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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:
Dirckx, J. (1950). Contribution à l'étude du type sauvage de Neurospora crassa (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.
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THÈ5E DE DOCTORAT
Contribulù. ilitusk iaTyp. Jâm/âÿe
de Neaj ^ospora. cra.ssi
psLr J. DirHx
Unit/ersité LLbi'e. de ôruXeUe.S
FACULTÉ oes SCIENCES
INTRODUCTION.
I®) LE GENRE NEUROSPORA.
2®) LE CYCLE VITAL DE NEUROSPORA CRASSA.
y) LES PUTATIONS BIOCHBlIQUES CHEZ lŒUROSPORA.
Création du genre
Le genre Neurospora fut créé par Dodge (15) en 192? qui groupa sous ce nom plusieurs raoississures classées précédemment dans le genre Monilia. En même temps qu’il créa le genre,
Dodge le subdivisa en quatre espèces dont les trois principales sont : N. crassa, N. sitophila et N. tétrasperma.
Neurospora crassa est connu coMmunément sous le nom de
moisissure rouge du pain. Cette espèce apparaît^ en effet^pério- diquement dans les grandes boulangeries^surtout dans les boulan geries militaires où la propreté laisse souvent à un peu à
désirer.
Au point de vue systématique, le genre Neurospora appartient au groupe des Pyrénomycètes, ascomycètes qui doivent leur nom au fait que leurs périthèces présentent une forme caractéris tique de bouteille.
L’Hétérothallisme.
même culture. Autrement dit, un thalle d’un type donné peut être cultivé indéfiniment sans qu’apparaissent les phénomènes de reproduction sexuelle; ceux-ci, en ce qui concerne Neurospora, se traduisent par l’apparition dans la culture de périthèces . petites boules noires d’un millimètre de diamètre environ et qui contiennent un grand nombre d’asques.
Au contraire, quand les deux types de mycéliums se rencontrent, c’est-à-dire quand ils sont cultivés ensemble, le phénomène sexuel se manifeste par l’apparition des périthèces après une dizaine de jours de culture. Il existe donc deux types se^cuels ou types conjugants de mycéliums.
-4-LE CYC-4-LE VITAL DE NEUROSPORA
C R A S S A .
A, La morphologie du thalle.
A l’exaiiaen direct comme à l’examen microscopique, la culture de Neurospora crassa montre que le thalle est constitué de
filaments comme tous les ascomycètes, les levures mises à part. Les filaments mycéliens forment un réseau très dense et touffu. A la fin d’un grand nombre de filaments^ on remarque la formation de spores. Ces spores sont formées par la f^ragmentation de l’extré mité du filament; la résultante de ce phénomène est que les spores se trouvent donc disposées en file à 1 ’ extrémiiaté des filaments. Il n’existe pas chez Neurospora, comme chez d’autres espèces
d’ascomycètes, d’organes différenciés tels que l’aspergille ou la pénicillé dont le rôle est de porter les spores. On donne au
filament fragmenté en spores le nom de conidie et à la spore ainsi formée le nom de conidiospore.
»
Signalons encore que l’espèce est pigmentée* Elle contient, en effet^ diverses substances carotinoïdes particulièrement
abondantes dans les spores et qui communiquent à la culture une couleur rouge orangé.
B* La reproduction par voie asexuée.
Comme la plupart des organismes végétaux peu élevés en
organisation, Neurospora crassa possède deux modes de reproduction: a) La reproduction asexuée et
b) La reproduction sexuée.
La reproduction asexuée est assurée par les conidiospores dont il a été question plus haut.
S’il advient qu’une de ces conidiospores se détache du
filament qui la porte et si, d’autre part, cette spore rencontre un milieu favorable à la croissance de la moisissure, elle va,
en germant, donner naissance à un mycélium qui aura toutes les caractéristiques du mycélium dont elle est issue et par conséquent le même sexe + ou - .
Gomme les conidies sont facilement dissociables en conidio spores et que ces conidiospores sont extrêmement nombreuses, la reproduction asexuée représente plutôt la forme de dissémination et d’envahissement de l’espèce.
Signalons enfin, que, ainsi que nos expériences l’ont montré, les conidiospores sont sensibles à la chaleur et détruites par une température de l’ordre de 55 a 60°G.
G. La reproduction se:?aiée.
-6-On trouve dans le nycélium d’un sete des formations particulières qui sont ; les sperinaties d’une part et les oogonies d’autre part. Les spermaties sont constituées de petites cellules ou microspores. Les oogonies contiennent les oogones, grosses cellules ayant la morphologie d’moeuf. La fécondation consiste en la pénétration dans un oogone d’une microspore de spermatie. Toutefois, il n’y a jam*ais d’autofécondation c’est-à-dire que les spermaties d’un sexe ne sont pas capables de féconder les oogones de ce sexe
mais seulement les oogones de l’autre sexe. Les oogones du thalle + ne peuvent être fiécondés que |iar les microspores du thalle - .
Les oogones du thalle - ne peuvent être fécondés que par les spermaties du thalle + ÿ
Lorsque la fusion de deux cellules^oogone^ et microspore^a eu lieu, il se forme alors une cellule à deux noyaux ou dicaryon. Ce dicaryon donne naissance au zygote par fusion des deux noyaux. Chaque zygote donne naissance en se divisant à Ô spores.
Parmi les trois divisions qui ont lieu pour donner naissance aux spores à partir du zygote, une d’entre elles est une méiose. Au cours de cette méiose s’opère la ségrégation des sexes et parmi les spores formées, 4 donneront naissance à un mycélium +, les 4 autres donneront naissance à des mycéliums - .
L’ensemble des è spores formées par la division du zygote est contenu dans une gaine cellulosique et forme l’asque. Ces asques, au moment de leur formation^ sont contenus en grand nombre dans des organes spéciaux appelés périthèces. Dans le grand
Les périthôces de Neurospora sont de petites boules noires et dures de I à 2 millimètres de diamètre environ. Leur présence dans une culture permet de conclure à la présence simultanée des mycéliums + et - . Les périthèces ne se forment^en effet^qu’après fécondation et peuvent servir d'indice à ce phénomène. C'est également par leur présence que peut se déterminer le sexe d'un mycélium cultivé en présence d'un autre mycélium de sexe connu. Comme on le iioit^ dans ce cycle vital de Neurospora, la phase diploïde est extrêmement brève. Elle se réduit en pratique au zygote et au dicaryon résultant directement de la fédondation. La phase haploïde^par contre,représente l'état normal du cham pignon. Les thalles + et - sont donc^en fait,des haplontes et cette particularité est en partie la cause pour laquelle Neuro spora crassa et Neurospora sitophila ont été employés en génétique, le problème des caractères dominants et des caractères récessifs ne se posant,de ce fait, pas.
Il est encore à remarquer que les spores formées par le processus de reproduction sexuée sont assez différentes des
spores formées par voie asexuée. Ces dernière, on s'en souvient, sont assez sensibles à la chaleur et tuées par des températures de l'ordre de 55-60°.
-g-Les ascospores extraites de l'asque et déposées aseptiquenent dans un milieu neuf n'y germent jamais si elles n'ont pas au
préalable été chauffées. Cette activation est d'ailleurs
réversible et les spores activées peuvent être remises à l'état de latence par traitement au moyen d'une solution diluée de cyanure de potassium. (+)
Signalons enfin que les ascospores sont plus grandes que les conidiospores; qu'elles sont de forme elliptique, les conidiospores^au contraire^ étant sensiblement sphériques. Ënfin, les ascospores sont entourées d'une membrane épaisse et dure de couleur noire.
LES MUTATIONS BIOCHI Mil QUES CHEZ ==================== NEUROSPORA. ==================
Le gros intérêt de Neurospora résulte de son emploi en génétique et de la somme importante de travaux faite sur cette moisissure au cours de des dernières années. Un des facteurs
qui ont permis l’emploi de Neurospora en génétique est notamment la facilité avec laquelle on peut obtenir des mutations chez cette espèce.
