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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:
Bonotto, S. (1969). Synthèse du RNA et morphogenèse chez acetabularia mediterranea (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.
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UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES
3
Faculté des Sciences
Laboratoire de Morphologie Animale
SYNTHESE DU RNA ET MORPHOGENESE
CHEZ
Acetabularia med i ter ranea
Mémoire présenté pour l'obtention du grade scientifique de Docteur en Sciences
BONOTTO Silvano 1969
DEPARTEMENT DE RADIOBIOLOGIE C.E.N.
THESE ANNEXE
UNIVERSITE LIBRE DE ER'J.\'£LL'LS Faculté des Science»
Laboratoire de Morphologis Animale
SYNTHESE DU RNA ET MORPHOGENESE CHEZ
"Aoetabulopïa meditewanea"
Mémoire présenté pour l'obtention du grade scientifique de Docteur en Sciences
BONOTTO, Silvano 1969
Département de Kadiobiologie Co E. N.
REKEKCïaiENTS
Qu'il nous soit permis d'exprimer ici toute notre res pectueuse gratitude envers le Professeur J.Brachet qui nous a donné la possibilité d'effectuer dans son Laboratoire la plus grande partie de ce travail et qui, incessamment, nous a prodigué ses précieux con seils O
Ce travail a été effectué presque entièrement en collaboration avec notre ami Michel Janowski. Sans son intuition pé nétrante et son habileté, nous n'aurions pas trouvé une solution aux nombreux problèmes théoriques et pratiques posés au coux's de nos rc- chercheso Je suis heureux de lui exprimer ici toute ma reconnaissance<>
Notre reconnaissance s'adresse également à tous les chercheurs et amis qui, à Rhode-St-Genèse, à Mol et à Naples, nous ont aidé de quelque manière que ce soit à mener à bien la réalisation de ce travail O
Nous tenons à remercier tout particulièrement Monsieur R.Kirchraann pour l'intérêt qu'il a porté à notre travail et pour des discussions fructueuses. Madame E.Bonnijns-Van Gelder pour son aide technique efficace^ et Monsieur A.Geusens, pour la réalisation des gra phiques*
Nous remercions egalement les Docteurs T.Vanden
Driessche et H. Boioukh.ère pour leur collaboration fructueuse et Mon sieur J. Verhulst ainsi que Madame N. Herremans pour leur précieuse aide technique* L’aide constante de Monsieur L.Lateur a été vivement appréciée.
Nous exprimons notre plus vive gratitude à Monsieur Goens, Directeur Général du Centre d'Etudes de l'Energie Nucléaire (C.E.N.) et à Monsieur J.R.Maisin, Chef du Département de Radiobiologie pour avoir bien voulu nous autoriser à préparer ce mémoire dans le
cadre des activités du C.E.No
Houe reiaercions très vivecent aussi le Professeur K.Errera pour les conseils qu'il nous a donoés au cours de nos recherches et les Professeurs ci.H.Bacq, J.Maisin et P.Manil pour l'intérêt qu'ils ont porté à notre travailo
Au cours de ce travail, nous avons bénéficié d'une Bourse de Recherche de 1'EURATOM, d'une Bourse d'Etude de l'EMBO et de l'aide financière du Laboratoire International de Génétique et de Biophysique (L.IoG.B.) de Naples. Je désire exprimer ma profonde reconnaissance aux Docteurs K.Appleyard et H.Bertinchamps et aux Professeurs H.Chan- trenne et A.Buzzati-Traverso pour cette aide précieuse.
Nous remercions sincèrement le Professeur J.Hammerling ainsi que ses élèves, les Docteurs H.G.Schweiger et G.Werz, pour leur très chaleureux accueil à Wilhelmshaven et pour de très fructueuses dis - eussions.
Le Docteur K.Beth, à plusieurs reprises, a mis à notre disposition des algues récoltées dans la mer. Qu'il trouve ici uos plus vifs remerciements O
Nous remercions, enfin, sincèrement nos collègues de l'Université de Padoue et tout spécialement les Professeurs N.Sili- prandi et V.Moret pour l'intérêt qu'ils ont constamment porté à nos rechercheso
TAKL£ I;E MATIERES
Page .
But du travail 1
Chapitre I. I. Introduction 2
1.10 L'algue 2
1.2o Les "substances morphogénétiques" J 1.3o Les relations nucléocytoplasmiques 5
1.4. Synthèse du DNA 5
1.5. Synthèse du RNA 7
1.60 Synthèse des protéines 9
10 1.7. Conclusions
Chapitre II» II. Matériel et Méthodes 11
2.1. Cultures des algues et anucléation 11
2.2. Fractionnement subcellulaire 11
2.3* Extraction du EI^A total 12
2.4. Extraction du ENA des fractions subcollulaires 12 2.3* Extraction du ENA-''H des particules 50 S JO So 12 2.6. Extraction du ENA du foie de lapin 1j 2.7o Extraction du ENA~''H d*Escherichia coli 15 2.8. Extraction du ENA des micro-organismes contami- 15
nants
2.9. Isolement et purification des ribosomes chloro- 15 plastiques d'Acetabularia
2.10 Isolement des ribosomes, marqués à l'uriaine-Jjj 14 d'un homogénat total
2.11 Isolement et fractionnement des ribosomes chlo- 15 roplastiques et non-chloroplastiques, marqués à
1'uridine-^H
2.12 Isolement des ribosomes d'Escherichia coli -15-2.13 Isolement des ribosomes des micro-organismes
2.14 Traitement du RHA et des ribosomes par la RNAso l6 2.15 Analyse du RNA d'Acotabularia à la centrifugeu- 16
se analytique
2.16 Microscopie électronique 17
2.17 Mesure de la radioactivité 17
2.18 Mesure de la densité optique 17
Chapitre IIIo III. Résultats 18
RNA d*Acetabularia 18
5.1.1. RNA des algues antières 18
5.1.2. RNA des algues anucléées
5.1.5* NNA des fragments nucléés *19
5.1.4. Constante de sédimentation du RNA d'Acetabularia -19 5.1.5. RNA des fractions subcellulaires 20
5.1.6. Synthèse du RNA 20
3
5o1.7« Sort du RNA- H néosynthetise, Mise en évidence 21 d'un RNA 15 stable
5.1.80 RNA des micro-organismes contaminants 22
5.2. Ribosomes d*Acetabularia 25
5.2.1. Ribosomes non marqués chloroplastiques et non- 23 chloroplastiques
5.2.2. Ribosomes marqués d'un homogénat total 23 5.2.5. Ribosomes marqués chloroplastiques et non- 24
chloroplastiques
5.2.4. Constante de sédimentation des ribosomes mar- 24 qués chloroplastiques et non-chloroplastiques
5.2.5. Synthèse et stabilité des particules 5O S et 3OS. 25 5.2.6. Ribosomes marqués des micro-organismes contami- 26
nants
Chapitre IV. IV. Discussion des Résultats 27
4.1. RNA d*Acetabularia 27
4.1.1. RNA total extrait des algues entières 27 4.1.2. RNA total extrait des fragments nucléés et 28
4.1.3. KÎÎA des fractions cubcellulaires 2g
a) cytoplasme 2^
b) mitochondries 2g
c) chloroplastes ^0
4.1.4. Stabilité du RNA chloroplastique
4.1.5. Synthèse du RNA ^2
a) RNA marqués pendant un temps bref ^2 b) RNA marqués pendant un temps long
c) Expérience de chasse: Mise en évidence d'un RNA I5 S stable
4.2. Ribosomes
4.2.1. Ribosomes non marqués.chloroplastiques et non- chloroplastiques
4.2.2o Ribosomes marqués cliloroplastiques et non- chloroplastiques
4.2.3. Nature des particules 50 S et 30 S marquées jy 4.2.4o Expériences de chasse: Mise en évidence d’une
particule ^0 S stable
4.3. Considérations sur le métabolisme du RÎ^A et des ribo- somes chez les algues nucléées et ajiuclcées
Résumée
1.
