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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Ryelandt, M. (1995). Tolérance et mémoire : les choix stratégiques du système immunitaire. (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.

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U n i v e r s i t é L i b r e d e B r u x e l l e s Faculté des Sciences

Département de Biologie Moléculaire Laboratoire de Physiologie Animale

Professeur Jacques Urbain

Tolérance et mémoire:

les choix stratégiques du système immunitaire

Marion Ryelandt

Thèse présentée en vue de l'obtention du grade légal de Docteur en Sciences

Mars 1995

Thèse annexe

L'utilisation d'anticorps monoclonaux dirigés contre les molécules de surface des

cellules de l'éponge Ephydatia fluviatilis devrait permettre de comprendre le

mécanisme de l'alloreconnaissance observée chez ces métazoaires primitifs.

U n i v e r s i t é L i b r e d e B r u x e l l e s Faculté des Sciences

Département de Biologie Moléculaire Laboratoire de Physiologie Animale

Professeur Jacques Urbain

Tolérance et mémoire:

les choix stratégiques du système immunitaire

Marion Ryelandt

Thèse présentée en vue de l'obtention du grade légal de Docteur en Sciences

Mars 1995

vouÀraii profiter de ce6 pa^ei pour remercier tous ceux. (j.ui m ont accompagnée au cours de ces années de tlièse. est une occasion uni<j,ue pour moi de rassemLier ici toutes ies

personnes c^ui m ont Soutenue fors de ce travail. Jt.a liste est longue... mais après tout, la page des its est probablement la page la plus amusante à lire, alors faisons durer le plaisir/

remerciemeni:

I Irbain pour m avoir accueuUe ,

^e voudrais tout d abord remercier le professeur ^accj,ues Urbain po dans son laboratoire et pour m avoir guidée pas à pas tout au lon^ de ce travail. Son entière disponibilité me permit de faire irruption à tous moments dans Son bureau pour profiter de Ses connaissances encgclopédicj.ueS et de Ses vues brillantes en immunologie, l^erci beaucoup ^accf.ueS, tes conseils et tes encouragements me furent très précieux.

un

^eorgette ^ansanten n est pas seulement la personne dont j ai partagé leb ureau pendant 3 ans, bien (fue ceci Soit déjà digne d être mentionné, (^ar, ^eorgette, tu as Supporté avec

une Lumeur toujours égale les frasc^ues de mon caractère lunatic^ue et Surtout mon goût de lordre cj.i entravait ton évolution et lentropie naturelle g.ue tu dispenses généreusement.

Tïlais Çjeorgette fut également ma marraine en immunologie. C'est avec elle cj.ue furent réalisées grand nombre des expériences présentées dans cette tlièse. SI faut vous dire gue ^eorgette, tout en restant très discrète, fut toujours à côté de mol au moment où J en avais besoin, interrompue dans tout article ou manipulation par lurgence de mes guestionS. %^n grand merci ^eorgette pour toutes ces discussions et ces bons moments passés ensemble.

^e n oublierai pas ^tiominigue n)eWit gui a eu la tâcLe, parfois difficile, de m initier à limmunologie et avec g-ui J ai travaillé en étroite collaboration pendant les premières années de ma tkèse. ^t)o, merci pour tout ce gue tu m as apporté.

^aimerais aussi remercier Oberdan <=Zeo. l^ous avons la cLance de profiter dans ce laboratoire à la fois des compétences d un directeur et d un SouS-directeur. /"Personnalités complémentaires, ils forment à eux deux un duo redoutable d efficacité dans la direction du laboratoire.

9?Jerci donc Oba de m avoir aidée à comprendre et intégrer des données parfois contradictoires dans ept général grâce à ton formidable esprit de Sgntkèse.

un concep

-i-

expérienceô, J ai eu ia cliance Je trat/aiiier également ai/ec ^y4nnette

^an ^y4cler, (^kantai YfjaôUÊi^i-^uLo, Tïjarcelie ^an 97Jecliefen, Malienne .^nJriâ et .^Jriana i3az. (^ompa^iteà a^réaiieà etJei on conàeil. je ieô en remercie.

^e penée également à ^amiîa Jsmaïii et l^ar^ie lirait cj.ui ^ont comme moi partie Ju cercle trèi priée Je6 .^miô Ju Système ^y4rionate. Yjoui ai/onà parcouru réôeau eniemlie. Queicfuei piitei non expioréei reitent encore Jerrière noui, maii iainoni un peu Je modère...

^e iuii extrêmement reJeuaLie à ^Lierr^ Sornaiàe, Serge l^arc^, ^ric Tïlurailte et ^liiLaut <2)e SmeJt pour leurô nombreux Jépanruigei in^ormaticj,ue6. Ifjoué avoni là une écj.uipe Je cLoc toujouri préiente en ca6 Je coup Jur.

Yï]erci auâii à Patrice 2)ul>oii pour no6 compati immunologicf.ueS trèô initructi^i, à YÏJarc 2.eicLer et 'ÎJliierri^ Sornaiie pour m avoir fait rire aux larmeô.

^e tienâ à remercier particulièrement ^aLrielle H)ewa6me pour ion aiJe tecLnitjue précieuie et pour toutei lei petites Jouceuri Lieni/enuei, Pkilippe ^eirman et ^y4l)iJ SznaJen pour 6 être occupés Je mes Souris, SJu/ige -À/uez, notre LiLliotLécaire Super efficace, tf.ui finit toujours par Jénicfier les articles introuvables.

jLeS autres membres Ju laboratoire présents et passés m ont tous à un moment ou un autre Jonné un conseil ou un coup Je main, alors... Tïjonsieur ^eener, ^^nnicl, darole,

datlierine, (^kristian, (^ici, 2)aniel, H)aviJ, Srila, Fabienne, Florence, Françoise, JreJJt^,

^réJéric, ^enei/ièue, ^o, Jtaurence, Tïjculg, ITJarie, Tï]artine, Tï]aurice, Yï]irabel, TÏ]oncef, Yl^umu, ^ïï]uriel, Pascal, Patricia, Saguitte, S^li/ain, ^éronit^ue, ^iména,... ^ai eu beaucoup Je plaisir à travailler en votre compagnie. npagri

^e remercie le Professeur JJerué i^azin pour les nombreuses expériences cj-ui ont été réalisées avec les ckercLeurS Je son laboratoire. ^ÏÏJerci beaucoup à Olivier H^enis, Françoise

Yjisol et 3'ernanJa IfïJacecioSoareS cf-ui ont granJement contribué à cette fructueuse collaboration.

^ ai reçu un accueil très ckaleureux auprès Ju Professeur ^isèle %^an <IZ)e %^ij et Je ^velgne PicLelle lors Je lélaboration Ju projet Je ma tkèse annexe. ^entkousiasme

lecj.uel elles m ont offert leur collaboration fut très stimulant.

ver avec

'tanne.

^e vouJrais également remercier mes autres amis immunoloqistes: ^oiia

Iflatlfialie, Sonia, P.ackel, (Lbantal, Kïjicbel, ^ïïjiguel,... ^ous n avons pas eu loccasion Je

travailler ensemble mais nous retrouver au liaSarJ (Jj JeS congrès était Jéjà en soi très amusant.

te car noué auoné

^ aimeraii adresser un mot tout ipéciai à mon Linôme i^énédicte

fait toutes nos études main dans ta main (j en vois c^ui ri^olentlj (^Lère i3enn^, Je pense cj.ue c est inutile cj.ue Je te ie dise mais Je te te dis cf.uand même: ce fut un urai ptaisir de traverser toutes ces années en ta compagnie!

.aurence.

