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Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository
Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:
Bidouil, S. (2001). Contribution au développement d'un modèle de métabolisation in vitro : applications à l'étude d'interactions médicamenteuses impliquant l'isoforme 3A4 du cytochrome P450 (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté de Pharmacie, Bruxelles.
Disponible à / Available at permalink : https://dipot.ulb.ac.be/dspace/bitstream/2013/211541/1/c47b7023-88a9-43fa-8865-a357c19c0ee7.txt
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UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES INSTITUT DE PHARMACIE
LABORATOIRE DE CHIMIE BIOv^NALYTIQUE, TOXICOLOGIE ET CHIMIE PHYSIQUE APPLIQUEE
PROMOTEUR : Professeur J. Dubois
CONTRIBI TIOS A V DE\ ELOPPEMEST D'UN MODELE DE METABOLISA TION !N I ITRO.
A PPL! CA TfONS A L'ETUDE D'INTERACTIONS MEDICAMENTEUSES IMPLIQUANT L'ISOFORME 3A4
DU CYTOCHROME P450
Protoport hyTH) IXwȔl*. T^
^ rhiocar’ph»»r
S. BIDOUIL Pharmacien
Thèse présentée en vue de l’obtention du grade de Docteur en
SoiencesPharmaceutiques.
Université Libre de Bruxelles
UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES INSTITUT DE PHARMACIE
LABORATOIRE DE CHIMIE BIOANALYTIQUE. TOXICOLOGIE ET
CONTRIBUTION A U DEVELOPPEMENT D ’UN MODELE DE METABOLISATION IN VITRO.
APPLICA TIONS A L ’ETUDE D ’INTERA ETIONS MEDICAMENTEUSES IMPLIQUANT L ’ISOFORME 3A4
DU CYTOCHROME P450
: —= T fv. -
Thèse en vue de l’obtention du grade de Docteur en Sciences Pharmaceutiques.
CHIMIE PHYSIQUE APPLIQUEE
PROMOTEUR : Professeur J. Dubois
S. BIDOUIL Phannacien
BRUXELLES, Novembre 2001
REMERCIEMENTS
Au terme de ce travail, je tiens tout particulièrement à exprimer ma plus profonde gratitude à Monsieur le Professeur Michel Hanocq pour la confiance qu'il m'a témoignée en m'accueillant dans son laboratoire en tant que chercheur et assistante à l'Institut de Pharmacie.
Je le remercie pour ses conseils et sa rigueur scientifique ainsi que pour les moyens mis à ma disposition pour la réalisation de cette thèse dans les meilleures conditions.
Je tiens à remercier particulièrement le Professeur Jacques Dubois pour avoir dirigé ce travaü avec compétence. Ses conseils et son investissement de tous les jours m'ont beaucoup aidé dans la conduite et l'amélioration de ces recherches.
Ce travail n'aurait pas été possible sans la collaboration scientifique, établie dans le cadre de la modélisation mathématique, du Docteur Philippe Bogaerts du Service d'Automatique dirigé par Monsieur le Professeur R. Hanus. Je remercie chaleureusement le Docteur Philippe
Bogaerts pour ses compétences, sa disponibilité et son aide apportée lors de la réalisation et la rédaction de cette partie importante de mon travail.
J'adresse également mes plus vifs remerciements à Madame le Docteur Laurence Lagneaux du Laboratoire d'Hématologie de l'Institut Bordet pour son aide et ses connaissances lors de la réalisation et l'interprétation des études de recherche d'apoptose.
Ma gratitude va également à Monsieur le Professeur Jean Paul Dehaye ainsi qu'à ses collaborateurs et à Monsieur le Professeur Ruysschaert et son collaborateur le Docteur M. Vandenbranden pour leurs contributions précieuses dans la cadre de la recherche de la P-gP-
Que les Doctorants (et Docteurs) ainsi que tous les membres du Laboratoire de Chimie Bioanalytique, Toxicologie et Chimie Physique Appliquée trouvent ici l'expression de mon amitié. Nos discussions passionnées et chaleureuses ont contribués à une ambiance de travail très agréable. Soyez tous remerciés pour vos conseils et pour votre inestimable aide.
SOMMAIRE
OBJECTIFS DU TRAVAIL... 1
CHAPITRE 1~ INTRODUCTION GENERALE... 3
1.1. CONSIDERATIONS GENERALES... 6
1.1.1. ABSORPTION... 7
1.1.2. DISTRIBUTION... 9
1.1.3. METABOLISATION...9
1.1.3.1. Généralités 1.1.3.2. Différents paramètres influençant la métabolisation 1.1.3.3. Bioinactivation et bioactivation 1.2. CYCLE CATALYTIQUE DU SYSTEME CYTOCHROME P450- MONOOXYGENASE...12
1.3. CLASSIFICATION DES ISOFORMES CYTOCHROME P-450... 18
1.3.1. CYTOCHROME P450: nomenclature... 18
1.3.2. PRINCIPAUX ISOENZYMES HUMAINS IMPLIQUES DANS LA METABOLISATION DES XENOBIOTIQUES... 19
1.4. FACTEURS INFLUENÇANT LE METABOLISME... 27
1.4.1. INHIBITION ET INDUCTION DU CYTOCHROME P450...27
1.4.1.1. Inhibition des enzymes du cytochrome P450 1.4.1.2. Induction des enzymes du cytochrome P450 1.4.1.2. a. Isoformes inductibles par des hydrocarbones aromatiques 1.4.1.2. b. Récepteur au phénobarbital 1.4.1.2. C. Induction par les stéroïdes 1.4.1.2. d. Autres inductions 1.4.2. AUTRES FACTEURS INFLUENÇANT LE METABOLISME...32
1.4.2.1. Influence du sexe de l'animal 1.4.2.2. Influence de l’espèce 1.4.2.3. Influence de 1' âge 1.4.2.4. Influence de facteurs génétiques 1.5. DETERMINATION DE L'ISOFORME IMPLIQUE DANS LE METABOLISME D’UN DERIVE... 39
1.5.1. ANALYSE PAR ETUDES DE CORRELATION... 39
1.5.2. UTILISATION D'INHIBITEURS... 39
1.5.3. UTILISATION D'ANTICORPS... 39
1.5.4. METABOLISATION PAR DES LIGNEES CELLULAIRES EXPRIMANT UN SEUL ISOFORME... 40
1.6. TECHNIQUES IN VITRO POUR ETUDIER LA METABOLISATION DE XENOBIOTIQUES... 40
1.6.1. GENERALITES... 40
1.6.2. MODELES DE METABOLISATION IN VITRO... 42
1.6.2.1. Coupes de foie 1.6.2.2. Hépatocytes 1.6.2.3. Fractions subcellulaires 1.6.2.4. Systèmes recombinants 1.6.3. APPLICATIONS DES MODELES IN VITRO... 45
I
CHAPITRE 2 :
METHODES GENERALES UTILISEES DANS LE TRAVAIL Y COMPRIS CERTAINS
ASPECTS LIES A LA CARACTERISATION DU MODELE CELLULAIRE... ... 48
2.1. INTRODUCTION... 50
2.2. MATERIEL ET METHODES... 51
2.2.1. Matériel... 51
2.2.1.1. Matériel relatif à l'enseinble du travail 2.2.1.2. Matériel relatif au Western blotting 2.2.1.3. Matériel relatif à la méthode fluorimétrique (Fura-2) 2.2.2. Modèles utilisés in vitro... 54
2.2.2.1. Choix de la lignée cellulaire 2.2.22. Choix des microsomes 2.2.2.S. Choix du substrat 2.2.3. Milieu de culture et maintient des lignées... 57
2.2.4. Mesure de la croissance cellulaire et de la cytotoxicité des différents dérivés au moyen du test MTT... 60
2.2.4.1. Principes 2.2.4.2. Modes opératoires 2.2.4.2. a.. Courbes de croissance cellulaire 2.2.4.2. b. Cytotoxicité 2.2.4.2. C. Traitement des résultats: logiciel FADHA 2.2.5. Dosage des protéines par la méthode de Folin... 67
