- - -
- - -
Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository
Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:
Pays, E. (1984). Bases génétiques de la variation antigénique chez les trypanosomes. (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.
Disponible à / Available at permalink : https://dipot.ulb.ac.be/dspace/bitstream/2013/213673/1/815f08be-374b-466c-bb91-3e5e129952b9.txt
(English version below)
Cette thèse de doctorat a été numérisée par l’Université libre de Bruxelles. L’auteur qui s’opposerait à sa mise en ligne dans DI-fusion est invité à prendre contact avec l’Université ([email protected]).
Dans le cas où une version électronique native de la thèse existe, l’Université ne peut garantir que la présente version numérisée soit identique à la version électronique native, ni qu’elle soit la version officielle définitive de la thèse.
DI-fusion, le Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles, recueille la production scientifique de l’Université, mise à disposition en libre accès autant que possible. Les œuvres accessibles dans DI-fusion sont protégées par la législation belge relative aux droits d'auteur et aux droits voisins. Toute personne peut, sans avoir à demander l’autorisation de l’auteur ou de l’ayant-droit, à des fins d’usage privé ou à des fins d’illustration de l’enseignement ou de recherche scientifique, dans la mesure justifiée par le but non lucratif poursuivi, lire, télécharger ou reproduire sur papier ou sur tout autre support, les articles ou des fragments d’autres œuvres, disponibles dans DI-fusion, pour autant que :
Le nom des auteurs, le titre et la référence bibliographique complète soient cités;
L’identifiant unique attribué aux métadonnées dans DI-fusion (permalink) soit indiqué;
Le contenu ne soit pas modifié.
L’œuvre ne peut être stockée dans une autre base de données dans le but d’y donner accès ; l’identifiant unique (permalink) indiqué ci-dessus doit toujours être utilisé pour donner accès à l’œuvre. Toute autre utilisation non mentionnée ci-dessus nécessite l’autorisation de l’auteur de l’œuvre ou de l’ayant droit.
--- English Version ---
This Ph.D. thesis has been digitized by Université libre de Bruxelles. The author who would disagree on its online availability in DI-fusion is invited to contact the University ([email protected]).
If a native electronic version of the thesis exists, the University can guarantee neither that the present digitized version is identical to the native electronic version, nor that it is the definitive official version of the thesis.
DI-fusion is the Institutional Repository of Université libre de Bruxelles; it collects the research output of the University, available on open access as much as possible. The works included in DI-fusion are protected by the Belgian legislation relating to authors’ rights and neighbouring rights.
Any user may, without prior permission from the authors or copyright owners, for private usage or for educational or scientific research purposes, to the extent justified by the non-profit activity, read, download or reproduce on paper or on any other media, the articles or fragments of other works, available in DI-fusion, provided:
The authors, title and full bibliographic details are credited in any copy;
The unique identifier (permalink) for the original metadata page in DI-fusion is indicated;
The content is not changed in any way.
It is not permitted to store the work in another database in order to provide access to it; the unique identifier (permalink) indicated above must always be used to provide access to the work. Any other use not mentioned above requires the authors’ or copyright owners’ permission.
NIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES
<VBORATOIRE DE CYTOLOGIE ET EMBRYOLOGIE MOLECULAIRES V
BASES GENETIQUES DE LA VARIATION
ANTIGENIQUE CHEZ LES TRYPANOSOMES
HESE D'^REGATIOj^DE LENSEIGNEMENT SUPERIEUR. 1984
UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES LABORATOIRE DE CYTOLOGIE ET EMBRYOLOGIE MOLECULAIRES
BASES GENETIQUES DE LA VARIATION
ANTIGENIQUE CHEZ LES TRYPANOSOMES ETIENNE PAYS
THESE D'AGREGATION DE LENSEIGNEMENT SUPERIEUR. 1984
^ fsUeàe. .ce^tèt
y^jtUÂA^ .^£4 yÔio^ /Jn/^xyr^eAita <9aL
yhi£4 d^lcy^^jeAcAi ^^CaUi *'y^L£XAjau-t.é^
^ ytô< aM.,^4^^ y»to^ c^e/L
<^oje. J^ ‘'caca ^ eJr "taTA ^ eU y’^xxjxt.
6Uinuji4tAji>*^ '’J.êM^- l^tiê. 444^. _
Ce travail n'est pas mon oeuvre. C'est avant tout celle de Maurice
Steinert, qui l'a conçue, sollicitée et pratiquement réalisée à travers moi.
Je ne peux que souhaiter encore de très nombreuses années d'une telle collaboration. C'est aussi l'oeuvre de chercheurs bien souvent plus dynamiques et compétents que moi. Je pense surtout à Monique Laurent et Suzanne Van Assel, à qui véritablement je dois beaucoup. Enfin, je tiens à dire combien je suis fier du "team trypanosomes" qui s'est constitué petit à petit au cours de ces années exaltantes, et qui, de près ou de loin, a aussi contribué au progrès des découvertes; ceux du passé, comme Michel Lheureux, Michèle Delronche et Martine Darville, et ceux du présent. Pascale
Paindavoine, Brigitte Dero, Michel Guyaux, Marie-France Delauw, Karin Delinte et Aline Van der Werf. J'ajouterai aussi nos collaborateurs de la VUB, avec qui les contacts, très nombreux, furent aussi fructueux
qu'enrichissants: Gaston Matthyssens, Frank Michiels et Peter Kronenberger.
Enfin, "last but not least", c'est un réel plaisir de souligner combien j'ai pu apprécier l'expertise, mondialement reconnue, de Nestor Van Meirvenne, Tony Vervoort, Eddy Magnus et Dominique Le Ray, de l'Institut de Médecine Tropicale à Anvers. Il n'est pas exagéré de dire que l'avancement rapide de nos recherches est essentiellement dû à la qualité du matériel expérimental que cette équipe nous a fourni. A tous, je formule non seulement de vifs
remerciements, mais aussi des voeux pour encore beaucoup d'amusement et d'excitation (intellectuelle) avec nos partenaires communs: les
trypanosomes.
Pour terminer, je tiens aussi à dire combien j'ai apprécié, tout au long de ma (déjà longue) carrière, l'intérêt, les encouragements et le soutien constant de Mr. Brachet: qu'il trouve ici l'expression très sincère de toute ma reconnaissance.
PRELIMINAIRES
Le but du travail est de mettre en évidence la tature des mécanismes génétiques qui contrôlent la variation antigénique chez les trypanosomes africains.
La présentation de la thèse» fruit de ce travail, est organisée comme suit:
-l'introduction générale est présentée dans le chapitre 1;
-les techniques et résultats sont présentés dans les articles publiés ou en voie de publication, dans les chapitres 2 à 7;
-la discussion générale est présentée dans les chapitres 8 et 9;
-les références sont présentées à la fin de chaque chapitre, ainsi qu'à la fin des articles; dans le chapitre 2, toutes les références sont à trouver dans les articles.
Abréviations ; -VSA = variant-specific antigen;
-VSG = variable surface glycoprotein;
-VAT = variable antigenic type;
-AnTAR = Antwerp Trypanozoon antigen répertoire;
-AnTat = Antwerp Trypanozoon antigenic type;
-ELC = expression-linked copy (of the antigen gene ) ; -BC = basic copy (of the antigen gene);
-kb = kilobase pair(s);
-mRNA = ARN messager;
-cDNA = ADN complémentaire de 1'ARN messager.
SOMMAIRE
1. Variation antigénique des trypanosomes africains; résumé des principales données du problème.
1.1. Cycle de développement du parasite 1
1.2. Variation antigénique et infection chronique 2
1.3. Modalités d'expression du répertoire antigénique 3
1.4. Nomenclature, clonage, conditions de culture et de récolte des
trypanosomes 4
1.5. Références 6
2. Analyse du mode d'expression de différents gènes d'antigènes de surface.
2.1. Clonage et caractérisation de deux séquences spécifiques
d'antigènes de surface 9
2.2. L'expression de différents gènes d'antigènes de surface est
liée à une duplication-transposition 29
2.3. La copie transposée du gène est la séquence transcrite 37 2.4. La copie transposée peut être plus étendue que la séquence