Ces mutants peuvent être obtenus de diverses manières,
La première méthode consiste à traiter l’organisme par le gaz moutarde (di-bêta-chloroéthvlméthvlamine)_comme l’ont fait Au^.erbach et Robson sur la drosophile. Cette méthode a été employée avec succès sur Neurospora par Horov/itz, Houlahan, Hungate et Wright ( 66) et également par Beadle et Tatum (1), La technique consiste à traiter des conidies par une solution tamponnée de gaz moutarde et à mettre ensuite ces conidies
lavées en présence de l’autre sexe. Il s’ensuit la formation d’asques dont les spores isolées donnent naissance en germant à un pourcentage assez élevé de mutants. Mac Elroy, Cushing et Miller ont trouvé que les jeunes conidies traîtées par ce procédé donnaient un pourcentage plus élevé de mutants que les conidies âgées et ont pu obtenir de cette manière jusqu’à Ô $ de mutants (45)»
-10-Les spores ainsi traitées sont ensemencées sur le même milieu que des spores non traitées de l'autre sexe. Les ascospores résultant de la copulation de ces deux sexes mis en présence donnent naissance à un nombre relativement élevé de mutants. Sur environ Ô5.000 spores isolées selon ce procédé, 500 à 600 souches mutantes ont été isolées.
L’intérêt de ces mutants réside d^ns le fait qu’ils se caractérisent par leur incapacité à croître dans un milieu synthétique simple et qu’il leur manque la possibilité de synthétiser un constituant chimique parfaitement défini.
C’est ainsi qu’ont été isolées des souches de Neurospora exigeant pour croître des vitamines du groupe B, Il a été
trouvé autant de souches mutantes qu’il y a de membres dans le groupe des vitamines B à 1’exception^toutefois,de l’acide folique. On connaît donc^à l’heure actuelle^pour chaque vitamine B, un
mutant de Neurospora incapable de croître en l’absence de cette vitamine.
Ce double mutant peut pousser quand on lui fournit les deux composés sulfamide et acide p-aminobenzoïque dans un rapport moléculaire l/l.
Un autre mutant intéressant a été obtenu par Levjls (39) exigeant pour sa croissance la présence d’acide succinique. Il s’agit ici^d’après 1’auteur^d’un blocage génétique associé au cycle de Krebs.
Un nombre important de mutants de Neurospora^ exigeant
des acides aminés ou des composés participant à la structure des acides nucléiques^ont également été obtenus. Citons notamment un mutant exigeant la lysine (Mitchell et Houlahan) (47), un autre
exigeant le tryptophane (Mitchell et Lein) (4^), un autre encore exigeant l’inositol (Schopfer, Posternak et Boss) (54).
Fierce et Loring (44,50) ont isolé un mutant exigeant des bases pyrimidiques. Enfin, Beadle et Tatum ont isolé de nombreux mutants manifestant une exigence bien marquée pour de nombreux acides aminés (1).
L’étude de ces nombreux mutants a permis de déterminer que la synthèse d’un constituant biologique se fait en plusieurs étapes, chaque étape étant placée sous le contrôle d’un gène. Nous reprendrons^d’ailleurs^plus loin^l’étude de ces mutants.
Retenons toutefois qu’ils ont mis en évidence la relation existant entre les gènes et la synthèse de constituants biologiques
-12-Ges raut^nts présentent également un autre intérêt, plus secondaire il est vrai, en ce sens qu’ils permettent de doser de très petites quantités, grâce à leur croissance, de la substance qu’ils exigent pour croître.
C’est ainsi^notamment^qu’un mutant de Neurospora a été utilisé par Harrison et Miller (25) pour le dosage de petites quantités d’aneurine, un autre par ’Stokes, Larsen, Woodward et Foster (60) pour le dosage de la pyridoxine.
L’étude du type sauvage de Keurospora a été faite principale ment par Dodge, à une époque où 1’intérêt biochimique et génétique de Neurospora n’était pême pas soupçonnée.
C’est dire ç|ue cette étude du type sauvage a été faite sur le plan purement morphologique, en dehors de toute considération
d’ordre chimique.
La principale étude de Dodge sur Neurospora date déjà de 22 ans, au moment où cet auteur créa le genre (15)» Dodge, depuis ce moment, n’a pas cessé de publier des travaux sur Neurospora (15,1$,17, I^) mais ces travaux sont toutefois restés dans le domaine de la
morphologie ou de la cytologie.
Il nous a semblé digne d’intérêt d’entreprendre une étude du type sauvage de Neurospora crassa en nous plaçant^le plus possible^ sur le plan chimique. Cette étdde a }Dorté, d’une part, sur la cytochimie des thalles, d’autre part, surtout sur les
phénomènes de croissance de ces thalles qui présentent, ainsi qu’on le verra, des particularités intéressantes.
L’étude de la croissance de Neurospora nous a conduit^d’autre part^ à des remarques plus générales sur la croissance et sur la
synthèse des protéines en particulier.
-14-I
CHAPITRE I.
ETUDE CYTOLOGIQUE DE MEUROSPCRA.
I. La basophilie cytoplasraique due à l'acide ribonucléique mise en évidence par les colorants basiques et test à la ribonucléase.
II. Mise en évidence des noyaux. Méthode à la ribonucléase ; Réaction de Feulgen ;
Réaction des phosphatases alcalines de Gomori,
III. Etude statistique de la répartition des noyaux dans les spores + et -.
nmimmmmm
ETUDE CYTOLOGIQUE DE NEUROSPOHA.
I, LA BASOPHILIE CYTOPLASi-UQUE.
La méthode devenue classique de mesure de la basophilie cytoplasmique consiste à colorer le matériel cytoplasmique à étudier par le bleu de toluidine.
Ce colorant se fixe, en effet, de façon élective sur les acides nucléiques (Brachet - B). D’autre part, Lison (4^) a montré que^ dans certains tissus^la coloration appelée métachromatique^donnée par le bleu de toluidine^pouvait être attribuée à la présence
d’esters sulfuriques. Wiame, travaillant sur la levure de boulange rie a montré que la métachromasie des levures était due à la
présence^dans leur cytoplasme^de granulations constituées de métaphosphates (64, 65).
Enfiçi, Brachet et Jeener ont mis au point une méthode de mesure quantitative de la basophilie des levures par emploi du bleu de toluidine (3I)«
Dans le cas du mycélium de Neurospora crassa, une méthode quantitative de mesure ne peut être employée pour la bonne raison que les quantités de matériel employé sont infimes et ne peuvent être comptées comme dans le Cas d’individus isolés tels que les levures.
Toutefois, un examen microscopique direct après coloration
-I6-Les travaux de Brachet et Jeener^cités plus haut^ont montré que c'est aux acides nucléiques qu'est due l'affinité de certaines parties de la cexlule pour les coloi'ants baqiques et pour le bleu de toluidine en particulier.
Nous avons donc effectué la coloration des thalles par le bleu de toluidine et le bleu de méthylène, autre colorant basique. Le bleu de toluidine que nous avons employé açt cours de ce travail était de marque Grübler (Leipzig) qui nous a donné les meilleurs résultats ; quant au bleu de méthylène, il était de marque Merck, Darmstadt.
Technique de__coloration au_bleu de_toluidinej^
Sur des lames propres et bien dégraissées, on dépose dn petit fragment de mycélium que l'on étire dans une goutte d'eau distillée au moyen de deux aiguilles emmanchées. Les frottis^ainsi préparés^ sont laissés sécher à l'abri de la poussière puis fixés dans
l'alcool à 94° pendant dix minutes. On les laisse à nouveau sécher puis on les immerge daba yhe solution saturée (2 de bleu de
toluidine pendant 20 minutes. Les frottis colorés sont alors différenciés à l'alcool à 94° pendant une heure. Pendant la différenciation, l'alcool est plusieurs fois renouvelé de façon que les frottis baignent finalement dans un bain pratiquement incolore. Après la différenciation, les frottis sont séchés et mohtés au baume du Canada pour l'examen microscopique.
