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Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository
Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:
Demonte, J.-P. (1984). Diversité conformationnelle de l'enképhaline en solution aqueuse. Approche théorique (Unpublished doctoral dissertation).
Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.
Disponible à / Available at permalink : https://dipot.ulb.ac.be/dspace/bitstream/2013/213733/1/c2a1c329-b5d4-4fef-864b-ff12506c3812.txt
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Laboratoire de Chimie Générale I
DIVERSITE CONFORMATIONNELLE DE L ’ ENKEPHALINE
EN SOLUTION AQUEUSE Approche théorique
Thèse présentée pour l’obtention du grade de Docteur en Sciences
DEMONTE Jean-Paul
Année Académique 1983-1984
DIVERSITE CONFORMATIONNELLE DE L ’ ENKEPHALINE
EN SOLUTION AQUEUSE Approche théorique
These présentée pour l’obtention du grade de Docteur en Sciences
DEMONTE Jean-Paul
Année Académique 1983-1984
FACULTE DES SCIENCES
L'épreuve publique pour l’obtention du grade légal de Docteur en Sciences de Monsieur DEMDNTE, Jean-Paul, Licencié en Sciences, pour le groupe des sciences chimiques, aura lieu le :
MERCREDI 30 MAI 1964 A 15,30 HEURES dans le Local 203, Bâtiment -Préfabriqué III, 2e étage, 50, avenue Roosevelt à 1050 - Bruxelles.
Monsieur DEMONTE présentera et défendra publiquement une dissertation originale intitulée ;
"Diversité conformationnelle de 1'enKéphaline en solution aqueuse.
Approche théorique”;
et une thèse annexe intitulée :
"L'introduction de nouveaux paramètres physico-chimiques pour établir
les relations quantitatives structure-activité (QSAR) permettrait
d'améliorer la prédiction de l’activité biologique des peptides".
L’introduction de nouveaux paramètres physico-chimiques pour établir les relations quantitatives structure - activité (QSAR) permettrait d'améliorer la prédiction de l'activité biologique des peptides.
e
TABLE DES MATIERES
Résumé
I Introduction II But du travail
III Application du calcul conformationnel à l'étude des enképhalines en solution aqueuse
IIIA Méthodes
#1 Géométrie et potentiel
#2 Méthode statistique
#3 Calcul des propriétés liées au transfert d'énergie non radiatif
#4 Calcul des constantes de couplage IIIB Analogues de l'enképhaline étudiés
IIIC Résultats
#1 Influence de la séquence
#2 Fiabilité et limites de la méthode
#3 Modèles représentant un "tournant flexible"
#4 Enképhalines Noi-méthylées
#5 Evolution des propriétés moyennes en fonction de la longueur du peptide
#6 Modèle non perturbé
#7 Enképhalines dansylées IIID Discussion
IV Etude de l'hydratation du tétrapeptide TYR-GLY-6LY—PHE IVA Méthodes
#1 Méthode de Monte Carlo et grandeurs calculées
#2 L'eau> géométrie et potentiel IVB Choix des conformations
IVC Résultats
#1 Eau pure
#la Propriétés thermodynamiques
#lb Propriétés structurales
#2 Hydratation du tétrapeptide
#2a Propriétés thermodynamiques
#2b Propriétés structurales
#2c Première couche d'hydratation
#2d Structure du solvant IVD Discussion
#1 Reproductibilité des résultats
#2 Influence des conditions opératoires
#3 Pour conclure V Conclusions générales Bibliographie
Annexes
3 5 9 12
13
20 24
40 45 46 54
64
89
97
111
Je tiens à exprimer tous mes remerciements le Professeur J. Léonis pour son accueil et son des demandes de mandat qui ont permis de mener à thèse de doctorat.
à Monsieur soutien lors bien cette
Qu'il me soit permis d'exprimer ma reconnaissance au Professeur A. Englert qui a proposé et dirigé ce travail avec compétence et gentillesse^ tout en laissant une grande liberté d'action dans son organisation et en encourageant des collabo
rations fructueuses avec divers groupes étrangers» en particu
lier ceux des professeurs B. P. Roques» Université René Descartes» Paris» M. C. Fournie - Zaluski» Université Marie Curie» Paris» et ceux des docteurs A. T. Hagler» The Agouron Institute» La Jolla» USA» S. Premilat» Université de Nancy I»
et J. M. Garcia Anton» Instituto de Tecnologia Quimica»
Barcelone. Qu'ils en soient eux et leurs collaborateurs remerciés.