2.2.6. Détection de la Pg-p par Western blotting...68
2.2.7. Détection de la Pg-p par une méthode fluorimétrique (Fura-2)... 71
2.3. RESULTATS... 74
2.3.1. Croissance cellulaire... 74
2.3.2. Tests MTT... 77
2.3.3. Dosage des protéines... 79
2.3.4. Western Blotting...79
2.3.5. Méthode fluorimétrique...80
CHAPITRE 3: MISE AU POINT ET VALIDATION D'UNE METHODE ANALYTIQUE PAR CLHP POUR L'ANALYSE DE L'ISRADIPINE ET DE SES PRICIPAUX METABOLITES DANS DIFFERENTS MILIEUX BIOLOGIOUES... ... 82
3.1. INTRODUCTION... 84
3.2. MATERIEL ET METHODES...85
3.2.1. Molécules étudiées...85
3.2.2. Réactife et appareillage... 87
3.2.3. Méthodes chromatographiques générales... 88
3.2.4. Méthodes utilisées lors de la validation... 88
3.2.4.1. Méthode CLHP... 88
3.2.4.2. Culture de cellules et milieu de culture... 88
3.2.4.3. Méthodes d'extraction... 88
3.2.4.4. Protocole opératoire...89
3.2.4.5. Définitions et description des critères de validation... 91
3.2.4.6. Aspects statistiques de la procédure de validation... 94
3.2.4.6.1. Généralités 2.4.6.2. Symboles utilisés 2.4.6.3. Formules 3.2.5. Principes de la chromatographie CLHP par appariement d'ions... 104
3.3. RESULTATS... 105
3.3.1. Mise au point de la méthode analytique...105
3.3.2. Validation...114
3.3.2.1. Stabilité 3.3.2.2.Spécificité 3.3.2.3. Validation dans l'eau 3.3.2.4. Validation dans le milieu cellulaire 3.3.2.5. Validation dans le culot cellulaire 3.4. CONCLUSION... 124
CHAPITRE 4: CONTRIBUTION AU DEVELOPPEMENT DU MODELE CELLULAIRE ET ETUDES D'INHIBITION... ... 126
4.1. INTRODUCTION...130
4.2. MATERIEL ET METHODES... 131
4.2.1. Développement de modèles de métabolisation... 131 4.2.1.1. Matériel (relatif aux modèles de métabolisation en général)
4.2.1.2. Méthodes (relatives aux modèles de métabolisation en général)
4.2.1.2. a. Méthodes générales utilisées conjointement aux méthodes de métabolisation
4.2. L2.a.l. Extraction à partir du culot cellulaire 4.2.1.2. a.2. Extraction à partir du milieu de culture 4.2.1.2. b. Préparation des solutions
4.2.1.2. C. Méthodes de métabolisation
4.2.1.2. C.L Modèle de métabolisation sur cellules h3A4/OR non lysées
4.2.1.2. C.2. Modèle de métabolisation sur cellules h3 A4/OR lysées
4.2.1.2. C.3. Modèle de métabolisation utilisant les microsomes 4.2.1.2. d. Etude du système métabolique utilisant les cellules h3A4/OR
non lysées
4.2.1.2. d.l. Effet du temps d'incubation de l'isradipine 4.2.1.2. d.2. Effet de la concentration en isradipine 4.2.1.2. d.3. Influence d'inducteurs enzymatiques 4.2.1.2. e. Etudes sur le système microsomial
4.2. L2.e.l. Taux de recouvrement de l’extraction
4.2.1.2. e.2. Effet du temps d’incubation de l’isradipine sur les microsomes
4.2.1.2. e.3. Effet de la concentration en isradipine sur les microsomes
III
4.2.2. Etudes d’inhibition (sur les cellules h3A4/OR non lysées
et sur le système microsomial)... 137
4.2.2.1. Matériel (relatif aux études d’inhibition) 4.2.2.2. Méthodes (relatives aux études d’inhibition) 4.2.2.2. a. Méthodes d'inhibition sur les cellules h3A4/OR non lysées 4.2.2.2. b. Méthodes d'inhibition sur les microsomes 4.2.2.2. C. Préparations des solutions (études d’inhibition) 4.2.3. Quantification... 139
4.2.4. Cytotoxicité... 139
4.2.5. Analyses statistiques... 140
4.3. THEORIES ENZ’m\TlQUES ET D’INHIBITION... 140
4.3.1. Cinétique enzymatique... 140
4.3.2. Etudes d'inhibition... 140
4.4. RESULTATS... 141
4.4.1. Modèle de métabolisation sur cellules h3A4/OR non lysées 4.4.1.1. Nombre de cellules...141
4.4.1.2. Influence d'inducteurs enzymatiques 4.3.1.3. Effet du temps d'incubation de l'isradipine sur les cellules h3A4/OR 4.4.1.4. Effet de la concentration en isradipine 4.4.2. Modèle de métabolisation sur cellules h3A4/OR lysées... 151
4.4.3. Modèle de métabolisation utilisant les microsomes... 153
4.4.3.1. Taux de recouvrement de l’extraction 4.4.3.2. Influence du temps d’incubation sur la métabolisation 4.4.3.3. Influence de la concentration en substrat 4.4.4. Résultats concernant les tests d’inhibition (sur cellules h3A4/OR non lysées et sur les microsomes)... 158
4.4.4.1. Détermination des CI50 des différents inhibiteurs étudiés... 158
4.4.4. La. Pourcentages d’inhibition de l’isradipine par le kétoconazole... 159
4.4.4.1 .a. 1. Sur les cellules h3A4/OR non lysées 4.4.4.1. a.2. Sur les microsomes 4.4.4.1. b. Pourcentages d’inhibition de l’isradipine par la troléandomycine... 160
4.4.4. l.c. Pourcentages d’inhibition de l’isradipine par la quercétine... 160
4.4.4.1. d. Pourcentages d’inhibition de l’isradipine par le saquinavir... 161
4.4.4.1. d.l. Sur les cellules h3A4/ORnon lysées 4.4.4.1 .d.2. Sur les microsomes 4.4.4.1 .e. Pourcentages d’inhibition de l’isradipine par l’indinavir...162
4.4.4.1. e.l. Sur les cellules h3A4/ORnon lysées 4.4.4.1. e.2. Sur les microsomes 4.4.4.2. Détermination du type d’inhibition et les paramètres d’inhibition Ki, Ki...164
4.4.4.2. a. Kétoconazole... 164
4.4.4.2. b. Troléandomycine... 166
4.4.4.2. C. Quercétine... 168
4.4.4.2. d. Saquinavir...170
4.4.4.2. e. Indinavir...172
4.4.4.2. f Détermination des paramètres d’inhibition...174
4.5. DISCUSSION...177
4.6. CONCLUSIONS...189
CHAPITRE 5:
MODELISATION MATHEMATIQUE... 187
5.1. INTRODUCTION... 189
5.2. GENERALITES... 189
5.2.1. Champs expérimental... 189
5.2.2. Structure des modèles...189
5.2.3. Fonction de coût définissant une distance entre le modèle et l'expérience... 191
5.2.4. Détermination des paramètres du modèle... 191
5.2.5. Validation du modèle...191
5.3. DEVELOPPEMENT DU MODELE MATHEMATIQUE... 192
5.3.1. Champs expérimental... 192
5.3.2. Structure des modèles...196
5.3.3. Fonction de coût définissant une distance entre le modèle et l'expérience...199
5.3.4. Détermination des paramètres du modèle...201
5.3.5. Validation du modèle... 202
5.3.6. Tableaux de résultats... 206
5.3.6.1. Etude sans inhibiteur 5.3.6.2. Etude avec inhibiteurs 5.3.6.2.1. Kétoconazole 5.3.6.2.2. Saquinavir 5.3.7. Graphiques... 213
5.4. DISCUSSION... 229
5.5. CONCLUSIONS...233
CHAPITRE 6: APPLICATION DU MODELE DE METABOLISATION UTILISANT LES CELLULES h3A4/ORNON LYSEES... 235
6.1. INTRODUCTION...238
6.2. BUTS... 244
6.2.1. ETUDE METABOLIQUE DE L'HMM... 244
6.2.2. ETUDE DES DEGATS AU NIVEAU DE L'ADN (AU MOYEN DE LA TECHNIQUE COMET) ET METHODES DETECTANT L'APOPTOSE...244
6.3. PRESENTATION DES TECHNIQUES... 245
