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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Delwiche, F. (1987). Contribution à l'étude des facteurs de modulation de l'érythropoièse normale et pathologique (Unpublished doctoral dissertation).

Université libre de Bruxelles, Faculté de Médecine – Médecine, Bruxelles.

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UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES FACULTE DE MEDECINE ET DE PHARMACIE

SERVICE DE MEDECINE INTERNE HOPITAL ERASME

CONTRIBUTION

A L’ETUDE DES FACTEURS DE MODULATION DE L’ERYTHROPOIESE

NORMALE ET PATHOLOGIQUE

Francis

Travail présenta en vue de l obtention du grade d'agrege de l'enseignement supérieur

1987

UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES

Service de Médecine Interne Hôpital Erasme

UNIVERSITY OF WASHINGTON SEATTLE USA

Division of Hematology University Hospital

CONTRIBUTION

A L'ETUDE DES FACTEURS DE MODULATION DE L'ERYTHROPOIESE

NORMALE ET PATHOLOGIQUE

Francis DELWICHE

Travail présenté pour l'obtention du grade d'agrégé de l'enseignement supérieur

1987

PouK une. uinJJii probable.,

c.ombi.ejn. d'eA.fie.uK6 ceAXcUneA.

Je -tXen4 à manl^e^tOA ma ptu6 pfLo^ondz gfiatltude. zt l'expae^- iLon dz ma 6inzzKZ adm-ÜLoXLon aux qucutKZ pzn.6onnaJUXz(t quÂ. m’ont, touA. à toa>i, guidz, 6u6cJXz une émulation IntzHzztuzllz zt épaulé dané Izi momznté dl^^l-

cÀlzi : Izi ?Koizti>zu>i^ John William kdamion, RogzA EoJilejn.6, Jzan-PlzAfiz Nazti et VlzfLKZ StKljzkmané. Chacun d'zntn.z zux, aux momznti oppon.tun6, dam deA do- malnzé dl^^zfiznti et complémzntaxAeA, ont pzmli la Kéolliatlon dz ce travail.

kp>iéA une ^onmatlon clÀxilquz enfilchlA^antz, J. P. Nazti a zveJJlz mon IntéAZt poun. l’hzmatologlz expinÂmentalz en m'Initiant, pan -6a mé- thodz ■&ocfLatlquz d’zmeJLgnemejit, aux nlguzuAi dzA InveAtlgatlom 6clzntl{,lqueA.

Jl m'a lait connaXtxz toutz6 IzA potexitlalltéA dzA méthodzi dz cultuKZ poun.

étudlzn. l’éAgthnopolzAZ et, apn'zi dz6 tâtonnements maladnolts qu'il a zu la gnandzun. dz ne pas peAczvoln. d'unz manléaz péjonatloz, m'a lntn.odult aupnzs d’un "maZtnz" dans la dlsclpllnz, à savoln. J.W. Adamson.

Czlul-cl m'a acceallll avec znthouslasmz et pn.ocun.z toutz

1’ln^n.astn.uctun.z nzczssaln.z à la n.zallsatlon dzs expéalenceA. Sa pnzszncz pzn.-

manzntz Sun. Izs ilzux du tnavalt, sa dlsponlbllltz et suntout son Insexislblti-

tz aux démonstnatlons sclzntl^lquzs Insu^^lsantzs, ont élzvz gn.aduellzmznt Iz

nloeau dz ma pznszz et zntn.alnz sa concnétlsatlon dans dzs expénlences nzpno-

ductlblzs. En plus dz czs qualités dz chznchzun. dynamlquz, n.lgoun.zux, objzctl^,

cet hommz a zu l’ant dz gllsszn pnesqu’lmpZAczptlbtzmznt une nzlatlon pnochz dz

V amitié.

Ce 6tjoufL aux Etat6-UnLi, xmpJLiquant du

6

^

.

^Inan- cxèA.zi et une ab-ienee pKotongée du -henutee de Médeetne Interne, ne ^ut pout- ble que paK tex> tnteAventton^ e^^teaeei de R. BetZené aup^èô du CometZ MédZcaZ de Z'HôpZtaZ E^aime et du Eondi HationaZ de la Rec.hen.eke SeZentZ^Zque. CeZuZ-eZ, pan. 6ei eonieZZi et 4e4 qualZtu humaZneA éZevéei, m'a eonétamment pnodlgué le ioutZen néee4>iaZn.e à V éuZtement de la tendance natuneZZe à la dZiiZpatZon de6 actZvZtu. Son noie ne 6'ex>t pa-i annête là, et, juéqu'à l'achèvement de ce tnavaZl, IZ m'a aZdé, éZnon enieZgné Z'ant de la dZ&6entatZon. Son Zmpact ne 6'achève pa6 avec, la nédactZon de cette thhie, Zl 4e prolonge dané l'avenZn. de me4 actZvZtu clZnZquei et expènJjmentalei.

En^Zn, P. StnZjckmani, 6uZvant dZicnèt^Ttent maZt icnupuZeu- iement l'évolutZon det tnavaux, m'a ouvent let pontes de -ton labon.atoZn.e poun.

acheven. leà den.nZen.ei, expénZencei, ZncZtè à cotmencen. la nédactZon de ce tnavaZZ et, avec la gentZlleue et la douceun connuei pan noui toui, Znlauablement connZgé au couni de ia pnogneiiZon, la nédactZon de cet ouvna^e.

Je doZi également expnZmen ma neconnaZuance au Pno^eueun J. Wybnan quZ m'a oHent la IZbenté d'utûZZ^en lei neuouncei de ion labonatoZne et l'aZde de LZlZane Schandene poun la néalZiotZon de centaZnei manZpuZatZoni ZndZipeniablet.

Je me doZi également de mentZonnen la dZZZgente aide ZnteZlec- tueZle d'AlaZn VeZ^ongei et la dZiponZbZlZté de Hadame Soquet.

En^Zn, je nemencZe toui lei membnei du ienvZce de UédecZne

Zntenne de l'HôpZtal Enaime qui m'ont octnoyé une centaZne IZbenté clZnZque

pendant lei dennZènei iemaZnei et, iuntout, la dZicnète et pen^onmante tâche

de Madame Suzanne BeZZeni quZ, déi le début de la nédactZon, i'eit e^^oncée

avec un dévouement iam néienve et une onganZiatZon métZcuZeuie, de m'aZden à

la pnéientatZon de ce tnavaZl.

CHAPITRE I. PREFACE ... 4

CHAPITRE II. INTRODUCTION GENERALE

LES CONCEPTS DE L'ERYTHROPOIESE ... 10

CHAPITRE III. OBJECTIFS DU TRAVAIL ... 40

CHAPITRE IV. METHODOLOGIE GENERALE ... 46

CHAPITRE V. RESULTATS EXPERIMENTAUX

I. MODULATION HUMORALE DE L'ERYTHROPOIESE --- 80

I. I. Etude in vitro de l'action de la

parathormone sur 1'érythropoièse ... 82 I. II. Etude in vitro des facteurs inhibiteurs

de 1'érythropoièse dans l'insuffisance

rénale chronique ... 111

II. MODULATION CELLULAIRE DE L'ERYTHROPOIESE 149

II. I. Etude de la modulation de l'érythro- poièse in vitro par le facteur de crois­

sance d'origine plaquettaire (PDGP) .... 151 II.II. Etude de la modulation de l'érythro-

poièse in vitro normale et dans l'apla­

sie pure de la lignée rouge ... 186

CHAPITRE IV. CONCLUSIONS GENERALES ... 215

BIBLIOGRAPHIE 223

PREFACE

Au coufU de. ce.i deux deAnd-èAt^i dicenni-Zi, ta rrûJ>z au potnt de nouveJULzi méthodzi d'inutitlgatton, peJi{^o>manXeJ> et ^tabtzi, et tzuK appti- zatton, dam dtueAiZi condittom phyitotogtquzi et patkotogtquet, ont pA.o^on- démznt modt^té. noi conczpti en mattèAZ de Kigutatton de V éAytk>iopoi.e.iz. Vam V état actuet de no6 connataance^, cette fiigulatton, anatgiiz gtobatemznt, iembtz tz mtzux fizpondKZ à un iy-itbnz " ittmutatJion - modulatton L'homzo- 4taitz de V ZAyth^opotèAZ n'z^t pa-i untvoquz; ettz Zit zondJLttonnzz pan. un znakatnement izquznttzt dz phénomènes, d'abond dz " ittinutatton ", éutvÀs pan dzi mzzanûimzi dz " modutatton " tn^tuenç,ant dan6 un 4zn6 poàXttf, ou négatif la pnolt(,énatton des pnogznJtzuni znythnoZdzi.