BUT DU TRAVAIL
Selon une hypothcee de BRACHET (1962, '•965)1 Iss ''substances morpho- génétiques" de HAiillERLING ('195^» a) pourraient s'identifier avec des RNA messagers (m-RNA) d'origine nucléaire, qui s'accumuleraient dans la zône apicale de l'algue géante unicellulaire Acetabularia mediterra- nea, là où se formera plus tard le chapeau reproducteur, osa m-RNA pourraient "survivre" dans le cytoplasme 2 à 3 semaines avant d'être dégradés »
Cette hypothèse, qui rend compte parfaitement des princi - paux faits expérimentaux observés, ne repose cependant que sur des évidences indirectes, telles que les effets de la ribonucléase (STICK et PLAUT, 1958)» des irradiations par les rayons ultraviolets (OLSZEWS- KA, de VITRY et BRACHET, 196'!), de 1 • actinomycine (BRACHET, DENIS et de VITRY, 1964), de la puromycine (BRACHET, 1963)» et sur le comporte ment soit d'un RNA rapidement marqué (OLSZEV/SKA et BRACHET, 196I), soit de certaines protéines basiques (OLSZEWSKA, de VITRY et BRACHET, 1961 ; WERZ, 1961 ; de VITRY, 1965)0
Une étude biochimique des propriétés et du sort du RNA ra pidement marqué semble donc nécessaire afin de prouver l'exactitude d'une telle hypothèse»
Si le RNA rapidement marqué (ou une fraction de ce RNA) correspond à un m-RI^A stable, il devrait en principe être possible de l'extraire des polyribosomes cytoplasmiques même 2 à 3 semaines après sa synthèse. Un tel projet exige une connaissance approfondie des différentes es - pèces de RI’IA et de ribosomes présents dans Acetabularia»
Le développement récent de techniques satisfaisantes, soit pour l'extraction du RNA (BALTUS et ôtUERTIEH, 1966), soit pour l'étude
des ribosomes et polyribosomes (JANOWSKI, 1966), d'Acetabularia a rendu possible la réalisation de ce travail»
2.
CMPITRE ïo ►
INTRODUCTION
Le grand intérêt d*Acetabularia, au point de vue de la Biologie Générale et de la Physiologie cellulaire, réside dans la taille gécuite do cette algue unicellulaire, dans la possibilité d'ob tenir facilement deux fragments (nucléé et anucléé) par simple sec - tion du siphon axial et, surtout, dans les remarquables capacités de régénération des fragments anucléés.
Dans une série de travaux fondamentaux, qui ont débuté en 19J1, HAMÎiERLING a observé que les fragments anucléés d*Acetabularia non seulement possèdent une longévité extrême (plusieurs mois) mais, ce qui est plus important, qu'ils sont capables do regénérer des structures complexes (verticilles, chapeau) portant les caractères génétiques de l'espèce à laquelle le noyau appartient (UAIii'àixîLlNG,
1931, 1932, 193^a, 193^b, 1933).
Ces observations, basées sur des expériences désormais classiques de greffes intra - et inter - spécifiques, lui ont permis de concliire que le noyau des Acetabularia produirait des "substances morphogénétiques " possédant une spécificité d'espèceo
Bien qu'il soit fort probable que les "substances morphogénétiques" soient des m-PllA stables (BRACHET, 1962, 196?), leur nature chimique n'est pas encore connue avec certitudoo
J Nous reviendrons plus loin sur ce pointe Nous donnerons tout d'abord une description synthétique d'Acetabularia et nous résumerons les principaux résultats obtenus sur cette chlorophycéeo
1.1 algue.
3
de sa vie (HAîiiiEHLIÎÎG, 'Î93”'t ‘'>932), présente une certaine ressem blance avec les végétaux supérieurs (PUISEÜX - DAO, 1962)0
Elle est constituée d'une partie basale munie de rhizoldes, qui con tient le noyau et d'uzx siphon axial surmonté d'un ou de plusieurs verticilles de poils et, à maturité, d'un chapeau reproducteur (Figol, c) rempli de cystes (HA2IHERLINQ, 193^ b)o
Son cycle biologique est montré dans la fig.2o Au cours de la croissance végétative de l'algue, le noyau augmente environ
—9 3 «3 3
1 million de fois sa taille (de dans le zygote à 10 "^mm^ dans l'algue au moment de la formation du chapeau) sans se diviser
(HAIIKERLING, 1963)0 C'est seulement quand la croissance végétative de l'algue est terminée que le noyau primaire se fragmente en un très grand nombre de noyaux secondaires (de-10.000 à 20»000), qui vont co loniser les nombreuses loges du chapeau. C'est autour de chacun de ces noyaux que se délimitent les cystes (fig.3) (WORCNINS, I86I5
SCHÜLZE, 1939)0
La forme ovoïde, typique des cystes d'Acetabularia mediterranea
(WOROHINE, 1861), est soiis le contrôle du noyau secondaire (VVERZ, 1968a X Dans les cystes, le noyau secondaire se divise activement pour donner naissance aux gamètes (de BARY et STRASBURGER, 1877; HAI-li-lERLING, I93I, 193^t 1964; CRAWLEY, I966).
Selon PDISEUX - DAO, cependant, dans certaines conditions de culture au moins, la reproduction d'Acetabularia aurait lieu par des zoospores
(PUISEÜX - DAO, 1962, 1963)0
La méiose semble avoir lieu 12 heures avant la libération des gamètes (SCHULZE, 1939)» Ces derniers possèdent 2 flagelles et plusieurs mitochondries (CRAWLEY, 1966), mais un seul chloroplaste, plus ou moins replié sur lui-même (WERZ, communication personnelle)o Dans certaines algues, les chloroplastes d'un gamète dégénèrent peu après la formation du zygote (GRANICK, 1961)0 Chez Acetabularia, tou tefois, un tel phénomène ne semble pas se présenter (CRAWLEY, 1966).
f
1.2o Les "substances morghogénétiques ",
4
Wettsteinll, Acetabularla crenu3.ata et Acefabularia schenkli ont été largement utiliBée£5 par HAi'ihERLIKG et ses élèves dans des expériences de greffe et de régéîiération (cf. HAldiERLING, 1953» 3963)»
Les conclusions fondamentales de leurs très nombreux travaux peuvent être ainsi résumées ;
1) Les processus morphogénétiques chez AP^tafa^l^rla sont con trôlés par le noyau par l'intermédiaire de "substances mor— phogénétiques",
2) Ces substances, qui sont produites par le noyau, sont accu mulées dans le cytoplasme selon un gradient apico-basal et peuvent assurer la continuation de la morphogénèse même en l'absence du noyau.
3) Ces substances sont particulièrement stables : 28 jours au moins chez Acetabularia mediterranea et 70 jours environ
chez Polyphysa Cliftonii (HAi'LMEKLING et ZETSCHE, 1966). 4) Le noyau serait capable de synthétiser les "substances mor-
phogénétiques" même à l'obscurité totale, Lano ces conditions elles sont, cependant, inactives®
Elles ne manifestent leur activité que lorsque les algues sont exposées à la lumière (BETH, 1953 )»
5) Les "substances morphogénétiques" sont de deux types : a) les substances qui induisent la formation du charjeau
("hutbildende Substanzen "), qui sont aspécifiques, b) les substances qui contrôlent les caractères morpho
logiques du chapeau ("hutgestaltende Substanzen") f qui sont probablement un complexe de substances spé cifiques différentes. (BRACHET et LANG, 1965)0
Transposé en termes de Biologie moléculaire, le concept de "substances morphogénétiques" doit se changer, évidemment, en celui de RNA messa gers (m-RNA)o
Synthétisés au contact du DNA nucléaire, ceux-ci seraient déversés dans le cytoplasme où ils assureraient la synthèse des protéines né cessaires à la différenciation de la cellules
Cette hypothèse de travail simple, qui a été proposée par BRACHET en 1962, est actuellement adoptée aussi par HAMMSRLING et ses élèves
5
1.5» Les relatioriK nucléoc^toplae’ii.icjues,
Nous avons vu plus haut que le noyau primaire augmente con sidérablement de tailla au cours de la croissance végétative de l'al gue, sans toutefois se diviser (HAMliERLING, 1963)»
A un moment donné, cependant, le gros noyau végétatif se fragmente en un très grand nombre de noyaux fils.
Ce phénomène doit comporter sans doute une réplication rapide et assez importante du DNA nucléaire. Ce sont probablement des facteurs cyto plasmiques qui sont impliqués dans la régulation de la synthèse du DNA nucléaire. En effet, HAhalEHLING a montré qu'il suffit de couper la tige d'une façon répétée pour empêcher le noyau primaire de se diviser (cf. HAIihERLING, 1963)* ün tel traitement, qui provoque une réduction très importante du volume du cytoplasme et du noyau, empêche la répli cation du DNA nucléaire de s'amorcer.
D'autre part, nous savons que, si on greffe un chapeau âgé sur une tige jeune, le noyau primaire de cette dernière se divise.
Il serait extrêmement intéressant de connaître la nature chimique de ces facteurs cytoplasmiques inconnus. Le noyau, d'autre part, exerce un contrôle négatif sur le cytoplasme : BRACHET, CHAIITRrDÎNE et VANDER- HAEGHE (1935) observé que la synthèse des protéines est, initiale ment tout au moins, plus rapide dans les fragments anucléés que dans les autres.