codante 41
2.5. L'étendue de la duplication-transposition peut varier pour un
gène donné, 57
2.6. Différentes copies peuvent être transposées dans un même "site
d'expression" télomérique. 71
2.7. Le mécanisme de duplication-transposition est une conversion
génique 73
2.8. Autre type d'activation génique: recombinaison réciproque
entre télomères? 87
2.9. Relation entre modes d'activation génique et d'expression
antigénique 111
3. Transcription des gènes d'antigènes de surface.
3.1. Le contrôle de l'expression de ces gènes est transcriptionnel 117
3.2. Evidences indirectes d'un épissage complexe du mRNA 117
3.3. Evidences dlTCCtes d^n épis¥age: mini-exon, intron (?) 135
3.4. Hypothèse d'un promoteur répétitif 145
3.5. Longueur du RNA précurseur hypothétique 146
3.6. Références
146
4. Répression de l'activité des gènes d'antigènes de surface.
4.1. Disparition de l'ELC dans la forme procyclique? 149
4.2. Répression de la transcription 150
4.3. Références 151
5. Structure de l'antigène de surface, déduite de l'analyse des gènes.
5.1. Peptide hydrophobe C-terminal 153
5.2. Conservation de séquences dans la région 3' terminale des gènes
d'antigènes de surface 159
5.3. Peptide signal 159
5.4. Modifications post-traductionnelles 160
5.5. Domaines de la protéine 160
5.6. Références 161
6. Evolution des répertoires antigéniques.
6.1. Evolution des familles de séquences spécifiques d'antigènes de
surface 165
6.2. Certains gènes sont plus stables que d'autres: hyperévolution
télomérique? 167
6.3. Les répertoires antigéniques de T. b. gambiense sont moins
variables que ceux d'autres sous-espèces 179
6.4. Application en épidémiologie 193
6.5. Le problème du vaccin 213
6.6. Références 213
7. Structure du génome des trypanosomes.
7.1. Le problème de la diploidie 215
7.2. Nombreux télomères: nombreux chromosomes 215
7.3. Fluctuations de la taille des télomères 216
7.4. Références 229
8. Résumé et discussion des observations principales.
8.1. Résumé 231
8.2. Discussion générale des caractéristiques de la conversion génique chez
les trypanosomes 232
8.3. Discussion des résultats principaux 232
9. Variation antigènique et réarrangements génétiques dans d'autres systèmes.
9.1. Discussion générale 279
9.2. Références. 283
1
1. Variation antigénique des trypanosomes africains; résumé des principales données du problème»
1»1. Cycle de développement du parasite.
Les trypanosomes sont des Protozoaires Zooflagellés de l'ordre des
Kinétoplastidés. Les espèces africaines de trypanosomes parasitent le sang de différents mammifères, provoquant des maladies graves telles que, chez
l'homme, la maladie du sommeil causée par T. b. gambiense et T. b.
rhodesiense; d'autre part, les espèces T. congolense, T. vivax et T. b. brucei sont pathogènes pour le bétail et rendent un quart du continent africain
impropre à l'élevage.
Le cycle de développement de ces parasites s'effectue en deux phases. Dans un premier hôte, une mouche du genre Glossina ("mouche tsé-tsê"), les
trypanosomes subissent une série de transformations qui se reflètent
morphologiquement au niveau de la mitochondrie et de la surface cellulaire;
d'une forme "procyclique", au début de leur développement dans l'intestin de la mouche, ils se transforment finalement en forme "métacyclique",
caractéristique des glandes salivaires de l'hôte (voir schéma, figure 1). Les
BLOODSTREAM FORMS (+»€)
SALIVARY GLAND EORMS
MtTACYCLIC ( + ve)
@(Basic antigen) (Antigenic
changes)
— ^
IN TSETSE FLY IN MAMMAL
Figure 1. Cycle de développement des trypanosomes africains (d'après Vickerman)
2
trypanosomes métacycliques sont seuls capables d'infester le système sanguin du second hôte, un mammifère. Probablement en guise de préadaptation, ils se recouvrent complètement d'un manteau compact constitué d'une espèce unique de glycoprotéine, d'un poids moléculaire voisin de 60.000 daltons. Les formes métacycliques sont transmises dans le sang du mammifère lors de la piqûre de ce dernier par l'insecte. La prolifération des trypanosomes dans le sang s'accompagne de modifications morphologiques du parasite: au début de leur croissance, les trypanosomes sont allongés (formes "long slender"), puis graduellement ils se raccourcissent, jusqu'à atteindre une forme trapue
("stumpy"), auquel stade les trypanosomes sont à la fo-is incapables de se diviser et susceptibles d'être transmis à nouveau à la glossine (figure 1).
1.2. Variation antigénique et infection chronique.
Le manteau de glycoprotéine dont se recouvrent complètement les
trypanosomes métacycliques persiste tout au long de leur développement dans le sang de l'hôte vertébré. La partie protéinique de ces molécules est reconnue comme antigène par le système immunitaire de l'hôte. Ce dernier synthétise donc des anticorps dressés contre le revêtement de surface des trypanosomes, ce qui conduit à la destruction quasi complète de la première population de cellules infestantes. Une faible proportion d'individus (moins de 0.1%)
Figure 2. Vagues de parasitémie lors de l'infection chronique par T. b.
gambiense (d'après Fantham, H.B. & Thomson, J.G. (1911) Proc. Roy. Soc. B 83, 206-211).
échappe cependant à cette réponse immunitaire: on appelle ces individus
"hêtêrotypes", parce qu'ils sont caractérisés par la présence d'antigènes de surface différents de celui exhibé par la majorité des trypanosomes. Une nouvelle vague de parasitémie, d'un type antigénique différent, peut se développer par prolifération de certains de ces hétérotypes, jusqu'à la lyse par la réponse immunitaire suivante. L'infection chronique par les
trypanosomes est donc maintenue grâce à la variation antigénique du parasite (figure 2). On a pu établir qu'à partir d'une population clonée de
trypanosomes, plus de cent types antigéniques différents peuvent apparaître successivement lors d'une infection.
Il convient d'ajouter ici que la réponse immune de l'hôte mammifère n'est pas uniquement dirigée contre l'antigène variable de surface du parasite. Il semble que les formes trapues de trypanosomes induisent aussi une réaction immunitaire dirigée contre des déterminants de la membrane plasmatique,
probablement à la suite d'une dégénérescence de ces trypanosomes dans le sang.
En outre, l'infection chronique conduit finalement à une immunodépression généralisée chez l'hôte, liée à l'activation polyclonale de sécrétion d'anticorps et à la prolifération des cellules T.
1.3. Modalités d'expression du répertoire antigénique.
L'expression des différents types antigéniques d'un répertoire ne s'effectue pas totalement au hasard: dans un clone de trypanosomes,
l'apparition de certains hétérotypes s'observe toujours rapidement, que les trypanosomes soient analysés juste après transmission cyclique dans les
glossines, ou qu'ils soient analysés au cours de passages successifs dans des souris naïves. On parle, à propos de ces antigènes, de types "prédominants"
ou "précoces". Par contre, d'autres types antigéniques ne s'observent que très rarement ou tardivement dans les mêmes circonstances d'analyse: ces types antigéniques sont appelés "tardifs". La probabilité d'expression des différents antigènes est donc très variable. On sait que la virulence des trypanosomes varie selon le type antigénique qu'ils exhibent, ce qui conduit à une compétition entre différents variants mélangés au sein d'une même
population. Le degré de virulence ne peut toutefois pas expliquer à lui seul l'espèce de programaation dans l'apparition des types antigéniques ; par exemple, les types tardifs peuvent être beaucoup plus virulents que les précoces.
L'ensemble de ces observations parasitologiques permettait de supposer que probablement des gènes différents sont impliqués dans l'expression des
antigènes de surface, car des modifications successives d'un gène unique, par mutations par exemple, ne rendraient pas compte de la programmation
relativement reproductible de la variation antigénique.
La variation antigénique ne semble pas dépendre de la présence d'agents externes aux trypanosomes. En particulier, l'effet des anticorps semble n'étre qu'une sélection des variants antigéniques. La variation antigénique peut en effet se produire dans des animaux immunosuppressés ou en culture in vitro, et avant toute réponse immunitaire de l'hôte. La fréquence de variation semble
-4 ^ -5 être de l'ordre de 10 a 10
Deux cas particuliers d'expression antigénique requièrent une mention spéciale.
Il s'agit tout d'abord de l'expression des types antigéniques observés dans les formes métacycliques du trypanosome. A ce stade précis du cycle de
développement, tous les trypanosomes se mettent à synthétiser un antigène de surface, et les types antigéniques caractéristiques de ce stade ("métatypes") ne représentent qu'une petite fraction du répertoire total. Ces observations suggèrent qu'un inducteur peut activer au moins certains gènes d'antigènes de surface. Parmi ceux-ci, quelques gènes, au moins, peuvent être réexprimés par la suite, lors de l'infection chronique dans le sang du mammifère. Les
métatypes sont très instables: lors de la transmission des trypanosomes métacycliques dans le sang du mammifère, ces antigènes sont généralement observés pendant une période assez courte, puis disparaissent; in vitro, les trypanosomes métacycliques se transforment rapidement en d'autres variants.