^e remercie également ^ves, (^atkerine, StépLane, Yjatkatie, ^Ï7]ar^uerite, l^icLet, oZa PatricL, ^ÏÏJarie, ^Lierr^, SsaLelte, ^ouis, (^arotine, (^Lristian, ^t)enis,... mes amis Lioto^istes

^cliimistes, agronomes, vétérinaires,...j (f-ui avez fait de ces années de dur taLeur ^si si!j une aventure passionnante.

mes amis non immunotogistes, non Liotoqistes mais néanmoins très cLers:

^fTjarc, Jrance, l^éatrice, ^otaine, l^atricL, ^ÏÏJarie-Jdétène, {3runo, S^litte, ^iovanni,

^éronicj.ue, ^y4texander, S^tviane, é^ric, yXavier, Yjatliatie, (^liristian, ^JJenri, H)ais^, Pliitippe,

^^nne, ^^nne-3^rançoise, l^a^ati, .3mma, Jrédéric^ue, Sotedad, ^t^idier ^et tous tes

aficionadosj,... à vous cj,ui savez cj,ue te nerf de ta guerre c est... te fou rire, de tout coeur merci.

&nfin Je voudrais remercier ma famitte et tout particutièrement mes parents pour leurs encouragements ou simplement leur présence. Yïjerci pour votre écoute attentive et votre Soutien en toute occasion.

Yï]erci également à l^atltalie et ^JdugueS pour toutes nos discussions pliitoSopLicf.ueS, politicj.ues,...

très stimulantes; à iSenoit pour la fabuleuse découverte du ^apon; à Laurence et iSernard pour les moments de vraie détente passés cliez eux et pour leur enthousiasme communicatif; à Ssaiette et

^ean pour leur aide substantielle tors de mes déménagements et leurs conseils Juridic^ues,...; à

^baniet, ^^ugustin, ^y4lo^S, (Clémence, j^autine, ^y4ntoinette, Uictoria, it^runo, ^eoffrog et

^y4lice pour les moments très Jogeux ^et un peu Lrugantsj passés tous ensemble; à Qrand-mère pour Son auLerge ckateureuse et réconfortante; à iSonne-maman pour Son enthousiasme constant vis-à-vis de mes différentes activités; à l^anuela et Sopkie, mes contemporaines, mes amies, ainsi cj.u à tous tes autres cousins, oncles et tantes gue Je ne peux citer tous et avec gui J ai passé de très bons moments; et merci à 9^etl^ pour lintendance discrète et efficace d OrcLimont.

S' fe crois gue je vais m arrêter ici car guana il n g en a plus... ! arrêter ici car auand il n u en a plu .^L!J oubliais... Yïjerci à toute léguipe de l^adio (intact... ^cette fois, c est une blague!j

-iU-

TABLE DES MATIERES

-Abréviations 2

I. BUT & RESUME 3 IL INTRODUCTION 5

IIL RESULTATS & DISCUSSION 45

IV. CONCLUSIONS & PERSPECTIVES 77 V. MATERIEL & METHODES 82

VL BIBLIOGRAPHIE 91 VIL ANNEXES 108

-1-

ABREVIATIONS

-Abl Anticorps de première génération

-Ab2 Anticorps de seconde génération (anti-Abl) mAb2 Anticorps de seconde génération monoclonal -Ac Anticorps

-Ag Antigène

-A/J Lignée pure de souris A (laboratoires Jackson) -APC Cellule présentatrice d'Ag

-ARS p-azophénylarsonate -BSA Albumine bovine sérique -CFA Adjuvant complet de Freund -FACS Fluorescence activated cell sorter -FITC Fluorescéine

-FDC Cellule dendritique folliculaire -HEL Lysozyme d'oeuf de poule -HGG Gamma globulines humaines

dHGG HGG "désagrégées"

-HSA "Heat Stable Antigen"

-IFN7 Interféron gamma -Ig Immunoglobuline -IL-2R Récepteur à riL-2 -i.p. Intrapéritonéal -i.v. Intraveineux

-KLH Hémocyanine de patelle -LPS Lipopolysaccharide

-MHC Complexe majeur d'histocompatibilité -NP (4-hydroxy-3-nitrophényl) acétyl

-OPDA Orthophénylènediamine dihydrochloride -PBL Lymphocytes du sang périphérique

-PE Phycoérythrine -PU Peroxyde d'urée

-TCR Récepteur des lymphocytes T

-Th (Thl ou Th2) Lymphocyte T helper (de type 1 ou de type 2)

I. BUT & RESUME

I. But & Résumé

Une des caractéristiques les plus étonnantes du système immunitaire est l'énorme diversité de son répertoire. L'assemblage combinatoire des divers segments de gènes codant pour les récepteurs spécifiques des lymphocytes T et B crée des milliards de spécificités différentes. Cette diversité est un élément clé de

l'adaptabilité du système immunitaire face à son environnement antigénique. Il a en effet la capacité de reconnaître l'imprévisible et d'élaborer une réponse vis-à-vis d'une molécule synthétique n'ayant jamais fait partie de son univers naturel.

Mais le répertoire que l'individu adulte utilisera pour faire face aux agressions du monde extérieur n'est pas uniquement le fruit du hasard. En effet, de l'énorme diversité du répertoire immunologique résulte la formation de clones reconnaissant les constituants normaux du soi. L'autoagression étant proscrite pour la survie de l'individu, une sélection négative s'exerçant sur les clones autoréactifs va assurer la tolérance du soi. Une sélection positive agit également sur les lymphocytes en développement. Celle-ci est bien démontrée pour les lymphocytes T et assure la reconnaissance des molécules du complexe majeur d'histocompatibilité.

La tolérance naturelle d'un individu vis-à-vis de ses propres constituants résulte d'un apprentissage qui a lieu pendant la maturation des lymphocytes. Les lymphocytes immatures passent, lors de leur développement, par une phase de sensibilité particulière oCi la rencontre de l'antigène dont ils sont spécifiques induit des signaux négatifs. Il est dès lors possible d'abuser le système immunitaire en lui présentant une molécule étrangère lors de sa formation. Cette molécule va être considérée comme faisant partie du soi et être tolérée par l'individu devenu adulte.

Ce système expérimental nous a permis d'étudier la tolérance aux gamma globulines humaines induite chez le souriceau. La réponse humorale dirigée contre une protéine soluble étant le résultat d'une collaboration entre les lymphocytes B et les

lymphocytes T helper, il est souvent postulé que l'élimination ou l'inactivation des lymphocytes T helper spécifiques est nécessaire et suffisante pour obtenir une tolérance vis-à-vis de cet antigène. La tolérance des lymphocytes B serait inexistante.

De manière étonnante, nous démontrons que, dans notre système de tolérance induite chez le nouveau-né, les lymphocytes T spécifiques des gamma globulines humaines ne sont pas affectés par les mécanismes de la tolérance. Une inactivation

fonctionnelle des lymphocytes B spécifiques semble être le mécanisme principal de l'inhibition de la réponse.

Afin d'analyser les sélections qui interviennent dans l'établissement du

répertoire préimmun des lymphocytes B, nous avons utilisé les idiotypes, ou

I. But & Résumé

déterminants antigéniques des anticorps, comme marqueurs permettant de suivre l'expression des différents anticorps présentant une spécificité particulière.

En réponse à un antigène donné, chaque individu synthétise des anticorps spécifiques portant des marqueurs idiotypiques qui lui sont propres, ou idiotypes privés. Mais, en réponse à certains antigènes, la majorité des individus d'une lignée pure de souris synthétisent des anticorps portant des marqueurs idiotypiques communs, appelés idiotypes récurrents. Certains de ces idiotypes dominent la réponse primaire. D'autres ne dominent la réponse qu'après un rappel antigénique et sont étroitement liés à la mémoire immunologique.

Nous nous sommes intéressés au choix des idiotypes qui dominent la réponse à l'haptène arsonate. Il est souvent supposé qu'aucune sélection positive n'influence le répertoire préimmun des lymphocytes B. Mais, les expériences présentées dans ce travail démontrent que l'antigène n'est pas le seul facteur de sélection des

lymphocytes B qui lui sont spécifiques. L'antigène activerait des lymphocytes B qui ont été présélectionnés avant son arrivée. En effet, la présence de l'antigène à la naissance, au moment de la formation du système immunitaire, ou un traitement néonatal polyclonal visant tous les lymphocytes B, empêche cette sélection et conduit à la perte de l'idiotype dominant. Nous proposons que, durant l'ontogenèse du système immunitaire, un réseau de lymphocytes et de récepteurs spécifiques, appelé réseau idiotypique, soit formé au sein duquel une sélection positive conduise à la dominance de certains idiotypes.