Je tiens particulièrement à exprimer ma reconnaissance au professeur Roques pour avoir mis à notre disposition les résultats expérimentaux obtenus dans son équipe» pour les discussions enrichissantes que j'ai pu avoir avec lui et avec M. C. Fournie - Zaluski» et pour 1'intérêt qu'il a témoigné à
l'élaboration des modèles des enképhalines.
Que les deux autres mousquetaires “théoriciens”» Claire Debever et Roger Guillard qui m'ont épaulé au cours de ce travail sachent que leur aide» leurs conseils et leur bonne humeur ont toujours été appréciés. Que ceci soit le témoignage (tardif) de l'existence passée d'une équipe aujourd'hui dissé
minée au gré de vents.
Je remercie particulièrement G. Destrée pour son intérêt» ses conseils et ses “coups de pouce”. Que les
“théoriciens” de l'équipe de J. L. De Coen et S. Wodak» les membres du service de Chimie Générale I et plus particu
lièrement C.
remerciements suscités.
Enfin»
technique à la Cette 1 'IRSIA.
Renneboog trouvent ici l'expression de mes pour la sympathie et les échanges qu'ils ont
je remercie J. Vanophalvens pour son apport réalisation de ce travail.
thèse n'aurait jamais vu le jour sans l'appui de
H amie t a.i
Résumé
Notre travail est consacré à l'étude théorique de la conformation des enképhalines> pentapeptides opioïdes endogè
nes# en solution aqueuse. Dans la première partie# nous avons calculé les propriétés moyennes de plusieurs analogues des enképhalines en partant de l'hypothèse que ces molécules sont flexibles et# par conséquent# existent en solution sous forme d'un ensemble de conformères. Cette hypothèse# basée sur un certain nombre d'observations rapportées dans la littérature#
privilégie le mode d'interaction avec le récepteur décrit par une succession d'étapes et appelé mécanisme "zipper".
Le calcul est basé sur une approche statistique# la méthode de Monte Carlo - Métropolis qui permet de construire#
sans sélection préalable# un échantillon représentatif des conformations par évaluation de l'énergie conformationnelle exprimée grâce aux fonctions potentielles semi-empiriques.
Les propriétés calculées# à savoir l'efficience du transfert non radiatif d'énergie d'excitation électronique entre deux luminophores et les constantes de couplage ">J/^
hch,
c>
sont comparées aux propriétés mesurées par fluorescence et par résonance magnétique nucléaire par les groupes du Dr. P.W.
Schiller <Montréal) et du professeur B. P. Roques (Paris) principalement.
L'accord entre les résultats expérimentaux et nos résultats théoriques est en faveur de l'hypothèse selon la
quelle la conformation des enképhalines et de leurs analogues étudiés# comprenant notamment des composés ou la glycine—2 est remplacée par une alanine D ou L et des composés N-méthylés en position 4 et 5# est# en solution aqueuse# caractérisée par un équilibre dynamique entre de nombreux conformères ayant des structures spatiales très variées. Celles-ci s'étendent des conformations reployées aux conformations étendues# les pre
mières représentant une fraction plus importante de l'ensemble que les secondes. Nous avons aussi montré que les tournants p qui sont souvent cités dans la littérature en tant que conformations représentatives des enképhalines# ne forment pas un ensemble prépondérant de cette population.
M?me si le solvant influence manifestement la conforma
tion des hormones peptidiques comme les enképhalines# sa
présence n'est prise en compte dans les calculs mentionnés
ci-dessus que d'une manière très globale par l'intermédiaire
des fonctions potentielles représentant l'énergie intramolécu-
laire du peptide. C'est pourquoi» dans la seconde partie du travail» nous avons introduit explicitement les molécules du solvant» en comparant les énergies d'hydratation relatives et l'hydratation» au niveau microscopique» des trois conformères du tétrapeptide N—terminal des enképhalines TYR—GLY-GLY-PHE.
Pour ces trois modèles» chacun des conformères du soluté» pris sous forme zuiittérionique» est entouré de plus de trois cents molécules d'eau» ce qui correspond à une double couche de molécules du solvant autour d'une molécule du soluté.
La simulation de l'ensemble solvant-soluté est réalisée par une méthode de Monte Carlo - Métropolis qui permet de calculer les caractéristiques de la structure du solvant autour du soluté.
On obtient ainsi une représentation du solvant au voisinage du soluté au niveau microscopique» représentation qui n'est acces
sible expérimentalement que pour des cristaux hydratés.
La conformation la plus étendue du tétrapeptide <Et) qui a ainsi été étudiée a une énergie d'hydratation plus favorable que celle des deux autres conformations envisagées»
celle stabilisée par un lien H intramoléculaire déterminée par rayons-X dans le cristal <Rx) et celle reproduisant le mieux les caractéristiques géométriques des opiacés rigides proposée dans la littérature comme étant la conformation active sur le récepteur morphinique y <Mu).
