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Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository
Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:
Godeau, J.-M. (1980). Arginyl-tRNA synthetase de Bacillus stéarothermophilus. Purification et caractérisation de l'enzyme (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.
Disponible à / Available at permalink : https://dipot.ulb.ac.be/dspace/bitstream/2013/214015/1/527e08e7-d494-42f3-91d5-8f4426e354d3.txt
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INYL-tARN SYNTHETASE
BACILLUS STEAROTHERMOPHILUS
l!
ili
PURIFICATION
ET CARACTERISATION DE L'ENZYME
Godeau Jean-Marie
pour l’obtention du grade d’agrégé de l'enseignement J,*.'' ‘
Faculté de Médecine Vétérinaire.
UNIVERSITE DE LIEGE
MARS 1980
Bibliothèque de Khodr
Travail présenté pour l'obtention du grade d'agrégé de l'enseignement supérieur.
Faculté de Médecine Vétérinaire.
UNIVERSITE DE LIEGE.
ARGINYL-tARN SYNTHETASE
D E
BACILLüS STEAROTHERMOPHILUS
Purification et Caractérisation de 1' Enzyme.
GODEAU Jean-Marie
MARS 1980.
TABLE DES MATIERES .
Remerciements ... ... 1
Résumé... ,... 3
Abréviations et Notations... 7
Chapitre I : INTRODUCTION ... 9
1. Généralités... 9
2. Structure Moléculaire des AaRS... 11
3. Activité Catalytique et Mécanisme des AaRS... 14
Buts de notre travail... I8 Chapitre II : MATERIELS ET METHODES... 19
1. Culture de B. stearothermophilus... 19
2. Isolement de tARN 2.1. tARN total d'E.coli... 20
2.2. tARN de B. stearothermophilus... 21
2.2.1. tARN total... 21
2.2.2. tARN spécifique de l'arginine 21 2.2.3. tARN oxydé au périodate... 25
3. Purification de l'ArgRS de B.sth... 26
3.1. Purification sans inhibiteur de protéases... 26
3.2. Purification en présence de PMSF.... 27
4. Dosages Enzymatiques... 33
4.1. Arginyl-tARN Synthétase... 33
4.1.1. Réaction d'acylation du tARN par l'arginine... 33
4.1.2. Réaction d'échange ATP:PPi... 36
4.1.3. Consommation d'ATP... 38
a. Dosage de l'ATP résiduel par la bioluminescence. . .. 38 b. Analyse des produits de
dégradation de l'ATP pair chromatographie... 4l
4.2. ATPase... 4l 5. Prépairation d'arginyl(^^C)-tARN... 43 6. Purification d'ADP... 43 7. Mesures quantitatives des protéines... 45 8. Electrophorèses en gels de polyacryla-
mide... 45 8.1. Electrophorèses non dénaturantes.... 45 8.1.1. Electrophorèses analytiques.. 46 8.1.2. Extraction de protéines de
gels découpés... 47 8.1.3- Electroélution par électro
phorèse discontinue perma
nente... ... 48 8.2. Electrophorèses en milieu dénatu
rant. Détermination du PM... 48 9. Interactions de l'ArgRS avec ses
substrats... 51 9.1. Chromatographie d'affinité avec
du tARN total... 51 9.2. Fluorimétrie... 55 9.3. Ultracentrifugation en gradient de
saccharose. Détermination du PM... 56 10. Digestion des protéines par la trypsine.. 58 11. Précipitation au sulfate d'ammonium... 58 12. Filtration moléculaire sur Séphadex.
Détermination du PM... 59 13. Thermostabilité des extraits enzymati
ques... 61
Chapitre III : RESULTATS EXPERIMENTAUX... 62
1. Purification de l'ArgRS... 62 1.1. Purification en absence d'un
inhibiteur de protéases... .. .. 63
1.1.1. Electrophorèses préparati
ves... 68 1.1.2. Chromatographie d'affinité... 71 1.1.3. Précipitation au sulfate
d'ammonium... 77 1.1.4. Filtration sur Séphadex G-lOO 86 1.1.5. Ultracentrifugation en gra
dient de saccharose... 89 CONCLUSION et DISCUSSION... 94
1.2. Purification de l'ArgRS en présence de PMSF ... 98
CONCLUSION et DISCUSSION... IO6
2. Interaction entre l'ArgRS et le tARN'^^®. . I17 2.1. Introduction...117 2.2. Interaction entre le tARN et l'ArgRS
de B. stearothermophilus...121 2.2.1. Analyse fluorimétrique... 126 2.2.2. Ultracentrifugation en gra
dient de saccharose... 129 3. Activités catalytiques de l'ArgRS... 143
3.1. Détection d'un complexe intermé
diaire ... 144 3.1.1. Consommation d'ATP par
l'ArgRS...145 3.1.2. Réaction d'échange ATP:
(^^P)PPi... 166 3.1.3. Discussion... 174 3.2. Conditions expérimentales pour
l'aminoacylation du tARN^^®... 184 3.2.1. Force ionique. Besoins en
MgClj et en NaCl... 185
3.2.2. Influence du pH sur la vi
tesse de la réaction d'ami- noacylation... 191 3.2.3. Concentrations saturantes
en substrats...199 3.2.4. Discussion...203 3.3. Mécanisme cinétique de l'aminoacy-
lation du tARN'^'^® catalysée par
l'ArgRS... 213 3.3.1. Expérimentation et résul
tats ... 218 A. Etude en vitesse initiale
sans addition des produits de la réaction... 2l8 B. Etude en vitesse initiale
en présence d'inhibiteurs de la réaction... 230 3.3.2. Discussion... 246 A. Synthétases "classiques".248 B. Synthétases catalytique-
ment dépendantes du tARN..262 3.3.3. Mesure des constantes ciné
tiques ... 269
Chapitre IV : CONCLUSIONS GENERALES... 289
BIBLIOGRAPHIE 302
REMERCIEMENTS.