6.3.1. ESSAI COMET... 245
6.3.2. ETUDE DES DEGATS AU NIVEAU DE L'ADN (METHODES DETECTANT L'APOPTOSE)... 248
6.3.2.1. BREVE DESCRIPTION DU PHENOMENE D'APOPTOSE
V
63.2.2. TECHNIQUES D'ETUDE DE L'APOPTOSE 6.3.2.2. a. ETUDES MORPHOLOGIQUES
6.3.2.2. b. PRINCIPE DU TEST UTILISANT L'ANNEXINE V- FITC/PI
6.3.2.2. C. PRINCIPE DU TEST UTILISANT L'IODURE DE PROPIDIUM
6.3.2.2. d. CYTOMETRIE DE FLUX
6.4. MATERIEL... 252
6.5. METHODES...254
6.5.1. TEST DE CYTOTOXICITE (MTT)... 254
6.5.2. METABOLISATION... 254
6.5.3. ESSAI COMET... 255
6.5.4. ETUDE DE L'APOPTOSE... 257
6.5.4.1. EXPOSITION DES CELLULES AUX TOXIQUES 6.5.4.2.. ETUDES MORPHOLOGIQUES 6.5.4.3. ANNEXINE V-FITC / PI 6.5.4.4. L'IODURE DE PROPIDIUM 6.5.5. PREPARATION DES SOLUTIONS STOCKS... 259
6.6. RESULTATS ET DISCUSSION... 259
6.6.1. TESTS DE CYTOTOXICITE (MTT)... 259
6.6.2. METABOLISATION... 261
6.6.3. ESSAI COMET... 263
6.6.4. APOPTOSE... 269
6.6.4.1. ETUDES MORPHOLOGIQUES 6.6.4.2. ANNEXINE V-FITC / PI 6.6.4.3. L'IODURE DE PROPIDIUM 6.7. CONCLUSIONS...278
CHAPITRE 7: DISCUSSION GENERALE... 281
CHAPITRE 8: CONCLUSIONS GENERALES... 293
CHAPITRE 9:
REFERENCES BIBLIOGRAPHIOUES... ...295
VII
OBJECTIFS DU TRAVAIL
Les recherches et études concernant le rôle des principaux enzymes du système du cytochrome P450 impliqués dans le métabolisme de médicaments et de xénobitiques sont devenues des éléments importants lors des difiFérents stade de développement d'une molécule et principalement en phase de recherches précliniques. Pour faciliter ces études, depuis ces dernières décennies, différents systèmes in vitro ont été mis au point, utilisant divers modèles:
coupes de foie, hépatocytes, microsomes, systèmes recombinants....Chacun présente avantages et inconvénients en regard de l'utilisation souhaitée.
La métabolisation de médicaments par un processus oxydatif est réalisé majoritairement par un isoformé particulier dénommé CYP3A4. Il est largement distribué dans l'organisme humain et permet la métabolisation de substrats appartenant à de nombreuses classes thérapeutiques et présentant des structures chimiques très diverses.
Le but principal de ce travail est d'optimiser un modèle de métabolisation in vitro utilisant une lignée cellulaire continue exprimant l'isoforme 3A4. Les cellules utilisées h3A4/OR seront utilisées pour la métabolisation de l'isradipine, substrat du CYP3A4 et analogue de la nifédipine, substrat de référence pour l'enzyme étudié.
Différents paramètres relatifs à la lignée cellulaire vont être étudiés pour permettre le
développement d'un système de métabolisation optimal. Une méthode analytique originale et diverses méthodes d'extraction seront développées et validées pour permettre une analyse qualitative et quantitative du substrat et métabolite(s) présents.
DifiFérents systèmes de métabolisation seront développés et seront caractérisés par difiFérents paramètres cinétiques reconnus dans la littérature. Le modèle le plus performant sera
déterminé.
DifiFérents inhibiteurs enzymatiques potentiels de l'isoforme 3A4 seront testés sur le modèle développé. Les types d'inhibitions rencontrés seront étudiés au regard des théories d'inhibition définies dans la littérature et les difiFérentes constantes d'inhibition seront déterminées.
Un modèle mathématique performant mieux adapté aux conditions expérimentales
rencontrées sera développé pour permettre l'étude de l'évolution temporelle de la quantité de métabolite formé en fonction de l'augmentation de concentration en substrat et dans une seconde étape de suivre l'évolution de ce produit en présence d'inhibiteurs.
du CYP3A4 sera vérifiée dans la lignée h3A4/OR au moyen de deux techniques utilisant respectivement le Westem-blotting et la fluorescence.
Le modèle de métabolisation développé sera couplé à plusieurs types de mesures au niveau cellulaire, permettant d'apporter certains renseignements sur la toxicité des métabolites formés. Ceci sera réalisé pour étudier le mécanisme d'action de l'altrétamine, dérivé
anticancéreux exerçant potentiellement son activité après formation de métabolites réactifs.
Les dégâts provoqués au niveau de l'ADN seront visualisés au moyen des techniques COMET et de cytométrie de flux directement sur les cellules ayant métabolisés la prodrug.
CHAPITRE 1
INTRODUCTION GENERALE
1.1. CONSIDERATIONS GENERALES
1.1.1. ABSORPTION 1.1.2. DISTRIBUTION 1.1.3. METABOLISATION
1.1.3.1. Généralités
1.1.3.2. Différents paramètres influençant la métabolisation 1.1.3.3. Bioinactivation et bioactivation
1.2. CYCLE CATALYTIQUE DU SYSTEME CYTOCHROME P450- MONOOXYGENASE
1.3. CLASSIFICATION DES ISOFORMES DU CYTOCHROME P-450 1.3.1. CYTOCHROME P450: nomenclature
1.3.2. PRINCIPAUX ISOENZYMES HUMAINS IMPLIQUES DANS LA METABOLISATION DES XENOBIOTIQUES
1.4. FACTEURS INFLUENÇANT LE METABOLISME
1.4.1. INHIBITION ET INDUCTION DU CYTOCHROME P450 1.4.1.1. Inhibition des enzymes du cytochrome P450
1.4.1.2. Induction des enzymes du cytochrome P450
1.4.1.2. a. Isoformes inductibles par des hydrocarbones aromatiques 1.4.1.2. b. Récepteur au phénobarbital
1.4.1.2. C. Induction par les stéroïdes 1.4.1.2. d. A utres inductions
1.4.2. AUTRES FACTEURS INFLUENÇANT LE METABOLISME 1.4.2.1. Influence du sexe
1.4.2.2. Influence de l'espèce 1.4.2.3. Influence de l'âge
1.4.2.4. Influence de facteurs génétiques
1.5. DETERMINATION IN VITRO DE L'ISOFORME IMPLIQUE DANS LE METABOLISME D'UN DERIVE
1.5.1. ANALYSE PAR ETUDES DE CORRELATION 1.5.2. UTILISATION D'INHIBITEURS
1.5.3. UTILISATION D'ANTICORPS
1.5.4. METABOLISATION PAR DES LIGNEES CELLULAIRES EXPRIMANT UN SEUL ISOFORME
1.6. TECHNIQUES IN VITRO POUR ETUDIER LA METABOLISATION DE XENOBIOTIQUES
1.6.1. GENERALITES
1.6.2. MODELES DE METABOLISATION IN VITRO 1.6.2.1. Coupes de foie
1.6.2.2. Hépatocytes
1.6.2.3. Fractions subcellulaires 1.6.2.4. Systèmes recombinants
1.6.3. APPLICATIONS DES MODELES IN VITRO
1.1. CONSIDERATIONS GENERALES
Le développement de nouveaux médicaments et l'exposition de l'homme à im nombre
croissant de xénobiotiques (s 200 000) et de polluants de l'environnement rend primordiale la compréhension des processus de métabolisation et la connaissance de leurs interactions potentielles [Lewis, 1998, a].
L'évolution et les progrès des techniques analytiques et biochimiques ont permis de comprendre et de préciser le mode d'action de nombreux dérivés.