A l'examen microscopique, les frottis traités de cette façon montrent une basophilie cytoplasmique tellement intense que les noyaux n'apparaissent pas. La basophilie nucléaire est donc
Ghez ces cellules âgées, le cytoplasme apparaît par endroit comme givré. La petitesse du matériel ne permet rLaMieureusement pas de décider si cet aspect est dû à la formation de petites vacuoles ou^ au contraire^s’il s’agit de cellules mortes dont le
cytoplasme s’est coagulé.
Singions encore que les thalles + et - de N. crassa colorés au bleu de toluidine montrent d’assez nombreuses granulations méta-
chroraatiques dans les mycéliums très jeunes au début de leur croissance.
D’une manière générale, les thalles + et - de Neurospora crassa présentent donc au bleu de toluidine une basophilie assez élevée. Cette basophilie étant vraisemblablement due à l’acide ribonucléique, nous avons cherché à nous en assurer en utilisant la méthode de Brachet à la ribonucléase. Ainsi qu’on le sait, ce ferment dont l’optimum de température se situe aux environs de 60® dépolymérise spécifiquement l’acide ribonucléique et permet sa diffusion à travers les membranes cellulaires. De ce fait, la basophilie cytoplasmique se trouve pratiquement annulée.
Nous avons donc fait agir la ribonucléase sur les frottis de mycéliums en opérant de la manière suivante.
Te£hni_que d’em£loi_de la_ribonucléase sur le_s frottis
Quelques cristaux de ribonucléase sont dissous dans 100 cc. d’un tampon au phosphate à pH Ô-Ô,5. On ajoute à la solution un petit cristal de chlorure de magnésium, les ionsMg++ activant la ribonucléase. La solution^ainsi préparée^est versée dans un bac à coloration et mise à l’étuve à 60°. Quand l’équilibre des
températures est atteint, on dépose dans la solution de ribonucléase les frottis mycéliens préparés comme précédemment. On laisse agir pehdant une heure la ribonucléase sur les frottis puis ces derniers sont lavés à l’eau distillée et colorés au bleu de.toluidine comme dans la méthode précédente. La solution de ribonucléase ainsi
-lô-Les frottis mycéliens ainsi traités, colorés par le bleu de toluidine montrent que leur basophilie c^,rtoplasmique a complète ment disparu. Le cj^toplasme, après action du bleu de toluidiney reste parfaitement incolore, montrant ainsi que le substance
causant la basophilie cytoplasmique est bien l'acide ribonucléique.
Çoloration_au bleu_de méthylène.
La coloration des frottis au bleu de méthylène a été réalisée également par la technique suivante :
Les frottis mycéliens fixés à l'alcool à 94® sont immergés dix minutes dans une solution à I de bleu de méthylène. Après ce temps, ils sont lavés à l'eau distillée courante pendant cinq minutes puis observés au microscope.
Les frottis^ainsi traités, montrent au microscope les mêfïies caractéristiques que ceux traités au bleu de toluidine,
c’est-à-dire : intense coloration des cellules jeunes et des filaments en voie de croissance, coloration plus faible des
cellules les plus âgées montrant également la forte vacuolisation de ces dernières.
Les frottis ayant subi l'action de la ribonucléase et traités ensuite par le bleu de méthylène présentent le même aspect que ceux traités par le bleu de toluidine après action de cet enzyme. Ces frottis, à part les noyaux qui restent
fortement colorés, montrent également un cytoplasme complètement incolore.
cytoplasme est moins intensément coloré que celui des cellules jeunes.
Essai de_mise en_éyidence des £hromosomes dans_le thalle__par le_bleu de_méthylène_j_
Lindegren (40> 41) a montré que les chromosomes de la levure pouvaient être mis en évidence par coloration vitale au bleu
de méthylène à 0,01 ‘-Jq, Il signale les chromosomes de la levure
comme de petits corpuscules irréguliers, généralement libres et doués de mouvements brovmiens.
Nous avons employé la méthode de Lindegren de la façon suivante :
Un fragment de mycélium est déposé avec le minimum de liquide sur une lame porte-obj^et. On ajoute sur la lame une goutte d’une solution à 0,01 /à de bleu de méthylène dans l’eau distillée et on recouvre la préparation d’une lamelle couvre- objet. On pratique l’examen direct de cette préparation au microscope.
Cette coloration fait apparaître dans les thalles de petits granules sphériques de diamètre variable et doués de mouvements browniens.
Il nous semble toutefois peu probable que ces granulations puissent être assimilées à des chromosomes pour les raisons suivantes ;
I®) Le nombre de ces granulations varie très fortement d’une cellule à l’autre. Ce fait, en ce qui concerne Neurospora^ ne suffit pas à exclure l’hypothèse de chromosomes, le
-20-cloisons étant variable^, il n’est pas exclu que le nombre de chromosomes compris entre deux cloisons soit variable également. Cependant, la répartition topogra phique de ces granulations ne correspond pas avec celle des noyaux ; c’est ainsi^par exemple,que l’on trouve de telles granulations dans les vacuoles.
2®) La forme des granulations observées est sphérique alors que les chromosomes le sont rarement.
3®) La taille de ces granulations est variable également^alors que les chromosomes présentent une remarquable constance de forme.
Il semble donc très peu probable que les granulations observées soient réellement des chromosomes.
Es_sai de_coloratj.on simultanée_des_deux acides_nucléique_s.
Nous avons cherché à mettre en évidence en même temps les noyaux et la basophilie cytoplasmique en employant la méthode de Brachet qui consiste à colorer le matériel à étudier par le mélange de Unna.
Ce mélange contient les deux colorants suivants : le vert de méthyle et la pyroninie. Brachet (9) a montré que le vert de méthyle se fixe électivement sur l’acide thymonucléique contenu
seulement dans les noyaux et la pyronine colore électivement l’acide ribonucléique, tant celui du nucléole^quant( cet organite est présent, que celui du cytoplasme.
Bous avons donc opéré de la manière suivante ;
Cette méthode n’a pas fait apparaître de noyaux pour la raison suivante : Le cj’-toplasme, très basophile, a retenu une abondante quantité de pyronine et s’est très fortement coloré en rouge au point qu’il masque complètement le vert de méthyle qui aurait pu se fixer sur le noyau. D’autre part, comme nous le verrons plus loin, les noyaux retiennent assez fortement la pyronine également^ atténuant ainsi le contraste entre la colo ration verte et la coloration rouge.
Pour la suite de I^étude cjd:ochimique de Neurspora, et notamment en ce qui concerne la mise en évidence des noyaux, il nous est apparu que les conidiospores réprésentaient un matériel d’étude plus commode que les filaments mycéliens eux- mêmes, trop souvent enchevêtrés et plus difficiles à recueillir que les spores. Nous avons donc poursuivi l’étude cytologique de Neurospora sur les conidiospores.
Nous avons donc réalisé les frottis de la manière suivante : Sur une lame alburrànée, on dépose une petite gouttelette d’eau distillée. Dans cette goutte, on délaye quelques conidio spores prélevés asepti^uement au moyen do fil de platine. Les frottis sont laissés secher à l’air puis fixés.
M_se_en éviden_çe_dans les ^pores_dJ_une_forte_basophilie ^yto_£las- miç|_u e.
Les frottis de spores ont été colorés par la méthode au bleu de toluidine^suivant la technique précédemment décrite. Ces spores, comme les cellules jeunes des filaments mycéliens, ont montré une intense basophilie cytoplasmique. Cette basophilie des spores a d’ailleurs pu être mesurée quantitativement et correspond avec la teneur des spores en a^ide ribonucléique ( voir chapitre IV). Comr;.e dans le cas des filaments mycéliens, cette basophilie
-22-II. iiise en ôvidence des noyaux dans les si-iores.
Gomrae, ainsi que nous l’avons vu, la ribonucléase fait disparaître complètement la basophilie cjd^oplasmique, il nous a semblé logique de traiter les frottis de spores par la ribonu cléase pour mettre en évidence les noyaux. Cette méthode a d’ailleurs été employée avec succès par Boivin (4) pour mettre en évidence les no^^'aux bactériens cachés eux au s s i^ par une intense basophilie cytoplasmique.