Nos expériences suggèrent également que les idiotypes qui dominent les réponses primaires et ceux qui dominent les réponses secondaires sont synthétisés par deux sous-populations différentes de lymphocytes B. Ce résultat s'oppose à l'idée

généralement admise selon laquelle les cellules de mémoire s'exprimant en réponse secondaire dérivent des mêmes précurseurs que les lymphocytes B responsables de la réponse primaire. Cependant, en inhibant spécifiquement l'une des sous-

populations de lymphocyte B les marqueurs caractérisant la réponse primaire sont perdus, alors qu'en inhibant l'autre sous-population ce sont les caractéristiques des réponses de mémoire qui ne sont plus exprimées. L'existence de deux sous-

populations permettrait d'expliquer certaines différences fondamentales qui existent entre les réponses primaires et les réponses de mémoire.

Les idiotypes récurrents qui dominent progressivement les réponses de mémoire sont prédisposés à faire partie de cette réponse adaptative. Une sélection indépendante de l'antigène leur a donné cet avantage sélectif. Dans le répertoire préimmun, ils

constituent en quelque sorte la mémoire du futur.

II. Introduction

1ère PARTIE: L'ETABLISSEMENT DU R E P E R T O I R E I M M U N O L O G I Q U E DISPONIBLE

/ . LES PRINCIPAUX ACTEURS DU SYSTEME IMMUNITAIRE 6 1.1 Les APC et la présentation antigénique 7

1.2 Les lymphocytes T 8 1.3 Les lymphocytes B 11 2. SELECTION NEGATIVE 17

2.1 Sélection négative des lymphocytes T 18 2.1.1 Elimination 18

2.1.2 Anergie 19 2.1.3 Suppression 21 2.1.4 Ignorance du soi 23

2.2 Sélection négative des lymphocytes B 24 2.2.1 Elimination ou anergie 24 2.2.2 Suppression 26

2.2.3 Ignorance du soi 26

2.3 La collaboration B-T comme sauvegarde de la tolérance 26

2.4 Sélection négative lors de la formation du répertoire secondaire 28 3. SELECTION POSITIVE 31

3.1 Sélection positive des lymphocytes T 31 3.1.1 Sélection des lymphocytespre-T 31

3.1.2 Sélection des lymphocytes T immatures 31 3.2 Sélection positive des lymphocytes B 37

3.2.1 Sélection des lymphocytes pre-B 37 3.2.2 Sélection des lymphocytes B immatures 37 3.2.3 Sélection des lymphocytes B matures 38

2ème PARTIE: I N T R O D U C T I O N A U S Y S T E M E E X P E R I M E N T A L

4. LE SYSTEME HGG. 41

5. LE SYSTEME ARS 42

II. Introduction

1ère PARTIE: L'ETABLISSEMENT DU REPERTOIRE IMMUNOLOGIQUE DISPONIBLE

/ . LES PRINCIPA UX ACTEURS DU SYSTEME IMMUNITAIRE

Le système immunitaire des vertébrés assure la défense de l'individu contre toute agression venant de l'extérieur (parasite, bactérie, virus) susceptible de mettre en péril son intégrité. Ces pathogènes ont souvent un temps de génération très court ce qui leur permet d'évoluer par mutation beaucoup plus rapidement que leur hôte vertébré ne peut acquérir de gène de résistance. Face à ce monde d'envahisseurs aussi varié qu'imprévisible, le système immunitaire a développé une stratégie de défense reposant sur l'élaboration d'un répertoire de cellules et de récepteurs spécifiques extrêmement diversifié. La version la plus élaborée de ce système de défense se trouve chez les mammifères. La majorité des descriptions qui suivent découlent d'observations faites chez la souris mais le système immunitaire de l'homme est fort similaire à celui de la souris sous beaucoup d'aspects.

On appelle antigène (Ag) toute molécule susceptible de provoquer une réponse de la part du système immunitaire. Ces molécules proviennent le plus

souvent de microorganismes étrangers, cependant lors d'une dérégulation du système immunitaire une molécule du soi peut devenir antigénique et être la cible d'une réponse autoimmune.

Différentes lignées de cellules spécifiques, ou lymphocytes, reconnaissent ces Ag et assurent différentes fonctions comme la sécrétion par les lymphocytes B de grandes quantités de molécules se liant spécifiquement aux Ag et appelées anticorps (Ac); la destruction par les lymphocytes T cytotoxiques des cellules portant des Ag

anormaux (par exemple viraux); ou la sécrétion de lymphokines par les lymphocytes T helper (Th). Ces derniers collaborent, entre autre par la production de ces signaux, à la synthèse d'Ac par les lymphocytes B (immunité humorale) ou à l'expansion des cellules T cytotoxiques (immunité cellulaire).

Contrairement aux lymphocytes B, les lymphocytes T ne reconnaissent pas

l'Ag sous sa forme native mais sous forme d'un peptide présenté en association avec

une molécule du complexe majeur d'histocompatibilité (MHC) à la surface d'autres

cellules (restriction MHC). Il existe deux types de molécules MHC: le MHC de

II. Introduction

classe I présent sur presque toutes les cellules sera reconnu par les lymphocytes T cytotoxiques, tandis que le MHC de classe II présent uniquement sur quelques lignées cellulaires du système immunitaire, appelées plus communément les cellules présentatrices d'Ag (APC), sera reconnu par les lymphocytes Th. Les APC sont les cellules dendritiques, les macrophages et les lymphocytes B eux-mêmes. Ainsi, les APC captent l'Ag, l'intemalisent, le découpent en fragments peptidiques et

réexpriment ceux-ci à la surface associés aux molécules MHC de classe II. La reconnaissance de ce complexe par les lymphocytes T helper ainsi que d'autres signaux délivrés par l'APC vont activer le lymphocyte T helper qui pourra alors, à son tour, activer les lymphocytes B ou les lymphocytes T cytotoxiques.

1.1 Les APC et la présentation antigénique

Les molécules MHC présentent, au sein d'une espèce, une grande diversité due à leur polymorphisme allélique. C'est la raison pour laquelle elles sont

probablement la cible principale de la réponse immune qui, lors d'une

transplantation, conduit au rejet de l'allogreffe. Chaque individu de l'espèce exprime deux types de molécules MHC:

-les molécules de classe I (Bjorkman 1987, Lawlor 1990) sont des glycoprotéines de membrane exprimées par la majorité des cellules. Elles se

composent d'une chaîne a très polymorphique associée de façon non covalente à la (3 2-microglobuline. La chaîne a se compose de trois domaines extracellulaires ( a l a 2 a3), un domaine transmembranaire et un court segment cytoplasmique. Les peptides antigéniques, produits de la dégradation de protéines endogènes (y compris virales), s'associent à la chaîne a de la molécule MHC de classe I. La liaison du peptide modifie la conformation de la chaîne a qui peut alors s'associer avec la (32

microglobuline. Cette dernière étape permet l'expression du complexe à la surface de la cellule. Il existe deux ou trois variants non alléliques des protéines de classe I chez la souris: H2-K, H2-D, (H2-L).

-Les molécules de classe II (Gorga 1989, Cresswell 1994) sont également des glycoprotéines membranaires se composant d'une chaîne a et d'une chaîne (3

associées de façon non covalente. Chacune est composée de deux domaines extracellulaires ( a l a 2 et (31 (32), d'un domaine transmembranaire hydrophobe et d'un court segment cytoplasmique. Deux variants non alléliques sont exprimés chez la souris: I-A et I-E. Elles présentent les peptides issus d'Ag exogènes.