En examinant le devenir d'une substance exogène dans l'organisme, il est utile de distinguer dififérentes étapes (Figure LL).
Fieure 1.1.
Devenir d'une substance exogène dans l'organisme.
Mé^cament
- désintégration de la forme
- dissolution de la substance active
phase
oharmaceutiaue
'y
médicament devient disponible par absorption
r Absorption Distribution Métabolisation Excrétion
phase
oharmacocinétiaue
y
médicament devient disponible pour l'action
r
Organe cible:
Interaction médicament-récepteur
phase
nharmacodvnamiaue
La pharmacologie s'intéresse à l'action du médicament sur l'organisme au contraire de la pharmacocinétique qui a pour objet l'étude descriptive et quantitative de l'action de l'organisme sur le médicament et autres substances actives étrangères à l'être humain.
Il existe une relation (le plus souvent linéaire) entre la concentration de médicament au niveau de son site d'action et son activité thérapeutique. Cette concentration est directement
proportionnelle à la dose administrée mais certains facteurs affectent cette concentration:
- absorption à partir du site d'exposition - distribution dans les tissus
- métabolisation - excrétion.
Ces quatre étapes en interrelations peuvent être résumées comme indiqué dans la figure 1.2. .
Fieure 1.2.
Etapes pharmacocinétiques.
Absorption---► Distribution ◄---► Métabolisation
Excrétion 1.1.1. ABSORPTION
Ce phénomène d'absorption est directement lié à la notion de biodisponibilité absolue
représentant la fraction du médicament en solution qui, après absorption, atteint la circulation générale et la vitesse à laquelle elle y arrive.
Après une prise orale (la plus rencontrée en thérapeutique) et arrivée dans le tractus intestinal, le médicament doit passer quatre sites physiologiques principaux intervenant dans la
biotransformation avant d'atteindre la circulation systémique: la lumière intestinale, la muqueuse intestinale, le foie, les poumons.
Il y a possibilité de perte de médicament au niveau de la lumière intestinale sous l'effet des enzymes de la flore et au niveau du passage de la muqueuse présentant à ce niveau un taux d'enzyme plus important. Ces phénomènes de dégradation et/ou de métabolisation sont appelés effet de premier passaee intestinal.
Après résorption au niveau de l'intestin, le médicament atteint le foie par la veine porte. Les hépatocytes du foie en contact avec le sang peuvent capter ces dérivés et les transformer de façon intense en métabolites. Cette capture par le foie, organe essentiel des métabolisations, aboutit à une perte de médicament par métabolisme et constitue l’effet de premier passage hépatique. Cet effet est quantifié par un coefficient d'extraction hépatique (fraction de médicament extraite par un organe à chaque passage et soustraite à la circulation générale) et
thérapeutique. Cependant, un effet favorable peut être enregistré après libération de produits actifs. Dans le cas où seule la molécule initiale est active, les médicaments qui subissent un grand effet de premier passage hépatique auront une biodisponibilité faible. Il est difficile de prévoir cet effet, de plus des variabilités entre les individus existent (ex: la quantité de propanolol atteignant la circulation générale varie de 20 à 80 % de la dose administrée [TimbreU, 3""“éd. ].
Très souvent l'effet de premier passage est assimilé à l'effet de premier passage hépatique.
De façon générale, les substances administrées par voie orale sont susceptibles d'être
biotransformées avant d'atteindre la circulation générale. Ces phénomènes mettant enjeu des réactions de nature enzymatique sont, par définition, saturables et peuvent aboutir à une atténuation des métabolisations par augmentation des doses administrées se traduisant par une augmentation des taux plasmatiques circulant de la molécule initiale.
Différents facteurs sont susceptibles de modifier l'effet de premier passage. Au niveau pulmonaire l'incidence essentielle s'observe chez les fumeurs. Au niveau intestinal, l'alimentation, le ralentissement de la motilité intestinale et une modification de la flore intestinale (prise d'antibiotiques) peuvent être à l'origine de variations importantes.
Le métabolisme hépatique est influencé par trois facteurs importants:
- interactions exogènes: aliments, substances susceptibles d'induire ou d'inhiber le métabolisme
-âge
- états pathologiques: maladies hépatiques, modifications hémodynamiques et métaboliques entraînant des modifications de débit sanguin hépatique (insuffisance cardiaque...) et de façon générale toutes maladies susceptibles de modifier l'activité enzymatique.
La connaissance d'un effet de premier passage (notamment au niveau hépatique) est
primordiale pour comprendre les différences d'activités selon les voies d'administration, pour établir en conséquence les posologies actives en fonction du type d'administration et pour éviter tout accident lié au surdosage.
I.I.2. DISTRIBUTION
La distribution est le processus dans lequel un composé est transporté vers l'ensemble des tissus ou des organes par le flux sanguin ou le système lymphatique.
Une fois dans la circulation générale, le médicament se trouve dans le plasma et va diffuser librement dans les capillaires sanguins et/ou se fixer à des protéines des cellules sanguines et quitter la circulation pour aller vers les tissus.
1.1.3. METABOLISATION
1.1.3.1. Généralités
La métabolisation (ou biotransformation) est le processus par lequel un médicament va être transformé en métabolites (actifs ou non actifs) dans l'organisme.
La métabolisation est le plus souvent un processus de détoxification. Dans certain cas, les métabolites sont des substances plus toxiques ou constituent les réels agents
pharmacologiques.
Le foie constitue l'organe essentiel où s'effectue la majorité des métabolisations. Il existe cependant d'autres voies de métabolisation au niveau de l'intestin, des rems, du tube digestif, du sang....
La figure 1.4. reprend differents processus impliqués dans la métabolisation hépatique.
Fieure 1.4.
Métabolisation hépatique.
PRECURSEUR INACTIF MEDICAICNT ACTIF
nétabollte inactif
L'un des buts ultimes des processus de biotransformation est la conversion de substances relativement lipophiles en dérivés plus polaires et par conséquent plus facilement éliminables
On note deux types de réactions:
1. réaction déphasé 1: réaction de dégradation. La molécule initiale est transformée en métabolite polaire le plus souvent par addition de groupements ionisables.
Ce sont les réactions d'oxydations, réductions, hydrolyses faisant appel à de nombreux systèmes enzymatiques: cytochrome P450 {point 1.2.), réductases, estérases...
2. réaction de phase 2: phase de synthèse ou de conjugaison entre le ou les
métabolite(s) formé(s) et une substance endogène. Le dérivé polaire de phase 1 est transformé en un dérivé de polarité accrue très hydrophile facilement éliminable par élimination rénale.
Réactions de phase 1
Le système enzymatique le plus important impliqué dans les réactions de phase 1 est le système du cytochrome P450. Ce système localisé au niveau du réticulum endoplasmique est particulièrement abondant au niveau du foie mais se trouve également au niveau des intestins, des reins, du coeur, du cerveau, des poumons, de la peau. Ce système catalyse des réactions d'oxydation et présente une large gamme de substrats de structures chimiques très différents.
Son mode d'action et sa spécificité seront envisagés d'un point de vue détaillé dans la section 1.2..
Les réactions d'oxydations les plus courantes sont des N-oxydation, S-oxydation, oxydations aromatiques, aliphatiques, hétérocycliques, déalkylations. Il existe d'autres systèmes
enzymatiques: amine oxydase, mono-oxygénase, flavine monooxygénases, aldéhyde déshydrogénase, xantine oxydase, alcool déshydrogénase...
La majeure partie des réactions de réductions sont des azo et nitro réductions. Ces enzymes (réductases) sont présentes dans la flore intestinale et dans d'autres tissus.
Les hydrolyses concernent le plus souvent des groupements ester ou amide. Elles sont catalysées par des enzymes présentant ime large gamme de substrats.
Réactions de phase 2
Ce sont les glucurono, sulfo, glycyl, acétyl-conjugaisons, les méthylations....Les enzymes intervenant dans ces réactions sont le plus souvent des transférases.