Nous avons aussi examiné l'organisation des molécules du solvant dans la première couche de solvatation des trois conformations du peptide par l'intermédiaire des fonctions de distribution radiale des atomes du solvant et des atomes du soluté. Ces fonctions permettent de calculer» par intégration»
le nombre moyen de molécules d'eau dans la première couche d'hydratation des atomes do peptide et le nombre moyen de molécules d'eau liées par un lien H aux atomes polaires du peptide. A partir d'un critère de distance entre le groupe donneur du proton et le groupe accepteur de celui-ci» on obtient qu'en moyenne 15.7 <Et)» 14.2 (Mu) et 13. 1 <Rx) liens H sont formés entre les molécules d'eau et les atomes du soluté.
Parmi ces liens H» les plus nombreux sont ceux formés avec les groupes chargés terminaux du peptide et l'hydroxyle de la tyrosine. La structure du solvant ainsi obtenue est visualisée par 1 'intermédiaire d'une configuration instantanée du solvant autour de chacun des conformères étudiés.
Pour les deux méthodes utilisées pour simuler le comportement des enképhalines et du tétrapeptide TYR-GLY-GLY—
PHE en solution aqueuse» l'influence des divers paramètres intervenant dans les calculs et la reproductibilité des résul
tats obtenus sont examinés. Finalement» les résultats de cette étude suggérant la présence de conformations multiples des enképhalines en solution aqueuse» sont examinés du point de vue biologique» en relation avec l'existence de différents récep
teurs des peptides opioïdes.
Than are dreamt of in your philosophy.
Uamlet 1.5
I INTRODUCTION
s 1 ' un L'opium et douleur et produire n'est que depuis entrevoir le mécanisme quand< indépendamment couverte dans les tiss de sites stéréospéci ans plus tardj quand 1 confirmée <4-6). C' identifièrent ce ligan peptides»
es dérivés s euphorie depu e dizaine d de leur a
> trois lab us du cerveau fiques morph 'existence d' est Hugues e d comme étant
ont utilisés po is la Grèce ant 'années que 1' ction. D'abor oratoires annon de mammifères inophiles (1—3) un ligand end t coll. (7) qui
un mélange de
ur apaiser la ique mais ce on commence à d» en 1973, cèrent la dé—
(porc, rat. . . ) Puis, deux ogène a été les premiers deux penta—
Tyr - Gly — Gly — Phe - Met et Tyr - Gly - Gly — Phe — Leu
qu'ils nommèrent Met-enképhaline et Leu-enképhaline. Depuis, cette découverte suscite annuellement des centaines de travaux recencés régulièrement (8,9), qui touchent à de nombreux domaines, chimie des peptides, biochimie, neurobiologie...
Cette découverte a également entraTné celle de l'existence dans de nombreux tissus d'un réseau de peptides contenant la séquence des enképhalines, peptides qui résultent de la convei—
sion d'au moins trois protéines précurseurs génétiquement distinctes (10 et références citées). Nous nous limiterons ici à indiquer les grands axes qui permettront de situer notre travail.
L'activité analgésique des peptides morphinomimétiques se manifeste, in vitro, dans des bioétalonnages classiques (inhibition de la libération de neurotransmetteur par le vas deferent de souris ou le muscle longitudinal de l'iléon de cobaye stimulé électriquement) aussi bien que par leur affinité spécifique pour les récepteurs des opiacés situés dans les membranes du cerveau. Elle se manifeste, in vivo, par l'inhi
bition des réactions à la douleur (pincement de la queue chez le rat ou la souris, test de la plaque chauffante). Cependant, l'activité analgésique des enképhalines administrées par voie intraveineuse est faible et de courte durée à cause de la dégradation enzymatique.
Le caractère analgésique endogène des enképhalines a
ouvert une nouvelle voie pour la recherche de l'analgésique idéal qui ne provoquerait ni la tolérance ni la dépendance qu'entraînent opiacés et enképhalines. Aussif des centaines d'analogues ont-ils été synthétisés» puis testés» en modifiant systématiquement et empiriquement les pentapeptides naturels pour en optimiser les propriétés (11). Cette méthode permit de découvrir que le remplacement de la Gly-2 par une D-Alanine augmente la résistance contre la dégradation enzymatique (12»
13) et élève l'activité morphinomimétique par incorporation d'autres éléments structuraux (14-16). Malheureusement» le problème de la morphinomanie n'a pas encore été éliminé.