Nous avons donc utilisé la ribonucléase pour faire disparaître l’acide ribonucléique cytoplasmique et nous avons coloré les
frottis^ ainsi traités^ par différentes méthodes de coloration.
I®) Combinaison de la ribonu_çléase_aveç le_bleu de_toluidine_. Nous avons employé les techniques pré cédemment décrites d’action de la ribo nucléase sur les frottis de spores. Toutefois, comnie il est signalé plus haut, les frottis de spores sont cdilléa à l’albumine à cause de la tendance
qu’ils ont à se décoller. La colo ration au bleu de toluidine est effec tuée suivant la technique également décrite plus haut. Le résultat de cette coloration est
représenté par la microphoto ci-contre.
Fig. I : Microphoto (1000 X) des conidiospores traités^par la ribonucléase et colorées au bleu de toluidine.
plus un aspect homogène comme lors de la coloration sans action de la ribonucléase. On voit appraître à l’intérieur des spores des granules plus fortement colorés dont le nombre est d'ailleurs variable d'une spore à l'autre. Ces granules sont^soit agglomérés
comme dans la cellule A, soit dispersés comme dans la cellule B, La coloration des spores par le bleu de méthylène^ après action de la ribonucléase^donne des figures semblables à la coloration par le bleu de toluidine comme en témoigne la fig.2.
Fig,2 : Spores traitées à la ribonucléase et colorées par le bleu de (Microphoto ; grossissement I.OOO X).
Les substances basophiles les plus importantes de la cellule étant les acides nucléiques, l'acide ribonucléique ayant été
-24-acide n'est contenu que dans les noyaux, les granulations
apparues lors des colorations précédentes seraient donc bien les noyaux des spores. Pour acquérir la certitude qu'il s'agit bien de noyaux, deux méthodes spécifiques des noyaux ont été essayées. La première de ces méthodes consiste à faire agir sur les spores préalablement traitées par la ribonucléase^le mélange de Unna. Gomme l'ont montré les travaux de Brachet cités plus haut, la pyronine se fixe spécifiquement sur l'acide ribonucléique et le vert de méthyle sur l'acide thymonucléique. On peut donc s'atten dre, par l'emploi de ce procédé de coloration, à ce que les
granules apparus plus haut apptraissent colorés en vert s'ils contiennent de l'acide th3ononucléique.
Les frottis de spores^ après action de la ribonucléase^ ont donc été colorés au mélange de Unna suivant la méthode décVite plus haut.
La micDophoto repro duite à la figure 3 montre l'aspect de trois spores ainsi traitées.
Gomme on le voit, ces spores continuent à présenter les granu lations mises en évidence par le bleu de toluidine et par le bleu de méthylène. Cependant, au lieu d’être colorées en vert ainsi que l’on pouvait s’y attèndre, elles ont surtout retenu la
pyronine. Ce fait n'ejsclut pas à priori la structure thymonucléique de ces corpuscules ; en effet, il apparaît comme très probable
que l’affinité manifestée par le vert de méthyle pour l’acide thymonucléique et par la pyronine pour l’acide ribonucléique est régie par des raisons physiques plutôt que par des raisons
4j.raiques. Il semble notamment que cette différence d’affinité des deux colorants pour les deux acides nucléiques soit liée à une question de ij>olymérisation. On sait, en effet, que l’acide thymonucléique est, à l’intérieur de la cellule^généralement plus polymérisé que l’acide ribonucléique. La coloration par la pyronine des granulations des spores pourrait donc être due au fait : ou bien que l’acide thymonucléique des noyaux de Neurospora
est relativement peu poiymérisé, ou bien plus probablement, que le traitement à la ribonucléase qui maintient les cellules
pendant une heure à 60° fait subir une dépolymérisation partielle à l’acide thymonucléique. Remarquons également qu’il est
absolument exclu que ces granulations pyront>philes soient constituées d’acide ribonucléiques, les spores ayant été traitées par la ribonucléase.
Il existe enfin une deuxième méthode, spécifique celle-là) de l’acide thymonucléique. Cette méthode est la réaction de Feulgen (21). Le principe de la réaction de Feulgen consiste à hydrolyser l’acide thymonucléique par l’acide chlorhydrique formai à 6C°; le produit d’iwdrolyse recolore la fuchsine décolorée par SO (réactif de Schiff).
-26-Ce temps d’hydrolyse doit évidemment être déterminé expérimen talement pour chaque matériel étudié.
Teçhniç[ue de_colqr'ation suivant Feul^en.
Pour effectuer la réaction de Feulgen, l’agent fixateur employé présente une certaine’ importance. L’alcool convient mal pour effectuer cette réaction. Le fixateur qui donne le meilleur résultat est le mélange de ZENKER (bichromate-acide acétique- sublimé). Le temps d’hydrolyse optimum pour les spores de Neurospora est de 6 minutes. La technique suivante a donc été employée ; Les frottis, collés sur lames albuminées sont fixés pendant 30 minutes dans le fixateur de Zenker. Après lavage à l’eau distillée, ils sont déposés dans l’acide chlorhydrique normal et maintenus pendant 6 minutes à l’étuve à 60°. Les frottis sont lavés à nouveau et plongés dans une solution de fuchsine décolorée par le bisulfite de soude. Les frottis^sont maintenus pendant deux heures dans le réactif à l’obscurité. Ils sont ensuite lavés à l’eau saturée de gaz sulfureux deux ou trois fois et finalement lavés à l’eau distillée, séchés et montés au baume.
Comme les résultats obtenus par les colo rations précédentes permettaient de s’y attendr^les figures obtenues sont exacte ment comparables à
celles déjà obtenues par les autres colo rations. Il apparaît dans chaque spore un certain nombre de gra nulations exactement semblables par la forme et la disposi tion à celles des préparations précé dentes.
4 et 5 permet donc de conclure à la présence dans la cellul^ de gra nulations contenant de l'acide thynonucléique. Comme le seul organe cellulaire contenant cet acide est le noyau^ nous pouvons considérer comme mis en évidence les noyaux dans les spores de W. Grassa.
Fig.5 : Réaction de Feulgen sur les spores (î-iicrophoto X I.COO)
Rappelons donc que les méthodes employées : la coloration par les colorants basiques après action de la ribonucléase, la coloration par le mélange de Unna après ribonucléase et enfin la réaction de Feulgen donnent des résultats comparables, pouvant recevoir une même interprétation, à savoir que les granules sont effectivement des noyaux.
Gomme on sait^ d'autre part, que les no3^aux contiennent très souvent en grande abondance de la phosphatase alcaline, on
peut se demander si lion ne parviendrait pas à mettre en évidence les noyaux de îleurospora dans les spores par emploi de la réac tion de Gomori (6?) qui permet de mettre en évidence les points d'activité phosphatasique à l'intérieur de la cellule.
' ijfct
4
#
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Fig, 6 : réaction des phosphatases alcalines de Gomori sur les
spores (microphoto X I.OOO).
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'■J <
Fig, 7 t réaction des phos|iiiatases alcalines sur les spores
(microphoto X I.OOO)
I La réaction des phosphatases de Gomori, consiste à mettre en milieu alcalin, les
cellules en contact avec ,un substrat sur lequel peut
s'exercer l'acitivté phos- phatasique, en l'occurrence du glycérophosphate; on
ajoute au milieu dU-chlorure de calcium de telle façon qu'aux endroits d'activité
•i
phosphatasique, le phosphate libéré par la phosphatase 'se précipite sous forme
de phosphate de calcium. ■ Ce pfécipité local est^
'après lavage de la prépa ration, traité par une
solution (il I de chlorure de cobalt et transformé par double décomposition en phosphate de cobalt. Le pré cipité de phosphate de cobalt .est, après lavage, transfor
mé en sulfure de cobalt noir en traitant la préparation par une solution très diluée de sulfure d'ammonium fraîchement préparé. Nous avons adopté
chez Neurospora correspond exactement à la localisation des noyaux. Les spores contiennent un certain nombre de points d’activité phosphatasique dont la mise en évidence donne des figures exactement semblables à celles obtenues par la mise en évidence des noyaux.