Remarque
II existe une réaction appelée parfois métabolisation de phase 3 caractérisée par une conjugaison du xénobiotique au glutathion. Cette molécule est parmi les plus importantes dans les mécanismes de détoxification de l'organisme contre ime substance étrangère. Ce tripeptide particulièrement abondant au niveau du foie se conjugue entre autre avec les espèces électrophiles (très réactives, potentiellement toxiques pour les macromolécules nucléophiles comme l'ADN...) issues des réactions de phase 1.
1.1.3.2. Différents paramètres influencent la métabolisation
On peut distinguer différents facteurs intrinsèques (propres à l'organisme qui métabolise) et les facteurs extrinsèques. Parmi les facteurs intrinsèques, on peut citer: spécificité d'espèces, sexe, états physiologiques (âge, femme enceinte...), présence de cofacteurs, états
pathologiques (insuffisance rénale et hépatique, maladies cardio-vasculaires, pulmonaires, migraines...), rythmes circadiens, influence du stress, compliance, constitution génétique...
Parmi les facteurs extrinsèques citons la dose (et la saturation éventuelle de systèmes
enzymatiques), présence d'agents protecteurs ou d'agents de l'environnement, les interactions médicamenteuses (compétition de deux substances pour un même site, induction ou inhibition enzymatique...).
1.1.3.3. Bioinactivation et bioactivation
La métabolisation est le plus souvent génératrice de détoxification mais parfois peut produire des métabolites beaucoup plus réactife et même parfois toxiques, incluant carcinogénicité, tératogénicité et mutagénicité [Shimada, 1989, a] [Raza, 1994 ] [Kahl, 1977 ] [Brian, 1990 ] [Hashimoto, 1995] [Guerre, 2000 ] [Gallagher, 1994] [Shimada, 1989, b] [Guengerich, 2000, a ] [Guengerich, 1991 ] [Glatt, 2000 ] [Nedelcheva, 1994 ] [Paofini, 1997 ] [Crespi, 1993 ].
La connaissance minutieuse des différentes voies de métabolisation d'un dérivé est particulièrement importante tors du développement de nouvelles molécules (NCE: New Chemical Entities) en phase préclinique de développement.
La figure 1.5. illustre différentes conséquences du métabolisme d'un dérivé étranger.
Figure 1.5.
Conséquences du métabolisme de xénobiotiques.
L'élimination d'un médicament est liée à la notion de clairance totale correspondant à la capacité de l'organisme à épurer le composé après qu'il ait atteint la circulation générale.
La clairance totale correspond à la somme des clairances partielles rénale, hépatique et due à d'autres organes de métabolisation. Elle dépend (en un organe précis) du débit sanguin en cet organe et du coefiBcient d'extraction du composé par cet organe.
Un paramètre utile est le temps de demi-vie (t l/2~) correspondant à l'intervalle de temps durant lequel une concentration X de médicament est réduite à la valeiu- X/2 à la suite d'im processus d'élimination.
Le volume de distribution, la clairance et le t ’/z apparaissent comme des paramètres primordiaux lors d'études pharmacocinétiques.
1.2. CYCLE CATALYTIQUE DU SYSTEME CYTOCHROME P450- MONOOXYGENASE
Les cytochromes P450 appartiennent à une famille é'héme-thiolate-proléines faisant partie des déhydrogénases ou oxygénases [Granner, 1989]. Elles catalysent les réactions
d'oxydations d'une large gamme de composés endogènes ou exogènes incluant les médicaments et carcinogènes. Originellement décrite comme ime seule protéine, il est actuellement connu plus de 400 cytochromes P450 largement distribuées au sein du monde animal, des plantes et des micro-organismes et situées dans le réticulum endoplasmique [Lewis, 1998, a] [Omura, 1999 ].
La structure de base des cytochromes est le noyau porphyrine, corps formé de quatre cycles pyrrohques reliés entre eux par des ponts méthényls. La protéine contient im seul groupe prosthétique appelé protoporphyrine IX. Le noyau hèmique est constitué d'im atome de fer à l'étage d'oxydation +3 ou +2 liés aux quatre azotes (figure 1.6. ) [Omura, 1999 ]
[Lewis, 1998, a].
Fieure 1.6.
Représentation du cycle hèmique.
X
Il existe dans le cas du cytochrome P450 un cinquième ligand inhabituel provenant d'un résidu de cystéine (cystéine-thiolate) donnant un spectre d'absorption caractéristique avec un maximum à 450 nm en présence de monoxyde de carbone (fixé à la forme réduite de
l'enzyme). Lorsque ce lien (thiolate) est rompu, le cytochrome est converti en une forme inactive appelée cytochrome P420 [Capdela, 2™® éd.]. Au cours de la réaction, le fer se liera en plus, avec le substrat ou la molécule d'eau. Le nom de cytochrome P450 provient de ce spectre particulier illustré dans la figure 1.7. .
Fisiire 1.7.
Spectre d'absorption du cytochrome P450.
Pour les autres hémoprotéines liant le CO, la longueur d'onde maximale d'absorption est de 420 nm. Toutes les hémoprotéines absorbent dans le visible mais seul le cytochrome P450, par la présence de son cinquième ligand, absorbe à 450 nm.
Cependant l'addition de ligands organiques ou inorganiques va perturber ce spectre. Ces perturbations de spectres, visibles au moyen d'un spectrophotomètre sensible, ont été étudiées pour caractériser les dififérents cytochromes P450, surtout dans les décades précédant le développement de la biologie moléculaire permettant les clonages moléculaires et l'expression d'isoformes spécifiques (formes différentes du cytochrome P450, envisagé au point 1.3.2.) [TimbreU, 3^éd. ].
Cette famille intervient dans différents métabolismes essentiels:
- le système de métabolisation par oxydation des médicaments et xénobiotiques
- d'autres voies métaboliques importantes de la cellule telles que: biosynthèse des hormones stéroïdiennes, dégradations du cholestérol, métabolisme des acides gras et de leurs dérivés...
Les dififérents composés de cette famille servent d'agents transporteurs d'électrons au cours de réactions d'oxydo-réductions.
La réaction globale eatalysée par le système du cytochrome P450-monooxygénase s'écrit:
Substrat (RH) + O2 + NADPH + _____ ► Produit (ROH) + H2O + NADP^
Une molécule de substrat réagit avec une molécule d'oxygène moléculaire et du NADPH pour former le substrat oxydé contenant un atome d'oxygène moléculaire, de l'eau (contenant l'autre atome d'oygène) et le NADPH sous forme oxydée. Le cytochrome P450 sert d'accepteur d'électrons mais également de monoxvsénase dans les systèmes de transports d'électrons. L'incorporation d'un atome d'oxygène à partir de l'oxygène moléculaire au substrat est à l'origine du nom monooxygénase. La stoechiométrie de la réaction semble simple mais il existe un grand nombre d'oxydation et de réduction qui se déroulent simultanément. Au total, cette réaction requiert 2 électrons pour la réduction du noyau hémique, le lien oxygène et le clivage de l'oxygène. Durant la catalyse, le cytochrome P450 lie directement le substrat et l'oxygène moléculaire mais n'interagit pas directement avec le NADPH. Les électrons sont pris en charge du NADPH vers le cytochrome P450 par la
NADPH-cytochrome c réductase [Capdella, ] [Lewis, 1998, a ] [Guengerich, 2000 ] [Shen, 2000 ] [Lewis, 2000, a] [Voice, 1999 ] [Omura, 1999 ] [Yamazaki, 1995 ]
[Halpert, 1998] .
La NADPH-cytochrome c réductase est une flavoprotéine contenant deux flavines: une flavine adénine dinucléotide (FAD) et une flavine mononucléotide (FMN). Grâce à cette flavoprotéine, les électrons sont transférés à partir du NADPH vers le cytochrome par la FAD (servant de site pour l'entrée d'électron) vers la FMN (donneur d'électron au cytochrome P450). La flavoprotéine réduite donne ses électrons à la forme oxydée (Fe du cytochrome P450. Celle-ci se transforme en forme réduite
(Fe ^"^.Cette forme réduite réagit alors avec l'oxygène moléculaire dont un atome sera réduit pour donner l'eau et l'autre atome créera une liaison avec le substrat. Cette enzyme sert aux transferts de deux électrons (un à un).Un premier électron sert donc à créer le lien avec l'oxygène et le deuxième au clivage de la molécule d'02.