L'approche empirique de la conception de nouveaux analogues a pu être améliorée par l'étude des relations structure—activité (11»17) et par une meilleure connaissance du comportement des enképhalines et de leur récepteur.
Malheureusement» la structure du récepteur reste» jus
qu'à présent» inconnue» malgré les efforts entrepris pour le solubiliser (18-22) et le purifier (23). Aussi s'est-on limité à définir la topographie du récepteur complémentairement à ses ligands rigides» la morphine et ses dérivés» en s'inspirant du vieux paradigme selon lequel un ligand s'adapte à son récepteur comme une clé à sa serrure. Les modèles du récepteur morphino—
phile ainsi obtenus (24»25) ne facilitent cependant pas l'éla
boration de nouveaux analogues car le mécanisme moléculaire de l'interaction ligand-récepteur est mal connu» et parce que les problèmes qui se posent sont nombreux.
En effet vraisemblab1ement posant ainsi à récepteur» ce qui tranSConformation
le ligand endogène» un flexible» doit d'abord être des altérations. Ensuite» i peut nécessiter un ou des
du ligand ou encore une dynamique du ligand et du récepteur» avan biologique ne soit induite. Les enképhalin sujettes à l'action d'enzymes spécifiques qu (aminopeptidases» carboxypeptidases et autre réf : 12»26-36 ). Enfin» le récepteur des en pas unique mais multiple l'existence de différents a en effet été déduite de nombre (37-41) et par l'activité spécifique de certai un site particulier. Ces récepteurs sont dis trois lettres ja > h et \C.
peptide linéaire transporté» s'ex- 1 doit se lier au cofacteurs» une transeonformation t qu'une action es sont également i les dégradent s enképhalinases»
képhalines n'est trois récepteurs uses expériences ns analogues pour tingués par les
La modélisation d'un récepteur» complémentairement à son ligand implique la connaissance de la structure du ligand.
Les molécules peuvent Ftre observées par l'intermédiaire de la cristallographie aux rayons-X» mais si la molécule possède une certaine flexibilité» les conformations ainsi observées (42»43) peuvent ©tre très différentes de celle existant sur le récep
teur. Donc» on doit recourir à une combinaison de techniques
spectroscopiques et théoriques et à la comparaison avec d'
autres molécules actives ou inactives» pour déterminer les
caractéristiques conformationnelles du ligand impliquées dans
le processus de reconnaissance du récepteur.
La comparaison de la structure des opiacés et des enképhalines permit rapidement de déterminer les éléments structuraux nécessaires (mais non suffisants.' ) pour conférer aux enképhalines leurs propriétés analgésiques la tyrosine N-terminale et plus particulièrement ses groupes amine et phénol que 1 ■'on retrouve dans la plupart des opiacés est indispensable à l'activité (44»45) (voir schéma ci-dessous).
C'est pourquoi la tentation est grande d'attribuer à la tyrosine la conformation qui reproduit le mieux celle de la tyramine de la morphine» alors que cette conformation possède une énergie défavorable (46). En l'absence de similitude structurelle évidente entre le ligand endogène et les opiacés»
les méthodes spectroscopiques et théoriques ont été utilisées pour déterminer la conformation des enképhalines et de ses divers analogues» afin de préciser les caractéristiques struc
turelles générales de ces peptides» étant donné que l'étude du processus de reconnaissance hormone (neurotransmetteur) récep
teur ainsi que les relations entre la structure et 1'activité nécessite une connaissance préliminaire de la conformation des molécules peptidiques impliquées.
Met
Morphine Enképhalines
Différentes conformations ont été suggérées à la suite de l'analyse conformationnelle expérimentale en solution» mais les résultats obtenus dépendent appréciab1ement de la méthode utilisée et du solvant considéré. Dans le diméthylsulfoxyde (DMSO)» un tournant pi sur les résidus Gly-3 et Phe-4 a été mis en évidence par des mesures de résonance magnétique nucléaire du proton (47» 48) et du C (49) et par des mesures de dichroïsme circulaire (50). Cette conformation doit sa stabi
lité à la présence d'un lien hydrogène et d'une interaction
favorable entre les groupes chargés terminaux. Deux types de
conformations ont été mis en évidence à l'état cristallini en fonction du solvant utilisé lors de la cristallisation. Dans un cas> on observe un tournant impliquant les deux glycines (42) ce qui confère au peptide une similitude conformationnelle avec la morphine (44). tandis que dans l'autre (43) deux molécules forment un feuillet plissé, la t§te de l'une intera
gissant avec la queue de l'autre, et ne forment que des liens H intermoléculaires.