III. Un calcul assez intéressant est celui de la répartition stqtistique des noi^'aux dans les spores des mycéliums + et -.
Gomme on le voit à l’examen microscopique direct, les spores contien.ient un nombre variable de noyaux et sont pour la plupart multinuclées.
Nous avons effectué l^. comptage des noyaux par spore, sous le microscope sur une préparation sur laquelle avait été effectuée la réaction de Feulgei^ spécifique de l’acide thymonucléique.
Pour les spores de signe + les comptages ont porté sur 2q26 spores et pour les spores - sur 2314 spores.
Les résultats de ces comptages sont résumés dans le tableau suivant:
t
Nombre de ; Nombre de : ^0 t Nombre de : Nombre de :
noyaux par : spores t noyaux par : spores :
spore T
T
spore
-30-Comme le montre ce tableau, les spores + contiennent donc statistiquement moins de noyaux que les spores - . Ces résultats a .paraissent clairement également si l’on emploie les chiffres en )o de ce tableau à l’établissement d’un polygone d^e fréquence
(Fig. Ô).
Fig. â : Pol3'‘gones de fréquence montrant la répartition des noyaux par spore
pour les sexes + et
(en abcisse ; nombre de noyaux par spore)
On voit sur ce graphique que^ bien que la fréquence la plus éle^îée soit de deux noyaux par spore chez les spores + comme chez les spores -, il y a un décalage du poly gone de fréquence des
spores - vers la droite. Autrement dit, la proba bilité de rencontrer une
spore à un seul noyau est plus élevée dans les +, la ppobabilité de rencontrer une spore à deux noyaux est sen siblement la même dans les + et dans les - et la probabilité de rencontrer une spore à 3 noyaux est plus élevée dans les - que dans les + .
CHAPITRE II.
ETUDE DE LA GRCISSAHGE .
I. Les méthodes de culture et d’entretien des souches + et
-II. Technique pour l’étude de la croissance.
III. Mise en évidence d’une différence de vitesse de croissance entre les thalles + et - .
IV. Interprétations possibles de la différence de vitesse de croissance.
V. Etude de pouvoir gerrainatoire des spores + et - au moyen du micromanipulateur de Fonbrune,
-32-I, LES I^iETKQDES‘DE CULTURE ET D» ENTRETIEN DES SOUCHES + ET - .
Le_s Souche^.
Les souches que nous avons utilisées au cours de ce travail sont donc les deux sexes + et - de Neurospora crassa. Elles
nous ont été fournies par le "Gentraalbureau voor Schirvnelcultuur” de Baarn qui^ lui-même^les détient du généticien Beadle, un des grands pionniers de la génétique et dejÿ^mutations biochimiques de Neurospora.
L’entretien des _s ou ch es.
Les souches ont été entretenues sur milieu naturel ainsi que le recommande Langeron (3S) dans le but d’éviter leur appauvrissement par cultures répétées sur milieu s^nithétique. Nous avons utilisé deux milieux de repiquage et d’entretien : le premier est du moût de brasserie gélosé, fréquemment utilisé pour la culture des moisissures. Le second est un milieu à la farine d’avoine, gélosé également. Ces milieux sont préparés de la manière suivante ;
milieu de culture au moût de brasserie gélosé :
On ajoute au moût brut de brasserie préalablement déprotéiné
partiellement par une première stérilisation et filtré, 2 grammes pour 100 cc d’agar-agar en tresse. L’agar est dissouî par^chauf fage modéré/ puis la solution chaude est centrifugée pour éliminer les impuretés insolubles qui troublent le milieu. Le milieu ainsi préparé est réparti en tubes à raison de 5 ce par tube. Les tubes bouchés à l’ouate hydrofuge sont stérilisés à l’autoclave 20
minutes à 120®. Après stérilisation, les tubes sont inclinés jusqu’à la solidification de la gélose et conservés jusqu’à l’emploi^en chambre froide,pour éviter une trop grande dessi
Ce milieu est celui recommandé par Dodge (15, I6) comme étant tout particulièrement favorable à la fécondation et à la repro duction de Neurospora.
Il se prépare de la façon suivante :
On délaie dans 100 cc d'eau distillée froide 20 grammes de
farine d’avoine brute non blutée. (Jette suspension est chauffée et maintenue pendant deux heures environ à ÔO®. Il faut éviter de chauffer plus haut pour éviter le gonflement et la prise en pâte de l'amidon. Après ce temps, la suspension est filtrée sur tissu étamine pour séparer les écorces d'avoine. Après filtration, on ajoute à la suspension deux grammes d'agar-agar et on ramène au volume initial avec de l'eau distillée,
au moyen Cette suspension mise en ballon bouché+d'ouate est passée à l'autoclave pour dissoudre rapidement la gélose. La suspension pâteuse obtenue est répartie en tubes ou en boites de Pétri et
stérilisée à l'autoclave pendant 20 minutes à 120°
Les souches ont initialement été entretenues sur ces deux milieux alternativement, culture sur un milieu puis passage et culture sur le suivant. Cependant, il nous est apparu très tôt que les mycéliums cultivés longtemps sur un milieu tel que le moût par exemple, gardaient pendant très longtemps toutes leurs propriétés sans qu'aucun changement d'ordre morphologique ou chimique y apparaisse. Nous avons alors entretenu les souches initiales uniquement sur moût de brasserie gélosé, gardant le milieu à la farine d'avoine pour les phénomènes de sexualité. Les souches + et - de Neurospora ont donc pratiquement été entretenues sur moût gélosé.
Les repiquages ont été faits par prélèvement de petites
quantités de conidiospores au moyen d'un fil de platine stérilisé par passage à la flamme. Ces conidiospores sont ensemencées
-34-Les cultures repiquées sont ensuite placées à l'étuve à 25®, température usuelle de croissance de la moisissure et elles y sont laissées de Ô à 10 jours. Après ce laps de temps, elles sont conservées à la chambre froide à 4° pendant un temps de trois semaines environ. Elles sont ensuite repiquées à nouveau. Chaque culture est donc pratiquéraent repiquée tous les mois. Les cultures de souches sont en fait,conservées deux mois à la chambre froide, jusqu’au moment du repiquage de la culture
suivante, toujours dans le but de pouvoir pallier à un accident possible par contamination. Parmi les deux cultures résultant du repiquage d’une seule souche, une est employée pour l’expéri mentation, c’est-à-dire qu’elle sert à ensemencer les milieux utilisés pour l’étude de Neurospora, l’autre est conservée sans
que le tube ait été ouvert et ne servira que pour le repiquage du mois suivant. De cette manière, le risque de souiller la
culture stock est éliminé et cette dernière reste donc absolument pure.
On s’est assuré également, à intervalles réguliers, qu’il n’y avait pas eu mélange des deux sexes dans une même culture. Cet accident est rendu facilement possible par l’extrême légèreté des conidiospores qui se répandent facilement dans l’atmosphère. Le contrôle a été fait en repiquant de temps à autre les cultures
sur un milieu à la farine d’avoine et en constatant l’absence des périthèces après 20 jours de culture à 25®. Le temps de 20 jours est très suffisant; les périthèces se formant sur le milieu
Ili: TEüHNIQUE D^ETUDE DE LA üHCISSANüE.
LES MTHODES__DE MESUHE_DE LA_(JKOISSAIiGE.
L'inégalité du développement des sexes + et - sur moût ou sur milieu à la farine d’avoine nous a amené à étudier la crois sance des thalles. Quelques méthodes ont été mises au point pour mesurer cette croissance dans l’étude des mutants biochimiques de Neurospora,
Laprepière de ces méthodes : et à notre avis la plus rationnelle, consiste à mésurer le poids sec de mycélium formé en fonction du temps. Cette méthode est celle recommandée par Barton-Wright (2) pour le dosage de certaines vitamines au moyen des mutants de heurospora.