Tout pontz a cnotnz quz, d'unz pant, ta itimutatton dz t'zny- thnopotziz est 6ou6 ta dzpendanzz pnzzmtnentz dz Vznytknopotétinz; mats d'au­

lnes ■itimutatzuni iembtent existzn; et quz, d'autnz pant, à zôtz dz ce ou dz zzi> pnlnctpzi détznminanti, des ^acteun^ humonaux et zettutatnz6, ^aztzun6 dz modutatton, tntznléJiznatent aozz t'actton dz t'honmonz znytknopotéttquz 6un ta zettutz iouzhz znythnotdz.

Poun d'auzum, ces ^actzum dz modutatton, dam tes condt- ttom phyitotogtques, ontzntznatent tz contnôtz ^tnat dz V homzoétaitz zny­

thnotdz; dan6 czntatnzA ctncon6tanczi pathotogtquzi, tzun pnésencz, en con-

5.

c.e.ntfLatJLon6 anoKmale.6, KtndKcuLt comptz dz la dy^ifiythaopoli-iz.

Au dé-but dz cz t>Lzzlz, zn 1906, dz^i autzuai ^aançaLi ont mLi zn zvtdzncz, dani Iz 6ZKum d'animaux. Kzndui anzmtquzi, un p^iinzipz qu'ilé nom-

mznt

kmopolztinz ", zapablz dz itimulzK la {^onmatton dzA globulzi> aougz-i.

L'dxittznzz dz zzttz ^ubitanzz humoaalz nz lut zoniijimzz qu'au dzbut dz6 annzz-i -50. Quzlquzi annzzt plui taad (1957, 1958), ■ion oKlginz Kznalz zt ia natuaz homonalz ^uKZnt ztabtizi; zllz {.ut dznommzz

zaythfLOpotztinz

Cz n'zit qu'au début dzi annézi -70 quz dzi pkénomznzi dz KZ- gulatton, autazi quz l'action itimulantz dz V ZKytk>Lopoi.étinz, ont été iuggéaéi.

Czi obizavattoni nz {uKznt poiii-blzi quz gaâcz au dévzloppzmznt dzi métkodzi dz cultuKZ in vitn

dzi czllulzi médullainzi. Vzputi, pluilzuKi {actzuKi, tant hu­

moraux quz czllulaiAZi, in{luznç.ant l'zxpaniion du tLiiu érythroldz, indépzn- dammznt dz l'érythropolétlnz, ont été rzconnui, Kinii., naquit Iz conczpt dz

" modulation " dz l'érythropolziz. Czpzndant, à l'analyiz dztallléz, il apparaît quz Iz rôlz phyilologlquz dz czi {actzun rzitz controvzriz zt Izur impact, dam Izi clrcomtanczi pathologlquzi, zncorz mal przciAZ. Czi prlnclpzi, dont bon nombrz zncorz à rzconnaltrz, izraiznt multlplzi zt dlvznl{lzi zt Izun mzcanli- mzi d'action iûrzmznt dlitincti.

Cz brz{ apzrçu montrz la complexité dz la régulation dz l'zry- thropolz.iz zt ioullgnz Izi lacunzi dz noi connalaanczi alml quz czrtalnzi dl- vzrgznczi conczptuzllzi. Il mzt zn zxzrguz un iyitémz dz : " itimulatlon - modu­

lation SI Izi iitzi dz production dz l'hormone itimulantz izmblznt bien con-

nui zt il la compréhznilon dz ion mode d'action zit zn plein ztior, grâce aux

progrzi réalliéi dam Izi domainzi dz la biologie moléculaire zt du génlz génz-

-tique, t<u donnieJi conczAnant ta. modutatton du -t-t64u é/LytkaoZde. 6ont mcoae.

c.on{itijc.tuztteA.

Vani te. p>iueyit tfiavalt, nou-6 nou-6 ■6omme4 attachée à expto- fieA ce-fitatmi ■ittuattoM pcutkotogtqueA, dam teAqueZtz^ teJ> phénomèneyi de. mo- dutatton paKaJUtienZ trnpttqum. Notfiz tntéAêX poua te iujeX e-ô-t né d'un paemten.

groupe d'expéfiteneeA ujuant à tnve^Ztguen. t'acXton hypothéZtque de ta pan.aX.kon.

mone iun. t'énytknopotèAe, dam ta pempeeXXoe d'apponXen. une expLieotton à t'a némte de t'Jum^uHmanee nénate ehnontque. ït eéX appanu que eeXXe honmone n'a pai d'aetton tnhXbtXnÂee 6un. te déveZoppemenX de V en.yXhn.on. ?oun.6uÂ.vanX dam cette vote, noui avom monXné que te -ôénum de 6ujeX6, aXXetnXi de cette a^^ee- Xton, conXtenX dex> pntnetpe^ tnhtbiXejum, dtatyiabte6 et non 6pécÂ.^tqueA. Ce pnemten. gnoupe d'études noui a pen/nt^ de.eonltnmex t'extiXenee de {^acXeum ku- monaux de modutaXton et de pnécLien tei ean.aeXénJx>Xtquex> de eenXatm d'enXn.e

eux. En un deuxtme Xempi, noui adne^^anX cette ^ot6 à de6 ^aeXeun.i eeJLtatat- n.ei, d'abond d'ontgtne ptaqueXXatne, tt ^uX dmonXné que eenXatm de eeux-et

éXatenX douéi d'un e^eX modutaXeun. poitXt^ iun. t'ényXknopothie. EonXi de ce-5 ob6en.vaXtom, nou6 noui 6ommej> tnXen.n.ogii 6un te note éventuel d'auXnm pntn- etpe6, notamment tymphoeyXatnei, con^tnmanX atmt que dei étémenXi eettutatnei peuvent eXne concenné^ dan-6 te conXnôte de t'ényXhnopoteie nonmate et paXhoto- gtque.

*

* *

hloXne eonXntbuXton apponXe ta eon{^tnmaXton de t'exLiXenee

de ^aeXeun6 de modutaXton négative de t' ényXhnopotèx>e, ^acXeum humonaux dan6

7.

i'ÂM^u^^Lianc.^ Kinate. thKonJiqat, mouLi igcutement pA.XncXpe-6 zQJilutcüJi<u>, d'o'ui- gjint ptaqueXX.aÂJiz zt tymphozytaÀJLZ, da.n6 d'autfiu zondi^tion6 phy6Âj}togÀjqaz4>

zt pathotogi-quiZi. Lojun.6 mzcanlimzi d'aztXxm iont di^tÂMzté.