Deuxièmement, alors que la transmission des trypanosomes dans la glossine s'accompagne d'une disparition de l'antigène de surface des parasites, le type antigénique exprimé avant le passage dans la mouche peut réapparaître
préférentiellement, très tôt après l'infestation du mammifère par la mouche.
Ceci suggère que le gène d'antigène de surface exprimé au moment de la transmission cyclique dans la glossine peut garder la "mémoire" de son
activation, même après répression dans la forme procyclique, et au travers de l'expression des types métacycliques dans les glandes salivaires de la mouche.
1.4. Nomenclature, clonage, conditions de culture et de récolte des trypanosomes.
La nomenclature des répertoires et types antigéniques universellement utilisée aujourd'hui est celle de Lumsden (1982). Ainsi le répertoire antigénique auquel se réfère notre travail est AnTAR 1, pour "Antwerp
Trypanozoon Antigen Répertoire 1" (l'analyse sérologique de ces trypanosomes a
5
été effectuée à l'Institut de Médecine Tropicale d'Anvers). Les types antigéniques de ce répertoire sont définis par le second chiffre qui suit l'expression AnTat (Antwerp Trypanozoon antigenic type). Ainsi, nous avons principalement étudié le gène de l'antigène AnTat 1 • J_« Enfin, nous avons pris
l'habitude de définir en plus, par une majuscule, le clone particulier
exprimant l'antigène que nous étudions: ainsi, les variants AnTat 1.1B, 1.1C, 1 . 1D, etc. sont tous sérologiquement identiques à AnTat 1.1, mais sont apparus indépendamment à partir de clones différents.
Le clonage des variants est effectué par sélection immunologique des trypanosomes qui se diversifient par variation antigénique lors de passages dans des souris. Les types antigéniques indésirables sont éliminés par lyse en présence d'antisérum approprié, puis une seule cellule, exprimant le type antigénique voulu, est transmise à une souris naïve. Le contrôle de
l'identité sérologique est effectué par tests d'immunofluorescence ou
d'immunolyse, selon Van Meirvenne et al (1975). Tout le travail sérologique impliqué dans cette thèse a été réalisé par les équipes du Dr. N. Van
Meirvenne et du Dr. D. Le Ray à l'Institut de Médecine Tropicale d'Anvers.
Conditions de culture et de récolte. Les trypanosomes et en particulier tous les variants antigéniques peuvent être "stabilisés" dans l'azote liquide.
Ils peuvent être propagés in vivo dans des lapins, par exemple, chez lesquels ils donnent lieu à une infection chronique qui dure des mois, ou dans des souris ou des rats, qui font une infection aigue qui tue l'animal en quelques jours. Selon que les souches de trypanosomes sont capables ou non de
morphogenèse dans le sang, on parle de trypanosomes pléomorphes ou monomorphes, respectivement; on admet généralement que les trypanosomes monomorphes ne sont plus transmissibles à la mouche. Nous avons le plus
souvent travaillé sur des trypanosomes monomorphes, récoltés après trois jours de prolifération dans des souris ou des rats: dans ces conditions, le nombre de trypanosomes peut atteindre 10 8« 5’ par ml de sang, et leur homogénéité antigénique dépasse 99.9%.
Il est bon de signaler que les trypanosomes peuvent être cultivés in vitro:
selon les conditions d'incubation (température, richesse du milieu et présence ou non de fibroblastes), les formes procycliques (sans antigène de surface) ou sanguicoles (avec antigène dë^ surface) peuvent être pîopâgêeS indéfiniment.
L'isolement des trypanosomes se fait par passage du sang infesté à travers DEAE cellulose, selon Lanham (1968): dans ces conditions, il est possible de les débarrasser totalement des globules rouges et blancs.
6
1«5. Références.
- Borst, P. & Cross, G.A.M. (1982) Molecular basis for trypanosome antigenic variation. Cell 29, 291-303.
- Capbern, A., Giroud, C., Baltz, T. & Mattern, P. (1977) Trypanosoma equiperdum; étude des variations antigéniques au cours de la trypanosomose expérimentale du lapin.- Experim. Parasitol. 42, 6-13.
- Cross, G.A.M. (1978) Antigenic variation in trypanosomes. Proc. Royal Soc.
Lond. B 202, 55-72.
“ Crowe, J.S., Barry, J.D., Lucl<ins, A.G., Ross, C.A. & Vickerman, K. (1983) Ail metacyclic variable antigen types of Trypanosoma congolense identified using monoclonal antibodies. Nature 306, 389-391.
- Doyle, J.J. (1977) Antigenic variation in the salivarian trypanosomes. In
"Immunity to blood parasites of animais and man" (eds. L.H. Miller, J.A. Pino
& J.J. Mc Kelvey; Plénum, New York) pp. 31-63.
- Doyle, J.J., Hirumi, H., Hirumi, K., Lupton, E.N. & Cross, G.A.M. (1980) Antigenic variation in clones of animal-infective Trypanosoma brucei derived and maintained in vitro. Parasitology 80, 359-369.
- Gray, A.R. & Luckins, A.G. ( 1976) Antigenic variation in salivarian
trypanosomes. In "Biology of the Kinetoplastida” (eds. W.H.R. Lumsden & D.A.
Evans; Academie Press, New York, London) vol. 1, pp. 493-542.
- Hajduk, S.L., Cameron, C.R., Barry, J.D. & Vickerman, K. (1981) Antigenic variation in cyclically-transmitted Trypanosoma brucei. Variable antigen type composition of metacyclic trypanosome populations from the salivary glands of Glossina morsitans. Parasitology 83, 595-607.
- Hajduk, S.L. & Vickerman, K. (1981) Antigenic variation in
cyclically-transmitted Trypanosoma brucei. Variable antigen type composition of the first parasitaemia in mice bitten by trypanosome-infected Glossina morsitans. Parasitology 83, 609-621.
- Lanham, S.M. (1968) Séparation of trypanosomes from the blood of infected rats and mice by anion-exchangers. Nature 218, 1273-1274.
- Le Ray, D., Barry, J.D. & Vickerman, K. (1978) Antigenic heterogeneity of metacyclic forms of Trypanosoma brucei. Nature 273, 300-302.
- Lumsden, W.H.R. (1982) Characterization and nomenclature of trypanosome serodemes and zymodemes: report of the meeting held in Edinburgh, sept. 1978.
Syst. Parasitol. _4, 373-376.
- Miller, E.N. & Turner, M.J. (1981) Analysis of antigenic types appearing in first relapse populations of clones of Trypanosoma brucei. Parasitology 82, 63-80
7
- Seed, J.R. (1978) Compétition among serologically different clones of T.b.
gambiense in vivo. J. Protozool. 25, 526-529.
- Sendashonga, C.N. & Black, S.J. (1982) Humoral responses against Trypanosoma brucei variable surface antigen are induced by degenerating parasites.
Parasite Immunology _4, 245-257.
- Van Meirvenne, N., Janssen, P.G. & Magnus, E. (1975) Antigenic variation in syringe-passaged populations of Trypanosoma brucei. 1. Rationalization of the experimental approach. Ann. Soc. belge Med. Trop. 55, 1-23.
- Vickerman, K.(1978) Antigenic variation in trypanosomes. Nature 273, 613-617.
2» Analyse du mode d’expression de différents gènes d'antigènes de surface.
2«1. Clonage et caractérisation de séquences spécifiques d'antigènes de surface.
(voir article en annexe: Nucl. Acids Res. _8, 5965-5981 (1980).)
Nous avons entrepris de cloner, dans le plasmide pBR322, les cDNAs
synthétisés sur les mRNAs spécifiques de deux types différents d'antigènes de surface du même répertoire: AnTat 1.1 et AnTat 1.8. Le principe du clonage reposait sur 1’assomption^ue la seule caractéristique différenciant les
m
clones de trypanosomes exprimant ces deux types antigéniques résidait précisément au niveau de l'antigène de surface. Cette hypothèse semblait validée par le fait qu'in vitro, des préparations de l'ensemble des RNAs polyadénylés dirigeaient dans les deux cas la synthèse des mêmes peptides, la seule différence observable étant l'antigène spécifique du variant. Il était donc théoriquement possible d'identifier la séquence spécifiant cette
différence, après clonage des deux préparations de cDNA total, et repérage des clones spécifiques de chaque variant. Pour ce faire, nous avons hybridé le DNA des différents clones de chaque cDNA avec deux types de sondes: soit du cDNA S impie-brin total, fortement marqué au P, synthétisé sur le même RNA que l'avait été le cDNA cloné, soit du cDNA synthétisé sur le RNA de l'autre variant. Les clones dont le DNA ne s'hybridait qu'avec la sonde de la même spécificité antigénique, et non avec la sonde hétérologue, furent retenus pour une analyse plus détaillée. La confirmation de la spécificité des clones
sélectionnés a été obtenue à la fois par l'observation que le DNA de ces clones était capable d'inhiber sélectivement la synthèse de l'antigène de surface par traduction in vitro du mRNA total, et par le fait qu'il était possible d'isoler le mRNA spécifique d'antigène de surface par hybridation
avec le DNA cloné.