La régénération, de même que la synthèse du DNA cytoplasmique (HSILPORN POHL et BRACKET, I966) semblent également être initialement stimulées
chez les fragments anucléés.
Tout se passe donc comme si l'enlèvement du noyau supprimait certains mécanismes de contrôle, qui répriment normalement la synthèse des protéines et des acides nucléiques et qui empêchent la morphogénèse (formation du chapeau) de débuter.
Nous examinerons ci-dessous l'action du noyau sur la synthèse des ma cromolécules cytoplasmiques,
"i.k. Synthèse du DNA.
Dès 1958, BRACIÎET a montré, par autoradiographic, que les fragments anucléés d'Acetabularia incorporent activement la thymidine
--L
6
sait évidemment, dès ce moment, le problème de la présence éventuelle de DNA dans ces organites cytoplaemiquea et de sa réplication possible en l'absence du noyau.
Des dosages, effectués jiar une méthode fluorométrique, sur des chlo- roplastes isolés à partir de fragments anucléés, ont permis, plus tard, à BALTUS et BRACHET (I963) de mettre en évidance la présence de faibles quantités de DNA dans les chloroplastes. ün résultat jsembljàble a .été ob tenu simultanément par GIBOR et IZAWA (1963)»
C'est à la même conclusion qu'est arrivée ensuite de VITRY (196^), qui a démontré, par autoradiographie, une fixation d'actinomycine - C dans les fragments anucléés. Plus récemment, la présence de DNA dans les chloroplastes d'Acetabularia a été montrée, au microscope électro nique, par PUISEÜX - DAO et coll. (1967) et par WZRZ et KELLNER (I968,
a et b).
Par des techniques d'ultracentrifugation en gradient de CcCl, GRjrI£>T et coll. (1967) ont pu établir la présence de DNA, non seulement dans les chloroplastes d'Acetabularia mais aussi dans leurs mitochoadrieso
Les DNA des chloroplastes et des mitochondries auraient une densité de 1,704 g/ml et de 1,7l4 g/ml respectivement.
Le DNA mitochondrial a été étudié aussi par NETRAiVALIo Cet auteur a montré qu'il est particulièrement sensible aux effets des radiations gamma du ^^Co (NSTRAWALI, communication personnelle ) o
Puisque les chloroplastes et les mitocnondries des fragments anucléés contiennent du DNA et puisque ces memes fragments incorporent de la thymidine -'H (BRACHET, 1958), une question particulièrement intéressainte se pose: les chloroplastes et les mitochondries peuvent- ils se multiplier en l'absence du noyau?
La réponse est, sans aucun doute, affirmative, du moins en ce qui con cerne les chloroplastes. En effet, en l'absence du noyau, le nombre des chloroplastes augmente (SHEPHARD, 1965)» Cependant, leur multi plication est ralentie par rapport aux fragments nucléés. Il semble donc qu'un facteur d'origine nucléaire soit nécessaire pour assurer une multiplication normale des chloroplastes.
7.
noyau, on doit s'attendre, en px'incipe, à ce qu'ils puissent réaliser, de façon autonome, la synthèse de tous leurs constituants : DHA, RNA, protéines, lipides, glucides, pigmente»
UEILPORN - POKL et BRACIï£T ('!966) ont montré qu'une synthèse nette de DNA se produit effectivement en l'absence du noyau cellulaire en une semaine environ, la teneur en DNA double chez les fragments anucléés.
On constate, paradoxalement, que l'enlèvement du noyau stimxtle, initia lement au moins, la vitesse de la synthèse du DNA cytoplasmique. On doit en conclure que, si la synthèse du DNA cytoplasmique peut se faire d'une façon autonome, elle est cependant influencée par le noyau
1.5« Synthèse de RNA.
On sait, depuis plusieurs années, que les fragments anucléés d*Acetabularia sont le siège d'une synthèse nette de RÏIA (DRâCHST, CHANTRENNE et VANDERHAEGHE, 1955).
Cette synthèse est même initialement plus rapide dans les fragments anucléés que les nucléés. Cependant, elle diminue fortement par la suite. Ces premiers résultats ont été confirmés par plusieurs auteui's (NAORA, NAORA et BRACEET, I96O; SCHV/EIGER et BREÎ-iSR, 196I; GCHiVEIGER et collo 19Ô7; BALTUS et coll» 1968)0
La plus grande partie du RNA cytoplasmique synthétisé a été attribué aux chloroplastes, sur la base d'expériences effectuées soit sur des plantes entières (NAORA, NACRA et BRACHET, 196O; SCîfNEIGER et coll. 1967* DILLARD et SGH'.VEIGER, 1968) soit sur des chloroplastes isolés (SCHWEIGER et BERGER, 1964; BERGER, 1967)0
Tout récemment, BALTUS a observé que, comme le DNA, le RÎ'îA total peut doubler en une semaine environ dans les fragments anucléés (BALTUS, résultats non publiés).
8
(GOFFEAU et BRACHET, 1965; BERGER, 196?). La synthèse du RRA est inhibée si les chloroplastes sont traités in vitro par 1'actinoaycine, ce qui suggère que le DNA des ciiioroplastes pourrait servir d'aiaorceur pour la synthèse de leur propre Rl-fAo
La nature du RNa synthétisé in vitro a été étudiée par BERGER (1967)0 Elle a montré, par des ultracentrifugations en gradient de saccharose, que les chloroplastes, outre le RNA ribosomial (r-RNA) synthétisent probablement aussi du RIJA de transfert (t-RNA).
Si le DNA chloroplastique peut être transcrit in vitro, il serait possi ble que même du RNA messager (m-RNA) chloroplastique soit synthétisé dans telles conditions o Que ceci soit bien le cas, est suggéré par le fait que 1’actinomycine D inhibe in vitro l'incorporation des acides aminés dans les protéines ciiloroplastiques (GOFFEAU et BRACHET, 1965)0 On se trouverait donc en présence d'une synthèse protéique dirigée par le DNA chloroplastique, par l'intermédiaire de molécules de m-RNA syn thétisées de novo.
In vivo, une synthèse de m-RNA semble se produire aussi en l'absence du noyau cellulairco JANOV/SEI, (I96ô),en effet, a mis en évi dence la synthèse de polyribosomes dans des fragments anucléés. Si les algues anucléées sont laissées auparavant pendant kS heures à l'obscu-*
■X
rité, puis incubées à la lumière en présence d'uridine la radio activité incorporée dans les polyribosomes peut augmenter d'une façon très importante,
Il se pourrait qu'un tel traitement des algues stimule l'activité de la RNA - polymérase chloroplastique.
Si les RNA ribosomiaux chloroplastiques continuent à être synthétisés en l'absence du noyau cellulaire, les RNA des vrais riboso mes cytoplasmiques semblent, au contraire, dépendre très étroitement de sa présence (BALTUS et coll, 1968)0
Ces auteurs ont, en effet, constaté une disparition plus ou moins com plète des r-RNA cytoplasmiques à la suite de l'anucléation. La composi tion en bases des r-RI\A cytoplasmiques a été comparée, par les mêmes auteurs, à celle des r-RNA chloroplastiques: les deux compositions se sont révélées être différentes.
9.
guanine et de la cytoaine (G + C = 55 a), les r-RNA cytoplasniques sont
exceptionnellement riches en uracile (38 %). Cette différence pourrait s'expliquer en supposant que, chez Acetabularia, tout comme chez les cellules animales (iIaDRK, 1968), les r-IitîA cytoplasmiques seraient syn thétisés dans le nucléole <>
Cependant, on a constaté avec surprise que la composition en bases du RNA nucléolaire ressemble à celle du DNA plutôt qu'à celle du r-RNAo Le RNA du suc nucléaire, par contre, ressemble très fortement au RNA des vrais ribosomes cytoplasmiques (BALTUS et coll., I968). On ne connaît pas les raisons de cette situation particulière. Une étude des RNA extraits à partir des noyaux isolés (et éventuellement de leurs nucléoles) devrait permettre de résoudre ce problème. On sait, depuis longtemps déjà, que la noyau incorpore activement de l'uridine -^H et qu'une radioactivité importante s'accumule ensuite à la pointe de la tige (OLSZSWSKA et BRACHET, 1961). Il serait extrêmement intéressant de savoir si cette radioactivité correspond, au moins en partie, au m-RNA stable, dont l'existence a été suggérée par BRAGHET dès 1982
(cf. BRACHET 1962 et I965).
