée.

f] néthodes utilisées dans l'étude des liaisons DNA-protéines

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3) Chromatrographie sur colonne de DEAE et de Cnc-cellulose La DEAE cellulose {diéthylamlnoéthylcellulose) a été conditionnée dans un tampon - Tris O.OIM pH = 8

- méthylamine 34.5%

- urée 6M

- mercapto-éhanol 2.1%

L’élution du matériel protéique a été effectuée suivant un gradient linéaire de NaCl mis en solution dans le tampon décrit ci-dessus.

La chromatrographie sur colonne de cnc-cellulose (carboxyméthylcellulose) a été réalisée dans un tamoon

- méthylamine 34.5% pH = 5.6 - urée 6!4

- mercapto-éthanol 2,1%

Pour l’élution. le NaCl a été remplacé par de l’acétate de sodium.

4) Electrophorèse sur gel de polyacrylamide

Les protéines étudiées se trouvaient dans un tampon

- Tris O.Oiri pH = 0

- méthylamine 34.5%

- urée 6M

- mercapto-éthanol 2.1%

Dans certains cas, un des échantillons a été soumis à un traitement réducteur plus sévère de 2 heures à 37°C au mercapto-éthanol 6.10‘^n.

Des gels cylindriques de polyacrylamide 7.5% à pH = fl.7 et à pH = 4 ont été préparés pour l’étude des composés protéiques.