Précisons cependant que les deux voies de dégradation d'Ag exogènes et endogènes se croisent. Les APC possédant les deux types de molécules MHC présentent parfois des Ag endogènes en association avec les molécules du MHC II (Nuchtem 1990) ou des Ag exogènes en association avec les molécules du MHC I (Moore 1988).

-7-

II. Introduction

L'expression des molécules MHC de classe II caractérise les cellules présentatrices d'Ag (APC): les cellules dendritignes. les macrophages et les lymphocytes B. On les trouve également sur les cellules de l'épithélium thymique qui, comme nous le verrons, jouent un grand rôle dans le développement des lymphocytes T.

Les APC se caractérisent aussi par la capacité de capturer l'Ag et de le dégrader en peptides présentables aux lymphocytes T. Cette capture peut se faire soit par pinocytose, soit en intemalisant des complexes immuns (Ag-Ac) par l'intermédiaire des récepteurs Fc (sur les macrophages et les lymphocytes B) fixant la partie

constante des Ac, soit par l'intermédiaire d'une reconnaissance spécifique de l'Ag via le récepteur membranaire du lymphocyte B (Chesnut & Grey 1981).

Il faut mentionner ici les cellules folliculaires dendritiques (FDC). Ces cellules, contrairement aux APC précitées et en particulier aux cellules dendritiques

lymphoïdes, ne dériveraient pas de la moelle osseuse, bien qu'elles aient une origine controversée. Les FDC ne sont pas des cellules présentatrices d'Ag pour les

lymphocytes T. Elles jouent cependant un grand rôle quant à la présentation de l'Ag aux lymphocytes B. Elles ont en effet la capacité de capturer l'Ag sous forme de complexes immuns à l'aide de leurs récepteurs Fc et de les conserver ainsi sous forme native pendant plusieurs mois à leur surface (Gray 1991).

1.2 Les lymphocytes T

Le récepteur spécifique des lymphocytes T ou TCR n'est jamais sécrété et se compose d'une chaîne a et d'une chaîne (3 (ou d'une chaîne y et d'une chaîne ô chez une petite minorité de lymphocytes T (Bom 1990)) liées par un pont disulfure.

Les chaînes polypeptidiques a et (3 se composent d'une partie constante codée par un seul gène et d'une partie variable qui résulte de l'assemblage de segments d'ADN différents: la région variable de la chaîne (3 se compose de trois exons (V(3, D et J(3), tandis que la région variable de la chaîne a se compose de deux exons (Va et Ja).

Ces différents segments appartiennent chacun à une famille multigénique. Au cours de l'ontogenèse du lymphocyte T des réarrangements génétiques (excision,

inversion) vont accoler un gène D(3 avec un gène J|3 qui seront ensuite associés à un V(3. Les mêmes phénomènes assembleront ensuite la partie variable de la chaîne a.

L'épissage de l'ARNm assemblera la partie variable à la partie constante de chaque

chaîne. L'assemblage combinatoire de ces segments entre eux et l'appariement des

chaînes a et (3 créent une grande diversité de récepteurs. Cette diversité est encore

accrue par les imprécisions introduites par le processus de réarrangement de l'ADN

au niveau de la jonction des segments, ainsi que par l'addition et l'élimination de

nucléotides N au niveau des différentes jonctions.

II. Introduction

Le TCR est associé avec un ensemble de protéines transmembranaires: le complexe CD3 qui se compose de trois types de chaînes polypeptidiques (7, ô et e), ainsi que les chaînes ^ et r|. Ces différentes protéines possèdent un domaine intracellulaire et jouent un rôle important dans la transduction des signaux émis par la liaison du TCR

à son ligand (Weiss 1986).

Les lymphocytes T portant un TCR a[3 se divisent en deux groupes selon qu'ils expriment le corécepteur ou molécule accessoire CD4 ou CD8. Les molécules accessoires CD4 et CD8 interviennent dans la reconnaissance de la molécule MHC par le lymphocyte T en se liant à une partie non polymorphique de la molécule MHC de classe II ou I respectivement. Ainsi, les lymphocytes T CD4+, majoritairement des lymphocytes T helper (Th). reconnaissent le peptide antigénique associé à une molécule MHC de classe II, tandis que les lymphocytes T CD8+, majoritairement des lymphocytes T cytotoxiques. reconnaissent le peptide antigénique associé à une molécule MHC de classe I.

Les lymphocytes Th sont divisés en deux sous-groupes sur base des

lymphokines qu'ils sécrètent: les Thl sécrètent l'IL-Z et l'IFNy principalement, tandis que les JhZ sécrètent riL-4, l'IL-S, l'IL-ô et l'IL-lO. Il existe aussi des lymphocytes Th sécrétant à la fois l'IL-Z et riL-4 et appelés ThO qui semblent être les précurseurs des Thl et des Th2 (Mosmann & Coffman 1989).

Les lymphocytes Thl jouent un rôle activateur pour les lymphocytes T cytotoxiques et les phénomènes de DTH (hypersensibilité retardée). Leur action sur les

lymphocytes B et la synthèse d'Ac favorise la synthèse d'IgGZa par la sécrétion d'IENy. Les lymphocytes Th2 sont par contre les activateurs préférentiels de la réponse humorale en favorisant particulièrement la synthèse d'IgGl et d'IgE par l'action de riL-4 sur les lymphocytes B (Finkelman 1990).

Ces deux sous-groupes de lymphocytes Th ont également la propriété de s'inhiber l'un l'autre: en effet, I'IFNY synthétisé par les Thl inhibe la prolifération des Th2 et l'IL-lO synthétisée par les Th2 inhibe la production d'interleukines par les Thl et leur prolifération (Fiorentino 1989 et 1991, Howard & O'Garra 1992). Ainsi, les interactions des Thl et des Th2 régulent l'orientation prise par la réponse immune.

Parfois, l'un des deux compartiments prend une telle expansion qu'il inhibe

complètement la réponse induite par l'autre compartiment. Ceci est particulièrement

bien illustré lors de la réponse induite par le pathogène Leishmania major (parasite

intracellulaire) dans différentes lignées de souris: certaines lignées résistantes à

l'infection (C57bl/6 et C3H/HeN) développent une réponse dominée par les

caractéristiques induites par les Thl alors que les souris d'une autre lignée

II. Introduction

(BALB/c), incapables de se défendre efficacement, meurent après avoir produit une réponse de type Th2 (Heinzel 1989). Dans le cas de parasites extracellulaires, comme les helminthes par exemple, une réponse induite par les Th2 est plus adaptée et protectrice.

Les raisons de la différenciation des ThO en Thl ou en Th2 ne sont pas encore parfaitement comprises mais plusieurs facteurs semblent avoir une importance comme le type d'Ag et la voie d'administration, la concentration d'Ag (Fitch 1993), la nature des APC (Gajewski 1991, Somasse 1993, McArthur & Raulet 1993, De Becker 1994) et le contexte génétique de l'animal. Cette différenciation semble également être largement contrôlée par les lymphokines: la présence d'IL-4 favorise la différenciation vers les Th2 (Abehsira-Amar 1992, Seder 1992) tandis que l'IFNy et riL-12 dirigerait la différenciation vers les Thl (Schmitt 1994a et 1994b,

Heynderickx 1994). En effet, l'injection d'IL-12 aux souris BALB/c infectées par Leishmania major rend celles-ci résistantes à la parasitose en dirigeant la réponse vers le type Thl (Sypek 1993). D'autre part, une faible concentration d'Ag étant favorable à la différenciation des Thl (Fitch 1993), l'inoculation de souris BALB/c avec un petit nombre de parasites (10^) non seulement ne provoque pas la maladie mais leur confère une résistance à l'infection ultérieure par un plus grand nombre de parasites (10^) (Bretscher 1992).