TABLE DES ABREVIATIONS

ADN Acide désoxyribonucléique ADP Adénosine diphosphate

AMPc Adénosine monophosphate cyclique ATP Adénosine triphosphate

BPU-E Burst Porming Unit - Erythroid BPA Burst Promoting Activity

BSA Bovine Sérum Albumin CPU Colony Porming Unit

CPU-E Colony Porming Unit - Erythroid CPU-GEMM Colony Porming Unit - Granulocyte

Macrophage Megakaryocyte

Erythroid

CPU-GM Colony Porming Unit - Granulocyte Macrophage CPU-Meg Colony Porming Unit - Megakaryocyte

CPU-S Colony Porming Unit - Spleen CSA Colony Stimulating Activity CSP Colony Stimulating Pactor

CyA Cyclosporine A

Ep Erythropoiétine

ESM Erreur Standard sur la Moyenne PC S Petal Calf Sérum

GTP Guanosine 5' - triphosphate 5H-TDR Thymidine Tritiée

SH Sérum Humain

IBU Ibuprofène

IND Indométhacine

IRC Insuffisance Rénale Chronique LCM Leukocyte - Conditioned Medium

PHA Phytohemagglutinin

PDGF Platelet Derived Growth Factor

PP-PDS Platelet Poor - Plasma Derived Sérum PRCA Pure Red Cell Aplasia

PR-PDS Platelet Rich - Plasma Derived Sérum PTH Parathyroid Hormone

U/ml Unités par ml

CHAPITRE II

INTRODUCTION GENERALE

LES CONCEPTS ACTUELS DE L'ERYTHROPOIESE

1. Introduction.

Dans ce chapitre, nous nous proposons de résumer les concepts actuels de 1'érythropoièse.

L'homéostasie érythropoiétique aboutit à la production d'un nombre approprié de globules rouges, chargés adéquatement en hémoglobine, de façon à assurer leur fonction de transporteur d'oxygène. Deux voies distinctes s'intriquent : la prolifération cellulaire et la synthèse de l'hémoglobine, la cellule souche érythropoiétique est issue d'une cellule plus ancestrale, commune à toutes les lignées hématologiques, ce qui suppose une interrelation potentielle possible dans leurs développements ultérieurs.

La masse du tissu érythroide est vraisemblablement sous le contrôle d'un processus " stimulation - modulation ".

D'autre part, comme le souligne Finch (75), trois conditions

essentielles sont requises pour une homéostasie correcte : une

cellule souche saine, une réserve en Per adéquate et une

11.

production appropriée d'érythropoiétine (Ep).

En raison de l'orientation de nos travaux, il n'entre pas dans nos intentions d'aborder, ici, l'analyse, par ailleurs complexe, de la synthèse de l'hémoglobine au sein des progéniteurs érythroïdes. Par contre, il nous est apparu utile, pour la bonne compréhension de nos études personnelles, de rappeler les notions récentes relatives au développement cellulaire du tissu médullaire et d'analyser, au préalable, les mécanismes combien passionnants de la régulation de 1'hématopoièse.

2. L'évolution des étapes technologiques.

En matière d'érythropoièse, comme dans d'autres domaines de régulation, l'évolution des connaissances se déroula par étapes, en relation directe avec le développement des procédés d'investigations. Pour le physiologiste, le rapprochement est frappant et mérite d'être souligné.

A la fin du siècle passé et au début de ce siècle,

à la suite de Claude Bernard, la méthode expérimentale la plus

usitée consistait en des épreuves in vivo de circulation et de

circulation croisée. Mettant à profit ces techniques, Carnot et

Deflandre (30) eurent le mérite, en 1906, de démontrer

l'existence d'un principe humoral, " l'hémopoiétine ", stimulant

1'érythropoièse : le sérum du lapin, rendu anémique par saignées.

contient une substance, évidemment non identifiée à l'époque, favorisant la production des globules rouges.

Dans les années -50, la préoccupation des physiologistes était la mise au point de procédés permettant l'estimation des principes actifs par la quantification de leurs effets biologiques. Simultanément, Jacobson (108) et Naets (153)»

utilisant des modèles animaux différents, ont pu cerner l'hormone érythropoiétique, déterminer son origine rénale, la doser ou du moins apprécier ses effets, et établir son rôle de principal activateur de 1'érythropoièse. Depuis, ces méthodes biologiques, pendant longtemps les seuls procédés de dosage, se sont multipliées et affinées.

Evidemment et parallèlement, les hématologues étaient à la recherche de techniques de dosage radio­

immunologique de l'érythropoiétine. De nombreuses raisons, parmi

lesquelles l'absence d'une connaissance exacte de la structure

moléculaire de l'hormone érythroîde, ont rendu cette mise au

point difficile. Ce n'est qu'en 1972 que Garcia (83) d'une part,

et en 1973 que Cotes (43) d'autre part, proposèrent des méthodes

considérées comme valables. Sans vouloir entrer dans des

considérations techniques, ce sont probablement les mêmes raisons

qui doivent être invoquées, du moins partiellement, pour rendre

compte de certaines divergences enregistrées par les procédés

biologiques et radio-immunologiques.

13.

Les méthodes histologiques, de microscopies optique et électronique, pourtant largement utilisées, n’ont paradoxalement apporté que peu d'éléments décisifs quant à la compréhension de la régulation de 1'érythropoièse, à ses phases initiales. Par contre, aux stades avancés et différenciés de la maturation cellulaire, elles nous ont donné une description détaillée des éléments cellulaires aux diverses étapes de leur évolution. Toutefois, cette méthodologie, par comparaison avec les acquis obtenus dans d'autres domaines, conserve sûrement des perspectives d'avenir.

Dans les années -70, toujours dans la foulée de la préoccupation des physiologistes, l'intérêt se porta vers la mise en culture de tissus et d'éléments cellulaires isolés. Dans le domaine hématologique, en 1966, Bradley et Metcalf (23) furent les premiers à réaliser, avec succès, la culture in vitro de cellules médullaires.

Cette méthode a fourni une masse de renseignements

et a permis de franchir de grandes étapes dans la connaissance de

la physiologie et de la physiopathologie sanguines : notamment,

elle a contribué à la révélation de l'hypothétique cellule souche

hématopoiétique, cellule unique, se différenciant en cours de

maturation; à l'identification des facteurs de régulation de

l'érythron, mais aussi des autres lignées sanguines. Elle est à

la base de nos concepts actuels.

Depuis, cette méthode de culture médullaire a subi diverses adaptations, entre autres quant à la nature des cellules cultivées, également à propos de la composition des milieux de culture. Ces modifications méthodologiques pourraient éventuellement expliquer la discordance des résultats, observés dans des conditions expérimentales fort similaires. Cette technique de culture cellulaire, base de nos investigations, sera exposée et discutée ultérieurement.

3. Prolifération et différenciation des cellules souches hématopoiétiques.

Dès la découverte des éléments figurés du sang circulant (117), les chercheurs se sont efforcés de déterminer les organes responsables de la formation de ces cellules. En 1868 déjà, les travaux de Neumann (158) assignèrent à la moelle osseuse de l'homme adulte le site principal de la formation des cellules sanguines.

En 1879, Ehrlich (61) et plus tard, en 1898, Pappenheim (163), sur la base d'études exclusivement histologiques, proposèrent le concept d'une cellule souche médullaire, unique, commune à toutes les lignées sanguines. Il s'agissait là d'un postulat, postulat sûrement séduisant, compte tenu des développements ultérieurs. Mais, cette hypothèse

resta, pendant longtemps, sans le moindre support scientifique

valable. En effet, jamais, même actuellement, malgré les progrès

15.

de la microscopie, cette cellule souche ne fut identifiée.

Il fallut attendre, plus d'un demi-siècle (1961), la mise au point de méthodes de biologie cellulaire, pour ouvrir de nouvelles dimensions aux concepts de 1'hématopoièse. Till et Mc Culloch (204), eurent les premiers le mérite d'apporter une validité scientifique à l'hypothèse d'Ehrlich et de Pappenheim.