1.6. Sj’nthèse des protéines,
BRACHET, CHANTRENNE et VANDERHAEGHE (1955) ont montré que les fragments anucléés d'Acetabularia sont capables d'effectuer une synthèse nette de protéines. Parmi celles-ci se trouvent plusieurs enzymes, tels que la catalase, (BR-^CilET et CR(\NTREliNE, 195"'; CHANTRENNE, BRACHET et BRYGIER, 1953; VANDERIUEGHE, 195^), l'aldolase (BALTUS, 1959), l'invertase
(KECK et CLAUSE, 1958), la phosphorylase (CLAUSE, 1959), la phosphatase acide (KECK et CLAUSE, 1958^ .HARRIS, 1964; SPENCER et HARRIS, 1964; TRIPLETT, STSEÎ^S-LIEVENS et BALTUS, 1965), et l'uridine-diphosphateglu- cose 4'-épimerase (ZETSCHE, 1966).
OLSZEWSILa et BRACHET (196I) ont montré, d'autre part, à l'aide
de méthionine S, que certaines protéines sont synthétisées dans le noyau et migrent ensuite vers la pointe de la tige. Ces observations semblent en bon accord avec celles de WERZ (1959)* Cet auteur a établi, par des méthodes cytochimiques, que la pointe de l'algue contient,
réali-10.
satlon de la morphogénèee.
Il a été montré aussi qu'une synthèse ordonnée des protéines est nécessaire à une différenciation normale de l'algue (BRACHET, 196J) lorsqu'on traite les algues par des inhibiteurs classiques des synthèses protéiques (puromycine, cycloheximide), on observe un arrêt de la régé nération et de la morphogénèse tant cJiez les fragments nucléés que les anucléés.
Cet effet, qui est réversible pour les fragments nucléés et irréversible pour les fragments anucléés, était inattendu, en raison de la réversibi lité de l'action de 1'actinomycine sur les fragments anucléés. Il se peut que, comme il l'a été montré tout récemment pour les plantes supé rieures (IHGLE, 1968 a et b), les inhibiteurs des synthèses protéiques finissent par atteindre également les synthèses des i?ÎIAo Une autre ex plication possible est que, en l'absence des synthèses protéiques, les RNA accumulés dans les fragments anucléés soient rapidoment dégradés et que par conséquent la cellule ne soit plus capable d'effectuer les synthèses nécessaires à son développement. On sait, en effet, que la puromycine provoque la dissociation des polysomes des réticulocytes
(COLOilBO et collo, I968); il se pourrait fort bien que, en l'absence du noyau, ces polysomes ne puissent plus se reconstituer.
1.?o Conclusions.
Il semble désormais clair que les organites cytoplasmiques (chloroplastes, mitochondries), qui sont doués de continuité génétique, jouissent d'une large autonomie vis-à-vis du noyau.
Ceci explique pourquoi, chez Acetabularia, une synthèse nette de DNA, de RNA et de protéines est possible en l'absence du noyau.
Fig. 1. Acetabularia niediterranea .
a) Algues cultivées au laboratoire.
à gauche : algue portant un chapeau complètement développé.
à droite : algue dichotomique avec 2 chapeau murs, remplis de cystes.
b) Algues provenant de la mer (île d*Ischia).
Ces algues sont fixées sur les rochers par leurs rhizoïdes. Elles possèdent des tiges et des chapeaux calcifiés et sont recouvertes de plantes épiphytes. Leur morphogénèse est, cependant, normale.
Fig. 2O Cycle biologique d'Acetabularia nediterranea .
1) Zygote O
2) Algue très jeune . 3) Algue de 0,05 cm.
4) Algue présentant un siphon axial déjà bien développé ( 0,05 - 0,3 cm ) .
5) Algue avec deux verticilles de poils ( 0,5 ~ "i cm), 6) Algues avec plusieurs verticilles de poils. La for=>
nation du chapeau débute ( 3 ” ^ cm ). 7) Aigus possédant un jeune chapeau . 8) Algue possédant un chapeau adulte .
9) Migration des noyaux secondaires dans les loges du chapeau.
10) Formation des cj'-stes dans les loges du chapeau . 11) Cyste contenant des noyaux et des organites cellu
laires .
12) Ouverture du clapet d'un cyste et mise en liberté des gamètes ( ou des zoospores ).
13) Gamètes .
Fig. 3» Cystes d*Acetabularia mediterranea .
Cystes mûrs isolés d'algues provenant de la mer ( Ile d'Ischia , Naples ).
La forme ovoïde des cystes est contrôlée par le noyau secondaire ( '.VESZ ,1968,a ), probablement par l'intermédiaire des substances norphogénétiques, qui pourraient correspondre à des RNA messagers
(m-RNA) (vVERZ,1968,b ).
La longueur et la largeur moyennes des cystes mesurent 163 et 100 ^ respectivement .
11.
CHAPITRE II.
II. MATERIEL ET 1ÎETH0DE3.
2.1. Culture des algues en anucléation.
Les algues, Acetabularia mediterranea, sont cultivées selon la méthode décrite par LATEUR (1965), en faisant alterner 12 heures de lumière (I50O lux) 12 heures d'obscurité.
Le milieu de culture est composé d'eau de mer additionnée de nitrate de sodium (0,1 g/l), de phosphate bisodique (0,02 g/l) et d'une décoc~ tion de terre concentrée (2,5 ml/l).
Des analyses effectuées à l'aide d'un analyseur d'acides aadués Beck- man ont montré que la décoction de terre contient pratiquement tous les acides aminés courants(Fig. 4 et 5)0
La méthode de culture utilisée ne fournit pas des algues ab solument stériles. Cependant, des précautions sont prises pour mainte nir le niveau des contaminants le plus bas possible.
Les fragments anucléés sont obtenus en coupant le siphon axial au I/5 basal.
Ces fragments sont utilisés 48 heures après la section.
2.2. Fractionnement subcellulaire.
Des lots de 1000 algues entières ou anucléées sont homogénéisées dans 10 ml. de tampon à l'acétate 0,01 M (pH 5i0)» additionné de glucose 0,54 M, d'éthylène diamine tetracetato de sodium (EDTA) 0,001 M, do naphtalène disulfonate (NDS) 1 mg/ml et de polyvinysulfate (PVS) 100/Ig/ml (Milieu A.)
L'homogènat est filtré sur de la soie à bluter et centrifugé 2 min. à 70 g, afin d'éliminer les parois cellulaires.
12.
2.3» Extraction du RNA total»
Des lots de 500 à 1000 algues sont coupées en do petits fragmenta, à l'aide de ciseaux, dans le milieu A, afin d'obtenir une meilleure et plus rapide homogénéisation. Elles sont broyées dans un homogénéiseur conique en verre»
A l'homogénat, on ajoute du dodécylsulfate de sodium (SDS) jusqu'à une concentration finale de 1 % et on procède à l'extraction du RNA
total selon la méthode mise à point par BALTUS et i^UERTIER (1966). Le PVS, introduit par FELLING et VJILEY (1959)» semble offrir une très bonne protection du RNA pendant l'extraction à pH 5»0 (COCUCCI et STURANI, 1966)»
Les acides nucléiques, précipités par 2,5 volumes d'ethanol froid, sont récoltés par centrifugation. Le culot ainsi obtenu est dissous dans 2 ml de NaCl 0,01 M contenant 50 \xe/ral de PVS»
Cette solution est portée à une concentration finale de 2 M en NaCl par l'addition de 2 ml de NaCl 4 M et elle est laissée à 4®C pendant la nuit. Ce traitement est indispensable pour obtenir, d'une façon reproductible, des préparations de RNA ayant des profils comparables» Le RNA précipité est récolté par centrifugation, puis dissous dans 0»3 eQ. de tampon à l'acetate 0;01 M, additionné d'ELî.‘» 0,001 M et de
10 [ig/ml de PVS Qiilieu B.)
2.4. Extraction du
Les culots de chloroplastes ou de mitochondries sont mis en suspension, très rapidement (1 min»), dans le milieu A à l'aide d'un appareil
Vortex»
Les fractions chloroplastique et mitochondriale ainsi préparées et la fraction cytoplasmique (surnageant) sont additionnées do SDS (l %
concentration finale) et extraites selon la méthode déjà décrite pour le RNA total»
•ï;
2.5. Extraction du lîNA des gai'£Î2iii®s_^0__S_et_J0^S.
T
(15 - 30 %) est déterminée par comptage de la radioactivité acido- insolubla contenue dans 20 lil de chaque fraction de 2 gouttes. Les pics de plusieurs gradients sont rassemblés et le RNA est ex trait, en présence de RHA d'Acetabularia non marqué, selon le pro cédé déjà employé pour l'extraction du RNA total»
2.6. Extraction du RITA du foie de lapin.
Le RNA du foie de lapin est extrait selon la méthode décrite par HIATT (1962). Il est dissous dans le milieu B et conservé à - 30® C jusqu'à son utilisation,
T
2.7. Extraction du RNA -'"H d'Escherichia coli.
3
Le RNA d'Escherichia coli, marqué à l'uridine - H, est extrait selon la méthode employée pour l'extraction du RNA des fractions subcellulaires d'Acetabularia,
2,8. Extraction du RNA des micro-organismes contaminants.