L'activation complète d'un lymphocyte T mature requiert non seulement l'agrégation des TCR à la surface de la cellule par la reconnaissance du complexe peptide antigénique-MHC, mais également un signal costimulateur délivré par l'APC. Le prototype du signal costimulateur est donné par la liaison de la molécule CD28 à la surface du lymphocyte T avec les molécules B7 (B7-1 et B7-2) de l'APC (Schwartz 1992, Linsley 1992, de Boer 1993). Il semble que la molécule HSA (heat stable antigen) présente à la surface des lymphocytes B et des cellules dendritiques puisse également jouer ce rôle (Liu 1992, Enk 1994).

Les APC n'ont pas toutes la même capacité de costimulation. En effet, seules les cellules dendritiques expriment la molécule costimulatrice B7-1 de façon

constitutive. Les macrophages et les lymphocytes B nécessitent d'être activés pour exprimer B7-1 (Hathcock 1994).

Les lymphocytes T dérivent de précurseurs hématopoïétiques issus de la moelle osseuse et migrant vers le thymus où ils se différencient. Lorsqu'ils arrivent dans le thymus ils ne portent encore aucun des marqueurs qui caractérisent les lymphocytes T: ils sont TCR", CD3-, CD4-, CDS". N'étant ni CD4+, ni CD8+ on les appelle les thymocytes double négatifs. Ils se développent alors en thymocytes

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II. Introduction

double positifs qui expriment à la fois CD4 et CD8 et qui expriment également faiblement le récepteur spécifique TCR-CD3. Ils subissent à ce stade deux sélections importantes: l'une va purger toute autoréactivité du répertoire en éliminant les

thymocytes qui reconnaissent un peptide du soi et l'autre va éduquer les thymocytes à reconnaître les molécules MHC exprimées par l'individu. Ces deux sélections font l'objet des chapitres 2 et 3 de l'introduction. Les thymocytes ayant passé avec succès les deux sélections thymiques vont maturer en lymphocytes simple positifs CD4+ ou CD8''" exprimant fortement le complexe TCR-CD3 et migrer vers la périphérie.

1.3 Les lymphocytes B

Le récepteur spécifique des lymphocytes B, appelé immunoglobuline (Ig) ou anticorps (Ac) lorsque la spécificité de celui-ci est connue, peut être membranaire ou sécrété. Le récepteur Ig se compose de deux chaînes lourdes (H) et de deux chaînes légères (L).

Les chaînes L pouvant être de deux types (x ou À) sont composées de deux domaines: une région constante (CL) carboxy-terminale et une région variable amino-terminale. La variabilité de cette région est particulièrement concentrée dans trois segments hypervariables séparés par des régions charpentes.

Les chaînes H sont de différentes classes: [i, ô, y (yl, Y2a, Y2b, Y3), a et E formant les Ig de classes IgM, IgD, IgG (IgGl, IgG2a, IgG2b, IgG3), IgA et IgE respectivement.

Chaque chaîne H se compose d'une région variable amino-terminale et de trois régions constantes (CHl, CH2, CH3). Une région charnière sépare CHl de CH2 et confère une certaine flexibilité à ce récepteur. On distingue également trois régions hypervariables au sein de la région variable de la chaîne lourde. La région constante de la chaîne H confère des fonctions particulières aux différentes classes d'Ig (fixation du complément, fixation aux récepteurs Fc,...).

La grande diversité des régions variables des Ig résulte, comme pour le récepteur des lymphocytes T, d'un assemblage combinatoire. La région variable de la chaîne lourde se compose de trois éléments génétiques: VH, D et JH accolés l'un à l'autre par des processus de translocation et d'excision. La région variable de la chaîne légère se compose de l'assemblage d'un VL avec un JL. Il existe également plusieurs gènes pour chaque segment (il existe plus de 100 segments VH différents: 170 chez la souris). La combinatoire de ces différents segments formant chaque chaîne ainsi que l'appariement de deux chaînes H identiques avec deux chaînes légères identiques (soit %, soit À) génère une énorme diversité de récepteurs spécifiques. Cette diversité est encore augmentée par les imprécisions de jonction entre les différents segments et les adjonctions ou délétions de nucléotides dans les régions N (uniquement pour la chaîne H).

-11-

II. Introduction

La première Ig produite est l'IgM. Dès qu'une chaîne lourde \x est formée elle éteint la possibilité de produire une autre chaîne |i sur le chromosome homologue. Ce phénomène s'appelle l'exclusion allélique. Un phénomène similaire assure

l'expression d'un seul type de chaîne légère, X ou x, par cellule: la production d'une chaîne légère inhibe les réarrangements du chromosome homologue mais également ceux du chromosome qui détermine la chaîne légère de l'autre type.

L'Ig membranaire est associée avec 2 protéines transmembranaires, Iga et Ig(3 (et parfois une troisième protéine, Igy), intervenant dans la transmission des signaux émis lors de la liaison de l'Ig à son ligand.

Les Ig portent des déterminants antigéniques, c'est-à-dire des motifs susceptibles d'être reconnus par d'autres Ac. Ces déterminants antigéniques sont de trois types:

-les isotopes sont des déterminants se trouvant sur la partie constante d'une Ig et sont communs à tous les individus d'une espèce. Ils définissent les classes d'Ig.

L'ensemble des isotopes d'une Ig est appelé isotype. On dira ainsi d'une Ig qu'elle est d'isotype IgM ou IgG2a par exemple.

-Les allotopes sont les variants alléliques des isotopes et ne se trouvent donc que chez quelques individus d'une même espèce. L'ensemble des allotopes est l'allQtype d'une Ig.

-Les idiotopes sont les déterminants antigéniques présents sur la partie variable d'une Ig et en général diffèrent d'une Ig à l'autre puisqu'ils sont, par leur localisation, associés à la diversité des Ig. Certains de ces idiotopes sont étroitement liés avec le paratope ou site actif de l'Ig sans pour autant se trouver dans le site actif mais suffisamment proche pour que la liaison de l'Ag empêche la fixation de l'anticorps anti-idiotopique. L'ensemble des idiotopes d'une Ig définit l'idiotype de celle-ci, c'est-à-dire sa carte d'identité.

Un idiotype (Abl) peut être reconnu par un anti-idiotype (Ab2) polyclonal qui détecte l'ensemble des déterminants idiotopiques exprimés par les Ac Abl. Chaque déterminant peut être reconnu par un Ac anti-idiotopique monoclonal (mAb2).

On distingue deux types d'idiotypes: lors de l'injection d'un Ag à différents individus d'une même lignée pure de souris, ces individus répondent tous par la synthèse d'un grand nombre d'Ac spécifiques de l'Ag mais qui portent des idiotypes différents. Ces idiotypes sont appelés idiotypes privés ou "à la Oudin" (qui fut le premier à

découvrir ce type de déterminant antigénique sur les Ig).

Lors de la réponse à certains Ag dans des lignées de souris particulières, les individus synthétisent des Ac spécifiques dont quelques uns portent des idiotypes privés mais dont la grande majorité portent un idiotype commun aux différents

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Figure R

(Paul 1993)

STEM CELL B STEM CELL

# -

Gene Expression: Gene Expression:

B220 B220

R a g l R a g l

R a g 2 R a g 2

T D T VpreB

xs

Gene Gene

Rearrangement: Rearrangement:

D J H V L J L

IMMATIJRE B C E L L Gene Expression:

B220 mIgM

Gene

R e a m n g e m c n t : None

M A T U R E B C E L L Gene Expression:

B220 mIgM mlgD

C3m

Gene

Rearrangement:

None V H W H

Pathway of B-cell devetopment. B cells develop from hematopoeitic stem cells. Thèse cells and the proposed B stem cell (l.e., a self­replenishing cell with a differentiation capacity largely limited to the B lineage) give rise to the more identifiable memtiers of the lineage. Both the stem cell and the B stem cell are capable of self­renewal. The first dearly identifiable member of the B lineage is the pro­B cell. This cell has begun the process of Ig gene rearrangement, largely limited to H­chain gènes. It expresses gènes encoding the B­cell form of CD45 (B220), the recombinase activating gènes Rag­1 and Rag­2, and terminyl deoxynucleotidyl transferase (TDT), the enzyme responsible for N­region addition. The success­

ful completion of V„DJ„ rearrangement and expression of /i H chains signais the end of the H­chain gene rearrangement and the onset of L­chain gene rearrangement. It marks the txjundary between pro­B cell and pre­B cell states. Pre­B cells continue to express CD45 and Rag­1 and Rag­2 but extinguish expres­

sion of TDT. They express gènes that encode surrogate light chains (VpreB and X5) that can be ex­

pressed on the cell surface with M H chains. Once L­chain rearrangement has yielded an expressible L chain that can pair with the expressed n H chain, the cell may be considered to t>e an immature B cell bearing cell­surface IgM. With the further expression of the 6 H chain (and thus of membrane IgD) and of a set of other markers of which CD23 is one, the cell may be regarded as having entered a state of maturity.