Le RNA polyadénylé utilisé pour la synthèse des cDNAs AnTat 1.1 et AnTat 1.8 était fortement enrichi en séquences spécifiques, par isolement à partir de polysomes immunoprécipités en présence des antisérums correspondants. Cette caractéristique, jointe aux conditions optimales de transcription inverse des mRNAs (utilisation d'un inhibiteur de RNAase que nous avions extrait du
placenta humain) nous a permis de déterminer la taille maximale des deux cDNAs, et de dresser sommairement, avant le clonage, leur carte de
restriction. La stratégie du clonage ne nécessitait cependant pas un tel
enrichissement préalable du mRNA, et par la suite, pour d'autres clonages de cDNAs d'antigènes de surface, du RNA polyadénylé total a été utilisé avec succès»
Les cartes de restriction des deux séquences clonées ne révélaient pas d'homologies, confirmant que les deux types antigéniques étaient
vraisemblablement codés par des gènes différents. Dans le cas d'AnTat 1.8, le clone sélectionné était constitué par la ligation tête-béche de deux moitiés 3' de cDNA. Il allait s'avérer (voir 5.1) que ces deux cDNAs n'étaient pas totalement identiques, bien que synthétisés sur la même préparation de mRNA;
cette observation révélait la possibilité d'une terminaison différentielle de la transcription, entre messagers d'une même spécificité antigénique. Dans le cas d'AnTat 1.1, le clone sélectionné contenait en 5' une séquence clonée artificiellement avec la séquence spécifique de l'antigène de surface (voir
2.2 ).
Un des principaux résultats de ces premiers travaux était d'établir clairement que le contrôle de la synthèse des antigènes de surface était effectué au niveau de la transcription (voir 3.1).
Volume 8 Number 24 1980
Nucleic Acids Research
Qoning and chaiacterization of DNA sequences complementary to messenger ribonucleic adds coding for the synthesis of two surface andgens of Trypanosoma brucei
E.Pays'*', M.Delronche''’, M.Lheureux''’, T.Vervoort*, J.Bloch^, F.Gannon^ and M.Steinert'''
‘'Département de Biologie mole'culaire. Université' libre de Bruxelles, 67, rue des Chevaux, 1640 Rhode St. Genèse, Belgium
Received 4 November 1980
ABSTRACT
Full length double-stranded complementary DNAs (ds cDNAs) could be syn- thesized on mRNAs enriched in sequences coding for the synthesis of the variant spécifie antigens (VSAs) AnTat 1.1 and AnTat 1.8 from Trypanosoma brucei brucei. The size of these ds cDNAs is about 1700 and 1850 base pairs
for AnTat 1.1 and AnTat 1.8 respectively. The ds cDNAs were cloned in the plasmid pBR322; two clones harboring a copy of each coding sequence were selected. Both the hybrid-arrested translation and the positive hybridiza
tion elution methods confirmed that these recombinants contain VSA-specific inserts. A restriction map was constructed in each case. The two sequences seem to be inserted in a reversed 3'-5' orientation, respective to the plas
mid polarity. The AnTat l.b cloned sequence is a palindrome probably due to a cloning artefact.^ Hybridization of the cloned DNAs with "Northern" blots of total or poly(A) RNA revealed in each case a single, spécifie band. The expression of these VSA genes appears thus to be regulated at the transcrip- tional levai.
INTRODUCTION _ _
Antigenic variation allows african trypanosomes to évadé the immune res- ponse of their host (see ref 1-5 for reviews of the subject) . At least 40 different variable antigen types (VATs) hâve been characterized in the T. brucei brucei clone which has been used throughout the présent work (6), and more than 100 hâve been found in a related species (7). Each antigenic specificity is determined by the protein part of a coat glycoprotein, about 60,000 daltons in molecular weight, which covers the parasite completely (6, 7, 8, 9, 10, 11, 12). That these variant-specific antigens (VSAs) are genetically determined and encoded by probably as many spécifie genes had been infered from the absence of amino acid sequence homology between VSAs isolated from distinct variant populations (13, 14). From the homogeneity of such VSA préparations it had been deduced that, at any time, VSA of only one specificity is synthesized by individuel trypanosomes.
In an attempt to get an insight into the molecular and genetical bases of antigenic variation in african trypanosomes, we first isolated, from clone
© IRL Press Limited, 1 Felconberg Court, London W1V 5FG, U.K. 5965
Nucleic Acids Research
populations of Trypanosoma brucei brucei, the mRNA's coding for the synthe- sis of two different VSAs (11). The présent work deals with the synthesis, cloning and characterization of the double stranded complementary DNAs
(ds cDNAs) derived from these two spécifie mRNAs.
MATERIAL AND METH3DS
Growth and harvesting of trypanosomes from clones of T. brucei brucei, stock EATRO 1125, VATs AnTat 1.1 and AnTat 1.8, were conducted as described
(11). For convenience, the two VATs and their antigens will be further iden- tified as A.1 and A.8. The clone populations used for RNA isolation were at least 99.9Z homogeneous, as judged from immunofluorescence tests on dried smears.
RNA isolation; For the isolation of RNA the glassware was sterilized at 150°C before use in order to inactivate residual RNAase; the tubes were generally silanized and treated with diethylpyrocarbonate (15) for the same purpose.
Total RNA was extracted by the method of Auffray and Rougeon (16).
Briefly, the cell pellet was homogenized in about 10 volumes of 3 M LiCl, 6 M urea, 200 /ig/ml of heparin, 0.5% SDS and 10 mM Na acetate (pH 5) with the aid of a Potter homogenizer. The homogenate was kept in an ice bath ovemight, then centrifuged 20 min at 13,000 rpm. The pellet was resuspended in 1/20 of the original volume of 4 M LiCl, 8 M urea at centrifuged again, then dissolved in the same volume of cold bidistilled water. The so
lution was brought to 0.1% SDS, 0.1 M Na acetate (pH 5), and the RNA was phenol-extracted at room température. The aqueous and interphase were extrac
ted with the same volume of phenol/chloroform (1/1), then with chloroform alone. Finally, the RNA was precipitated in two volumes of éthanol at -20°C.
Poly(A)* sequences were isolated from total RNA by oligo(dT)-cellulose chro- matography, as described (11).
The isolation of mRNA enriched in VSA coding sequences was performed as described (11).
In vitro translation of mRNA was done in rabbit réticulocyte lysate in the presence of ( S) méthionine, using the New England Nuclear translation 35 kit under the manufacturer's recommandations. Electrophoresis of the trans
lation Products in polyacrylamide slab gels, sometimes after immunoprécipita
tion, the imprégnation of the gels with PPO in DMSO and their autoradiography were performed as described (11).
Double-stranded cDNA synthesis. In previous experiments with thyroglo-
5966
Nucleic Acids Research
bulin mRNA (17), we found that full length copies of this long (8500 bases) mRNA can be achieved using the avian myeloblastosis virus reverse transcrip
tase, provided that a suitable RNAase inhibitor is added to the System. The inhibitor was isolated from human placenta essentially following the method of Gribnau et al (18, 17). The reverse transcriptase was a generous gift of Dr. J. Beard (St Petersbourg, Florida). For the G1378 batch of enzyme we observed a maximum yield of cDNA using a ratio of one inhibitor unit for 114 transcriptase units (inhibitor units are defined in ref 18; the reverse transcriptase unit of activity is expressed as the incorporation of one mano- mole of dTMP into an acid-insoluble product in 10 min at 37°C). We showed
that the size of the cDNA is progressively larger, up to the full length size, with increasing amounts of inhibitor (17).
The first strand of cDNA was made in 100 ;ul of 50 mM Tris-HCl (pH 8.3), 0.1 M KCl, 8 mM MgCl_, 4 mM dithiothreitol, 0.5 mM of dATP, dGTP and dTTP,
3 ^
0.5 mM of ( H) dCTP (1 Ci/mmole), 25 >ig/ml of actinomycin D, 10^g/ml of oli- go(dT)j^Q, 3 _^g of enriched mRNA, 30 units of reverse transcriptase and 1.3 units of RNAase inhibitor. After a 45 min incubation at 44‘’C, the reaction was stopped by the addition of 100 ^1 of a 50/ig/ml solution of yeast tRNA, 25 mM EDTA, 1% SDS and 10 mM Tris-HCl (pH 8). After extraction with an equal volume of phenol/chloroform (1/1), the aqueous phase was incubated ovemight in 0.3 N NaOH at room température. The solution was neutralized with 0.1 M Hepes (pH 7.4) and 0.3 N KCl, then passed through a Sephadex G50 column on a cushion of Chelex 100, in 0.05Z SDS, 1 mM EDTA and 50 mM Hepes (pH 7.4).