Plusieurs litres d'un milieu de culture, dans lequel les algues ont été cultivées pendant 2 à 3 eemaines, sont centrifugés à 12.000 g, L'examen au microscope optique montre que les culots ainsi obtenus sont composés, en grande partie, de poils provenant des verticilles morts, et d'éléments rassemblant à des micro-organismes.
Les culots sont mis en suspension dans le milieu A et le RNA est extrait suivant la méthode décrite au paragraphe 2«3o
2.9. Isolement et purification des ribosomes chloroplastiques d' Acetabularia,
14.
Les chloroplastes sont sédiaentés pai' une centrifugation de 5 lûino à 1200 g. Ils sont î-nsuite homogénéisés avec un homogénéiseur en teflon dans 5 tampon Tris - HCl 0,01 H (pH 7*4) additionné de KCl 0,01 M, d'acétate de Mg 0,01 M, de déoxycolate 0,5 %* de Lubrol (impérial Chemical Industries, Ltd) 0,5 % et de Triton-X-100 (Rohm and Haas, Inc») 5 /»• (Milieu D.)» L'homogénat est centrifugé pen dant 10 min,, à 16.000 r.p.m. dans le rotor SS 34 de la centrifugeuse Servall RC-2.
Le culot, qui contient les débris de chloroplastes et les polysaccha rides de réserve, est éliminé. Le surnageant, qui contient les poly
ribosomes et les ribosomes, est centrifugé pendant 2 heures à 39*000 r.p.m., dans des tubes de 2 ml, dans le rotor 40 de la centrifugeuse Spinco L 50. Les culots sont rassemblés, remis en suspension dans le milieu D et récentrifugés pendant 2 heures à 39*000 r.p.ia.
Le culot des ribosomes est remis en suspension dans JOO |.il de milieu D et déposé sur un gradient (4,8 ml) de saccharose (I5 “ ?0 %), dissous dans un tampon Tris-HCl H (pH 7»4) et additionné de KCl 0,01 M et d'acétate de Ilg 0,01 M.
Le gradient est centrifugé pendant 3 heures à 39*000 r.p.m. dans le rotor SW 50 d'une centrifugeuse Spinco L 50* Des fractions de 2 goutte sont récoltées, en perçant le fond des tubes, dans 3OO 1J.I de tampon Tris - HCl (pH 7*4) additionné d'acétate de Mg 0,01 M et de KCl 0,01 H (Ililieu E).
2*10. Isolement des ribosomes, marqués à 1'uridine-''H, d'un horaogénat total.
Des lots de 20 à 50 algues entières ou anucléées sont incubés à 20 - 22® C et à la lumière (15OO - 2000 lux) dans 1 - 2 ml de milieu de culture stérile (LaTKUR, 1963) contenant de l'uridine -3jj (25 - 100 |iC/ml; Act.spéc.: 3330 ou 5OOO mC/nK; The Radio Chemical Centre, Amersham, England).
Le temps d'incubation est compris entre I5 min. et quelques heures. Les algues sont ensuite lavées dans de l'eau de mer,
5 nin. dans une aicrcfuge BeckEan (S^CO g) et le surnageant (jh JCX) fil) est déposé sur un gradiant ml) Üe saccharose (15 - 30 %).
Ce gradient est centrifugé pendant 3 iioures à 37*500 r.p.m. dans le rotor SW 50 de la centrifugeuse Spinco L 5O0
30 à 40 fractions de 2 gouttes sont recueillies en perçant le fond des tubes. Chaque fraction est laissée à 4® C pendant au moins 30 mino avec 1 ml d'acide Trichloacétique (TCA) 5i5 % et 100 |i,g d'albumine bovine. Les précipités sont recueillis par filtration sur des filtres Millipore (HA, 0,45 pi ) et lavés 3 fois successivement par 5 ml de TCA 5,5 % froid. Les filtres sont ensuite séchés pendant 2 heures à 80“ C et leur radioactivité est mesurée dans un compteur à scintillation liquide (Nuclear Chicago ou Tri-Carb Packard) (voir paragraphe 2.1?).
2.11. Isolement et fractionnement_des ribosomes chloro]3lastique.3_et non-chloroplastiques, marqués à l'uridine -^H.
Les algues sont incubées dans les conditions décrites au paragraphe 5 2.10., dans 1 - 2 ml de milieu de culture contenant de l'uridino - Ho Elles sont lavées à l'eau de mer, essuyées sur papier filtre et homo-«> généisés dans 0,3 ~ 0,7 ml de tampon Tris - HCl (pH 7*4) additionné de glucose 0,54 M, de KCl 0,01 M et d’acétate de Mg 0,01 M (Milieu F.) Les chloroplastes sont sédimentés par une centrifugation de 5 min. à la microfuge Beckman (85OO g). Le culot de chloroplastes est homogénéi sé dans 300 pi de molieu D et déposé, ainsi que le surnageant
( = fraction non-chloroplastique), sur un gradient (4,8 ml) de saccha rose (15 “ 30 %)•
Le gradient est centrifugé pendant 3 heures à 37.300 r.p.m. dans le rotor SW 5O0
2.12. Isolement_des ribosomes d'Escherichia coli.
en suspension dans un tarcpon Tris >- EL'l (pH 7,4) contenant de l'acétate de Mg 0,002 M. Ce traiteieent dissocie! partiellement les ribosomea de telle façon qu'on obtient une population mixte de ribosomes 70 S et de Bubunités ^0 S et JO G.
2.1Jo Isolement des ribosomes des micro~organisnies contaminantes.
Les micro-organismes contenus dans 350 ml de milieu de culture
conta-■2
miné sont incubés en présence d'uridine -''E (20 [i.C/ml) pendant 4 heu res. t'e'irs ribosomes sont extraits par la méthode décrite au paragraphe 2
.
10.
2.14, Traitement du RNA et des ribosomes gar la RNAse,
Dans des expériences de contrôle, le RNA-'"H d'Acetabüi.aria est traite par 30 - 50 [ig/ml de RNAse (RNAse pencréatique, Sigma) pendant JO niin. à 25® C, avant d'être centrifugé sur gradient.
Les ribosomes, par contre, sont traités par de la RîTAse à une concentration beaucoup plus faible (0,08 - 0,05 |tg/ml) pendant 30 min. à 4® C. Dans ces conditions les polyribosomes sont transformés en monosoraes (JAIJÜV/SKI, 1966).
La RNAse reste au sommet du gradient lors de la centrifugation (HSIAO, 1968). Ce fait pourrait expliquer, au moins en partie, pourquoi la particule 30 S, qui sédimente dans une zone voisine du sonunet du gra dient est plus dégradée par la RI^Ase que la particule 50 S, plus lourde
2.15. Analyse du RNA d'Acetabularia à Ia_centrifugeuse_anal2ti2ue.
Le RNA d'Acetabularia, obtenu par la méthode décrite au paragraphe 2.3« est centrifugé dans le rotor AN/D d'une centrifugeuse analytique Spinco Hodel E, munie d'optique Schlieren (angle à 70®; vitesse 59-780 r.p.m.;
temps entre 2 photos successives : 4 min.; temp. 20® C.).
17
2.16. Microscopie élGctrû.nique »
Afin de contrôler la pureté des fractions subcellulaires isolées des algues, les culots de chloroplastes et des mitochondries ont été ob servés au microscope électronique, par la méthode décrite par GRivEN et collo, 19670
2.17» Mesure de la radioactivitéo
a) Filtre Milliporeo
Les filtres J séchés à l'étuve (2 heures à 80* C), sont comptés dans 10 ml d'une solution scintillante obtenue en dissolvant 5 g de 2,5 - diphenyl - oxazol (PPO) et 0,5 g de 2,2' - p-phenylen-bis (4-methyl-5-phenyloxazal) (POPOP) dans 1000 ml de toluène pour chromatographie O
b) Gradients de saccharose»
Les fractions successives (chacune de 2 gouttes) d'un gradient de saccharose de 5 à 20 % sont comptées dans 10 ml d'une solution scintillante, ayant la composition suivante ; 60 g de naphtalène, 4 g de PPO, 0,2 g de POPOP, 20 ml d'éthylène glycol, 200 ml de méthanol et 1000 ml de dioxane (d'après BRAY, 156O, modifié )o
Nous avons observé que l'efficacité du comptage ne varie pratiquement pas ppur des concentrations en saccharose allant de 5 à 30 %,
2.18. Mesure de la densité ogtiqueo
La densité optique à 260 m^, des différentes fractions d'un gradient est mesurée, après dilution par 1 ml d'eau bidistillée, à l'aide d'un spectrophotomètre Beckman DU ou d'un spectrophotomètre Carjo
Figure 4 Acides arainés d'un extrait de terre
Figure 5
( terre de Bruxelles ), élues à pH 3*25.