II. Introduction

individus de la lignée. Cet idiotype est dit public ou récurrent. C'est le cas, comme nous le verrons, de la réponse anti-arsonate de la lignée pure de souris A/J.

Les lymphocytes B dérivent de cellules souches hématopoiétiques provenant du foie foetal où ils se différencient pendant la vie intrautérine. C'est la moelle osseuse qui, après la naissance, est le siège de cette différenciation (figure A).

Les cellules souches se différencient en cellules pro-B exprimant l'Ag B220 à sa surface (marqueur caractéristique des lymphocytes B) et réarrangeant la chaîne lourde [i d'Ig. La cellule se différencie alors en cellule pre-B qui exprime la chaîne lourde associée à des protéines VpréB et >^5 homologues aux parties variable et constante de la chaîne légère k. A ce moment la cellule réarrange les gènes de la chaîne légère d'Ig. Ensuite, elle se différencie en lymphocyte B immature exprimant sa première Ig complète, l'IgM membranaire. Les lymphocytes B immatures

expriment fortement le marqueur HSA à leur surface comme la grande majorité des cellules de la moelle osseuse. Les gènes RAGl et RAG2, activateurs de la

recombinase, sont éteints et le processus de réarrangement est stoppé. C'est à ce stade que s'opère la sélection éliminant les lymphocytes B autoréactifs qui fera l'objet du chapitre 2 de l'introduction. Le lymphocyte qui échappe à cette sélection devient un lymphocyte B mature et quitte la moelle pour gagner la périphérie oîi il va rencontrer le monde antigénique. Il est alors porteur d'un second isotype d'Ig, l'IgD, qui se compose de la même région variable associée avec une partie constante de type ô.

L'activation du lymphocyte B requiert une importante agrégation des Ig à la surface de la cellule. Etant donné que les Ig exprimées par un même lymphocyte ont toutes la même partie variable et reconnaissent donc toutes le même déterminant antigénique (la majorité des lymphocytes B et T sont monospécifiques). un Ag susceptible d'agréger suffisamment les récepteurs aura un grand nombre de déterminants antigéniques (ou épitopes) répétés. Dans la plupart des cas l'Ag seul, même provoquant une certaine agrégation des récepteurs, n'arrivera pas à activer le lymphocyte B. Un signal costimulateur délivré par un lymphocyte Th activé est requis: un lymphocyte Th activé spécifique du même Ag va reconnaître un fragment peptidique de celui-ci présenté sur le MHC de classe II à la surface du lymphocyte B. La molécule gp39 exprimée par le lymphocyte Th activé va alors se lier à la molécule CD40 du lymphocyte B et transmettre ainsi le signal costimulateur requis (Van den Eertwegh 1993, Foy 1993).

Certains Ag dit thymo-indépendants ne requièrent pas la présence de lymphocytes Th pour activer le lymphocyte B, soit parce qu'ils expriment un grand nombre

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II. Introduction

d'épitopes répétés susceptibles d'agréger fortement les récepteurs Ig, soit parce qu'ils activent le lymphocyte B suite à la reconnaissance d'un autre récepteur que l'Ig comme c'est le cas pour les lipopolysaccharides (LPS) présents dans la paroi des bactéries gram" et qui activent les lymphocytes B de façon polyclonale (Morrison 1993, Ulevitch 1994).

L'activation du lymphocyte B l'induirait à se différencier soit en cellule sécrétrice d'Ac ou plasmatocyte, soit en cellule de mémoire, suite à une division inégale. La production d'Ac par ces cellules sécrétrices d'Ac ou plasmatocytes donne naissance aux réponses primaires dominées au départ par l'isotype IgM qui est la première Ig produite (l'IgD n'est jamais sécrétée). Au cours de la réponse, d'autres isotypes vont apparaître par un mécanisme appelé commutation de classe et qui consiste à associer la même partie variable réarrangée avec une partie constante d'isotype différent. Les cellules de mémoire donneront naissance à des cellules productrices d'Ac après un second contact antigénique, elles sont donc responsables des réponses secondaires. Ces réponses secondaires sont des réponses plus fortes, survenant plus rapidement, se composant d'Ac de plus haute affinité et dominées par les classes IgG, IgA et IgE. C'est ce qu'on appelle la mémoire immunologique.

La montée d'affinité des Ac lors des réponses secondaires est due à un mécanisme propre aux lymphocytes B qui fait intervenir les centres germinatifs, structures particulières se formant progressivement au cours de la réponse. En effet, au sein des centres germinatifs, les lymphocytes B en prolifération subissent le phénomène d'hypermutation somatique provoquant des mutations ciblées dans la partie variable des Ig et permettant de générer des récepteurs ayant une meilleure affinité qui seront alors préférentiellement sélectionnés par l'Ag.

Notons que l'hypermutation de la région variable de la chaîne a du TCR des

lymphocytes T présents dans les centres germinatifs a été démontrée très récemment (Zheng 1994).

A la différenciation conventionnelle des lymphocytes B telle qu'elle a été décrite ci-dessus s'oppose une théorie développée ces dernières années par le groupe de N. Klinman (Linton 1989, Klinman 1994), qui postule que les lymphocytes B participant aux réponses primaires et les lymphocytes B de mémoire responsables des réponses secondaires sont issus de précurseurs différents, ce qui permettrait d'expliquer certaines différences observées entre les réponses primaire et secondaire.

L'Ac monoclonal J l l D (reconnaissant l'Ag de surface HSA) se lie bien à la plupart des lymphocytes B primaires et mal à la plupart des lymphocytes B participant aux réponses secondaires, qui ont une expression diminuée de l'Ag HSA. Le groupe de

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II. Introduction

Klinman a montré que les lymphocytes B spléniques issus d'une souris naïve (non immunisée) et enrichis par sélection au FACS (cytofluorographe) pour un fort marquage à l'Ac J l l D (HSA'^'g*') produisent une forte synthèse d'Ac après une première stimulation antigénique T-dépendante, à la fois in vivo et in vitro. Cette réponse humorale est dominée par l'isotype IgM. Il ne semble pas y avoir de

génération de cellules B de mémoire à partir des précurseurs HSA^^^gh stimulés une première fois. En effet, la quantité d'Ac synthétisée n'augmente plus après une seconde stimulation. Par contre, une très faible quantité d'Ac est obtenue après une première immunisation T-dépendante des lymphocytes B spléniques isolés pour leur faible marquage à l'Ac J l l D (HSAlo^). La majorité de ces précurseurs HSA'o^

donne naissance à des cellules qui répondent vigoureusement à une seconde stimulation antigénique. Ces cellules en culture produisent des Ac contenant une plus faible proportion d'IgM (Linton 1989).

La réponse anti-NP ((4-hydroxy-3-nitrophényl) acétyl) des souris de la lignée CB20 est caractérisée par la dominance d'Ac porteurs d'une chaîne légère k en réponse primaire et d'Ac porteurs d'une chaîne x en réponse secondaire. L'analyse de la réponse humorale anti-NP générée par des lymphocytes B CB20 mis en culture révèle que 60 à 70 % des clones issus des lymphocytes B HSA^igh produisent des Ac porteurs d'une chaîne légère X, tandis que 80 % des clones issus des lymphocytes B HSA '°^ synthétisent des Ac porteurs d'une chaîne x après plusieurs stimulations antigéniques.