The excluded peak was precipitated in two volumes of éthanol at -20°C after addition of NaCl to 0.3 M, then centrifuged at 10000 rpm for 1 h and resus- pended in bidistilled water. Typical yield was about 15%.
The second cDNA strand was synthesized during 1 h at 44”C in 100 ^ul con- taining 50 mM KCl, 8 mM MgCl2, 4 mM dithiothreitol, 0.5 mM each of dATP, dGTP, dTTP and (^^P)dCTP (1 Ci/mmole), 50 mM Tris-HCl (pH 8.3), about 1.5 ;ug of the first strand cDNA and 60 units of reverse transcriptase. The RNAase inhibi
tor was added as a protein carrier at a concentration of 5 ^g/ml. The reac
tion was stopped as above; after Sephadex G50 chromatography and précipita
tion in éthanol in the presence of 5 /ig of yeast tRNA, the double-stranded cDNA was pelleted then digested by 25 units of nuclease SI (Sigma) during 1 h at 37°C in 200 ;ul of 70 mM Na acetate (pH 4.5), 0.14 M NaCl and 5 mM EnSO^. One unit of nuclease SI activity is the amount causing 1 ;ig of single- stranded DNA to become acid-soluble per min under these conditions.
The double-strended cWfA was extraeted with 1 veltme of phenol/chloroform
5967
Nucleic Acids Research
(1/1), after addition of Tris-HCl to 0.1 M (pH 8), EDTA to 5 mM and SDS to IZ. The aqueous phase was chromaCographed on Sephadex G50/Chelex 100 as above, then precipicaced in éthanol in the presence of S /ig of yeast tRKA.
About 75Z of the first strand were copied into ds cDNA, as judged by SI nu- clease digestion.
Cloning of the ds cDNA sequences . The ds cDNA was centrifuged on a 5-20%
sucrose gradient in 0.8 M NaCl, 5 mM EDTA and 10 mM Tris-HCl (pH 8) at 20°C for 13 h at 29000 rpm in a SW56 rotor (Beckman). Molécules of size greater than 1 kb were selected and cloned in the pBR322-E.coli C600 System (19).
These expérimenta were conducted in a P3 containment (Laboratoire de Géné
tique des Eucaryotes, Strasbourg). The bacterial clones were stored at -20°C in glycerol.
Isolation of plasmid DNA. The bacteria were grown in L-broth medium supplemented with 70 yig/ml ampicillin or 20 ^g/ml tétracycline, for the recombinants in the pBR322 Sali site or PstI site, respectively. After am
plification in the presence of 200 yug/ml chloramphenicol, the bacteria are pelleted and resuspended at 0°C in 20% sucrose in 50 mM Tris-HCl (pH 8).
They are then lyzed by successive additions of lysozyme (to 1.7 mg/ml), EDTA (pH 8) (to 80 mM) and Triton XlOO (to 0.7%) in 40 mM Tris-HCl (pH 8), 60 mM EDTA, always on ice; between each addition the cells are kept for 10 min on ice. After centrifugation at 70,000g for 45 min at 20°C, the supematant is centrifuged in a CsCl gradient in the presence of 1 mg/ml ethidium bromide The foim I plasmid DNA is collected by syringe, ethidium bromide is removed by 4 successive extractions with isopropanol, and the DNA is then dialyzed against 1 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl (pH 8). After RNAase A (10 ^g/ml) and protéinase K (50 yig/ml) digestions at 37°C, the DNA was phénol and chloro- form-extracted, then precipitated in éthanol at -20°C. Sometimes we used polyethylene glycol 6000 to reduce the volume of cleared lysâtes before CsCl centrifugation (20).
DNA digestion by restriction endonucleases was performed under the manu
facturer' s instructions, with enzymes purchased from Boehringer Mannheim (EcoRI, Bgll, PstI, BamHI, Sali, Hindll, HindlII), Bethesda Research Labora
tories (Xorll, Haell, HaelII, Hinfl) or New England Biolabs (PvuII, Taql) . The reaction was stopped by addition of 0.2 volume of 4 M urea, 50% sucrose and 50 mM EDTA (pH 7) .
Electrophoresis of the DNA digestion products was performed at 4'’C in 2 mM EDTA, 20 mM Na acetate and 40 mM Tris (pH 8) on agarose slab gels, in a horizontal apparatus at 1.6 V/cm ovemight. The size markers were usually
5968
Nucleic Acids Research
SV40 DMA digesced wich HindlII or Hinfl, phage lambda DMA digesced with HindlII, EcoRI or PstI, and 0X174 DNA digested with Haell or HaelII.
Electrophoresis of RNA was conducted in Tris-borate buffer in the pré
sence of methylmercuric hydroxide, as described by Bailey and Davidson (21).
The gels were stained for 1 h at room température in 3 ^g/ml ethidium bromide, and photographed under UV light.
Préparative electrophoresis of DNA was done on low melting point agarose (BRL) as above. After staining with ethidium bromide the bands were visua- lized and excised under long wave UV light (366nm). The agarose was melted at 65°C, then two volumes of 0.5 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl (pH 8) were added at 37°C. The DNA was extracted three times with phénol saturated with 0.1 M Tris-HCl (pH 8), two times with chloroform and three times with ether, then precipitated in 3 volumes of éthanol at -20°C, after addition of Ma acetate
(pH 7) to a final concentration of 0.3 M.
Hybrid-arrested translation of mRNA was done as described by Paterson et al (22). In vitro translation was performed after hybridization of selected fragments of the cloned trypanosome DNA with the enriched mRNA, as speci- fied in the figure legends. Except when mentioned, we added 400 yug/ml of yeast tRNA as carrier in the hybridization and translation mixtures.
Nick-translation of DMA was performed as described by Rigby et al (23).
For small DNA fragments DNAase was omitted from the reaction mixture. We routinely obtained a spécifie radioactivity around 2.10 dpm/^g of DNA.
Covalent binding of DNA to diazotized paper. DBM paper was prepared as described by Alwine et al (24). Altematively the following procedure was used: 20 g of filter paper (Whatman, type 50), eut to the desired size, was incubated with agitation for 15 h at room température in a sealed plastic bag containing 70 ml of 0.5 N NaOH with 2 mg/ml NaBH^ and 30 ml of 1,4-buta- nedioldiglycidylether. This solution was replaced with 10 ml 2-aminothio- phenol in 40 ml acetone, and incubation continued for 10 h. After two washes in acetone and two washes in 0.1 N HCl, the filters were thbroughly washed in bidistilled water. They were airdried and stored at -20°C in dry sealed plastic bag. Activation was done just before use by incubation at 4°C for 30 min in 100 ml of 1.2 N HCl, after addition of 2.7 ml of 1% NaNO^. The papers are washed with 1.2 N HCl, water, éthanol and ether, then prepared for nucleic acid binding by washing in 1 M Na acetate (pH 4) . DNA was bound to the paper by ovemight incubation (5 ^/cm ) at 0°C in 1 M Na acetate (pH 4). The filters were then washed successively as follows : 3 x 5 min at room température ia 0.5 ml ai IZ glycine Cw/v)_ in 1 M Na acetate ^H 4),
5969
Nucleic Acids Research
3x5 mia ac rocm température in 0.3 ml formamide, 2 min at 68*C in formamide and 3x5 min at room température in 0.5 ml 1 H Na acetate (pH 4).
Transfer o£ RNA from agarose gels to diazotized paper was done as des- cribed by Alwine et al (24), except that 1 M Na acetate (pH 4) was used instead of Na borate (pH 8). The methylmercuric hydroxide was removed from the gel by washings with 2-mercaptoethanol; the mercaptoethanol was then removed with excess iodoacetamide.
Transfer of DNA from agarose gels to cellulose nitrate filters was done by blotting as described by Southern (25).
Hybridization of RNA with DNA bound to paper was performed after a 3 h- preincubation of the activated paper at 38°C in 50% formamide, 5 x SSC, 0.1%
SDS, 50 ^g/ml of yeast tRNA, 0.04% polyvinylpyrrolidone, 0.04% Ficoll and 1%
glycine, followed by several washes at 38°C in the same medium without gly
cine (medium A), itybridization was in the minimal volume of medium A at 38°C for 4 h. Following two washes of 5 min at 38°C in medium A, the filters were incubated for 3 x 10 min at room température in 1 x SSC, 1 mM EDTA (pH 8) and 0.2% SDS, then again in medium A for 2 h at 38°C and finally for 3 x 10 min at room température in 50% formamide, 5 x SSC and 0.1% SDS.