Les méthodes théoriques basées sur l'évaluation de l'énergie conformationnelle au départ de fonctions potentielles semi-empiriques arrivèrent également à des conclusions diver
gentes : soit qu'une conformation ( tournant jBII' 5-2) est prépondérante (51). soit qu'il existe un équilibre entre conformations reployées et étendues (52). Finalement. en solution aqueuse. la flexibilité des enképhalines fut mise en évidence par des mesures de dichroïsme circulaire (53). de résonance magnétique nucléaire (54-56) et par spectroscopie Raman (57).
Ces résultats apparemment contradictoires soulignent l'importance de la détermination de nombreux paramètres struc
turaux. le besoin de combiner un ensemble de techniques et la nécessité de comparer les résultats obtenus pour un ensemble d'analogues, actifs et inactifs, pour arriver à une représenta
tion de la réalité dans toute sa complexité. Il faut insister sur le fait qu'une méthode expérimentale, quelle qu'elle soit, ne peut fournir des informations sur la conformation du peptide que pour autant que la conformation soit définie à l'échelle de temps propre à la méthode. Un peptide flexible pourrait fournir des paramètres spectroscopiques qui ne reflètent aucune des conformations présentes mais simplement une moyenne pondé
rée des populations présentes. Il est indéniable, qu'une étude exhaustive d'analogues contraints (58) et d'analogues cycliques actifs (59—61). voire d'analogues spécifiques à un récepteur (60—63) permettrait de mieux cerner la conformation active des enképhalines sur un récepteur particulier ainsi que de. in fine. sélectionner parmi les modèles obtenus ceux qui tolèrent l'ensemble des contraintes et des paramètres définis.
L'importance de la connaissance du comportement et de la conformation des enképhalines. et plus généralement de toute molécule ayant un rôle biologique, vient d'Çtre montrée et les problèmes que ces études rencontrent ont été soulignés.
C'est à étendre et améliorer cette connaissance que. bien
modestement, ce travail veut contribuer.
II BUT DU TRAVAIL
vouloir préci- analogues en l'analyse conforma- performances des Nous nous sommes volontairement limité à
ser le comportement des enképhalines et de leurs solution aqueuse par l'intermédiaire de
tionnelle théorique rendue possible par les
ordinateurs actuels. Ce solvant a été privilégié car aucune méthode expérimentale ne peut fournir des indications suffisan
tes sur le type de conformations et le comportement qu'adopte une molécule peptidique en solution dans l'eau et parce qu'il existe dans la littérature un grand nombre de données expéri
mentales concernant ce solvant. D'autre part, l'eau est aussi le constituant principal des systèmes biologiques, et la solution aqueuse est probablement le solvant le plus proche de l'environnement du peptide avant qu'il ne se lie à son récepteur. Enfin, malgré sa complexité et ses propriétés physiques inhabituelles, l'eau est le solvant le plus étudié et par conséquent le mieux connu.
Dans la première partie de ce travail, nous nous sommes proposé de développer un modèle théorique destiné à Ftre confronté avec l'ensemble des propriétés expérimentales mesu
rées en solution aqueuse, celles mesurées par le transfert d'énergie d'excitation électronique (P.W. Schiller et collabo
rateurs, 64-68) et par la résonance magnétique nucléaire.
Nous avons admis comme hypothèse de départ que les enképhalines se présentent sous forme d'un ensemble de confor—
mères. Les propriétés de cette population ont été calculées par l'intermédiaire d'une méthode de Monte Carlo, ce qui nous a permis, contrairement à la plupart des travaux antérieurs, de tenir compte de tous les états conformationnels des résidus isolés de poids statistique supérieur à 0.0001. Dans les calculs, les interactions entre tous les atomes ont été prises en considération. La comparaison des propriétés expérimentales et calculées permet de juger de la validité du modèle théorique de départ.
La capacité de calcul d'envisager les propriétés d d'une molécule de la taille de solvant. C'est pourquoi dans le solvant n'est pas repré intervient par l'intermédiaire
des ordinateurs actuels ne permet
'une population de conformères
s enképhalines qu'en l'absence du
la première partie de ce travail
senté de manière explicite mais
des fonctions potentielles inte—
ratomi ques.
Dans cette première partie^ l'influence sur les pro
priétés conformationnelles de la substitution d'un acide aminé par un autre» celle de la variation du nombre total d'acides aminés et celle produite par une contrainte due à la présence d'un acide aminé Noc-méthylé ainsi que l'influence de l'intro
duction d'un groupe dansylé <qui confère aux enképhalines des propriétés intéressantes, 68-70) a pu §tre déterminée.
Il s'avère en vertu de l'étude décrite ci-dessus que la présence en solution aqueuse d'une population de conformères est en accord avec les valeurs de l'ensemble des propriétés déterminées expérimentalement. La population de conformères est composée de conformations qui vont des formes très re—
ployées jusqu'aux formes étendues.