Sans fournir de démonstrations histologiques, ces auteurs

rassemblèrent des arguments, indirects et par là même

hypothétiques, mais reposant sur les principes fondamentaux de la

biologie cellulaire. Leurs expériences, où des souris irradiées,

donc à système hématopoiétique désintégré, après injection

d'éléments cellulaires médullaires issus de souris saines,

développent au niveau de la rate des colonies cellulaires

contenant les diverses lignées de l'hématopoièse, apportent un

argument formel en faveur d'une cellule souche hématopoiétique,

unique et ancestrale. Ces colonies sont dénommées en littérature

anglo-saxonne CPU-S pour " Colony Porming Unit - Spleen ". Les

données expérimentales ultérieures compatibles avec l'existence

de cet élément cellulaire souche unique sont actuellement

considérées comme suffisamment probantes ; la démonstration de la

monoclonalité des cellules souches hématopoiétiques dans la

leucémie myéloide chronique et la polycythemia vera par l'examen

de la répartition cellulaire des isoenzymes de la glucose-6-

phosphate-déshydrogénase (74,2) ainsi que les colonies dérivées

des CPU-GEMM (73). Au point que ce concept, malgré l'absence de

preuves histologiques, est définitivement admis.

Si les développements initiaux des lignées hématopoiétiques échappent à l'examen direct, par contre, aux stades ultérieurs de la maturation cellulaire, eux bien observés par les procédés microscopiques, la filiation vers les trois grandes lignées hématologiques est bien établie et les modifications cellulaires structurelles, y afférentes, bien décrites.

En résumé, l'état actuel de nos connaissances en matière d'hématopoièse relève, pour les développements initiaux de celle-ci, de données résultant avant tout de constatations de biologie cellulaire, obtenues in vitro, et, pour les déroulements ultérieurs, d'observations microscopiques, receuillies in vivo, surtout au niveau du tissu médullaire, mais aussi des autres organes impliqués.

Depuis les travaux de Bradley et al. (23), il fut possible d'étudier la régulation des cellules souches médullaires en révélant celles-ci par leur capacité de donner lieu à des colonies différenciées dans les conditions de culture appropriées. Le nombre de colonies cellulaires obtenues, in fine, par rapport au nombre de cellules implantées dans le milieu, est lié par une relation linéaire du premier degré; ce type de relation, en termes de dynamique cellulaire, laisse supposer que chaque colonie forme un seul clone issu d'une cellule souche unique. Dans la terminologie anglo-saxonne, cette cellule

souche hypothétique, capable de générer une colonie cellulaire.

17.

est appelée : " Colony Forming Unit " (CFU).

Par transposition conceptuelle, cette cellule

souche unique, placée dans son environnement médullaire, subirait une double évolution : un phénomène de prolifération et un phénomène de différenciation. Prolifération et différenciation constituent la maturation cellulaire.

Dans le domaine de la biologie cellulaire appliquée à 1'hématopoièse, l'état de maturation cellulaire peut être estimé, entre autres, par deux techniques in vitro : la vitesse de sédimentation cellulaire et la méthode de " suicide cellulaire " par la thymidine tritiée "(3H-TDR). En ce qui concerne les progéniteurs hématopoiétiques, il a été établi que :

- la vitesse de sédimentation est d'autant plus rapide que la cellule est mature, indiquant que celle-ci croît en taille au cours de sa maturation (145). Cette observation valable pour les progéniteurs hématopoiétiques révélés par les colonies ne l'est plus pour les précurseurs devenus visibles à l'examen microscopique; en effet, dans ce compartiment, la taille de la cellule décroît en cours de maturation;

- le pourcentage de cellules tuées par la 3H-TDR augmente avec la

maturation (la cellule souche en phase de synthèse d'ADN

incorporant une quantité d'autant plus léthale de cet isotope

qu'elle prolifère activement) (104).

Fait par ailleurs important : le passage de la cellule souche unique vers les diverses lignées sanguines ne s'effectue que sous l'influence de facteurs spécifiques dits

d'" induction En effet, in vitro, l'élément générateur de colonies, la CPU, ne donne naissance à l'une ou l'autre filiation cellulaire sanguine qu'à la condition de la présence, dans le milieu d'incubation, de constituants spécifiques, appropriés; ces facteurs, dans la littérature anglo-saxonne, sont dénommés

" Colony Stimulating Factor " (CSP).

Autre observation intéressante : ^our privilégier, in vitro, la génèse préférentielle au départ de l'élément formateur commun, la CPU, la présence de principes stimulateurs spécifiques d'une lignée pourrait s'avérer déterminante; ainsi, l'érythropoiétine, hormone essentiellement stimulatrice de 1'érythropoièse, serait une substance favorable à la prolifération d'autres éléments cellulaires, par exemple mégacaryocytaires (142,105); ces observations, entre autres implications, laissent supposer, au niveau médullaire, des mécanismes d'interrelations qui pourraient être médiés par des facteurs humoraux.

En matière d'hématopoièse, ces observations ont

permis de dégager diverses phases de maturation cellulaire :

19.

a) aux stades initiaux et hypothétiques ;

- les cellules souches, indifférenciées, seraient nanties de propriétés d'auto-renouvellement ; elles seraient douées de pluripotentialité, c'est-à-dire capables de générer les éléments cellulaires spécifiques des diverses lignées sanguines,

- à cet égard, une cellule souche, progéniteur des autres lignées, a été reconnue; il s'agit, dans la nomenclature anglo-saxonne, de la cellule identifiée sous le sigle : CFU-GEMM, pour " Colony Forming Unit Granulocyte, Erythroid, Macrophage, Megakaryocyte ", cellule capable, en fonction de son environnement, de produire les différents éléments cellulaires précités ;

- après intervention des facteurs d'induction, les cellules souches s'engageraient, d'une manière irréversible, dans une lignée donnée; elles deviennent incapables de s'auto- renouveler, mais proliféreraient dans un sens donné en fonction des conditions du milieu environnant.

b) aux stades ultérieurs de développement, les cellules, une fois orientées irréversiblement dans leur voie, deviennent optiquement repérables. Elles subissent des modifications structurelles, bien répertoriées par l'analyse microscopique du tissu médullaire, modifications structurelles

les rendant aptes à l'exercice de leurs fonctions spécifiques.

Tout porte à croire que cette maturation terminale n'est plus influencée par les facteurs d'induction. L'induction signe donc la différenciation cellulaire, qui, inéluctablement conduit, après maturation et exercice des fonctions spécifiques, à la mort de la cellule. Celles d'entre elles, qui n'entrent pas dans ce cycle, conservent leurs propriétés d'auto-renouvellement et leur pluripotentialité.

Ces expériences, in vitro, de culture médullaire, par le jeu dv^s modifications des milieux d'incubation : milieux synthétiques, sérum ou plasma, introduction de facteurs hématopoiétiques plus ou moins purifiés, inclusion d'autres

substances par exemple hormonales, ou encore substitutions ioniques, ont donné lieu à une masse d'informations. Certaines d'entre elles, plus concernées avec nos études, seront exposées ultérieurement.

Dans le souci d'éclairer le lecteur, nous proposons une représentation schématique, inspirée de diverses revues antérieures, retraçant les concepts actuels de 1'hématopoïèse. Celle-ci est illustrée par la fig. 1. Cette manière de voir est la transposition théorique, au niveau médullaire, des études réalisées tant in vivo qu'in vitro.

Trois compartiments distincts, en fonction du degré

de maturation cellulaire se dégagent successivement :

PIG. 1

INDUaiON

COMPARTIMENTS 2

PASSAGE DANr»SANC

OO ERYTHROCYTES

«Vo

EOSINOPHILES MONOCYTES

NEUTROPHILES

MATURES

CONCEPTS ACTUELS DE L'HEMATOPOÏESE

EA : érythroblastes acidophiles.

MGK : mégacaryocytes.

EO ; éosinophiles.

MAC : macrophages.

MO ; monocytes.

NE : neutrophiles.

MM ; monocytes-macrophages.