De plus, les Ac d'hybridomes issus de la fusion d'un myélome et des cellules de rate de souris SCID (déficientes pour la recombinase nécessaire à l'assemblage des gènes d'Ig) repeuplées avec des précurseurs HSA'o^ et recevant un rappel antigénique 8 jours après l'immunisation primaire, témoignent de l'accumulation rapide de mutants

somatiques (Linton 1989).

Ainsi, les lymphocytes B HSA*^igh (exprimant fortement le marqueur HSA) ne se différencieraient pas en cellules de mémoire lors du contact antigénique mais donneraient uniquement naissance à des cellules sécrétrices d'Ac. Tandis qu'une seconde population de précurseurs moins nombreux (environ 10 % des cellules I-A+

d'une rate adulte), les lymphocytes B HSA'o^ (exprimant faiblement le marqueur HSA), serait impliquée dans les réponses de mémoire survenant lors d'un second contact antigénique. Ces cellules seraient responsables de la formation des centres germinatifs et auraient une adaptabilité particulière à subir le processus

d'hypermutation somatique.

Cette hypothèse, bien que très attractive, reste encore actuellement fort controversée.

Notons que les auteurs n'excluaient pas la possibilité que des lymphocytes B

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II. Introduction

puissent à la fois donner naissance à des cellules sécrétrices d'Ac et à des cellules de mémoire après une première stimulation antigénique.

Il faut mentionner l'existence d'une population de lymphocytes B qui diffère de la population majoritaire précédemment décrite. Ces cellules portent le marqueur CD5 ne se trouvant pas sur les autres lymphocytes B mais qui est un marqueur habituel des lymphocytes T. Les lymphocytes B € 0 5 + se retrouvent principalement dans la cavité péritonéale et sont très nombreux dans la vie foetale et post-natale. Ils dérivent de précurseurs différents que l'on trouve dans le foie foetal mais pas dans la moelle osseuse de l'adulte. Cette population de lymphocytes est donc acquise tôt dans la vie et n'est pas renouvelée. En réalité, il semble y avoir une certaine autorégénération des lymphocytes B CD5+. Ils synthétisent des Ig largement autoréactives mais leur fonction est mal connue.

Les cellules souches hématopoïétiques précurseurs des lymphocytes T et B possèdent un répertoire germinal ou répertoire potentiel identique, composé de tous les gènes V, D et J du génome. Le nombre de combinaisons différentes est estimé à plus de 10^ pour les lymphocytes B, de même que pour les lymphocytes T. Au cours de l'ontogenèse, se déroulant dans le thymus pour les lymphocytes T et dans la moelle osseuse pour les lymphocytes B, les cellules vont devenir des lymphocytes immunocompétents exprimant un récepteur spécifique codé par une combinaison de gènes différente d'une cellule à l'autre. Les lymphocytes matures vont ensuite rejoindre les organes périphériques où se déroulent les réponses immunitaires.

Cependant, un très grand nombre de lymphocytes vont mourir et être éliminés sans jamais pouvoir atteindre la périphérie. En effet, parmi les lymphocytes T en développement dans le thymus, seulement 1 à 5 % atteindront le stade mature susceptible de quitter le thymus et de participer aux réponses immunes (Scollay 1980, Surh & Sprent 1994). Il semble qu'il en soit de même pour les lymphocytes B dans la moelle. Ainsi, dans ces organes centraux où se déroulent les mécanismes générant la diversité s'effectue également une forme de contrôle de qualité surveillant étroitement les spécificités qui vont être exportées et exerçant une régulation fine sur la formation du répertoire.

L'ensemble des combinaisons V, D, J exprimé par les lymphocytes de la périphérie constitue le répertoire disponible. Ce répertoire est restreint par le nombre de lymphocytes matures: chez la souris qui possède environ 10^ lymphocytes B matures, la taille moyenne d'un clone étant approximativement de 10 cellules, 10^

régions variables d'Ig différentes sont exprimées (Jeme 1971).

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II. Introduction

Finalement, les cellules activées par l'Ag utilisent un répertoire encore plus restreint appelé répertoire fonctionnel ou accessible à l'Ag.

2. SELECTION NEGATIVE

Etant donné la formation largement stochastique d'un répertoire de récepteurs spécifiques extrêmement vaste, le système immunitaire génère non seulement des récepteurs reconnaissant "l'étranger" ou "l'anormal" mais également des récepteurs reconnaissant les constituants normaux du soi. Une forme de sélection négative prévenant l'autoagression existe donc.

Cette caractéristique du système immunitaire appelée plus globalement tolérance naturelle est assurée par plus d'un mécanisme: l'élimination physique des cellules autoréactives, leur anergie, une suppression éventuelle de ces cellules exercée par d'autres cellules et par des facteurs solubles ou tout simplement l'ignorance de l'Ag du soi.

Les tissus et organes qui constituent le système immunitaire sont divisés en deux catégories, les organes lymphoïdes primaires où sont produits les nouveaux lymphocytes et les organes lymphoïdes secondaires oix les lymphocytes adultes rencontrent l'univers antigénique. L'organe primaire où maturent les lymphocytes T est le thymus et c'est la moelle osseuse qui joue ce rôle pour les lymphocytes B. Les organes lymphoïdes secondaires sont principalement la rate, les ganglions

lymphatiques, les plaques de Peyer et les amygdales. La division entre organes primaires et secondaires n'est pas absolue, on trouve dans la moelle osseuse des plasmatocytes recirculants et on peut également observer quelques centres germinatifs formés dans le thymus en réaction à l'antigène.

Ce sont dans les organes primaires où les lymphocytes se différencient que se passent les événements de translocation de gènes donnant naissance au récepteur spécifique de chaque cellule. C'est donc là que se place la première et la plus importante des barrières de tolérance, au cours de la maturation de la cellule.

De très anciennes théories postulaient déjà que l'établissement de la

tolérance survienne tôt dans l'ontogenèse du système immunitaire (Bumet & Fenner 1949) au moment où, en principe, aucun Ag étranger n'est présent. En 1953, le groupe de Medawar (Billingham 1953) montrait que l'injection de cellules

allogéniques (portant des molécules MHC différentes) chez un souriceau nouveau-né rendait celui-ci tolérant à une greffe de peau provenant du même allotype. Ces

travaux et d'autres ont progressivement établi que la tolérance naturelle résulte d'un

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II. Introduction

apprentissage qui débute dès les premiers instants de la vie embryonnaire du système immunitaire, se poursuit et s'achève après la naissance.

Bumet fut le premier à lier le phénomène de tolérance naturelle à la monospécificité des lymphocytes. La réponse immunitaire pouvait alors s'expliquer en termes de sélection clonale et il proposa que la tolérance du soi s'établisse par l'élimination clonale des lymphocytes autoréactifs (Bumet & Fenner 1949).

En 1959, Lederberg proposa alors sa célèbre théorie selon laquelle tout lymphocyte passe, au cours de sa maturation, par un stade oîi il est particulièrement sensible aux signaux de tolérance et où toute rencontre avec l'Ag dont il est spécifique le paralyse

(Lederberg 1959). Cette différence de sensibilité à l'induction de tolérance entre les lymphocytes immatures et matures fut largement étayée par de nombreux travaux

(Bruyns 1976, Nossal & Pike 1980, Kappler 1987, Finkel 1989, Matzinger &

Guerder 1989, Nossal 1992). G. Nossal proposa également l'anergie clonale, ou inactivation fonctionnelle, comme un mécanisme cellulaire alternatif à l'élimination clonale.

Comme nous allons le voir, ces auteurs détenaient tous une part de la vérité.