Il existe dans le foie une deuxième chaîne transporteuse d'électrons non phosphorylants: ü s'agit de la NADH-cvtochrome b s réductase et du cytochrome . Cette chaîne apparaît parfois pour le transfert du second électron. Cette réaction est eflFectuée par la réductase qui réduit le cytochrome bs et transfère l'électron au cytochrome P450. Il est largement distribué dans la fraction microsomiale et est impHqué dans certaines réactions métaboliques (comme la désaturation des acides gras) impliquant des substrats endogènes. Il est clair qu'il n'est pas essentiel pour toutes les P450- monooxydations et la raison pour laquelle certaines réactions requièrent le cytochrome b 5 n'est pas complètement connue [Omura, 1999 ] [Lewis, 1998, a ].
Le système cytochrome P450-monooxygénase est un ensemble d'enzymes constitués de:
- cytochrome P450
- NADPH-cytochrome c réductase (ou NADPH cytochrome P450 réductase) - cytochrome b 5
- NADH-cytochrome bs réductase.
Le mécanisme d'action du système du cytochrome P450 n'est pas encore tout à fait établi, cependant les points reconnus sont exposés dans la figure 7.8. .
NADPH
Etape!
1
D'après [Capdela, 2'^éd.].
• Etape J: l'étape initiale consiste à la liaison du substrat (R)avec la forme oxydée du cytochrome P450,
• Etape 2 : réduction par addition d'un électron catalysée par la NADPH-cytochrome c réductase à partir du NADPH pour former un complexe cytochrome-substrat sous forme réduit. L'atome de fer est réduit de l'état Fe à l'état Fe Ce complexe peut
éventuellement se lier avec le CO pour former un complexe possédant un spectre caractéristique (maximum à 450 nm).
• Etape 3: cette étape est moins bien comprise et implique l'interaction avec l'oxygène moléculaire pour former un complexe ternaire. L'oxygène semble exister sous forme peroxyde ou sous forme superoxyde ).
• Etape 4: ce complexe accepte un second électron à partir du NADPH (réaction catalysée par la NADPH-cytochrome c réductase).
• Etape 4' : le second électron peut être donné par une voie alternative par le NADH via le cytochrome b 5 et la NADH-cytochrome bs réductase.
un ou plusieurs complexes de structures peu connues. Ce mécanisme, encore obscur, semble impliquer l'oxygène sous sa forme activée (anion peroxyde). Normalement, un atome d'oxygène se lie au substrat pour donner le produit et l'autre est réduit en H2O et génération de la forme oxydé du cytochrome. Cep>endant, le complexe peut parfois se rompre et former de l'H202 et la forme oxydée du cytochrome.
Il existe deux produits résultant de la métabolisation de l'oxygène: fanion superoxyde O2 et
Si saturation: O2 + H2O2--- ► O2 + OH' + OH (OH‘ radical libre hydroxyl provoquant une réaction en chaîne au niveau des lipides non saturés des membranes (peroxydation)
provoquant une nécrose cellulaire et dans certains cas réactions avec l'ADN (entraînant des phénomènes de carcinogénicité, mutagénicité, tératogénicité) [Hanocq, 1993 ].
Les phospholipides semblent également importants dans ce complexe enzymatique poim l'intégrité et les interconnections entre le cytochrome P450 et la réductase [Timbrell, 3““éd. ].
Le cytochrome P450, la NADPH cytochrome réductase, la NADH-cytochrome b 5 réductase et le cytochrome b 5 sont situés dans la membrane du réticulum endoplasmique, ce qui facilite leurs interactions [Capdela, 2®™éd. ].
La majorité des réactions d'oxydations sont catalysées par le système du cytochrome P450 monooygénase qui est localisé dans le réticulum endoplasmique des cellules. Ce système enzymatique est isolé dans la fraction microsomiale (qui provient du réticulum
endoplasmique) après homogénéisation des cellules hépatiques (hépatocytes) et fractionnement par différentes ultracentrifiigations.
Les microsomes sont des fragments du réticulum endoplasmique dans lequel l'activité enzymatique est préservée. Les deux types de réticulum endoplasmiques (lisse et rugueux contenant des ribosomes) présentent ce système enzymatique mais les microsomes issus du
• Etape 5: le complexe ternaire ayant accepté le second électron se réarrange et il se forment
H2O2 (éliminé par les peroxydases)
cytochrome, il existe dans le rétieulum endoplasmique d'autres types d'enzymes: azo réductase, cholestérol estérase, glucuronosyl tranférase....
1.3. CLASSIFICATION DES ISOFORMES DU CYTOCHROME P-450
1.3.1. CYTOCHROME P450: nomenclature
Depuis sa découverte en 1964, par Omura et Sato, un nombre important d'isoformes ont été isolés et caractérisés. Les techniques récentes en biologie moléeulaire (techniques de
recombinaison de 1' ADN) ont permis de caractériser plus de 400 gènes dont la séquence de nucléotides et d'acides aminés ont été identifiées et eomparées. Dans certains cas, la
localisation du gène sur un chromosome particulier et les mécanismes d'expression de ces gènes ont été étudiés.
Un système de nomenclature à été proposé en 1987 et a été revu plusieurs fois, la dernière révision datant de 1996 [ Nelson, 1996 ].
Selon cette dernière nomenclature, les gènes codants sont appelés CYP. Un nombre arabe suit ce préfixe désignant la famille. Une lettre désigne ensuite la sous-famille et un nombre arabe identifie un gène (ou enzyme) individuel [Capdella, 2 ®"“éd. ] [Nebert, 2000 ]
[Rendic, 1997 ] [Omura, 1999 ] [Omiecinski, 1999 ].
Le nom d'un gène est indiqué de façon italique au contraire de celui de la protéine (enzyme).
Selon eette classification, la séquence d'acides aminés d'un membre d'une famille est égale ou inférieure à 40 % à celle d'un membre d'une autre famille de gènes (ex: CYPl, CYP2.
Les séquences d'acides aminés entre 40 et 55 % identiques appartiennent à difierentes sous- familles (ex: CYP2A, CYP2B...).
Une séquence identique supérieure à 55 % indique des membres d'une même sous-famille appelées également isoenzymes ou isoformes (ex.: CYP2A1, CYP2A2).
Remarques
A l'heure actuelle, dû à la multiplicité des gènes dans une espèce définie, de nombreuses formes du cytochrome P450 appelées isoformes ou isoenzymes ont été identifiées. D'une espèce à l'autre (micro-organismes, bactéries...) de grandes similitudes entre les isoenzymes existent. Il faut cependant remarquer que le nombre d'isoenzymes diffère d'une espèce à l'autre.
La quantité et l'activité de chaque isoenzyme varie d'un individu à l'autre et dépend de facteurs environnementaux et génétiques (point 1.4.2.4.).
Bien que ces enzymes servent toutes d'agents transporteurs d'électrons au cours de réactions d'oxydations, beaucoup d'isoenzymes sont non spécifiques et des substrats de structures et classes thérapeutiques très diverses sont métabolisés par un même isoforme
[Lewis, 1998 ] [Ekins, 1999 ].
De plus, il est possible parfois que plusieurs isoenzymes contribuent à la métabolisation d'une même substance (ex: le propranolol pour lequel l'isoforme 2D6 et 2C19 catalysent
respectivement la formation du 40H propranolol et de l'acide naphtoxyacétique [Timbrell, 3"^éd.].
1.3.2. PRINCIPAUX ISOENZYMES HUMAINS IMPLIQUES DANS LA METABOLISATION DES XENOBIOTIOUES
Les cytochromes P450-monooygénases sont, de loin, les plus souvent rencontrés pour l'oxydation des xénobiotiques (= 90 %) dû à leur abondance dans l'organisme
(particulièrement le foie), le nombre important d'isoenzymes et leur potentialité d'induction par d'autres xénobiotiques. Bien que ces enzymes soient plus abondants au niveau du foie, ils sont présents dans d'autres organes (figure 1.9.) [Zhang, 1999 ].
Fleure 1.9.
Répartition des différents isoformes au sein des différents organes ou tissus extrahépatiques (chez l'homme).