- le premier compartiment, le compartiment I, contiendrait exclusivement des cellules souches, cellules indifférenciées, non orientées, s’auto-renouvelant et à pluripotentialité; figurent sûrement aux nombre de ces éléments : la CFU-S et la CFU-GEMM;

- le compartiment II, dont les éléments ne se développeraient qu*après conditionnement par les phénomènes d'induction, se composerait de cellules exclusivement et définitivement engagées dans leur lignée respective; cet engagement irréversible a comme effet de les rendre incapables d'auto-renouvellement tout en .favorisant leur différenciation structurelle, selon le milieu environnant;

- le compartiment III est celui des cellules matures, ayant perdu toute propriété de prolifération, mais ayant acquis les formations structurelles pour assurer, après passage dans le sang périphérique, leurs fonctions spécifiques.

Au terme de cet exposé, un ensemble de faits peuvent être considérés comme acquis :

- l'existence d'une cellule souche hématopoiétique unique aux diverses lignées;

- l'influence de facteurs d'induction.

23.

probablement essentiellement humoraux, conditionnant l'orientation vers les lignées sanguines respectives;

- après influence de ces facteurs, la prolifération et la différenciation cellulaires, irréversibles, dans une lignée précise;

- en cours de maturation, l'acquisition de propriétés structurelles et fonctionnelles, spécifiques, au détriment des potentialités génétiques d'auto-renouvellement et de prolifération;

- en dehors des facteurs de stimulation, l'interférence probable d'une modulation.

4. Physiologie de 1'érythropoièse.

Le développement des concepts en matière de fonction érythropoiétique fut tributaire de l'évolution technologique. Diverses périodes se dégagent :

- celle des méthodes in vivo, les premières

utilisées, notamment : le compte des érythroblastes colorés au

May-Grünwald-Giemsa sur le frottis de moelle, le compte des

réticulocytes colorés au bleu de crésyl brillant dans le sang

circulant, la mesure de l'hématocrite, les méthodes isotopiques

au Fer 59 et au Chrome 51 pour mesurer respectivement la ferrokinèse, la durée de vie globulaire, ainsi que pour le dosage biologique de l'Ep;

- celle plus récente (1970) des techniques in vitro, à la suite des travaux de Stephenson et collaborateurs

(200), de cultures clonogéniques érythroîdes, avec de multiples variantes méthodologiques, rotamment quant à la composition des milieux d'incubation;

- celle (1972) de la mise au point des procédés radio-immunologiques de dosage de l'Ep.

Ces diverses méthodes explorent des phénomènes bien différents, ce qui rend compte de résultats parfois divergents, voire même contradictoires. De plus, autre cause de confusion, les principes actifs utilisés sont de pureté relative et variable, ou ont subi, au cours des années, comme c'est le cas pour l'Ep, des purifications de plus en plus poussées.

Globalement, la validité des observations peut être appréciée comme suit ;

- les techniques in vivo ont comme avantages de

fournir une mesure finale, résultat net d'événements propres à

l'homéostasie érythroide; elles ont comme inconvénients, entre

autres : d'utiliser des préparations relativement impures d'Ep et

25.

de recourir à des procédés biologiques de dosage de cette hormone, procédés moins sensibles et de réalisation fastidieuse;

- les études in vitro ont ouvert la voie aux investigations de physiologie cellulaire, mais elles ont parfois un caractère artéfactuel;

- dosages biologiques et radio-immunologiques s'adressent évidemment à des paramètres différents, notamment en ce qui concerne l'Ep.

Idéalement, l'exploration des mécanismes intimes de 1'érythropoièse devraient comporter des études parallèles in vitro et in vivo, mais ce fut rarement le cas.

Comme déjà exposé à diverses reprises, l'homéostasie érythroi'de se déroulerait, au départ d'une cellule souche hématopoiétique, ancestrale, unique, aboutissant à maturité sous l'influence d'un enchaînement séquentiel, d'abord de phénomènes de " stimulation ", complétés ensuite ou conjointement par des mécanismes de " modulation

Dans les paragraphes qui suivent, nous passerons successivement en revue l'état de nos connaissances à propos des processus de " stimulation ", de " prolifération " et de "

modulation " du tissu érythropoiétique.

A la suite de la découverte princeps de Carnot et Deflandre (50), relative à l'action stimulante de 1'hémopoiétine,

confirmée par les travaux de Reissman (176) et de Erslev (63)»

mais surtout à la suite des recherches de Jacohson (108) et de Naets (153)» il est unanimement admis que le régulateur principal de la masse du tissu érythroïde, " l'érythron ", est un principe synthétisé et sécrété en majeure partie par le rein : 1'" éry­

thropoiétine Toutefois, il est progressivement apparu que d'autres substances, telles que les androgènes, les hormones thyroïdiennes et surrénaliennes, pouvaient également, dans une certaine mesure, favoriser le développement de la masse érythro’ide. Par ailleurs, un autre facteur humoral, différent de l'Ep, facteur mitogénique, appelé dans la littérature anglo- saxonne " Burst Promoting Activity " (BPA) s'est avéré être, du moins in vitro, un agent stimulateur nécessaire à la croissance

de l'érythron.

L'Ep est une hormone dont la structure n'est

encore qu'imparfaitement connue. Elle n'intervient probablement

exclusivement qu'au niveau de la cellule souche érythroïde, mais

les récepteurs de son action restent hypothétiques. Elle est

produite par des organes distincts et non pas uniquement par le

rein, comme supposé initialement. Les mécanismes de sa sécrétion

ne sont que partiellement élucidés. Enfin, elle est dosée

biologiquement (7,44) et, depuis un certain temps, par des

méthodes radio-immunologiques (43»83)-

27.

Les principales caractéristiques connues de l'érythropoiétine sont ;

- sa nature chimique : il s'agit d'une glycoprotéine, mais sa structure moléculaire n'est toujours pas définie; au début de nos travaux, elle n'avait pas encore pu être synthétisée, avec les diverses implications qui en découlaient ; notamment, à propos de la validité des méthodes de dosages radio­

immunologiques et des techniques de cultures clonogéniques.

L'érythropoiétine humaine, dite purifiée, était extraite au départ d'urines, le plus souvent, de patients

atteints d'anémie aplastique ou d'aplasie pure de la lignée rouge. Selon les cas, les procédés d'extractions et de purifications sont très différents, ce qui rend compte, de la divergence de certains résultats expérimentaux. Des préparations, plus ou moins purifiées d'érythropoiétine, ont aussi été isolées d'urines d'autres espèces animales ; notamment le mouton et la souris. Tout récemment, un principe, doué des propriétés de l'érythropoiétine, a été obtenu par génie génétique (106);

- son site de production : initialement, cette hormone était considérée essentiellement d'origine rénale.

Depuis, selon les espèces animales, d'autres organes ont été

reconnus comme sites de production. Chez l'homme, le foie (168)

et les macrophages médullaires (178) ont été démontrés être des

structures sécrétrices; ce qui expliquerait, entre autres, que le

plasma de sujets anéphriques contient de l'érythropoiétine. Le

lieu exact de production de l'hormone, notamment au niveau du rein, n'a jamais pu être identifié d'une manière précise.

Certaines observations laissent néanmoins supposer que cette synthèse s'effectuerait dans les cellules de l'appareil juxta- glomérulaire.

- les mécanismes réglant sa sécrétion ; ceux-ci restent encore incomplètement élucidés. Toutefois, l'anémie et l'hypoxie la stimulent; 1'érythrocytose et 1'hyperoxygénation la dépriment. Le rein paraît le principal organe de cette régulation, mais d'autres parenchymes pourraient également être impliqués, vu que le plasma de certains sujets anéphriques contient des quantités anormalement élevées de cette hormone.