La deuxième méthode : dite méthode du tube, est due à Kj^an, Beadle et Tatum (52). Elle consiste à employer de longs tubes, légèrement relevés et ouverts aux deux bouts, à l’intérieur desquels on coule un milieu synthétique gélosé. Après refroi dissement, les tubès sont ensemencés à un bout et placés à l’étuve. A intervalles réguliers, les tubes sont marqués d’un trait à l’endroit où le mycélium est parvenu. On mesure les
distances du point d’ensemencement aux différents traits marqués à intervalles réguliers sur le tube et on établit le graphique de
croissance en fonction de ces données.
-36-D’autre part, toujours dans le cas des mutants biochimiques, Kyan a trouvé également que la vitesse de germination des
spores est proportionnelle à la concentration dans le milieu de la substance que le mutant est incapable de synthétiser. Cet auteur fait remarquer toutefois qu’il importe de tenir
compte de l’Sge des conidiospores et aussi de leur concentration dans le milieu où a lieu la germination.
Cette méthode n’a pas été employée par .ttyan pour mesurer la
croissance absolue de la souche sauteage de Neurospora. La vitesse de germination des conidiospores de la souche sauvage n’a servi à l’auteur qu’à établir une comparaison entre la vitesse de germination des spores sauvages et celle des mutants.
ÇhïTIQUE_DE CES METHODESj.
Pour établir une critique valable des méthodes ci-dessus mentionnées, il est nécessaire de donner une définition aussi
claire que possible de la croissance.
Deux définitions essentielles ont été données de la croissance : la première ^entend par croissance, la multiplication cellulaire
et mesure donc la croissance, théoriquement du moin^ en comptant le nombre de cellules initialement présent dans un volume déterminé, puis, le nombre de cellules dans un même volume après un certain temps.
La deuxième définition de la croissance la définit comme étant l’augmentation de poids d’un organisme en fonction du temps.
(Jette deuxième définition nous semble plus près de la réalité. En effet, la mesure du nombre de cellules ne tient pas compte du fait que, dans une culture âgée, les cellules ont une taille différente et un aspect différent ceil-e d’une culture jeune. La multiplication cellulaire -ae^présente plus à nos yeux comme une manifestation ou^si ’lon veut,une propriété de la croissance que comme la croissance elle-même. Dans ce travail, nous
adopterons comme définition de la croissance la définition suivante : On entend par croissance l’augmentation de masse
d’un organisme en fonction du temps.
(2ue valent alors les trois méthodes de mesure de croissance décrites plus haut ?
lia méthode du tube de Kyan, Beadle et Tatum nous semble peu/ exacte, i^ien ne prouve,en effet,que la variation d’un organisme en longueur telle que la mesurent ces auteurs,soit directement proportionnelle à la croissance de la masse de
cet organisme. Il semble bien,au contraite,ne pas en être ainsi. Nous avons employé la méthode du tube et avons constaté :
1°) Le graphique obtenu par cette méthode de mesure est une droite ( ce que trouvent d’ailleurs Kyan, Beadle et Tatum) alors que la courbe de croissance de la masse est une courbe en S caractéristique.
indiquant que l’augmentation de la masse n’est donc pas terminée.
Enfin, comme le déclarent les auteurs de la méthode, il est
nécessaire de travailler avec de l’agar-agar très pur et bien lavé. Or, la certitude de la pureté d’un produit aussi complexe que l’agar est toujours douteuse,
Ea méthode de mesure de la germination des spores^due à Ryan^ne constitue pas^elle non plus^une mesure de la croissance
et par ailleurs, comme on le verra à la fin de ce chapitre, les résultats que nous avons obtenus par celle méthode sont diamé tralement opposés à ceux auxquels on aurait dû s’attendre par la méthode de Ryan. ü’est^en effet^le mycélium ayant la vitesse de croissance la plus faible qui possède le pouvoir germinatoire le plus élevé,
La méthode que nous avons adoptée est donc celle initia lement décrite, qui consiste à mésurer le poids sec formé par une culture. Les graphiques qui suivent représentent donc
l’augmentation de poids sec des cultures en fonction du temps. Cette méthode exige évidemment un temps beaucoup plus long et un travail plus grand que les deux méthodes précédentes mais la rigueur et la certitude des résultats obtenus compensent largement ces inconvénients.
La composition da ce milieu a été empruntée à Barton-Wright et Stokes et légèrement modifiée. Bn voici la composition exacte :
Glucose 50 gr Tartrate d’ammonium 5 gr Citrate (disodique 4 gr PO^H^K 2,5 gr SoSdg, 7 H^O 0,5 gr NaCl 0,1 gr CaCl^ 0,1 gr FeCl^ 0,005 gr SO^Zn, 7 H^O 0,002 gr Biotine 0,000005 gr H^O I .000 gr.
Ue milieu, de composition très simple, contient donc du glucose jsomme principale source de carbone, du; tartrate d’ammonium comme source d’azote et du phosphate monopotassique comme source de phosphore. La très petite quantité d’ions Zn ++ présente dans ce milieu a pour but d’empêcher une formation trop abondante de conidies dont la récolte quantitative est très difficile à cause de leur légèreté et de la facilité avec laquelle elles se
> dissocient.
de milieu contient également de la biotine à raison de 5 micro grammes au litre. Cette vitamine est la seule qui soit exigée par Neurospora et sa synthèse ne peut donc être faite par le mycélium.
Les cultures en vue de la mesure de la croissance sont
-40-La technique de mesure de la croiss nce est donc la suivante 1°) Les Erlenmeyers^contenant chacun 10 cc. du milieu de culture,
sont stérilisés 15 minutes à l’autoclave à 110®, Il faut veiller à ne pas dépasser cette température de manière à éviter la caramélisation du glucose contenu dans le milieu et qui se traduit par un brunissement de ce dernier,
2°) A partir de cultures stock, on prépare une suspension de
conidiospores dans une solution stérile à 9 pour mille de chlo rure de sodium. On prélève quelques conidies au fil de
platine stérilement et on les agite vigoureusement dans un cc, de la solution stérile à 9 pour raille de NaCl. dette suspension de conidiospores s’homogénéise très facilement par agitation.
3®) On effectue alors un comptage des spores dans la suspension préparée à l’aide de l’héraatimètre de Thoma. La taille des spores convient,en effet,à une mesure de comptage au moyen de cet instrument.
4®) Les deux suspensions de spores + et de spores - sont ramenées à la même concentration en spores par dilution de la suspen sion la plus riche avec un volume calculé de hadl 9 pour mille stérile.
5® ) iJhaque Erlenraeyer est alors ensemencé avec une goutte de la suspension de spores prélevée avec une pipette Pasteur.
Uomrae les cultures + et - ne peuvent être ensemencées avec la même pipette et qu’il est important qu’elles soient ense mencées avec un volume égal de la suspension de spores, il faut préparer deux pipettes ayant exactement le même calibre intérieur et le même calibre extérieur. La dimension d’une goutte dépend en effet,principalement de ces deux facteurs. Les deux pipettes du même calibre sont préparées de la manière suivante : on étire à la flamme un tube stérile or dinaire servant à préparer les pipettes Pasteur. Au moment de l’emploi, ce tube est coupé avec une lime mince en sa ;o partie médiane; les deux sections ainsi réalisées ont donc mêlues diamètres e:cterne et interne. Le tube est rapidement passé à la flamme pour le stériliser avant d’être plongé dans la suspension de spores. Il faut prendre garde à ce que la flamme du bunsen ne jaunisse pas à ce moment^ ce qui indiquerait une fusion du verre^et par conséquent,une
variation de calibre.
6®) La récolte des mycéliums s'opère de la manière suivante : le contenu de l’Erlenmeyer ( milieu de culture et mycélium formé) est versé sur un filtre en verre d'Iéna de porosité G 3» dne légère succion à la trompe élimine le milieu de culture liquide : le mycélium lavé trois fois sur le filtre par un jet d'eau distillée à la pissette. Après lavage, le mycélium très compact est retiré du filtre au moyen de fines pinces et placé sur un verre de montre^préalablement taré. Tous les mycéliums sont alors placés au four à 120° pendant deux heures pour être séchés puis laissés refroidir dans un exsiccateur à vide ; cette précaution est absolument nécessaire, en effet,les mycéliums sont légèrement hygrosco- piques et leur poids est susceptible de variations par
a^orption d'humidité.