RNA was eluted by two washes of 1 min at 100“C with a minimal volume of 1 mM EDTA, 0.1%SDS and 10 mM Tris-HCl (pH 8), and precipitated in two volumes of éthanol at -EO^C ovemight after addition of NaCl to 0.3 M and 5 ^g of tRNA.
Hybridization of DNA with RNA bound to paper was performed as described by Alwine et al (24).
Hybridization of DNA with BNA bound to cellulose nitrate was performed in sealed plastic bags for 36-48 h at 65°C in the minimal volume of 6 x SSC, 1 X Denhardt's medium (26) containing 100_^g/ml of sonicated, denatured calf thymus or Micrococcus luteus DNA, after prehybridization of the filters over- night in this medium without DNA, and after dénaturation of the DNA for 10 min at 100°C in 0.1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl (pH 8). The filters were then
thoroughly washed under stringent conditions (0.1 x SSC, 65°C), as described by Jeffreys and Flavell (27).
Autoradiography of cellulose nitrate or diazotized paper filters, as well as dried agarose or polyacrylamide gels, was for 1-15 days at -70°C with Kodak X-ray films (XRl), usually with one intensifying screen (Siemens).
5970
Nucleic Acids Research
RESULIS
Synthesis of complementary DNA. Polyribosomal mRNAs from two brucei variant populations hâve been recently enriched in sequences coding for the synthesis of the VSAs A.l and A.8 respectively (11). In vitro translation of these two mRNA préparations gave rise to the synthesis of a variety of polypeptides, amongst which the spécifie antigen represented the major dif
férence (fig. 1). The size of these antigens was estimated to be approxima- tely 60,000 daltons, A.8 being slightly larger than A.l.
We used these mRNA sequences as template for the in vitro synthesis of ds cDNA by the avian myeloblastosis virus reverse transcriptase. In the presence of a RNAase inhibitor isolated from human placenta, full-size copies of large mRNA can be obtained (17). Under these conditions, ds cDNA sequen-
12 123456 789 10
Figure 1. In vitro translation of A.l and A.8 mRNAs. In (A), the transla
tion Products of A.l (lane 1) or A.8 (lane 2) enriched mRNAs uere subjected to electrophoresis and fluorography as described in (11) . The arrows point to the major différences between the two electrophoretic patterns. The thick arrows indicate the position of full-size antigens; the bands cor- responding to the thin arrows are immunospecific polypeptides, as shown in (B). Part (B) shows the immunoprécipitation pattern of the translation Pro
ducts of the A.l (lanes 3 to 6) and A.8 (lanes 7 to 10) enriched mUNAs.
Immunoprécipitation was performed as described in (11) with anti-A.l (lanes 4 to 6) or anti-A.8 (lanes 8 to 10) antibodies, in the presence of an excess of unlabelled antigen 1 (lanes 5 and 10) or 8 (lanes 6 and 9), or without unlabelled antigen (lanes 4 and 8). Lanes 3 and 7 are the A.l and A.8 non- imnunoprecipitated Controls, respectively. Lanes 1 and 2 show the template activity of the lys*e« aad aéeaevims aRNA aarker, res^ctively.
5971
18
Nucleic Acids Research
ces ranging from about 0.5 up to about 1.8 kb were synthesized on both mRNA templates, as revealed by autoradiography of ( P)-labelled ds cDNA subjected 32 to electrophoresis on agarose slab gels (fig. 2).
Amongst these sequences a discrète major component was clearly visible.
The size of this component was estimated to be around 1.7 kb for A.l and 1.85 kb for A.8. This size range is compatible with the estimated size of the two antigens and probably reflects the full size RNA message, since no discrète ccmponent of higher molecular weight can be found on the gel. Digestion of these cDNAs by varions restriction endonucleases revealed that the major ccmponent is different in the two préparations (fig. 3). Such a différence in size and sequence was expected for the VSA message, and we thus supposed that the major cDNA component was in each case the full size copy of the VSA mRNA.
Cloning the cDNA. The two cDNA préparations were cloned in the plasmid pBR322 following the strategy outlined in the method section. The screening
12 3 4
.45—
Figure 2. Electrophoretic patterns of the ds cDNA sequences synthesized on RNAs enriched in A.l (lanes 1 aftd.2) and A.8 (lanes 3 and 4) mRNAs. The (^^P)- labelled ds cDNAs were subjected to elec
trophoresis in a 1.7% neutral agarose slab gel, after treatment with SI nucle- ase (lanes 2 and 4) or without SI nucle- ase digestion (lanes 1 and 3), then au- toradiographed. The markers are diges
tion Products of phage lambda and SV40 DNAs by HindlII.
5972
Nucleic Acids Research
Figure 3. Restriction patterns of the cDNAs. The ds cDNAs synthesited on the mRNAs A.l (lanes 1 to 3) and A.8 (lanes 4 to 6) were digested by EcoRI
(lanes 1 and 4), PstI (lanes 2 and 5), HindlII (lanes 3 and 6), then analyzed as described for Fig.2. The size of the major bands is indicated. With the exception of the 1.4 kb fragment in lane 5 (see text), the major bands cor
respond to fragments which are also observéd in the corresponding cloned DNA (fig. 6).
procedure for spécifie clones was designed on the assumption that the presence of a spécifie VSA-coding sequence is the major differente between the two va
riant derived cDNA populations. Hybridization of the recombinant DNA clones is thus expected to be variant spécifie only if they contain the VSA DNA.
In this case a clone would only hybridize with its homologous probe (single- stranded ( P) cDNA). On the contrary, the clones containing recombinant DNA 32 hybridizing non-specifically with both heterologous and homologous probes are supposed to hâve inserted non-VSA-specific DNA. Starting from about 10 ng of A.l ds cDNA, the cloning procedure gave 33 positive colonies from a total of 110. A second screening using the non homologous probe suggested that
amongst these positive colonies 18 might contain the VSA A.l spécifie ds cDNA.
The corresponding figures for A. 8 were 18 out of 75, and 8 VSA-specific clones.
The size of the recombinant plasmid DNA of each of these spécifie clones was analyzed by electrophoresis on agarose slab gels. It was found that only
two clones (one for each variant) carried a cDNA insert of about the same size as the major cDNA component (1.7 kb for A.l, and 1.77 kb for A.8).
Characterization of the cloned sequences.
Sequence specificity. Evidence that the selected clones indeed carry VSA- specific sequences was obtained in two different ways : either by hybrid- arrested in vitro translation of the original enriched mRNA préparation, or by in vitro translation of RNA purified by hybridization with the cloned DNA
5973
Nucleic Acids Research
bound Co diazocized paper. In the first case, illustrated in fig. 4 for A.l, we hybridized a selected portion of the cloned sequence (the HindlII-HindlII A.l fragment, see below) with A.l enriched mRNA , prior to its translation in the réticulocyte lysate. A portion of the hybrids was denatured by hea- ting just before the in vitro translation. After electrophoresis on poly- acrylamide gels and autoradiography, the VSA-specific polypeptide, iiutunopre- cipitable with the purified spécifie antibody (11), appeared to be absent or drastically reduced only after hybridization of the mRNA with its presumed DNA complément. Dénaturation of the hybrids restored the synthesis of the VSA polypeptide. Similar results hâve been obtained with regard to the A.8 cloned sequence, although in this case most of the spécifie inmunoprecipi- table peptides produced by in vitro translation were of small size, as
Figure 4. Démonstration that the cloned A.l sequence is VSA-specific. Two methods were used : either the hybrid-arrested translation (lanes 4 to 11) or
the positive hybridization-elution-translation (lanes 12 and 13).
The templates for in vitro translation were ; lane 1: endogenous réticulocyte mRNAs; lane 2: adenovirus mRNAs; lane 3: A.l enriched mRNA; lane 4: same,
after mock-hybridization with buffer; lane 5: as lane 4, but melted for 90 sec at 100°C after mock-hybridization; lane 6: A.l enriched mRNA after hybridiza
tion with the 0.55 kb HindlII fragment of the putative A.l cloned DNA; lane 7:
as lane 6, but after melting; lane 8: A.l enriched mRNA after hybridization with the 1.17 kb PstI fragment of the putative A.8 cloned DNA; lane 9: as lane 8, but after melting; lane 10: same as lane 6 but without tRNA carrier (see Methods); lane 11; same as lane 10 but after melting; lane 12: RNA elu- ted by melting after hybridization of the enriched mRNA with the putative A.l cloned DNA bound covalently to diazotized paper strips; lane 13: as lane 12, but the DNA bound to paper was wild-type pBR322. The arrow points to the major immunoprecipitable polypeptide.