- son site d'action stimulante principal au niveau

de l'érythron : les mécanismes par lesquels elle extériorise cet

effet sur la cellule cible sont encore mal connus, notamment en

raison de l'absence d'une hormone purifiée, mais aussi de

l'hétérogénéité, en cultures médullaires, des cellules mises en

expérimentation. Néanmoins, divers arguments suggèrent la

présence d’un récepteur spécifique au niveau de la cellule souche

érythroi'de (39)» L'interaction de l'hormone avec ce récepteur

induirait une cascade d'événements biochimiques, deréprimant les

gènes codant la synthèse de diverses protéines spécifiques aux

caractères érythroîdes, notamment l'hémoglobine, la spectrine,

les antigènes de surface des groupes sanguins, etc...

29.

- sa production chez le sujet normal ; grâce à l'amélioration des procédés d'extractions, en 1966, Van Dijcke

(209) put déceler, dans les urines du sujet normal, des quantités mesurables d'érythropoiétine dont l'excrétion est de 3*5 /lU/jour.

Cette excrétion basale, en dehors de toute pathologie, établit formellement que l'érythropoiétine est une hormone sûrement sécrétée à l'état de base.

En résumé, l'érythropoiétine a un double mécanisme d'.action : elle stimule la prolifération de la cellule souche érythrolde et y induit la synthèse d'éléments spécifiques au phénotype érythrolde, conduisant in fine à la production d'un érythrocyte mûr. Le rein, organe qui synthétise et sécrète préférentiellement l'érythropoiétine, est sensible aux variations de la masse globulaire et de la p02; toute diminution de ces paramètres entraîne un accroissement du taux circulant d'érythropoiétine; leur augmentation le réduit. L'élévation du taux circulant d'érythropoiétine est associée à une stimulation de la prolifération des érythroblastes médullaires, via l'interaction avec un récepteur spécifique à la surface de la cellule souche érythrolde.

De découverte plus récente (1977), la " Burst

Promoting Activity " (BPA) se présente comme un autre activateur

de 1'érythropoièse (12,100). L'existence de ce facteur fut

suspectée au départ d'expérimentations in vitro, de cultures

clonogéniques érythro’ides. En conditions optimales et en présence

de concentrations élevées d'érythropoiétine, il fut d'abord observé que le développement dans le milieu d'incubation de cellules, accessoirement générées, dont des lymphocytes T et des monocytes, réduisait les besoins en érythropoiétine pour obtenir finalement le même rendement de colonies érythroîdes. Au cours d'études ultérieures, il fut constaté que l'adjonction, au milieu d'incubation, d'éluats, préparés par activation de ces éléments cellulaires accessoires, induisait le même effet stimulateur favorable, ce qui laisse supposer que cette action bénéfique serait médiée par la production de principes sécrétés par ces cellules.

Jusqu'à présent, la nature de cette ou de ces substances n'a pu être établie. Leur structure moléculaire reste inconnue, mais le poids moléculaire du complexe élué est estimé à 37-000 daltons. Evidemment, ces principes sont difficiles à doser; mais, les expériences d'Okamoto et al. (161 ) mirent en évidence leur présence dans les milieux biologiques, uniquement dans des conditions pathologiques, comme par exemple dans les anémies aplastiques.

Facteurs essentiellement révélés in vitro, leur

rôle physiologique reste hypothétique. Toutefois, la présence de

lymphocytes T et de monocytes, dans le tissu médullaire normal

n'exclut pas l'influence éventuelle de ces éléments sur

l'érythron, par le biais des substances sécrétées. Leur impact en

pathologie est possible, mais non démontré.

5. Méthodes de culture clonogénique des cellules souches

31.

érythroïdes «

Ces méthodes d'étude in vitro de 1'érythropoièse, introduites en 1970 par Stephenson et al. (200), ont permis de comprendre les étapes de la maturation érythroi’de.

Un premier groupe d'études a conduit à la notion de " Colony Forming Unit - Erythroid " (CPU-E).

Les cellules médullaires de souris en présence d'Ep donnent naissance à des agrégats de 4 à 64 cellules hémoglobinisées qui prolifèrent pendant 48 heures pour ensuite rapidement se lyser. Les mêmes phénomènes sont observés chez l'homme où ces agrégats contiennent de 8 à 200 cellules érythroïdes après 7 jours d'incubation. Des études ultérieures utilisant des milieux sans sérum (102), ont démontré que le nombre de ces colonies augmente proportionnellement à la concentration en Ep et ne requiert aucun autre facteur mitogénique. Ces agrégats hémoglobinisés ont été appelés CFU-E puisqu'ils dérivent d'une unité cellulaire souche qui a proliféré pour donner des colonies érythroïdes.

Un second train d'observations, d'ailleurs ultérieures, a abouti au concept de " Burst Forming Unit- Erythroid " (BPU-E).

Les cellules médullaires humaines, mises en

culture dans des conditions optimales et en présence d'Ep donnent

des agrégats cellulaires, qui synthétisent de l'hémoglobine après 6 à 8 jours d'incubation et forment de très larges colonies contenant jusqu'à 100.000 cellules hémoglobinisées et qui cessent de proliférer après 14 à 18 jours. Le même phénomène est observé chez la souris où des agrégats cellulaires commençant à synthétiser de l'hémoglobine apparaissent après 5 jours de culture pour devenir de très larges colonies hémoglobinisées contenant jusqu'à 100.000 cellules après 8 à 14 jours d'incubation. Ces colonies, évidemment différentes des CFU-E, furent baptisées BPU-E. Les études d'Iscove et al. (100) ont montré que les éléments cellulaires souches à l'origine de ces colonies requièrent la présence d'un facteur mitogénique différent de l'Ep, le BPA dont l'effet stimulant a été discuté plus haut. Par ailleurs, des investigations ultérieures utilisant les techniques de suicide à la 3H-TDR et de vitesse de sédimentation laissent supposer que la BEU-E est une cellule souche immature, à potentialités de prolifération élevées.

Compte tenu des réserves formulées à propos de la cellule hématopoiétique unique et ancestrale, il paraît logique de considérer que les événements conduisant la cellule engagée dans la lignée érythroïde à devenir un érythroblaste mûr se déroulent en deux étapes :

- une phase initiale où la BFU-E prolifère sous

l'influence du facteur mitogénique BPA et synthétise des

33.

récepteurs spécifiques qui la rendent progressivement sensible à l'Ep,

- une étape ultérieure où la BFU-E cesse de proliférer sous l'influence du BPA pour devenir une CPU-E, exprimant un maximum de récepteurs à l'Ep, indispensables à cette dernière pour induire la synthèse d'hémoglobine.

Cette manière de voir est schématisée à la fig. 2.

PIG. 2

MODELE DE LA REGULATION DE L'ERYTHROPOIESE EN DEUX ETAPES

O

; récepteur au BPA

A ; récepteur à l'Ep

Ce schéma un peu simpliste nécessite cependant, à la lueur d'expériences ultérieures (60), l'addition de subtiles nuances : en conditions optimales de culture, BPU-E et CPU-E s'associent en un continuum. A chaque moment, après 2 jours d'incubation chez la souris et 7 jours d'incubation chez l'homme, des cellules souches érythroïdes arrivent à maturation tandis que d'autres la commencent. Immédiatement après l'apparition des

CPU-E, de petits amas de cellules légèrement hémoglobinisées apparaissent et représentent les BPU-E matures. Ensuite, au cours des derniers jours d'incubation, de très larges BPU-E sont observées et représentent des BPU-E primitives.

Le concept de la régulation de 1'érythropoièse en deux étapes, tel qu'il découle des expériences princeps d'Iscove (101), souligne l'intrication étroite des deux modules de colonies : les BPU-E et les CPU-E, et implique, au point de vue expérimental, la détermination conjointe de leurs variations. Les CPU-E, éléments phylogénétiquement les plus récents, seraient surtout sous la dépendance de l'Ep. Les BPU-E, reflet du développement ancestral, seraient avant tout sous l'influence du BPA, l’Ep, à leur niveau, ne jouant que le rôle révélateur de

colonies par induction de la synthèse d'hémoglobine.