Afin de préciser l'influence de l'hydratation sur cette population, nous avons développé dans la seconde partie de ce travail un modèle théorique dans lequel les molécules du solvant sont représentées explicitement. Nous nous sommes plus particulièrement proposé d'examiner l'effet de l'hydratation sur les formes reployées et étendues du peptide. La méthode de Monte Carlo qui permet de déterminer les positions d'équilibre moyennes des molécules d'eau autour d'un soluté sera mise à profit pour obtenir une image microscopique de l'ensemble eau-peptide.
Les performances des calculateurs accessibles imposent une limite sur la taille du système à considérer et ne permettent que le calcul de la structure de l'eau autour d'un peptide figé dans une conformation déterminée. Notre choix s'est porté sur le tétrapeptide N-terminal des enképhalines
Tyr - Sly - Gly - Phe
qui est le plus petit fragment doté d'une activité biologique, m?me si elle est très faible. Cette molécule sous forme
zwittérionique a été étudiée à l'état cristallin par rayons-x et par RMN en solution aqueuse dans les laboratoires du professeur Roques <71-73). Nous avons choisi trois conforma
tions de ce tétrapeptide : une forme reployée identique à la forme cristalline <71), une forme étendue choisie dans une population de conformères obtenue par calcul et une forme reployée proposée par B. P. Roques et ses collaborateurs comme étant la conformation active sur le récepteur morphinique
^ <168).
Dutre l'évaluation de l'énergie d'interaction entre le
peptide et l'eau, le modèle fournit une image microscopique du
solvant autour du peptide, image qui n'est pas accessible
expérimentalement. Elle peut néanmoins Ftre confrontée avec
les résultats expérimentaux ou comparée aux résultats obtenus
par cristallographie des cristaux hydratés montrant les inte—
ractions entre le peptide et les molécules d'eau.
La seconde partie du travail est un complément indis
pensable de la première» car pour les peptides l'hydratation
des groupes polaires et apolaires est un déterminant essentiel
de la conformation» et parce que la fixation d'un ligand sur
son récepteur» comme le reploiement de la protéine» est dirigé
par les forces hydrophobes.
III APPLICATION DU CALCUL CONFORMATIONNEL A L'ETUDE DES ENKEPHALINES EN SOLUTION
Les méthodes expérimentales qui permettent d'étudier la structure spatiale d'un peptide en solution fournissent tantôt une description détaillée d'éléments structuraux distincts <les valeurs des angles de torsion déterminées grâce aux constantes de couplage en résonance magnétique nucléaire par exemple)<
tantôt une description globale de la structure secondaire de la molécule sans détails essentiels (dichroïsme circulaire). Le problème de la détermination de la conformation de la molécule n'est donc pas entièrement résolu ainsi et se complique encore si les grandeurs mesurées correspondent à une moyenne sur un ensemble de conformations et non à une seule et unique conformation.
Ces difficultés engagent à s'aider de l'analyse confor
mationnelle pour obtenir une image plus exacte et mieux détaillée de<s) la conformation(s) accessib le<s) au peptide.
Le but de telles études sera soit de déterminer une conforma
tion active sur le récepteur <25*52>74-76) soit de proposer une interprétation des résultats expérimentaux (51*77—79). Dans ce dernier cas* l'analyse peut ?tre faite en faisant l'une des deux hypothèses suivantes* à savoir qu'il existe une seule conformation de basse énergie ou bien une distribution de conformations. Nous avons retenu cette dernière hypothèse et nous l'avons vérifiée en comparant les résultats obtenus à l'ensemble des résultats expérimentaux obtenus par fluorescence et RMN. Ces deux méthodes expérimentales fournissent en effet des renseignements complémentaires sur la conformation. La RMN permet de relier les constantes de couplage l'angle de torsion autour de la liaison N-Coc*^ bien que de manière non univoque. Les résultats de fluorescence complètent cette détermination en précisant la distance entre deux chaînes latérales* distance qui est elle-mâme fonction de la conforma
tion du squelette peptidique.
Hamlel t.
IIIA METHODES
Le calcul de 1 •'énergie d'un peptide dans une conforma
tion particulière nécessite la connaissance de la géométrie de la molécule et celle de l'expression de l'énergie intramolécu- laire (#1). A l'aide de ces paramètres on peuti en principe»
générer autant de conformations que l'on désire et sélectionner les conformations les plus probables. En pratique cependant»
le calcul nécessiterait plusieurs milliers d'années d' un puissant ordinateur pour explorer l'espace conformationnel accessible à un pentapeptide. Aussi est-on obligé de recourir à une stratégie <#2> pour approcher au plus près le milliard de milliards de conformations que peut théoriquement prendre le pentapeptide. Un ensemble représentatif de ces conformations peut alors servir au calcul des propriétés de la molécule dépendant de la conformation l'efficience du transfert d'énergie non radiatif (#3) et les constantes de couplage de la RMN (#4).