CYP enzyme Organes ou tissus
lAl poumons, reins, tractus GI, peau, placenta, lymphocytes IBl peau, reins, seins, prostate, utérus, foetus
2A6 poumons, membrane nasale
2B6 tractus GI, poumons
2C tractus GI (petit intestin), larynx, poumons
2D6 tractus GI
2E1 poumons, placenta
3A tractus GI, placenta, foetus, utérus, reins, poumons tractus GI; tractus gastrointestinal. [Capdella, 2"“éd. ].
La présence ou l'absence dans un organe ou tissu d'un isoenzjmie en particulier (possédant sa
La quantité relative des différents isoformes dans le foie humain et l'importance relative des différents isoformes dans le métabolisme de médicaments sont illustrées respectivement dans les figures 1.10. et 1.11. .
Fisure 1.10.
Quantité relative des divers isoformes dans le foie humain.
CYP 2A6 CYP1A2 CYP3A
Fisure 1.11.
Importance relative des divers isoformes dans le métabolisme de médicaments.
D'après [Rendic, 1997 ], [Guengerich, 1996 ], [Capdella, 2'™éd. ] .
Comme l'indique la figure 1.11. , les iso formes 3 A4 et 2D6 (considérés globalement) sont responsables de 70 à 75 % des réactions de métabolisation impliquant le système du
cytochrome P450. Seul l'isoforme 3A4 sera envisagé dans notre travail étant donné sa place prépondérante (> 50 %) dans les processus d'oxydation de médicaments (et substances endogènes en général).
La partie suivante présentera brièvement les principaux isoformes impliqués dans le métabolisme de xénobiotiques [Capdella, 2 “™éd. ] [Nebert, 2000 ] [Rendic, 1997 ] [Omura, 1999 ] [Omiecinski, 1999 ].
CYP 1
La famille CYPl est majoritairement responsable de l'activation métabolique de procarcinogènes de l'environnement, de toxines et de toxiques en général.
Cette famille comprend deux isoformes: CYPl Al et CYPl A2, ce dernier présentant im taux relativement important dans les microsomes humains. On a constaté que leurs quantités diminuaient dans le foie et dans les autres tissus après la naissance mais persistaient de façon non négligeable dans les tissus présentant un taux de division important [Rendic, 1997 ].
Certains médicaments sont des substrats du CYPl A2 (ex: amines aromatiques,
acétominophène, phénacétine, caféine, 7-éthoxyrésorufine, propranolol,....) cependant certains sont également substrats d'autres isoformes. L'aflatoxine Bi (dérivé naturel) est également transformée en un dérivé toxique par cet isoforme. La caféine (N3 déméthylation) et la phénacétine (0-dééthylation) sont souvent utilisées comme substrats de référence pour cet isoforme.
Divers inducteurs et inhibiteurs enzymatiques sont connus. Des inhibiteurs relativement spécifiques du CYPl A2 sont la 7-8 benzoflavone (et différentes flavones en général), la fiirafylline et la fluvoxamine. Il existe cependant des différences d'inhibhion pour vm même dérivé selon les espèces: la fürafyUine est un inhibiteur puissant du CYPl A2 chez l'homme mais est im inhibiteur faible chez le rat.
Il a été reporté que le métabolisme de la phénacétine et du propranolol augmentait avec la prise de cigarettes. On a d'ailleurs constaté une corrélation entre le taux de ces isoformes au niveau du poumon et le taux de cancer (activation de PAH: hydrocarbones polycycliques aromatiques) [Neal, 1995 ] [Gonzalez, 1994 ]. L'agent inducteur reporté comme le plus puissant est un polluant de l'environnement: le TCDD (2,3,7,8 tétraclorodibenzo-p-dioxine).
La viande grillée est signalée également comme inducteur.
L'isoforme CYPl Al catalyse les réactions de peu de médicament mais cependant est considéré comme le plus actif dans l'activation de procarcinogènes de l'environnement (ex:
PAH). Il se trouve surtout au niveau extrahépatique, notamment dans les poumons de fiimeurs. Le gène CYPl Al a été détecté dans des tissus cancéreux humains (cellules de carcinomes pulmonaires et seins) [Rendic, 1997 ]. Il est également inductible par le TCDD.
La famille CYP2 est la plus répandue et la plus diversifiée. Elle comprend plusieurs sous- familles: CYP2A, CYP2C, CYP2D et CYP2E [Nelson, 1996 ].
CYP2A
La sous-famille CYP2A comprend plus de 10 membres dans les différentes espèces. Les isoformes CYP2A1, CYP2A2 et CYP2A3 sont exprimés chez le rat et CYP2A6 et CYP2A7 chez l'homme.
L'isoforme CYP2A6 est présent en faible quantité au niveau du foie (< 1 %) et sa contribution au métabolisme des médicaments est limitée. La coumarine est spécifiquement hydroxylée en position C7 est utilisée comme substrat de référence. Il est impliqué dans l'activation de composés du tabac, Fô-aminochrysène, l'aflatoxine Bj....
Les inducteurs sont tes barbituriques, les antiépileptiques, les corticostéroïdes [Rendic, 1997 ].
CYP2B
La sous-famille CYP2B comprend environ 17 membres identifiés dans différentes espèces. Le CYP2B1 et CYP2B2 se retrouvent chez le rat et le CYP2B6 est exprimé, de façon faible, dans le foie humain. Cette femille est inductible par les barbituriques et de nombreuses études ont été réalisées notamment chez le rat [Omiecinski, 1999 ] [Rendic, 1997 ].
L'isoforme 2B6 catalyse la C4-hydroxylation et l'activation des substances anticancéreuses, comme la cyclophosphamide et F ifosamine [Huang, 2000 ] [Chang, 1997, ] [Madsen, 1996 ] . Il participe à la métabolisation de la nicotine et l'activation de produits naturels et chimiques comme l'aflatoxine Bi et le 6-aminochrysène. Les dérivés pentox5Tésorufine et
benzoxyrésorufihe sont souvent utilisés comme substrats de référence.
CYP2C
La sous-famille CYP2C est composée d'un grand nombre d'isoenzymes: au total environ 20 membres ont été identifiés chez des espèces différentes (rats, lapins, singes, oies, cochons, chiens...). Chez l'homme, les analyses génomiques suggèrent au moins 7 gènes dans la
sous-famille CYP2C. Les isoenzymes impliqués dans le métabolisme des médicaments sont le CYP2C8, CYP2C9, CYP2C18 et CYP2C19.
Leur taux est augmenté après induction par la rifampicine et les barbituriques. L'isoforme le plus abondant chez l'homme est le CYP2C9.
CYP 2
La tolbutamide et la (S)-méphénytome sont utilisés comme substances de référence pour, respectivement, le CYP2C8, CYP2C9 et CYP2C18, CYP2C19. Ces isoenzymes sont
responsables de la métabolisation de nombreux médicaments: (S)-méphénytome, tolbutamide, phénytoïne, S-warfarine, antiinflamatoires non stéroïdiens.... Aucune substance toxique importante n'a été identifiée comme substrat. Des phénomènes de compétitions au niveau enzymatiques (provoquant des inhibitions) sont très courants dans cette famille métabolisant une multiplicité de substrats. De plus, il existe un polymorphisme génétique concernant particulièrement les isoenzymes CYP2C9 et CYP2C19 {\o\îpoint 1.4.2.4.).
CYP2D6
L'isoforme CYP2D6 est exprimé chez l'homme. Il métabolise un nombre très important de substances et est responsable de plus de 25 % des biotransformations des médicaments par oxydation.
Il est impliqué dans la métabolisation d'antidépresseurs (imimpramine, nortriptyline) , de neuroleptiques, de P bloquants (bufüralol, propranolol, métoprolol), d'antiarythmiques (spartéine), de codéine, de dextrométorphan, d'éthylmorphine, de nicotine....
Le dextrométhorphan est souvent utilisé comme substrat standard (0-déméthylation donnant le dextrorphan). Le bufüralol (Ci'-hydroxylation) est utilisé également au même titre.
Cet isoforme ne semble pas être inductible. Il existe certains inhibiteurs utilisés de façon courante en clinique (coadministration de ces dérivés): la quinidine, quinine, fluoxétine, paroxétine, halopéridol...