5974
Nucleic Acids Research
already observed in the experimenc shown in fig. 1.
The other approach involved the covalent binding of the cloned sequences to diazotized paper, followed by their hybridization with the enriched mBMA préparations. After extensive washings, the paper strips were heated in order to release the RNA from the hybrids. This RNA was then translated as des- cribed above. Using this procedure we detected only the inmunoprecipitable polypeptides, except a band also présent in the Controls (hybridization with the reccmbinant DNA derived from the other variant, or with wild-type plasmid DNA) (fig. 4 lanes 12 and 13, for A.l). An extensive purification of the VSA mRNAs was thus achieved by hybridization with the cloned DNA sequences, a
resuit which strongly indicates that the latter are VSA-specific.
That the two cloned sequences are copies of the A.l and A.8 spécifie mRNAs is also demonstrated by the experiment illustrated in fig. 5: each
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 II 12 13 14 15 16 17 18
kb
2.4—
• • I
Figure 5. Hybridization of the cloned sequences with "Northern" blots of total or poly(A) RNAs. The recombinant plasmid DNA containing the putative coding-sequence for the VSA type A.l (lanes 1 to 9) or A.8 (lanes 10 to 18) was ( ^P)-labelled by nick-translation, then hybridized with "Northern" blots of : a) 10 /Ug of total RNA from trypanosomes expressing A.l (lanes 1 and 10), A.8 (lanes^2 and 11), A.3 (lanes 3 and 12) or A.13 (lanes 4 and 13); b) 1/ig of poly(A) RNA from trypanosomes expressing A.l (lanes^S and 14), A.8 (lanes b and 15) or A.3 (lanes 7 and 16); c) 300 ng of poly(A) RNA enriched by immu- nonrecipitation in sequences coding for A.l (lanes 8 and 17) or A.8 (lanes 9 and 18). Electrophoresis of RNA was on 1.4% agarose slab gels, in the pre-
■sence of methvlnierciiric hydroxide. Ihe size markers are the ribosomal RNA sequences, visible by staining with ethidium bromide.
5975
Nucleic Acids Research
homologous hybridization test revealed a unique band of RNA, the size of which was estimated to be 1.85 kb for A.l and 2 kb for A.8. No cross-hybridi
zation was détectable. The size of these RNAs is in good agreement with the putative length of a VSA message and only about 150 bases larger than the cDNA size, a différence which could be accounted for by the poly(A) tail of the mRNA. Therefore we infer that the A.l and A.8 derived cloned DNA séquen
ces selectively hybridized to the homologous VSA mRNAs.
Restriction map. The two selected recombinant DNAs, as well as two other A.8 cloned DNAs, were digested by varions restriction endonucleases, and the Products of these digestions were analyzed by electrophoresis in agarose slab gels. The combination of data obtained by single and double digestions enabled us to map the restriction sites of the recombinant DNA in these dif
ferent clones (fig. 6).
In the case of A.l, the size of the digestion products of the original cDNA préparations (fig.3) fits the size inferred from digestions of the cloned sequence (fig. 6, clone A.l). This observation confirms that the ma
jor cDNA component was indeed the one coding for the A.l VSA. On the basis of experiments described above, we suppose that this conclusion is also valid for the A.8 cDNA, but the largest A.8 cloned sequence (clone A.8a, fig. 6) seems to hâve diverged from the original cDNA, since the 1.4 kb PstI fragment of the cDNA (fig. 3, lane 5) is replaced by a 1.17 kb PstI sequence in the cloned DNA; on the other hand, in this clone A.8a, the two PstI, the two Xorll, the two pairs of Hindll and the two inner Taql sites appear to be lo- cated on both sides of a comnon twofold symmetry center, at the position 880.
This symmetry was confirmed by hybridization experiments : ( P)-labelled 32 probes from the 3' and 5' ends of the cloned sequence were found to cross- hybridize, as detailed in fig. 7. Moreover, they gave rise to the same pattern of hybridization with restriction fragments of nuclear DNA from
brucei (data not shown).
These observations mean that either the A.8 gene is palindromie, or that the clone A.8a results from simultaneous insertion in the plasmid of twice the same fragment, in opposite directions. As shown in fig. 6, comparison of the clone A.8a sequence with that of the two other 1.24 kb and 0.88 kb A.8 clones (clones A.8b and A.8c) revealed that the second hypothesis is probably correct: indeed the sequence of clones A.8b and A.8c appears to be the same as that of clone A.8a from 3' up to the middle (around bp 880), then the restriction sites differ in both cases.
Orientation. In the presence of oligo(dT), the reverse transcriptase
5976
Nucleic Acids Research
Clone : A. I A.8a A.8b A.8c
Taql Taql
Taql
^ HindlII , Pset , Pscl - Pscl
- Taql - Taql
- Hindll - Hindll Pscl , Hindll - Hindll Hindll - Taql
- Xorll
. HindllI . Sali - Sali - Sali - PvuII - PvuII - PvuII - Taql
. EcoRI - Xorll
Taql Taql - Taql • Hindll ^Bgll ^Bgll
^ Hindll - Taql - Taql Taql
- PstI . Hindll - Pscl
- Taql
Figure 6. Restriction maps of the cloned VSA-coding sequences. The Taql sites présent at the ends of the inserted sequences hâve been produced by the blunt end ligation in the Sali site of the plasmid DNA. Clone A.8c was inserted at the PstI site of pBR322 by the tailing procedure (28) hence the two terminal PstI sites. Clone A.8a probably résulta from a cloning artefact (see text) . The position of the Xorll sites in clones A.8b and A.8c is not yet known. Both cloned sequences hâve been inserted in a reverse orientation with regard to the plasmid DNA (see text): the 3' ends represented here correspond to the 3' extremities of the RNA sequences.
starts from the 3' poly(A) tail of the mRNA template. Incomplète cDNA transcripts represent thus most probably the end of the coding message.
This assumption can be validated by initiating the reverse transcription with a puise of ( P) dTTP of a very high spécifie radioactivity, followed 32 by a "chase" by cold dTTP for the synthesis of complété ds cDNA : the rela
tive prédominance of some labelled bands is to be related to the polarity of the reverse transcription, starting from the 3' poly(A) tail of the mRNA.
We synthesized either short ( P)-labelled ds cDNA sequences, or ds32 cDNAs labelled only in 3' by a 5 min puise with traces of ( P) dTTP at 2-3 32 kCi/mmole in the presence of 0.5 mM unlabelled dATP, dGTP and dCTP, followed by a 45 min incubation with Q.S mM unlabelled dTTP. In both cases we
5977
Nucleic Acids Research
-«(W' — .66 - .51
Figure 7. The 1,77 kb A.8a cloned sequence is a palindrome. Part Spéci
fie 3‘ and 5' ( ‘P)-labelled probes were prepared from the 0.575 kb fragment between the pBR322 BamHI site 375 (29) and the A.8a PstI site 300, and the 0.56 kb fragment between the A.8a PstI site 1470 and the pBR Bgll site 910.
These probes were hybridized with "Southern" blots of clone A.8a digests, subjected to electrophoresis in 2% agarose gels. The probes were 3' for la- nes 1 and 2, and 5' for lanes 3 and 4. The digestions were by Hindll in
lanes 1 and 3, by PstI in lanes 2 and 4. As expected, the 3' probe hybridi- zes with the 1.61 kb Hindll and with the 1.7 kb PstI fragments, whereas the 5' probe hybridizes with the 3.78 kb Hindll and the 3.26 kb PstI fragments.
Cross-hybridization between the 3' and 5' fragments is however clearly shown by the second band in each lane; their lower level of labelling is due to the fact ttat the cross-hybridization is restricted to the inserted DNA.
Part B. ( '^P)-labelled probes were prepared from the 510 bp Pstl-Sall and from the 660 bp SalI-PstI fragments (see fig.6). These probes were hybridi
zed to "Southern" blots of clone A.8a digested by Pstl+Sall (lanes 1 and 3) or by Sali alone (lanes 2 and 4). The probes were Pstl-Sall for 1 and 2 and SalI-PstI for 3 and 4. The same bands are revealed by both probes.
analyzed the electrophoretic pattern of their digestion products by several restriction endonucleases. Both methods gave similar résulta. Fig. 8 (lanes 1 to 3) illustrâtes the data obtained with short ds cDNAs copied on A.l mRNA : the prédominant bands can be assigned to restriction fragments of the insert which belong to its 5' half, as defined by the plasmid DNA orien
tation. This indicates that the trypanosome DNA is inserted in an inverted 3'-5' orientation. Similar conclusions could be drawn for clone A.8a (fig.8, lane 4), although in this case some uncertainty remains due to the fact that
5978
25
Nucleic Acids Research
12 3 4
k b
a significant portion o£ the sequence
Figure 8. Restriction pattern of 3'-enriched ds cDNA sequences. In
complète ds cDNAs synthesized on mRNA A.l were digested by HindlII
(lane 1), PstI (lane 2) or PstI + EcoRI (lane 3), then analyzed as described for Fig.2. Lane 4 shows a similar test perfomed with A.8 incomplète ds cDNA, digested by PstI + Sali. The size of the major bands is indicated.
is not known.