Ce sont ces procédés de culture clonogénique qui,

dans le courant des années - 70, ont également permis de révéler

l'intervention de phénomènes de modulation

de

35.

1'érythropoièse, indépendants des processus prééminents de

" stimulation C'est à Adamson et à son équipe que revient le mérite d'avoir, parmi les premiers, attiré l'attention sur ces mécanismes. D'ailleurs, depuis, ces chercheurs se sont présentés comme parmi les principaux protagonistes du concept :

" stimulation-modulation

Les facteurs de " modulation " actuellement reconnus sont nombreux et disparates. Malgré les études qui leur ont été consacrées, probablement en raison d'un manque d'unicité et de systématisation des recherches, leur classification reste encore aujourd'hui difficile, surtout sur une base d'impact physiologique.

Certains de ces principes semblent intervenir, entre autres, par analogie, avec d'autres régulations, directement au niveau de la dynamique des organites cellulaires :

- les premières observations, dans ce domaine, furent faites par Brown et Adamson : des substances stimulant le système adénylate cyclase, telles que les nucléotides cycliques

(25) et les agents bêta-adrénergiques (26) modulent positivement l'action de l'Ep sur la cellule cible; cette action se déroule au niveau d'un progéniteur plus immature que la CFU-E, fort probablement la BPU-E mature;

- le lithium favorise l'effet de l'Ep sur les

progéniteurs érythroîdes (38);

- l'ion calcium, en concentrations intra- et extra-cellulaires adéquates, s'avère nécessaire à l'action physiologique de l'Ep sur la cellule cible (147).

L'influence de diverses hormones, en tant que facteurs de " modulation ", a été établie; pour certaines d'entre elles, le mode d'action a été approché; pour d'autres, il reste indéterminé.

Ici, aussi, les premières observations émanent d'Adamson et de ses collaborateurs (171) : les hormones thyroïdiennes stimulent la formation des colonies érythroïdes via les récepteurs bêta-adrénergiques; cet effet s'exerce sur un progéniteur plus ancestral que la CFU-E. Divers stéroïdes, notamment certains androgènes (196), l'hormone de croissance (85), ainsi que l'insuline (II4) sont doués d'un effet modulateur positif. Le rôle de la parathormone, par ailleurs controversé, d'autre part objet de certaines de nos études, sera discuté ultérieurement (165). Le glucagon, en concentrations élevées, inhibe 1'érythropoièse in vivo (155)-

Mais d'autres interférences, plus complexes

modulent 1'érythropoièse : " l'îlot érythroblastique " (18) est

implanté dans un microenvironnement médullaire, en contact

topographique intime avec d'autres éléments cellulaires. Des

interactions directes ou médiées, entre ces structures, ont été

démontrées.

37.

Divers médiateurs ont été reconnus :

- un facteur mitogénique d'origine plaquettaire, le " Platelet Derived Growth Factor " (PDGP), exerce une action stimulante sur la prolifération des précurseurs érythroïdes (45)»

Cette action, également l'un des sujets de nos études, sera détaillée plus loin;

- les monocytes-macrophages participent également à cette interaction. D'une part, ils sont doués d'un effet stimulant sur la croissance des colonies érythroïdes (87),

d'autre part, après déplétion du milieu en ces cellules, certains modulateurs perdent leur influence sur les éléments souches érythroïdes ; les prostaglandines, qui augmentent l'action de l'Ep sur les progéniteurs érythroïdes (58), cessent de stimuler la prolifération des BPU-E, en l'absence de monocytes- macrophages (184); l'inhibition de 1'érythropoièse humaine normale par les interférons (27) est atténuée par la déplétion des monocytes (127);

- les lymphocytes jouent également un rôle. En

1978, Nathan (156) démontre que les lymphocytes T sont requis

pour une prolifération optimale des BFU-E; malgré de nombreuses

confirmations ultérieures, Zuckermann, en 1981 (228), conclut au

rôle prépondérant des monocytes : l'action lymphocytaire sur la

croissance des BFU-E résulterait d'une stimulation des monocytes,

produisant secondairement un facteur activant la prolifération de

la cellule souche érythroîde; mais les travaux tout récents de Wisniewski (223) établissent que, indépendamment de toute interaction monocytaire, les lymphocytes T représentent la majeure partie des cellules produisant le BPA ; les sous- populations, " helper/inducer ” reconnues par l'anticorps monoclonal 0KT4 et " suppressor/cytotoxic " reconnues par l'anticorps monoclonal 0KT8, participent d'une manière identique à la production de ce facteur.

Enfin, des éléments cellulaires mésenchymateux, constituant la trame de soutien du tissu médullaire (stroma), paraissent incriminés dans la prolifération et surtout dans la maintenance des cellules souches érythroîdes :

4

- les expériences de Ghio (84) montrent que les fibroblastes embryonnaires de souris augmentent la quantité des CPU-E;

- les techniques de culture à long terme développées par Dexter (56) confirment ce rôle de maintenance du stroma médullaire sur la prolifération des cellules souches érythroîdes.

*

* *

Au terme de cette revue d'ensemble, relative à nos

connaissances en matière d'érythropoièse, on peut dire, mais non

39.

affirmer, que l'homéostasie érythroïde se déroule au départ d'une cellule souche, par un enchaînement séquentiel de phénomènes, d'abord de " stimulation ", puis de " modulation ", conduisant in fine à l'érythrocyte mûr. Malgré la masse des travaux, de nombreuses indéterminations persistent et des thèses conflictuelles, voire même contradictoires, continuent à s'affronter.

PKoc.e,au6 de. n-igulatlon paK la comblnalion -i iquentle.lle. de. micanlirmi de " étlmulatlon " et de

" modulation " ? Il 6'agit d'un concept p^eique unanimement adml6, mal-i tou^i lei cke'LcheuM ne partagent pai cette opinion.

" Stimulation " ?, mali quel-6 lacteu>i6 de

" stimulation " ? L'éfiythKopolétlne sû'Lement, mais ho^imone au sujet de laquelle persistent encore pas mal de méconnaissances.

La " Burst Promotlng kctlvltg ", la EPA, dont le rôle In vitro est certain, mais dont l'action physiologique n'est pas évidente.

Par ailleurs, n'existe-t-il pas d'autres principes prééminents de

" stimulation ", non encore révélés ?

" Modulation ", mais comment Interpréter l'Impact des divers facteurs, humoraux et cellulaires, actuellement

ldentl{,lés ? Quels sont leurs déterminismes physiologiques et pathologiques ?

Voilà autant de questions en suspens, auxquelles

les études ultérieures devraient tenter d'apporter des réponses.

CHAPITRE III

OBJECTIFS DU TRAVAIL

1 . Introduction.

Dans ce travail, nous avons rassemblé un ensemble de faits expérimentaux, relatifs à des situations pathologiques de dysérythropoièse. Ces situations reconnaissent toutes des déterminismes multiples et différents, mais elles ont, entre autres, comme trait commun, des anomalies du processus de

" modulation " de 1'érythropoièse.

Nos observations ne concernent qu'un nombre limité de dysérythropoièses; en effet, cette expression définit l'ensemble des états pathologiques de l'érythron : une production diminuée ou excessive d'érythrocytes, la formation d'éléments anormalement constitués , ou une prolifération anarchique de ceux-ci.

Les matériaux nécessaires à la maturation des précurseurs érythroïdes (Per, Eclates, Vit. B2, Vit. B6, Vit.

B12, Vit. C, Vit. E, protéines ...) étant présents, en

concentrations adéquates, et par ailleurs aucune circonstance

n'induisant la perte ou la destruction des érythrocytes, les

phénomènes impliqués dans les dysérythropoièses peuvent être

41.

scindés en diverses catégories :

- des anomalies de la cellule souche elle-même;

- des perturbations au sein de l'environnement médullaire ;

- des dérèglements dans la synthèse, la sécrétion ou l'interaction de l'érythropoiétine (Ep) avec sa cellule cible;

- des mécanismes de modulation inappropriés.