#1 Géométrie et potentiel
La conformation d'un peptide est obtenue à partir de la valeur précise des longueurs de liaison et des angles de valence. Ces valeurs varient quelque peu d'un composé à l'autre et oscillent légèrement autour de valeurs moyennes.
Les paramètres utilisés ici <SO) sont obtenus à partir des cristaux d'acides aminés et font maintenant l'objet d'un large consensus. Ils permettent de calculer les coordonnées carté
siennes de tous les atomes de la chaîne pour des angles de rotation donnés.
L'énergie intramoléculaire d'une conformation est scin
dée en quatres contributions : les interactions de Van der Waals» les interactions électrostatiques entre atomes non liés»
les liens hydrogène et l'énergie de torsion autour des liaisons simples» ce qui donne
E vw + E + E
LH ^ T
Cette décomposition de l'énergie intramoléculaire rend possible
la paramètrisation de l'énergie. mais elle représente une
approximation car les quatre termes dépendent dans une certaine
mesure les uns des autres. L'énergie potentielle de la molécule est représentée par un ensemble de contributions additives des paires d'atomes présentes dans la molécule. Les paramètres utilisés ici sont dérivés de l'étude des propriétés thermodynamiques de molécules modèles (80). Les fonctions potentielles obtenues selon ces principes sont qualifiées de semi-empiriques.
L'énergie de Van der Maals et du lien hydrogène sont calculées grâce à un potentiel du type Lennard — Jones:
"v V = - a. / r + b 1
/ r li
chaque atome est caractérisé par un couple de paramètres au >
bu et les paramètres a^x
jbu' sont obtenus par une combi
naison des paramètres a ' et b; > b;; (80).
n
L' énergie électrostatique coulombienne entre monopoles:
résulte de 1' interaction
= D.r,-
les charges des atomes et la constante diélectrique (3.5) sont données dans (SI). La constante diélectrique caractérise le solvant» la valeur utilisée ici représente l'environnement d'un peptide (d'une protéine) en solution aqueuse.
A la rotation autour d'une liaison simple entre deux atomes i et j est associée une fonction potentielle de torsion du type
E = (V/2H1+ c- cos ( dô ))
ou Ç est l'angle de torsion» d est l'ordre de l'axe de symétrie» V est la barrière de rotation et Ci^vaut +1.
Les paramètres géométriques sont considérés comme cons
tants (80) et par conséquent l'expression de l'énergie confor
mationnelle ne tient pas compte de la variation des longueurs de liaison et des angles de valence. Les paramètres utilisés ici ont été revus en 1975 et 1983 (82)» mais ces nouvelles fonctions sont plus difficiles à utiliser car les interactions ne sont pas toutes traitées de la mâme manière (82).
Tous les atomes des chaînes latérales des acides aminés sont représentés individuellement» à l'exception du groupe méthyle qui est remplacé par un atome composite (83). L'éner
gie des liens H est négligée car on considère qu'en solution aqueuse les liens H intramoléculaires ne sont ni plus probables ni plus favorables que les liens H intermoléculaires avec les molécules du solvant. Les charges du groupe dansyle et des bouts de chaTnes chargés et CDD”* ont été précédemment calculées par des méthodes quantiques (CNDO) (Oth» communica
tion privée et M. Leclerc (thèse»1977) et R. Guillard
<thèse»1982))» les charges nettes des groupes ionisés sont divisées par 2 pour tenir compte de l'hydratation de ces groupes et de 1'effet des contre-ions.
#2 Méthode statistique
Devant l'impossibilité de générer l'ensemble des con
formations» une première approche serait de négliger les conformations qui» au niveau de l'unité peptidique indépendante de chacun des acides aminés» ont une énergie élevée et ne peuvent par conséquent mener à des structures de basse énergie.
On risque alors de négliger des conformations qui au niveau local ont un faible poids statistique mais qui par des interactions à longue distance peuvent donner des structures de basse énergie. De plus» m^me si on se limite aux conformations dans un intervalle d'énergie raisonnable» de 3 à 4 Kcal/mole»
plusieurs jours seraient nécessaires pour calculer les pro
priétés d'un tel ensemble.