Pour mesurer la croissance, les mycéliums sont prélevés à des intervalles réguliers de 2C à 24 heures après le premier prélèvement ; ce dernier est effectué environ 4Ô heures après l'ensemencement. La croissance, en effet, est pratiquement nulle ’ pendant les 24 premières heures (phase de latence).
Les tableaux suivants montrent les résultats obtenus au cours de deux expériences complètement séparées.
Age de la POIDS SEU DU MYUELIUM EN MILLIGKAIvMES : culture
Mycélium + Moyenne Mycélium - • Moyenne !
-42-Age de la Poids sec du mycélium en millif rammes. : culture
Mycélium + Moyenne M3rcéliura - Moyenne ;
46 heures 17,1 4,7 17,2 17,5 5,0 4,7 : IÔ,I 4,6 72 heures 67,0 35,7 56.5 62,4 36,4 36,0 = 62,9 35,9 •• : 93,0 67,5 Si heures 92,9 92,2 67,1 67,9 = 90j7 69,2 90,2 83,7 100 heures 9â,o 9S,Ô 05^5 85,2 : 100,2 86,3 99,5 96,0 124 heures 96,1 102,6 97,5 97,6 : 111,2 99,4
Les résultats exprimés par ces tableaux sont représentés graphiquement sur les figures 9 et 10. Les chiffres placés entre parenthèses dans le tableau qui précède sont des valeurs trop fortement aberrrantejdont il n’a pas été tenu compte pour l’éta
blissement des moyennes.
Oomme on le voit par les deux tableaux et les courbes qui
précèdent, il existe une notable différence de croissance entre les thalles + et les thalles - de JMeurospora crassa.
dette différence finit naturellement par^s’annuler au moment où le mycélium + atteint son maximum de croissance; à ce moment, la
Dans la suite, nous avons cherché à annuler cette différence de vitesse de croissance au moyen de divers facteurs chimiquement définis ; dans chacune de ces expériences, en même temps que la courbe de croissance des mycéliunis établie en présence du produit à tester, nous avons réalisé une courbe de croissance témoin,
sur milieu simple de Stokes et Barton-Wright. Dans les nombreuses expériences qui ont été faites, les courbes de croissance témoin> ont toujours présenté le même décalage que celui observé dans ce premier cas. Il peut donc être considéré comme absolument certain qu’entre les deux sexes de souches de Beadle de Weurospora crassa il existe une notable différence de croissance.
Exprimée en pour cent du poids sec du m^z-célium +, à chaque instan^ cette différence évolue en fonction du temps suivant les cliifres donnés par le tableau suivant, établi d’après les résultats du deuxième tableau de mesure de la croissance.
Uomme on le voit, cette différence très forte au début de la croidsanc^diminue progressivement au cours de celle-ci. Elle finit d’ailleurs par s’annuler com.plètement. Le fait de cette différence de
croissance est déjà un phénomène intéressant en soi.
D’autre part, la certitude de la différence de croissance entre + et - permet de reconnaître de façon absolue des mycéliums auxquels^jusqu’à présentais signe sexuel + ou - n’avait été attribué que d’une manière absolument arbitraire.
âge de la culture différence en jo
46 heures 73,1 io
72 heures 42,3 io Ô1 heures 26,3 i 100 heures 13,S i
-44-Es_sai de_mesure de__la £roissançe_par_une_microméthode.
Principe :nous avons essayé de mesurer la croissance des thalles au moyen de cultures faites sur de petites quantités de milieu. Le but de la méthode est donc d’utiliser le minimum de milieu possible pour une mesure de la croissance.
Première méthode utilisée.
Elle consiste à mesurer, à intervalles réguliers, la quantité d'azote fixée par la moisissure au cours de son développement. En utilisant une micro-méthode de dosage de l’azote, on peut facilement doser ce dernier sur des quantités de matière sèche pratiquement impondérables. Nous avons dans
‘T
ce cas fait les cultures de mycéliums en tubes à essai sur un volume de milieu liquide de Stokes de 0,2 à 0,5 cc. Les cultures 'et l’ensemencement sont effectués comme pour la méthode usuelle
de culture.
Récolte des mycéliums.
Les mycéliums sont récoltés de la manière suivante pour le dosage de l’azote :
ïe_çhni_que de_récolte_
Sur un filtre diéna G 2 petit modèle, on dépose des bandes de papier filtre pour analyse, exactement calibrées. La bande de papier filtre est lavée préalablement sur le filtre au moyen d’un jet de pissette. Dette opération a pour résultat, en plus du nettoyage du papier filtre de faire adhérer celui-ci assez inti;émement au verre poreux d’Iéna.
Dispositif pour la récolte des cultures.
Le tube dans lequel la culture a été faite subitle même traitement de lavage, à 1'eau, à l’alcool et à l’éther. La languette de papier filtre portant la culture est alors délicatement enlevée au moyen de pinces fines et placée telle
quelle dans le tube lavé pour la minérali sation.
Minéralisation_des_mycéliums Les mycéliums^ainsi recueil lis^ doivent être minéra lisés de manière à trans former tout 1’azote qu’ils contiennent/Surtout sous forme protéique^ en azote ammoniacal. A cet effet, les mycéliums sont chauffés dans l’acide sulfurique pur avec un catalyseur hâtant la trans£i6rmation.
La solution de catalyseur.
Le catalyseur employé au cours des minéralisations a la
10 gr. I gr,I2 3 cc. 30 cc.
De catalyseur est employé à la minéralisation avec un volume égal d’acide sulfurique concentré pur.
Minéralisation ; technique. composition suivante : SO^K^ SOff-Hg SO^H^ H'^O
Les tubes contenant les mycéliumxS enveloppés de papier filtre sont placés au bain de sable. On leur ajoute 0,3 a 0,5 ce
-46-£i_stillation_et dosa£e_de l'ammoniac.
Les sels ammoniacaux formés par la minéralisation sont neutralisés et transformés en ammoniac gazeux. Cet ammoniac est distillé et recueilli dans une solution tamponnée à l'acide borique qui pei-raet de faire un dosage direct à l'acide sulfu rique n/ioo«
La solution à l'acide borique a la composition suivante : acide borique alcool absolu indicateur eau distillée 10 gr 200 cc 40 cc jusqu'à I.OOO cc. L'indicateur est formé d'une solution alcoolique contanant : 0,033 de vert de bromocrésol
0,C66 io de rouge de méthyle emprunté à Convray ( modifié) (14) •
Ce milieu est tel que la moindre variation du pH vers la zone alcaline entraîne un virage de l'indicateur du rouge au vert. D'autre part, comme elle est fortement tamponne^^ eüLa peut absobber des quantités relativement élevées d'ammo niac. L'absorption de l'ammoniac se traduit par un virage
immédiat de l'indicateur. Le milieu est ramené à sa coloration initiale par adjonction d'acide sulfurique N/lOO juste en
quantité nécessaire pour neutraliser la quantité d'ammoniac absorbé, ce qui permet de déduire^par un calcul simple^la quantité d'azote à doser.
Technique de dosage de l'ammoniac.
Le contenu des tubes après minéralisation est repris par 2 cc d'eau distillée et versé dans l'appareil à distillation de PMŒAS, Le contenu du tube est une nouvelle fois rincé par l'eau distillée (2 cc).^ Le liquide est neutralisé et alcalinisé par 4 ce de soude à 1+0%. L'ammoniac est entraîné p^r un courant de vapeur et recueilli dans l'acide borique.
Le dosage de 'ammoniac est effectué par l'acide sulfurique N/IOO au moyen d'une microbux’ette. On ajoute la quantité d’acide
1 tttT :
I
-47-correspond à celui de la neutralisation de l’ammoniac (pH 5)« La composition de ce milieu témoin est la suivante :
acide citrique 0,54 gr. citrate de sodium 1,Ô2 gr. eau distillée 100 cc.
Pour obtenir la teinte désirée, on ajoute à ce milieu un volume égal de milieu à l’acide borique.