Des substrats potentiels de cet isoforme peuvent souvent être identifiés à partir de leurs structures moléculaires et une stéréosélectivité a été observée in vitro (R et S propafénone...) [Gonzalez, 1994 ].
Les constituants de la fumée de cigarette sont parmi le nombre limité de dérivés procarcinogènes substrats de cet isoforme.
Il existe d'importantes variations ethniques et le polymorphisme débrisoquine/spartèine a été particulièrement étudié (voir point 1.4.2.4.).
CYP2E1
L'isoforme CYP2E1 est d'un point de vue toxicologique d'une grande importance car responsable de la formation de métabolites et d'intermédiaires réactifs à partir de substances
Il est à l'origine de la transformation de xénobiotiques de petit poids moléculaire incluant l'acétominophène, l'isoniazide, les anesthésiques halogénés, l'éthanol, l'acétone...
La chlorzoxazone et le p-nitrophénol sont des substrats standards utilisés pour mesurer l'activité de l'isoforme CYP2E1. Cet isoforme a été identifié au niveau foetal (foie) où son activité est comparable à celle de l'adulte. Il est inductible par l'éthanol, l'acétone, l'isoniazide.
L'inhibition est observée après traitements avec le diéthyldithiocarbamate, les isothiocyanates, le disulfiram, le diméthylsulfoxyde et le 4-méthylpyrazole. Cet isoforme ne présente pas de polymorphisme connu.
CYP 3
La famille CYP3 intervient dans la métabolisation de plus de 50 % des agents couramment utilisés en thérapeutique. Il existe approximativement 20 membres de la sous-famille CYP3 A appartenant à différentes espèces incluant l'homme, le rat, le lapin, la souris, le macaque et le chien [Omiecinski, 1999 ].
CYP 3A
La sous-famille CYP3A représente 25 à 30 % du contenu en cytochrome P450 du foie humain. Les CYP3A4, CYP3A5 et CYP3A7 constituent les dififérents isoformes chez l'homme. Le CYP3 A4 et CYP3 A5 sont exprimés au niveau du foie et de la muqueuse intestinale. Le CYP3A5 est une forme polymorphique et s'exprime à raison de 30 % dans le foie et 70 % dans l'intestin. Le CYP3A7 est la forme foetale du CYP3A et son taux diminue de façon importante à la naissance. Il est cependant encore parfois décelé chez l'adulte [Hashimoto, 1995 ]
La sous-famille CYP3A est inducible par la rifampicine, les barbituriques et pour une
moindre mesure par la carbamazépine, la phénytome et la dexaméthasone [Thummel, 1998].
Tous les foies humains expriment le CYP3A4 bien que son taux varie énormément d'un individu à l'autre (jusque 10 x ). Le CYP3A5 est présent de façon réduite dans le foie (10 à 30%).
Le CYP3A4 est important pour la métabolisation de nombreux médicaments, de structures très diversifiées et appartenant à des classes thérapeutiques très différentes (plus de 150 médicaments appartenant à 38 classes thérapeutiques sont substrats du CYP 3A4). Il présente un lien non spécifique avec le substrat contrairement au CYP2D6 par exemple qui présente un lien spécifique. La nifédipine, le midazolam et la testostérone (6p testostérone) sont utilisés
comme substrat de référence pour cet isoforme. Les substances exogènes métabolisées par le CYP3A4 sont: l'érythromycine, la nifédipine, le cortisol, l'alprazolam, la lidocaine
(N-dé-éthylation), le diazépam (Ca-hydroxylation), la cyclosporine, la terfénadine, le cisapride, l'indinavir, le ritonavir, la cyclophosphamide.... Le CYP3A4 est également impliqué dans la métabolisation de nombreuses substances endogènes (hormones stéroïdiennes...).
Certains substrats du CYP3A révèlent ime certaine toxicité: les enzymes appartenant à la sous-famille du CYP3A activent certains pré-carcinogènes comme l'aflatoxine Bi (3 a- hydroxylation et exo 8,9 époxydation), l'aminochrysène, le 1-nitropyrène...Certaines
substances d'origine diététique peuvent inhiber ou stimuler l'activité du CYP3 A4 (in vivo et in vitro). Par exemple certaines flavonoïdes inhibent l'oxydation de la nifédipine et de la
félodipine [Rashid, 1995 ] [Kupferschmidt, 1998 ]. Le jus de pamplemousse contenant certaines flavonoïdes (quercétine, naringénine, bergamotine...) inhibe l'oxydation de la nifédipine et félodipine, modifie la biodisponibilté de la cyclosporine, terfénadine, midazolam et 17-a éthinyloestradiol [Rendic, 1997 ] [Raza, 1994 ] [Hashimoto, 1995 ].
Ces enzymes sont inhibés par ime large variété de eomposés ineluant la triaeétyloléanomycine (TAO), les antibiotiques maerolides, les antifongiques de la classe des azoles (kétoconazole, imidazole...) et de façon compétitive par un nombre important de substrats de l'enzyme.
Le tableau 1.1. reprend différents exemples de substrats des principaux isoformes rencontrés chez l'homme.
Tableau 1.1.
Exemples de substrats des principaux isoformes rencontrés chez l'homme.
Isoforme Substrats de référence Substrats étudiés dans la littérature
CYP1A2 7-éthoxyrésorufine
(O-désalkylation)
acétominophène, acétanilide, P qflatoxine, amines aromatiques, caféine, oestradiol, éthoxyrésorufine,
imipramine, méthoxyrésorufine, phénacétine, propranolol, théophylline,
warfarine
CYP2A6 coumarine
(7‘hydroxylaüon)
P cflatoxine, 6-aminochrysène, coumarine, butadiène, nicotine
CYP2B6 P qPatoxine, 6-aminochrysène,
benzoxyrésorufine, cyclophosphamide, ifosphamide, pentoxyrésorufine
CYP2C8 taxai
(6-hydroxylation)
carbamazépine, taxai, tolbutamide
CYP2C9 tolbutamide
(méthyl-hydroxylation)
diclofénac, phénytoïne, piroxicam, ténoxicam, tétrahydrocannabinol,
tolbutamide. S-warfarine
CYP2C19 S-méphénytoïne
(4 '-hydroxylation)
citalopram, diazépam, diphényll^darüoïne, hexobarbital,
imipramine, lansoprazole, S-méphénylhydantoïne, oméprazole,
proguanile, propranolol
CYP2D6 dextrométorphan
(0-déméthylati on)
amiflamine, amitriptyline, aprindine, bufurolol, captopril, cinnarizine, citaprolam, clonipramine, clozapine, codéine, débrisoquine, désimipramine,
dextrométhorphan, éthylmorphine, fluoxétine, flunarizine, fluphénazine, halopéridol, hydrocodone, imipramine,
méthoxyamphélamine, méthoxyphénamine, métoprolol, miansérine, miniaprine, nicotine, nortriptyline, ondansétron, paroxétine, perhexiline, propqfénone, propranolol,
spartéine, timolol
CYP2E1 chlorzoxazone
(6-hydroxylation)
acétominophène, alcools, aniline, benzène, butadiène, caféine, chlorzoxazone, dapsone, enflurane, fluorocarbones, alcanes halogénés,
isofluranes, isoniazide, p-nitrophénol, nitrosamines, styrène,
théophyline, uréthanes
CYP3A4 testostérone
(6p-hydroxylation)
acétominophène, aldrine, alfentamil,alprazolam, amiodarone, astémizole, carbamazépine, cisapride,
cyclophosphamide, dapsone, digitoxine,diltiazem, diazépam, érythronç/cine, éthynyloestradiol, étoposide, flutamide, ifosphamide, imipramine, indinavir, isradipine, lansoprazole, lidocaïne, losartan, lovastatine, midazolam, nifédipine, oméprazole, quinidine, rapamycine,
ritonavir, saquinavir, sidénqfil, stéroïdes, tacrolimus, tamoxifène, taxol,
terfénadine, tétrahydrocannabinol, théophyline, triazolam, troléandomycine, vérapamil, warfarine
Adapté de [Parkinson ,1996] [ Capdeta, 7P“éd.], [Rendic, 1997].