2.1 Sélection négative des lymphocytes T 2.1.1 Elimination

Des cellules souches quittant la moelle osseuse gagnent le thymus où elles vont se développer en lymphocytes T compétents qui seront exportés vers la

périphérie. Lors de cet écolage des thymocytes qui prend environ 3 semaines (Shortman 1992) les cellules vont subir 2 sélections importantes. L'une va éduquer les thymocytes à reconnaître leur Ag en association avec les molécules MHC présentes dans le thymus (restriction MHC) et sera décrite dans le chapitre 3 de l'introduction. Une seconde sélection va purger l'autoréactivité de ce répertoire nouvellement formé.

Une élimination des clones autoréactifs a été mise en évidence par de très nombreuses expériences. La compréhension de ce phénomène a fort bénéficié de la découverte que certains Ag du soi (comme la molécule MHC de classe II, I-E ou les Ag codés par les MMTV (mouse mammary tumor viruses) endogènes) peuvent réagir avec tout un groupe de lymphocytes T dont le TCR comporte un V[3

particulier. Les Ac monoclonaux spécifiques des familles de chaînes V(3 permettent de suivre les cellules T réagissant à ces "super-antigènes". Il a ainsi été montré que les lymphocytes T spécifiques d'un super-antigène du soi sont présents dans le thymus au stade où ils expriment faiblement le TCR mais sont éliminés avant d'atteindre le stade où ils l'expriment fortement (Kappler 1987, McDonald 1988).

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II. Introduction

L'utilisation de souris transgéniques pour un TCR d'une spécificité donnée (la majorité des thymocytes exprimant cette spécificité, il est aisé de suivre leur évolution) a grandement contribué à la compréhension de la sélection négative.

Le groupe de von Boehmer (Kisielow 1988) a étudié le devenir de thymocytes porteurs d'un TCR transgène spécifique de l'Ag de transplantation mâle HY. Chez les femelles transgéniques (négatives pour HY) la majorité des lymphocytes T matures expriment le TCR transgène et sont de phénotype CDS"*" (voir le chapitre 3 de l'introduction: sélection positive). Chez les souris mâles une mort massive des thymocytes CD4''" CDS"*" est observée dans le cortex thymique de telle manière que le thymus a seulement 5% de son poids habituel. Les quelques cellules porteuses du TCR transgène échappant à la mort ont un taux de molécule CD8 très bas, ce qui les rend non fonctionnelles.

Un grand nombre de travaux ont démontré que la sélection négative était induite par les peptides présentés sur les molécules MHC des APC dérivées de la moelle osseuse, principalement des cellules dendritiques (von Boehmer & Schubiger

1984, Jenkinson 1985, Lo 1986). Comment se fait-il alors que ces cellules qui sont de puissantes activatrices des lymphocytes T dans la périphérie ont un effet aussi différent dans le thymus? Il semble vraisemblable que le couplage du TCR au mécanisme de transduction de signaux diffère entre les thymocytes immatures et les lymphocytes T matures. En effet, des Ac anti-TCR provoquent un important influx de calcium chez les lymphocytes T matures mais pas chez les thymocytes

immatures, par contre des Ac dirigés contre le complexe TCR-CD3 ont cet effet à la fois chez les lymphocytes T matures et immatures (Finkel 1989). Il se peut donc qu'un signal incomplet induise l'apoptose chez les cellules immatures.

La plupart des épitopes du soi reconnus par les lymphocytes T sont

présentés dans le thymus. Néanmoins, certains Ag du soi n'apparaissent que dans des tissus particuliers ou à des moments déterminés comme c'est le cas pour les Ag de différenciation. Leur présence dans le thymus à des concentrations suffisantes semble peu vraisemblable. Une tolérance périphérique complète donc la tolérance induite dans le thymus.

2.1.2 Anergie

L'anergie, ou inactivation fonctionnelle, semble être le principal mécanisme de tolérance pour les Ag du soi rencontrés par les lymphocytes T dans la périphérie.

Plusieurs études réalisées avec des souris transgéniques ont démontré ce phénomène.

Des souris transgéniques pour un Ag MHC de classe I (Morahan 1989) ou un Ag

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II. Introduction

MHC de classe II (Burkly 1989) étranger exprimé dans les cellules (3 du pancréas, et non dans le thymus ou les organes lymphoïdes périphériques, sont tolérantes vis-à- vis de ces Ag bien que les lymphocytes T spécifiques soient toujours présents chez ces animaux. Les lymphocytes T isolés du thymus sont toujours capables de répondre à l'Ag in vitro tandis que les lymphocytes T isolés de la rate en sont

incapables. Cette anergie est réversible si les cellules sont cultivées en présence d'IL- 2 (Morahan 1989). Le groupe de von Boehmer (Rocha & von Boehmer 1991) a suivi le destin de lymphocytes T matures provenant de femelles transgéniques pour un TCR anti-HY (Ag mâle) et injectés dans des mâles syngéniques nudes (dépourvus de lymphocytes T). Les lymphocytes T spécifiques de HY rencontrant leur Ag chez ces receveurs mâles prolifèrent fortement pendant environ 5 jours, ensuite une partie d'entre eux disparaissent. Ceux qui restent sont incapables de répondre à une

sollicitation du TCR même en présence d'IL-2. Ils sont donc devenus profondément anergiques après une première phase d'expansion et ne retrouvent leurs capacités d'activation qu'après avoir été maintenus pendant de longues périodes dans des souris femelles, c'est-â-dire en l'absence de l'Ag tolérogène.

Dans certains modèles les lymphocytes T anergiques sont

phénotypiquement normaux, tandis que dans d'autres expériences les cellules présentent un taux de TCR et/ou de molécule accessoire (CD4 ou CD8)

extrêmement bas. Il semble donc que la sélection négative périphérique puisse agir par différents mécanismes: une réelle inactivation fonctionnelle des cellules ou simplement une diminution des récepteurs présents à la surface, empêchant une stimulation correcte.

La façon dont les lymphocytes T tolérogénisés en périphérie rencontrent leur Ag est mal connue. En effet, les lymphocytes T matures vierges émigrant du thymus ont un parcours au travers des tissus fort limité. Ils migrent

préférentiellement du sang vers les tissus lymphatiques où les chances pour la rare cellule spécifique de rencontrer son Ag sont optimales. La plupart des lymphocytes T migrant vers d'autres tissus sont les lymphocytes T de mémoire. Une première rencontre avec l'Ag a permis leur expansion clonale et, plus nombreux, ils

patrouillent ainsi l'individu afin d'éviter toute réinfection. Il est difficile d'imaginer comment chaque lymphocyte T vierge émergeant du thymus peut visiter tous les sites possibles où des Ag spécifiques de tissus sont exprimés de manière à être rendu anergique dans un laps de temps raisonnable. Il se peut qu'il existe une forme de transfert des Ag du soi, par des APC, vers des tissus lymphatiques locaux.

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Figure B

(Waldman & Cobbold 1993)

(a) Two choice modei

Effecior T cell

Tolérant T cell

(b) Two lineage model Naive Thi cell Effector T cell

Naive Th2 cell Suppressor T cell

Models of infectious tolérance, (a) A T cell bas choices:

In a non-permissive environment, which directs a T cell to- vvards tolérance, it develops into a cell that itself can bias the décision making process. This could happen actively (through cytokine release, i.e. a ThO cell becoming a Th2 cell) or by the T cell becoming anergic. If anergic cells were to compete at sites of antigen présentation and block collaborative events, then the resulting 'helpless' microenvironment would encourage more naive T cells to become anergic. In this way the process would perpetuate itself in a passive way. For obvious reasons we refer to this model as the Civil Service Model. (b) We imagine that particular epitopes on the antigen would favour the activa- tion of cells with regulatory properties. Such cells would again corne to dominate and influence other naive cells to develop in the same way (e.g. the development of ThO to Th2 cells). The only différence between this and (a) is that it would be only a propor- tion of the antigenic epitopes that could engage thèse regulatory cells.