CKAPIÏRS IIÏ
/
IIIP R^ÜLTATS. • t / 3.1. RI^A d* Acetabularia» / i3.1.1. SNA des algues entlèreso
Le RNA total, extrait d'algues entières et précipité par du NaCl 2 M à froid, sédimente dans un gradient de saccharose de 5 à 20 % en deux pics, qui ont à peu près la œêae hauteur (Fig.6, a)« Le traitement par le NaCl 2 M à froid permet de sepérar le RNA ribosomiaJ. (r-RNA) du RNA soluble (s-RNA)o Dans ces conditions, le r-RNA précipite au fond du tube, le s-RNA reste, par contre, en solutiono
Le même traitement avait été utilisé avec succès pour séparer le r-RNA du s-RNA d*Arabidopsis thallana (BONOTTO et JACOBS, 1968). Une augmen tation de la concentration en NaCl de 0,1 à 0,2 ou 0,3 M dans le gradien ne modifie pas le profil de sédimentation du RNA (Fig.6, b)« Un profil de sédimentation très semblable pour le RNA d*Acetabularia avait été obtenu précédemment par d'autres auteurs (BALTÜS et *-iRTô.P*R, 19Co)o
Nous nous sommes demandé si le rapport inhabituel d'environ 1 entre les surfaces des deux pics du r-RNA ne pourrait pas être dû à u- ne éventuelle dégradation du r-RNA lourd en r-RNA léger.
Pour vérifier cette hypothèse, nous avons préparé les r-ldlA-^H lourd et léger d'Acetabularia et nous les avons réextraits en présence d'un homogénat d'algues entières non marquées.
L'examen, par ultracentrifugation en gradient de saccharose, du r-RNA
•Z
total ainsi obtenu a montré que le r-RNA-'^H lourd n'est pas dégradé
■Z , T ,
pendant l'extraction en r-RNA-'^H léger. Le r-RNA-'^H léger ne semble pas non plus subir de dégradation importante au cours de 1'extractiono Bien que nous ne pouvions pas exclure formellement une éventuelle
dé-*7
tats semblent indiquer que le proïil caractéristique du r-RNA total d*Acetabularia ne j>eut pas provenir d’une dégradation au cours de 1 *extractiono
Nous avons observé que, chea les algues qui possèdent un chapeau adulte, le pic correspondant au r-RNA lourd disparaît presque complètement, pendant que celui qui correspond au r-Rl’fA léger ne semble que très peu affecté (Fig.7» a)»
5.1.2. RNA des al^es anucléées.
Gomme dans le cas des algues possédant un chapeau adulte, le RI'IA extrait des algues anucléées présente deux pics : celui qui correspond au r-RNA léger est nettement prédominant par rapport à l'autre. Ce phénomène s'accentue en fonction du temps après 1'ànucléationo (Fig.?, b; c).
3.1.5. RNA des fragments nucléés.
Le RNA extrait des fragments nucléés présente pratiquement le même pro fil de sédimentation, dans un gradient de saccharose, que celui des algues entières (Fig.7» d).
5.1.4» Constante de sédimentation du RNA d'Acetabt;lnria»
La constante de sédimentation du RÎ^A d'Acetabularia a été calculés par deux méthodes différentes :
a) par ultracentrifugation à la centrifugeuse analytique (Fig.8, a) et b) par cosédimentation, soit de r-RNA non marqué d'Acetabularia avec du
TC
r-RNA-^H d'Escherichla coli (25 S et I6 S), soit de r-RNA-'H d'Ace- tabularia avec du r-RNA non marqué de foie de lapin (28 S et 18 S)» (Fig.8, d).
Lee résultats obtenus par ces deux méthodes ont montré que les constantes de sédimentation des r—RNA lourd et léger d * Acetabularia sont de 25 S et de 16 S respectivement»
20.
(KURLAIID, i960). Nous verrons plue, loin, que ces r-Fa^A-'^H synthétisés pendant un temps bref, sont, très probaVilement, de nature chloroplas- tique,
3.1.5* raiA des fractions subcellulaires,,
Le RNA extrait des chloroplastes isolés (Fig.S, b) présente le même profil de sédimentation que le RUA total (Fig.9» &)» tant chez les al~ gués jeunes que chez celles qui possèdent un chapeau adulte. Ce fait n*est pas surprenant, puisque nous Savons depuis longtemps (NAORA, NAORA et BRACIIET, 1960) que 80 % environ du RIU d*Acetabularia est localisé dans les chloroplasteso
Le RNA extrait des mitochondries isolées (Fig.8, c) ou du cytoplasme (Fig.9, b et c) présente, par contre, un profil de sédimen tation classique: le rapport entre la surface du pic lourd et celle du pic léger est de 2«1 au lieu de 1 : 1 comme dans les chloroplattesc
Une cosédj.aentation des r-RNA mitochondrial et cytoplasmique d*Acetabularia avec du r-RNA-'^H d'Escherichia coli (23 S et 16 S) nous a permis d'établir leurs constantes de sédimentation approximatives : a) r-RHA mitochondrial ; 25 3 et 1? S.
b) r-RNA cytoplasmique : 28 S et 19 S.
La constante de sédimentation du r-RIFA cytoplasmique d'Acetabularia ressemble donc très fort à celle du r-RHA extrait des ribosomes 80 S des cellules animales. Ce fait suggère que les vrais ribosomes cyto plasmiques d*Acetabularia, qui sont synthétisés probablement dans le nucléole (VAN GANSEN et B0L0UKH2RE - PRESBURG, 1965), pourraient avoir une constante de sédimentation semblable »
3.1.60 Synthèse du RNAo
Lorsqu'on incabe des Acetabularia, pendant un temps bref (30 min.), dans de l'eau de mer additionnée d'uridine-'H, le RNA-^H néosynthétisé présente un profil de radioactivité qui ne correspond pas à celui de la
21
sième pic, moins bien défini et plus léger que le pic l6 S«
Ceci s'observe ta:ït poxur, les algues entières (Fig. 10, a) que pour les fragments anucléés (Fig.10, b).
Après des temps de marqiiage plus longs (4, 48, 96 heures), profil 1 de la radioactivité correspond de plus en plus à celui de la densité optique (Fig.10, c;,d). Après 4 jours de marquage, on observe une parfaite correspondance entre les pics de la radioactivité et
ceux de la densité optique, constitués respectivement par les r-KNA 25S et l6 S. Cependant, dans ce cas, le troisième pic radioactif, plus
léger que le pic l6 S, n'est plus présent (Fig.10, d). Les pics de radioactivité observés après des marquages courts ou longs sont entiè rement dégradés par la ribonucléase.
5.1.7. Sort du RHA - H meosynthétisé - Mise en évidence d'un PNA I5.S stable.
■X
Si des algues qui ont incorporé de l'uridine -"H pendant un temps bref sont reportées dans un milieu de culture non radioactif, pendant une période de une à plusieurs semaines, on observe une progressive dispa rition de la radioactivité liée au pic 25 S. Après I5 - 20 jours, ou plus, de report, on observe un pic principal de radioactivité, ayant une constante de sédimentation d'environ I5 3. Il est accompagné d'un
composant mineur ayant une constante de sédimentation d'environ 8 - 10 S Nous avons observé que le pic principal est associé aux chloroplastes. Ce phénomène s'observe tant chez les algues entières (Fig.11, a) que chez les algues aiucléées (Fig.11, b).
Le pic de radioactivité 15 S semble particulièrement stable. Il reste décelable même après plusieurs mois de report dans l'eau de mer
(Fig.11, c.)
Notons que ce pic est entièrement sensible à la ribonucléase et qu'il s'agit donc bien d'une variété de RNA.