Nous avons utilisé cette méthode de mesure de la croissance pour vérifier l’importance de la richesse de l’inoculum sur la croissance. Nous avons réalisé des suspensions de spores de concentration décroissante de telle manière qüe l’inoculum ait les valeurs statistiques de 105, 103 et 10 spores.
Les résultats indiqués dans le tableau suivant représentent la moyenne de trois dosages, d’azote concordants.
Age de culture 33 heures 36 heures 30’ 40 heures 40 h. 30’ 47 heures 62 h. 30’
Richesse de l’inoculum en spores.
Quelle peut être l'influence de la richesse de l'inoculum sur la croissance ?
Dans le graphique de la figure nous avons porté en abcisse le logarithme décimal de la teneur en spores de l'inoculum et en ordonnée la croissance mesurée par la quantité d'azote fixée par des cultures de 47 heures. Il s'agit donc de cultures dont la croissance est pratiquement terminée dans le cas de celles qui ont été ensemencées avec lîinoculum le plus riche.
Gomme on peut le voir, les courbes obtenues sont sensiblement paraboliques. Nous pouvons alors poser que, en première appro ximation, la quantité d'azote fixée par la culture est propor tionnelle au carré du logarithme de la richesse en spores de
l'inoculum.
Soient : (N) la quantité d’azote fixée par la culture I le nombre de spores de l'inoculum ,
nous pouvons écrire en première approximation : 2
(N) = adog I)
La constante a calculée d’après les données expérimentales donne pour +, pour une concentration
en inoculum de
pour -, pour une concentration en inoculum de 10^ 10^ 10^ a = 11 a = 10,5 a = 10,4 10 10 10' a = a a Ô,3 S.I
Gette formule permet donc d'évaluer la richesse de l'inoculum d'une culture après croissance de cette dernière.
Deuxième microméthode de mesure de la croissance.
Nous avons essayé de mesurer la croissance par une méthode photoraétrique qui présente l'avantage de ne pas exiger le
sacrifice de la culture au moment de la mesure. Nous avons essayé de mettre au point une méthode de mesure permettant l'emploi du photomètre de Pulfrich Zeiss en utilisant feua dispositif des micro-cuves. Nous avons fabriqué pour les supports de micro-cuves du photomètre Pulfrich des cuves spéciales^ permettant la mesure de l'opacité du mycélium. Cette cuve est formée d'un petit cylindre en verre avec hernie latérale. Le fond de la cuve est formé par une lame de verre collée au fond du tube. Les cultures smht effectuées
en déposant au fond du tube tenu droit 0,2 à 0,5 cc de milieu de culture. Durant la durée de la culture proprement dite, le tube est maintenu verticalement et le mycélium se développe donc au fond de ce tube. Au moment de la mesure photométrique^ le tube est incliné horizontalement; le mycélium est maintenu au fond du tube au moyen d'un fin agitateur de verre et y reste collé. Le liquide de culture s'écoule le long de l'agitateur dans la petite hernie latérale. Le tube est ainsi placé dans les sup ports pour microcuves du photomètre de Pulfrich et l'extinction mesurée par rapport à un tube vide identique au premier.
-50-d’ondes, probablement due à la présence des pigments caroténoïdiques de Neurospora.
Le tube spécial pour mesurer la croissance par photornétrie.
pourtant appréciable.
L'extinction semble proportion nelle à la croissance des thalles. Toutefois, nous n'avons pu utili ser cette méthode sur Neurospora pour la raison suivante : au cours de la croissance :
1®) une partie du mycélium croît en longeant les bords du tube ; cette partie de mycélium est forcément négligée au cours de la mesure de l'e^ctinction.
2°) il se forme d'abondantes conidies le long des bords du tube en fin de croissance ; bien que leur masse soit faible,
l'erreur qui consiste à ne tenir compte de leur croissance est
Elle présente l’avantage de pouvoir faire toute une mesure de croissance sur une seule culture^à condition d’opérer stérilement au cours de toutes les manipulations iiscess .ires à la mesure. Nous avons dû^pourtant, abandonner cette méthode en ce qui
concerne plus précisément Neurospora crassa.
IV. INTERPRÉTÂTIONS POSSIBLES DE DIFFERENCE DE CRCISSANGI
A quelles causes peut-on attribuer la différence de crois sance observée entre les mycéliums + et les mycéliuras - ?
Trois explications possibles nous semblent se présenter natu rellement à l’esprit.
La première : consisterait à adraettre que cette différence est due à une différence dans le pouvoir germinatoire des spores. Cette interprétation se trouve naturellement renforcée par les travaux de Ryan^précéde;.;ment cités ^sur la germination des spores de Neurospora. D’après la conception de Ryan, il faudrait
s’attendre^en effet^ à ce que les conidiospores formées par le mycélium + aient un pouvoir germinatoire plus élevé que les coni diospores formée^par le mycélium - .
La deuxième : hypothèse, dans le mêmie ordre d’idée, consiste à admettre que la différence observée est due à une différence dans la vitesse de germination des spores.
-52-Une troisième explication : consiste à admettre que la crois sance ralentie du mycélium - est due, dans ce mycélium, à la synthèse incomplète d'un constituant biologique. Autrement dit, chez -, au cours des processus anaboliques, une des réactions de s^mthèse des constituants cellulaires se déroulerait à une vit\esse plus faible que chez + . On sait déjà que, chez
Neurospora, la sjmthèse de constituants biologiques importants (vitamines, acides aminés, etc...) est effectuée en plusieurs étapes, chaque étape étant contrôlée par un gène différent. ■*^n c e qui concerne ,par exemple,la synthèse de la choline, les travaux de Horov/itz (2é) et de Horowitz,Donner et Houlahan(29)
ont démontré que cette synthèse se faisant en quatre étapes qui peuvent se résumer comme suit :
H^N-GH^-GH^-OH GH^-NH-GH^-OH (GH^)^=N-GH^-GH^-CH {CH^)3=N_ch2_ch2_0B OH amino-éthanol monométhylarninoéthanol diméthylarainoéthanol choline
Chacune de ces réactions se trouve être contrôlée par des gènes séparés. On connaît,en effet,deux mutants différents incapables d’effectuer,par eux-mêmes, la synthèse de la cholinej ce sont les mutants 34*406 et 47*904. De premier de ces mutants (34*406) est incapable de synthétiser la choline à partir d'aminoéthanol mais parvient très bien à la synthétis€t^><i£i à partir de monométhyl aminoéthanol. On en conclut^que dans ce mutant^n'est le gène
Le deuxième de ces mutants (47.904) est incapable d’utiliser le monométhyl-aminoéthanol à la synthèse de la choline mais est capable de transformer en choline le diméthylamino-éthanol.
D’autre part, ce mutant est capable de transffrmer l’aminoéthanol en monométh^laminoéthanol ; ce dernier peut être utilisé par le premier mutant et transformé en choline. Dans le cas du
deuxième mutant expérimental, on coniut au blocage du gène contrôlant la méthylation du monométhyl-aminoéthanol en diméthyl-aminoéthanol. De la connaissance de ces mutants,
on conclut aussi que dans le type sauvage la synthèse de la choline à partir de l’aniinoéthanol se fait en quatre étapes, chacune
des réactions de synthèse s’effectuent sous le contrôle d’un gène. De telles chaînes de réactions contrôlées génétiquement ont
également été t rouvées chez Neurospora par : Donner et Beadle (5) pour la synthèse de l’acide nicotinique ; par Mitchell et
Houlahan (49) pour la synthèse de l’adéninè ; par Tatura et Bell (63) pour la synthèse de la thiamine ; par Donner (6), Donner,Tatum et Beadle (7) pour la synthèse de l’isoleucine ; par Tatum, Donner et Beadle (6I) et par Tatum et Donner (62) pour la synthèse du tr^^tophane.
Il n’est donc pas impossible que dans un des deux thalles
de la souche sauvage, une-de ces réactions contrôlées génétiquement soit plus lente que chez l’autre. Dans ce c^s, il est bien évident que c’est la réaction qui a la vitesse la plus lente qui déter mine la vitesse de synthèse du produit envisagé. Si^d’autre part,