En raison de l'intrication des phénomènes, tout porte à croire que deux, voire même plusieurs perturbations, s'associent dans la genèse du trouble final caractéristique de chaque dysérythropoièse.

La méthode expérimentale, base de nos travaux, est la technique de culture clonogénique érythroîde. Le substrat cellulaire fut principalement isolé au départ de moelles, soit de souris, soit de sujets humains. Ayant débuté nos travaux dans le laboratoire de J.P. NAETS (Bruxelles), les ayant poursuivis ultérieurement sous la direction de J.W. ADAMSON (Seattle), notre technique a subi diverses adaptations. Celles-ci n'ont eu aucun retentissement quant à l'interprétation de nos résultats.

Par contre, aux diverses étapes de nos

études, ayant disposé de principes actifs à des stades différents de purification, nous avons enregistré, comme d’autres chercheurs, des observations discordantes, génératrices de perplexités. Mais, grâce aux possibilités du laboratoire de J.V.

ADAMSON, ayant eu aussi le privilège de pouvoir bénéficier de principes actuellement considérés comme les mieux purifiés, nous avons pu apporter, du moins dans certaines dysérythropoièses, une solution à des problèmes jusqu'ici controversés.

Nos intentions initiales de recherches étalent bien orientées. Mais, à mesure de 1'urs déroulements, il est apparu que nous accumulions, dans des circonstances pathologiques différentes, des arguments en faveur du rôle des facteurs de

" modulation ", comme déterminants, soit prééminents, soit accessoires, dans la genèse de certaines dysérythropoièses. Cette évolution dans nos programmes d'études explique le recours à des modules expérimentaux distincts, comme à l'approche de situations pathologiques différentes.

2. Les problèmes explorés.

a.- L'anémie de l'insuffisance rénale chronique (IRC) a d'abord attiré notre attention ; elle est bien documentée, mais ses déterminismes restent controversés.

L'hyperparathyroïdie secondaire, complication presque obligée de

43.

cette condition pathologique, portait à penser que la parathormone (PTH), malgré des arguments divergents, pouvait être douée d'un effet inhibiteur de 1'érythropoièse. Travaillant en culture clonogénique, utilisant des préparations différentes de PTH, avec des résultats contradictoires, il semblerait que cette hormone n'intervienne pas dans l'homéostasie érythroïde, du moins d'une façon directe.

b. - Poursuivant dans la voie de l'IRC, chez l'homme, et dans 1'optique d'une compréhension de l'anémie de ces

patients, des sujets néphriques et anéphriques, dialysés ou non, ont été étudiés : nous nous sommes posés la question de savoir si le défaut de prolifération des progéniteurs érythroïdes, observé, in vitro, en présence de sérums urémiques, résulte de l'effet de facteurs humoraux inhibiteurs ou d'une carence en principes stimulateurs; nous avons aussi investigué les répercussions de 1'hémodialyse sur ces paramètres et tenté de préjuger de la spécificité des facteurs mis en évidence.

c. - Dans un second groupe d'expériences, nous nous sommes intéressés au rôle d'éléments cellulaires sur le

développement de l'érythron, éléments cellulaires, autres que

ceux issus de la lignée rouge. Dans son microenvironnement

médullaire, l'îlot érythroblastique est en intime association

topographique, avec d'autres structures cellulaires, et paraît sous l'influence, directe ou médiée, de celles-ci. L'action stimulante du " Platelet Derived Growth Pactor " (P.D.G.P.), sur l'érythron, ayant été établie par d'autres (45)» la question se posait de savoir si ce principe plaquettaire interférait directement ou par l'entremise de populations cellulaires accessoires, notamment mésenchymateuses. Les effets du PDGF ont été explorés en induisant des modifications des associations cellulaires et en utilisant des inhibiteurs de la synthèse des prostaglandines.

d. - Dans la même optique, nos études ultérieures confirment l'action favorable des lymphocytes T et des monocytes

sur l'expansion de la masse érythroïde, action jusqu'ici considérée comme directe ou médiée. Dans le but de mieux préciser, les mécanismes sous-jacents au rôle des populations incriminées, les effets, in vitro et in vivo, de la cyclosporine A (CyA) - agent réputé pour son inhibition élective de la population lymphocytaire T4 - ont été testés, chez des sujets atteints d'aplasie pure acquise de la lignée rouge ou " Pure Red Cell Aplasia " (PRCA).

5. Ordonnance du travail.

Chacun de ces quatre sujets sera développé, d'une

45.

manière exhaustive, dans les résultats expérimentaux décrits au chapitre V :

I. - MODULATION HUMORALE DE L'ERYTHROPOIESE

I. Le rôle de la PTH;

II. Les effets inhibiteurs du sérum urémique.

II. - MODULATION CELLULAIRE DE L’ERYTHROPOIESE

I. Les mécanismes d'action du P.D.G.P.;

II. Les interférences entre lymphocytes T

et CyA.

CHAPITRE IV

MET HO DOLOGIE GENERALE

Dans ce chapitre, les conditions méthodologiques générales, communes à la plupart de nos études, seront exposées et leurs validités discutées. D'autre part, en raison des orientations différentes de nos recherches, la technologie propre à chacune d'entre elles, sera détaillée dans les chapitres concernés.

La méthode principale, base de nos investigations dans les différents laboratoires, est le procédé de culture clonogénique en milieu semi-solide. En fonction de nos intentions expérimentales, cette technique a subi diverses adaptations : utilisation d'éléments cellulaires différents isolés à partir d'échantillons humains ou murins, adjonction de principes humoraux de pureté et de spécificité variables, et enfin modifications de l'environnement cellulaire.

Toutes les investigations se sont déroulées dans un contexte d'érythropoièse normale ou franchement pathologique.

*

* *

A7.

I. - ETUDES DE L'ERYTHROPOIESE

1. Les milieux de culture.

Les expériences consacrées à l'étude des modulations cellulaires et humorales de 1'érythropoièse furent réalisées à l'aide de cultures en substrat semi-solide. Dans ces conditions, la viscosité du milieu final d'incubation permet aux cellules, issues par mitoses successives de l'unité souche indifférenciée implantée au début de l'expérience, de rester confinées en agrégats ou colonies individualisées.

Trois méthodes permettent d'obtenir la viscosité optimale à l'individualisation des colonies :

a. - la méthode du caillot plasmatique

b. - la méthode utilisant la méthylcellulose c. - la méthode utilisant l'agar

Toute autre condition expérimentale étant égale par ailleurs, les trois procédés donnent des résultats similaires et nous avons marqué notre préférence pour la méthylcellulose étant donné les avantages suivants :

- la méthylcellulose est une poudre inerte sur le plan

biochimique ;

- avec cette substance,la viscosité optimale reste constante en dépit des variations de température inhérentes aux conditions d'expérience (20"C-37“C).

Les inconvénients de son emploi résident dans les faits que les colonies doivent être comptées immédiatement après la manipulation, que le caractère érythroïde ne peut être apprécié que par la perception parfois malaisée de la couleur rouge de l'hémoglobine et que les cultures ne peuvent être fixées pour conserver un document.

La méthode du caillot plasmatique permet une identification aisée des colonies érythroïdes après coloration spécifique à la benzidine et les colonies peuvent être fixées pour conserver un document. Mais, les artifices utilisés pour obtenir le caillot plasmatique induisent des réactions biochimiques pouvant interférer avec les expériences et les colonies érythroïdes immatures (BPU-E) ont tendance à se superposer, rendant le comptage final délicat.

Le gel d'agar est difficile à manipuler en raison

de sa solidification rapide à la température ambiante du

laboratoire et de sa viscosité plus élevée à la température de

l'incubateur. Cette méthode ne fut utilisée que pour des

expériences en cocultures, nécessitant deux couches cellulaires

qui ne peuvent entrer en contact l'une avec l'autre.