Nous avons choisi d'effectuer nos calculs à l'aide de l'algorithme de Monte Carlo do à Metropolis et al. mis au point pour l'étude de l'équation d'état des liquides (84) et appliqué ensuite à l'étude des chaînes polypeptidiques (85) qui permet d'obtenir un échantillon boltzmannien de conformations tenant compte des interactions entre tous les atomes de la chaîne.
Le principe de la méthode est le suivant:
a) on construit N chaînes en choisissant au hasard la séquence des angles 'f» H
t' et qui déterminent la conformation de ces chaînes»
b) chacune de ces N chaînes est ensuite modifiée M fois» par un choix aléatoire des angles de rotation correspon
dant à un acide aminé tiré au hasard»
c) la nouvelle conformation est acceptée ou rejetée selon un critère énergétique basé sur la différence d'énergie 4E entre les deux dernières conformations. Si est négatif ou nul» la dernière structure plus stable que la précédente est définie comme la nouvelle. Si ÛE est positif» la dernière structure est la nouvelle avec une probabilité égale au facteur de Boltzmann exp-<ÛE/kT). Si ce facteur est plus grand qu'un nombre aléatoire X compris entre O et 1» la dernière structure est choisie comme la nouvelle. Dans le cas contraire» la précédente est prise à nouveau comme la nouvelle.
On peut montrer (84) que cet algorithme permet d'obte
nir NxM chaînes dont la distribution déterminée par la probabi
lité de présence de chaînes ayant respectivement les énergie E^
et E/ tend vers la distribution de Boltzmann é
P. / P - =exp-( (E: -E. )/kT)
■3 6
lorsque le nombre de chaînes NxM est grand.
Pour améliorer la convergence de ce processus» les chaTnes aléatoires sont construites par un choix au hasard des angles -f et ^ dans l'espace conformationnel de basse énergie
<E^3. 75 kcal du minimum) de l'unité peptidique correspondante.
Les angles de torsion des chaTnes latérales sont choisis au hasard parmi les multiples de 30"»à l'exception des angles des résidus aromatiques qui sont limités à +90'* (86). De plus»
les N chaTnes de départ ne peuvent avoir une énergie défavora
ble due à un (ou plusieurs) contacts courts.
Les propriétés moyennes sont calculées à partir de l'échantillon de 10x1000 chaTnes ainsi obtenues. La valeur d'une propriété <X> est calculée à partir des valeurs X de cette propriété associée à chaque conformation i:
<X> = < 1/NxM) 51 X- L ^
Nous montrerons que la taille de l'échantillon est suffisante pour obtenir une bonne reproductibilité des propriétés étudiées et qu'ainsi la dispersion des résultats peut gtre négligée.
#3 Calcul des propriétés liées au transfert d'énergie non radiatif
L'efficience du transfert non radiatif de l'énergie d'excitation électronique entre deux luminophores fixés sur une m§me chaTne est une fonction de la distance qui les sépare. La mesure de cette grandeur permet donc de déterminer les dimen
sions moyennes de molécules biologiques.
Ce type de transfert est un cas particulier de couplage entre deux dipoles de transition et correspond au couplage très faible (87). Si un luminophore excité se trouve au voisinage d'un second luminophore à l'état fondamental» la vitesse de désexcitation du premier résulte de trois modes : 1' émission de fluorescence (constante cinétique kp )» l'extinction de fluorescence (quenching k«, ) et le transfert non radiatif
(k-r).Si la molécule est rigide» l'efficience du transfert (T) est décrite par le rapport
T = k^/(k,+k +k^ )
T T Q F
La relation (88)
9 K^(lnlO) 1
k = --- X X --- —
128 7ir^n''N' Tl' - FD r^ I
relie k.^. à la distance séparant les centres des luminophores(r^ )
avec intégra donneur n = indice
n
; = nombre temps d
du spectre d^émission du de 1 'accepteur
= facteur d'orientation déterminé par l'orientation relative des moments de transition des luminophores donneur et accepteur.
On appelle distance critique distance pour laquelle l'efficience vaut
de Forster (R
q) la 1/2 c'est-à-dire que + k.
Cette distance permet d'exprimer k.j- sous la forme 't X ( R
q/ r^
où T = durée de vie de l'état excité du donneur en l'absence de transfert. Ceci nous permet d'exprimer l'efficience sous la forme
T =
6 t,
1+ Rc/T'e
qui autorise le calcul de à partir de l'efficience et de Rg.
Cependant le facteur d'orientation inclus dans l'expression de Rp n'est généralement pas déterminé par l'expérience et peut varier de O (moments de transition perpendiculaires) à 4
(moments colinéaires>î aussi introduit-on (89) la notation
pour séparer le facteur dépendent de la nature des
k î b