Lorsque les algues marquées sont reportées pendant une di zaine de jours dans un milieu de culture contenant de 1'actinomycine D (20 |j.g/ml), on observe exactement le phénomène déjà décrit plus haut ;
X
22
le RNA 15 S n'est probablament pas synthétisé^ pendant le report,
■2,
-à partir de produits d.e dégradation des r~KNA -"'H 25 S et 16 S. Nous ne pouvons, cependant, pas exclure une synthèse d'un RNA insen sible à l'actinomycino (UOTTA et I965; RKVEL et HIATT,
CHROBOCZEK et CHERRÏ, I966; GIGOT, PHILIPPS et HIRTH, I968).
5.1.8, RNA des micro-organismes contaminants.
Plusieurs auteurs ont récemment attiré l'attention sur le fait que la présence de micro-organismes contaminants chez Acetabularia pourrait rendre difficile l'interprétation des résultats obtenus lorsque des précurseurs radioactifs sont utilisés (GREEN et coll., I967). Afin de savoir dans quelle mesure ces micro-organismes contaminants pourraient contribuer au profil de radioactivité observé lors d'un marquage de
-7.
courte durée des algues par l'uridine -"^H, nous avons effectué une étude de leur Rl'îA. Comme pour l'Acetabularia, le RKA total extrait
des micro-organismes contaminants sédimente en 3 pios différents cor'res- pondant respectivement au r-RNA lourd, au r-RNA léger et au s-RNAo
Cependant, lors d'un marquage de courte durée à l'uridine -"'H, à la différence de ce qui se passe pour Acetabularia, on observe une parfaite correspondance entre le profil de la radioactivité et celui de la den sité optique (Fig012, a).
En outre, les constantes de sédimentation, calculées par cosédimenta tion avec du r-RNA de foie de lapin (Fig.12, b), sont de 23 S, I6 S et
k S respectivement pour le r-RNA lourd, le r-RNA léger et le s-EITAo
Ces résultats montrent que le r-RNA de micro-organismes contaminants (2"^ S et 16 S) diffère de celui d'Acetabularia (25 S et 16 S)» Il n'est pas possible, toutefois, de distinguer aisément les r-RlIA - H bactériens
(23 S et 16 s) des r-RNA -^H extraits d'Acetabularia marquées pendant un temps bref (2-3 heures) à l'uridine (23 S et 17 S). Leur constante de sédimentation est, en effet, presque la même. Nous avons observé qu'il faut à peu près le même poids en micro-organismes contaminants qu'en algues pour atteindre la même radioactivité totale incorporée. Nous avons pu estimer ainsi que, dans nos conditions expérimentales, environ
1 % (au maximum 5 %) de la radioactivité totale incoi'porée pourrait être de nature bactérienne»
tabula-23.
rla ne peuvent pas influencer d’une façon importante les phénomènes observés. Cette conclusion est appuyée par les observations toutes récentes de DILLA?.D et SCHWEIGER (1968). Ces auteurs, lors d'expé riences de marquage par des précurseurs du RNA, n'ont observé, en effet, aucune différence entre des algues cultivées dans les mêmes conditions que les nôtres et des algues qui avaient été obtenues en culture stérile (BERGER, 1967).
3.2. RIBOSOMES d'Acetabularia.
3.2. 'l. Ribosomes non marqués chloroglastiques et_22n-chloro£lasti^ues
L'emploi des détergents (STÜTZ et NOLL, 19^7) nous a permis d'isoler les ribosomes chloroplastiques d'Acetabularia. Ils sédimentent,
dans un gradient de saccharose de 15 à 3O %, en trois pics différents (Fig.13) dont les constantes de sédimentation sont approximativement les mêmes que celles des ribosomes 70 S, 50 S et S, d*Escherichia coli.
Nous ne sommes pas encore parvenu à isoler des quantités appréciables de vrais ribosomes cytoplasmiques, bien qu'il soit
re-•Z
lativement aisé de les déceler par marquage à l'uridine -''H. Cet échec est dû, peut-être, au fait que les ribosomes cytoplasmiques pourraient être liés d'une façon particulièrement stable aux mem branes.
Ils seraient, dans cette éventualité, éliminés avec celles-ci lors des centrifugations.
3.2.2. Ribosomes marqués d'un homogénat tot^.
Déjà après un marquage à l'uridine -'H de courte durée (15 min.) on observe dans un horaogénat d'algues entières adultes, la présence de trois espèces différentes de ribosomes (Fig.l4, a), dont les con stantes de sédimentation sont de 70 S, 50 S et JO S respectivement. Les ribosomes 50 S et 30 S (pics II et III) sont beaucoup plus mar qués que les ribosomes 70 S (pic l). La particule 50 S contient essentiellement un RIIA -'^H 23 S (Fig. 14, b). La particule JO S
*2
pré-24.
eenco des pics de radioactivité 1? Ü et 23 S, que l'on voit sur les Fig.l4, a et b respectivement, est due, selon tonte probabilité, à une contamination croisée des ribosomes 50 S et 30 S entre euxo
3.2.3. Ribosomes i^ar2ués_chlorO£lastiques^en_non-chloroplaGtiques.
Comme dans le cas des algues entières (JANOWSKI, 1966), les fragments 7,
anucléés incorporent l'uridine dans 3 espèces différentes de ri bosomes (70 S, 50 S et 30 S), tant dans la fraction chloroplastique, que dans la fraction oon-chloroplastique. Si on traite les ribosomes non-chloroplastiques (Fig.l^» a) ou chloroplastiques ( Fi g. T 5 < 0 ) ps.r la ribonucléase, on observe une augmentation importante de la radio activité au niveau du pic 70 S (Fig.l^i b et d.). On doit en conclui'e que ce pic 70 S est constitué de monomères, qui sont présents presque entièrement associés sous la forme de polyribosomes.
Lorsqu'on omet le traitement à la ribonucléase, les polyribosomes, dans nos conditions expérimentales, sédimentent probablement au fond du gradient. Ceci expliquerait pourquoi nous n'avons pas obtenu de profils satisfaisants des polyribosomeso
Il est probable que les particules 50 S et ZO S marquées ne représentent pas, au moins dans le cas des marquage de courte durée, des sub-unités provenant de monocètres dissociéso En effet, loi’s d'un traitement par la ribonucléase, leur radioactivité n'augmente pas parallèlement avec celle des monomères. Nous avons observé, en outre, que le chloramphénicol inhibe préférentiellement la synthèse de la particule 50 S (Flgo'l6, a) ou celle de la particule 3O S
(Figol6, b), selon qu'une concentration de 200 |ig/ml ou de ^00 |J.g/ml de cet antibiotique est utilisée»
Ce fait ne peut être que difficilement expliqué par l'hypothèse que les particules 50 S et 30 S seraient constituées entièrement de sub- unités provenant d'une dissaciation des monomères.
3.2.4» Constante de sédimentation de6_ribosomes_marcjués_chloroplas- tigues et non-chloroglastigues.
en-25
viron que les ribosones non marqués (70 S, 50 S et 30 S respective ment) d'Escherichia col5- a). Ces mêmes ribosomes (Fin.l?» b) ainsi que les riboaorses non-culoroplostiques marqués ( Fi g. 17 i c ) ont, en outre, la même constante de sédimentation que les ribosomes chlo- roplastiques non marqués. Nous devons en conclure que les ribosomes
chloroplastiques et non-chloroplastiques marqués ont la même con stante de sédimentationo
Ce fait est plutôt surprenant, car nous avons vu plus haut que la con stante de sédimentation du RNA chloroplastique (25 S et l6 S) diffère de celle du RNA cytoplasmique (28 S et 19 S).
Cette contradiction manifeste ne pourra être résolue que lorsqu'on aura isolé et étudié les caractéristiques des ribosomes cytoplasmiques non marqués. Les ribosomes cytoplasmiques néosynthétisés pourraient, en effet, avoir une constante de sédimentation différente de celle des ribosomes cytoplasmiques mûrs accumulés par la plantée
5.2.5» Synthèse et stabilité des particules 50 S et JC S.
Nous avons vu plus haut (paragraphe 3*2.2.) qu'un homogénat total d'algues, entières ou anucléées, incubées pendant un temps bref (I5f30 min.) dans un milieu de culture contenant de l'uridine -''H, contient, à côté des polyribosomes et d'une faible quantité de mono- somes, deux particules marquées, ayant des constantes de sédimenta tion de 50 S et 30 3 respectivement.
La radioactivité liée à ces deux particules augmente considérablement quand l'incubation des algues dans l'uridine -"'H est prolongée jusqu' entre 2 heures à 2 jours (Fig.lS, a).
Si, à une incubation de brève (ou de longue) durée dans l'uridine -"H, fait suite un report des algues dans un milieu non radioactif, on observe une diminution progressive de la radioactivité des particules 50 S et JC S.