DISCUSSION
In the presence of an RNAase inhibitor from human placenta and using as template a partially purified préparation of brucei mRNAs, we hâve ob- tained full size ds cDNA copies of the messengers coding for the two anti
gens A.l and A.8. These ds cDNAs hâve been cloned in pBR322 and prescreened by differential hybridization with A.l and A.8 cDNA probes. Two clones, one for each antigen, with an insert of 1.7 and 1.77 kb for A.l and A.8 respecti- vely, hâve been selected for thorough characterization.
The coding specificity was asserted by two different approaches, by the hybrid-arrested translation test and by the positive hybridization-elution method. Both methods confirmed the résulta of the prescreen: the cloned
DNAs derived from A.l and A.8 specifically hybridized to the mRNAs coding for the homologous antigens. The specificity of these reactions has been control- led by the reciprocal A.l vs A.8 hybridization tests and rests also on the unambiguous immunological identification of the polypeptides whose in vitro synthesis was either blocked or induced by the hybridization. The specifici
ty of the immunoprécipitation reaction used, not illustrated here, has been previously demonstrated (11). We thus conclude that the cloned sequences are coding for the spécifie antigens of the serotypes AnTat 1.1 and AnTat 1.8. The mRNA copy présent in clone A.l might be complété, as its size is very close to the size of the mRNA that it specifically recognizes amongst
total poly(A)*-RNAs extracted from trypanosomes expressing A.l. This obser- vation, that both cloned sequences hybridize specifically to a unique 1850-
5979
Nucleic Acids Research
2000 nucléotide RNA species which is présent only in the homologous variant, provides additional evidence for the VAT-specificity of the cloned sequences.
Moreover, this experiment shows that the two VSA sequences do not share com- plementary segments. This resuit extends those obtained previously on cloned fragments of other VSA-coding sequences (30). It also proves that the con- trol of VSA expression is at the transcriptional level. Clone A.8a clearly appears to be palindromie. This either means that the A.S gene is a palin
drome, on that two identical fragments of the A.8 cDNA hâve been cloned to- gether. We do not think that this could resuit from a duplication produced during the cDNA synthesis (31) since the A.8 cDNA préparation does not con- tain the 1.17 kb PstI fragment characteristic of the palindrome. Instead, the data provide evidence for the occurrence of a cloning artefact: indeed the restriction map of clone A.8a differs from that of both the A.8 cDNA and two other A.8 clones. The fragment chat has been cloned twice is pro- bably the 3' half of the coding sequence, since 3' enriched cDNA appears to be enriched in the 0.51 kb PstI - Sali fragment, which has also been detec- ted in the nuclear DNA, and is Chus genuine.
Whereas in vitro translation of mRNA consistently resulted in full-sized A.l antigen synthesis, in the case of A.8 several incomplète immunospecific A.8 polypeptides were observed in addition to the complété antigen; some- cimes as in the hybrid-arrested translation test (data not shown), the full- sized A.8 protein was not detected at ail. This could be due to slowing down or arrest of the A.8 mRNA translation at a few spécifie sites. Addition of an excess of yeast tRNA in the translation System <fid not improve the A.8 translation pattern, suggesting that the stop points do not resuit from a déficit in some tRNA species.
ACKNOWLEDGEMENTS
We gratefully acknowledge invaluable aid from C. Wasylyk and J.M. Garnier (Strasbourg) for technical assistance. We thank Dr. J. Beard (St. Peters- bourg, Florida) for his generous gift of reverse transcriptase. This inves
tigation received support from the F.R.S.M. (Belgium), from I.N.S.E.R.M.
(France) and from the UNDP/World Bank/WHO Spécial Programme for Research and Training in Tropical Diseases.
•Laboratorium voor Sérologie, Instituut voor tropische Geneeskunde, Nationalestraat 155, 2000 Antwerpen, Belgium.
5980
Nucleic Acids Research
^ Laboratoire de Génétique moléculaire des Eucaryotes du CNRS, Unité 184 de Biologie moléculaire et de Ge'nie génétique de l’INSERM, Faculté de Médecine, Strasbourg, France.
REFERENCES
1. Vickerman, K. (1978) Nature 273, 613-617.
2. Cross, G.A.M. (1978) Proc. roy. Soc. London, B 202, 55-72.
3. Gray, A.R. 4 Luckins, A.G. (1976) in "Biology of the Kinetoplastida", Lumsden, W.H.R. 4 Evans, D.A. Eds., Academie Press, New York, p. 493-542.
4. Doyle, J.J. (1977) in "Immunity to blood parasites of animais and man".
Miller, L.H., Pino, J.A. 4 McKelvey, J.J. Eds., Plénum Press, New York 4 London, p. 31-63.
5. Cross, G.A.M. (1979) J. of Gen. Microbiol. 113, 1-11.
6. Van Meirvenne, N., Janssens, P.G. 4 Magnus, E. (1975) Ann. Soc. belge Méd. Trop. 55, 1-23.
7. Capbem, A., Giroud, C., Baltz, T. 4 42, 6-13.
Mattem, P. (1977) Exp. Parasitology 8.
9.
Vickerman, K. 4 Luckins, A.G. (196 9) Vickerman, K. (196 9) J. Cell Science
Nature 224, 5, 163-193.
1125-1127.
10. Baltz, T., Baltz, D., Pautrizel, R., Pj-chet, C., Lamblin, G. 4 Degand, P.
(1977) FEBS Letters 82 , 93- 96.
11. Lheureux, M., Lheureux, M., Vervoort, T., Van Meirvenne, N. 4 Steinert,M.
(1979) Nucl. Ac. Research 7, 595-609.
12. Cross, G.A.M. (1975) Parasitology 71, 393-417.
13. Bridgen, P.J., Cross, G.A.M. 4 Bridgen, J. (1976) Nature 263, 613-614.
14. Johnson, J.G. 4 Cross, G.A.M. (1979) Biochem J. 178, 689-697.
15. Williamson, R., Morrison, M., Lanyon, G., Eason, R. 4 Paul, J. (1971) Biochemistry 10, 3014-3020.
16. Auffray, C. 4 Rougeon, F. (1980) Eur. J. Biochem. 107, 303-314.
17. De Martynoff, G., Pays, E. 4 Vassart, G. (1980) Biochem. Biophys. Res.
Commun. 93, 645-653.
18. Gribnau, A.A.M., Schoenmakers, J.G.G. 4 Bloemendal, H. (1969) Arch.
Biochem. Biophys. 130, 48-52.
19. Cochet, M. , Perrin, F., Gannon, F., Krust, A., Chambon, P., McKnight.G.S., Lee, D.C., Mayo, K.E. 4 Palmiter, P. (1979) Nucl. Ac. Research 6, 2435- 2452.
20. Humphreys, G.O., Willshaw, G.A. 4 Anderson, E.S. (1975) Biochim. Biophys.
Acta 383, 457-463.
21. Bailey, J.M. 4 Davidson, N. (1976) Anal. Biochem. 70, 75-85.
22. Paterson, B.M., Roberts, B.E. 4 Kuff, E.L. (1977) Proc. nat. Acad. Sci.
USA 74, 4370-4374.
23. Rigby, P.W.J., Dieckmann, M., Rhodes, C. 4 Berg, P. (1977) J. Mol. Biol.
113, 237-251.
24. Alwine, J.C., Kemp, D.J. 4 Stark, G.R. (1977) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74, 5350-5354.
25. Southern, E.M. (1975) J. ÎIol. Biol. 98, 503-517.
26. Denhardt, D. (1966) Biochem. Biophys. Res. Comm. 23, 641-652.
27. Jeffreys, A.J. 4 Flavell, R.A. (1977) Cell 12, 429-439.
28. Humphries, P., Cochet, M., Krust, A., Gerlinger, P., Kourilsky, P. 4 Chambon, P. (1977) Nucl. Ac. Research 4, 2389-2406.
29. Sutcliffe, J.G. (1978) Nucl. Ac. Research 5, 2721-2728.
30. Hoeijmakers, J.M. J., Borst, P., Vandenburg, C. , Weissmann, C. 4 Cross, G.A.M. (1980) Gene 8, 391-417.
31. Fagan, J.B., Pastan, I. 4 de Crombrugghe, B. (1980) Nucl. Ac. Research 8, 3055-3064.