La radioactivité associée à la particule 50 S diminue,
Aprèe 20 jour environ de report, il ne reste plus que la particule 30 S, accompagnée d*un épaulement, à peine décelable, qui pourrait correspondre à la particule 50 S (FigolS, b).
Nous ignorons encore si le RNa particulièrement stable 15 S, qui est présent dans les algues au même moment (report de 20 jours^ est associé avec cette particule 30 S ou non.
26 O
3.2.6. Ribosomes marqués des micro-organismes contaminants.
Figure 6,ao RNA extrait des algues entières .
Figure 6,b. SNA entrait des algues entières,
Figure 7» a. RKA extrait d'algues entières possédant un chapeau adulte.
b. RNA extrait d'algues anucléées depuis 5 jours.
c. RNA extrait d'algues anucléées depuis 20 jours.
a.
b.
FIGURE 7
c.
d.
Figure 8,a. Ultracentrifugation analytique des RNA d'Acetabularia extraits d’algues entières.
Chaque photo a été prise tous les
k min. à la vitesse maximale
Figure 8,bo Fraction chloroplastique isolée d'algues entières, examinée au microscope électronique.
Microphotographie du Docteur Monique Boloukhère-Fresburg
Figure 8,c» Fraction mitochondriale isolée d'algues entières, examinée au microscope électronique
Microphotographie du Docteur Monique Boloukhère-Presburg
Figure 8,d Cosédimentation du RKA- H extrait 3
d'algues entières, incubées pendant 2 h en présence de 20 pCi/nl d'uridine-^H, avec du RNA de foie de lapin.
FIGURE 8, d
I
m {/) tn tn 00 CO oo rv «N ^ ^1
1
11
1
Figure 9»b RNA extrait des mitochondries des algues entières n*ayant pas encore formé leur chapeau.
Figure 9sc. RNA extrait du cytoplasme
Figure 10. Incorporation d • uridine-'^H dans des
algues entières et des fragments anucléés.
a) Algues entières, incubées pendant 30 en présence de 20 p,Ci/ml d'uridine-^H
b) Algi;es anucléées, incubées pendant 30 min en présence de 20 p.Ci/ml d'uridine~"^H.
c) Algues entières, incubées pendant 45h 30min en présence de 2 uCi/ml d'uridine.
(2 6 0 m p )
a.
b.
FIGURE 10
c
FracHon n* F rac lian n*
Figure 11, Expériences de chasse de la radioactivité instable *
a) Algues entières, incubées pendant 6 jours et 2h en présence de 2 jJ-Ci/ml d'uridine-^H, puis reportées pendant jours dans le milieu de
culture normal.
b) Algues ?inucléées,incubées pendant 6 jours et 21h en presence de 2 |iCi/ml d'uridine--^H, puis report^cspendant 17 jours dans le milieu de culture normal,
c) Algues entières, incubées pendant 24 h en présence
de 20 ^iCi/ml d'uridine-'H, puis reportées pendant 88 jours dans le milieu de culture normal.
d) Algues entières, incubées pendant 5h J>0 min en 3
Figure 12,a» RNA extrait des micro-organismes
contaninants les cultures d'Acetabularia.
Les micro-organismes contenus dans 1,4 1 de milieu infecté, ont été incubés pendant 3 h en présence de 11,45 uCi/inl d’uridine-^H.
17
Figure 12,bo Cosédimentation du RNA-^H extrait des micro-organismes, incubés pendant 5 h
Figure IJo Profil de densité optique, dans un gradient de saccharose, des ribosomes chloroplastiques d'Acetabularia
fraction n®
Figure l4 Incorporation d'uridine-^H dans les ribo somes d'algues entièreso
a) Particules d'un homogénat total, marquées par une incubation de 30 ®in en présence de TOO p,Ci/ml d'uridine-'^H
I particules 70 S II particules 50 S III particules 30 S
b) RNA de la particule 50 3 (pic II) marquée pendant h en présence de 25 liCi/ml
d'uridine-^H, cosédimenté avec du RNA carrier extrait d'algues entières. Le pic principal de radioactivité a une constante de sédimentation de 23 S,
c) RNA de la particule 30 3 (pic III^
marquée pendant 3 h en présence de 25 |iCi/ml d'uridine-^H, cosédimenté avec du RNA
Figure 15 Incorporation d’uridine-'^H dans les
ribosomes chloroplastiques et non-chloroplasti-ques,
a) Ribosomes non-chloroplastiques. Fragments anucléés, maintemis pendant 2 jours à l'obscurité, puis in cubés pendant 2 h à la lumière, en presence de 100 |iCi/ml d'uridine-'^H.
b) Même échantillon que a, traité pendant JO min à
k°C par 0,05 |-l£5^nil de RNAse „
c) Ribosomes ch3.oroplastigues. Plantes entières, in- ciibéos pendant 4 h à la lumière, en présence de 25 P-Ci/ral d'uridine-"^H o
Figure l6 Effets du chlorarn-phénicol sur l'incorporation d'uridine-^H dans les ribosomes non-chloro- plastiques des algues entièreso
a) Algues entières, incubées pendant k
•Z
présence de 25 |iCi/ml d'uridine-'^H prétra.iteir.cnt de 48 h par 200 (ig/ml chloramphénicol »
Particules cytoplasmiques 70 S (pic 50 S (pic II) et 30 S (pic III).
h en après un de
I), et
b) Même expérience, mais prétraitement de 48 h par
Figure I?» Constante de sédimentation des ribosomes marqués, chloroplastiques et non-chloro- plastiques .
a) Cosédimentation des ribosomes chloroplasti ques marqués avec des ribosomes 70 S, 50 S et 50 £ g'Sscherichia colio Algues anucléées, maintenues à l'obscurité pendant 3 h en
■X
présence de 50 |uCi/ml d ' uridine-'^K .
b) Cosédimentation des ribosomes non-chloroplasti ques marqués avec des ribosomes chloroplastiques non marqués.
Mime conditions expérimentales que a .
c) Cosédimentation des ribosomes chloroplastiques marqués avec des ribosomes chloroplastiques non-marqués .
FIGURE
/
•Z
Figure l8,a. Incorporation d'uridine-^H dans les particules d'un homogénat total d'algues entièreso
Algues entières, incubées pendant 2 h ou 44 h ■5
en présence de 10 |iCi/inl d'uridine-''^H.
Figure l8,b. Expériences de chasse de la radioactivité in= stable liée au ribosomes<>
Algues entières,incubées pendant 48 h en présence ■2
Figure 19» Incorporation d'uridine-'^H dans les ribosomes des micro-organismes contaminants les culture d'Acetabularia o
Les micro-organismes contenus dans J50 ml de milieu de culture vielli et infecté ont été récoltés par c-entrifugation et incubés 4 h
T.
27
CHAPITRE IV.
IV. DISCUSSION DES RL-:SULTATS.
^.1. RI^A d'Âcetabularia.
4.1.1. RNA total extrait des algues entières.
Acetabularia nediterranea, au stade utilisé au cours de ce travail (2-4 cm), possède plusieurs millions des chloroplastes (SHEPARD, 1965)* Nous savons que ces organites intra-cellulaires contiennent une grande partie (80 % environ) du RNA total de l'algue (NAORA, NAORA et BRACHET, i960). Il n'est donc pas surprenant d'observer que le RNA total d'Ace- tabularia possède le même profil de sédimentation que celui des chlo~ roplastes isolés. L'ultracentrifugation en gradient de saccharose permet de fractionner le RNA total en trois pics principaux; le RNA ribosomial lourd, le RNA ribosomial léger et le RNA soluble. Leurs constantes de sédimentation sont de 2> S, I6 S et 4 S respectivement. Des valeurs différentes (2& S et I8 S) ont été trouvées auparavant pour les mêmes RÎ^A (BALTUS et li^UERTISR, 1966).
Comme l'avaient déjà observé BALTUS et ^UERTIER (I966), les deux r-RNA non marqués d'Acetabularia sédimentent dans un rapport d'environ 1:1. Ce fait n'est probablement pas à imputer à la méthode utilisée pour l'extraction du RNA. En effet, les r-RI^A des cellules Hela, de même que ceux d'Escherichia coli K 12, extraits par la même méthode, sédimentent dans le rapport 2 ; 1, rapport habituellement
observé pour les cellules animales (GIRARD, PENKAN et DARNELL, 1964; PERRY, 1965; BERG et GOUTIER, 196?) et pour les bactéries (DI GIROLAlîO, HIKCKLEY et BUSIELLO, 1968).