Mes remerciements s'adressent, en tout premier lieu, à la Faculté des Sciences de l'Université Libre de Bruxelles et, plus particulièrement, à Monsieur le Profes
seur CHANTRENNE qui y dirige le service de Chimie Biologique au département de Biologie Moléculaire à Rhode-St Genèse.
Que Monsieur CHANTRENNE trouve ici, l'expression de toute ma gratitude pour m'avoir accepté dans une de ses équipes et avoir activement suivi l'évolution de mes travaux. Tout au long de ces derniers, sa présence et son intérêt ont régu
lièrement soutenu mes efforts. Avisés furent ses conseils et sages, ses suggestions.
Que la Faculté de Médecine Vétérinaire de l'Université de Liège et plus spécialement son Doyen,
Monsieur le Professeur LOUSSE, soient également remerciés de m'avoir autorisé, quel qu'en fut leur sacrifice, à acquérir la formation indispensable pour mener à bien une étude biochimique, mais aussi pour m'avoir permis de réaliser loin d'eux, des recherches fondamentales dans le domaine particulier de l'enzymologie.
Je me dois de remercier aussi Monsieur H.
GROSJEAN qui dirige l'unité de laboratoire où ce travail a été réalisé et auquel il s'est toujours intéressé de façon critique malgré ses lourdes obligations à l'étranger.
Ma reconnaissance s'adresse â Madame C.
TAKADA-GUERRIER qui, en compagnie de Madame S. de HENAU, m'a longuement et patiemment initié aux manipulations bio
chimiques et aux techniques de laboratoire.
Je remercie Madame J.CHARLIER de la Vrije Universiteit Brussel pour les conseils judicieux qui ont favorisé l'issue heureuse de la purification de la synthéta- se; Messieurs V.STALON et J-P.SIMON de l'Institut de Recher
ches du C.E.R.I.A., pour leur contribution à l'interpréta
tion du mécanisme cinétique de l'enzyme; Monsieur le Profes
seur SELS, de l'Université Libre de Bruxelles, qui m'a aima
blement autorisé à utiliser son appareillage spectrophotomé- trique.
Mon estime et ma sympathie vont à Messieurs A.BURNY, G.MARBAIX, G.HUEZ et, dans le souci de n'oublier personne, à l'ensemble des chercheurs et du personnel tech
nique qui oeuvrent à leurs côtés. Leurs conseils ont été et sont toujours appréciés; la bonne humeur, l'enthousiasme et l'esprit de camaraderie animant leur équipe créent au sein du service de Monsieur le Professeur CHANTRENNE, un climat exceptionnellement favorable à la recherche et à l'étude.
J'exprime mon plus profond respect à mon épouse pour l'appui moral qu'elle n'a cessé de me prodiguer et les renoncements qu'elle a dû s'imposer; admirable fut son effacement en face des exigences inhérentes à mes acti
vités.
-2-
RESUME .
L'isolement de 1'arginyl-tARN synthétase d'un micro
organisme thermophile (Bacillus stearothermophilus; souche NCA 1518) a initialement été effectué selon des techniques de sépa
ration déjà décrite dans la littérature, en absence d'un inhibi
teur de protéases. Mais cette purification n'a pas abouti au ré
sultat espéré. En effet, le faible rendement observé (20Î), l'ac
tivité spécifique peu élevée (500 U/mg) de la préparation finale et, particulièrement, un facteur de purification nettement insuf
fisant (30x) suggéraient une contamination importante par ail
leurs confirmée par l'examen électrophorétique: cet extrait con
tenait un grand nombre de protéines de poids moléculaires dif
férents dont deux protéines majeures de 78OOO et 43000 dalton.
La première de celles-ci était, dans la littérature, identifiée à 1'arginyl-tARN synthétase nonobstant certains résultats expé
rimentaux contradictoires. La découverte de ces contaminations permettait donc de s'interroger sur l'exactitude du poids molé
culaire adopté officiellement (78OOO ?) et impliquait de nouvel
les méthodes de purification.
Deins un premier temps, une séparation partielle entre les deux protéines majeures a non seulement montré une absence de relation entre la protéine 78000 et la synthétase recherchée, mais encore l'existence d'un lien entre cette dernière et la protéine 43000. Cependant, une analyse complémentaire devait infirmer cette nouvelle hypothèse.
Dans un second temps, un inhibiteur de protéases (le phénylméthylsulfonyl fluoride) a été ajouté aux tampons d'extrac
tion des premières étapes de purification pour réduire les dan
gers de protéolyses de l'enzyme. De plus, deux étapes nouvelles (filtration moléculaire; chromatographie sur phosphocellulose) ont été ajoutées à l'ancienne procédure de purification et ont permis d'atteindre l'objectif voulu: l'enzyme fut purifié 88O fois et était doté d'une activité spécifique très élevée (6230 U/mg). En milieu dénaturant, son exaimen électrophorétique a révé
lé l'existence d'un seule protéine de poids moléculaire 59000;
aucune trace des protéines 78000 et 43000 n'a pu y être détectée.
Dans des conditions non dénaturantes, l'expérience a également montré une identité entre l'activité enzymatique et une protéine
de 59000 dalton. La synthétase est donc de structure monomérique (a), le poids moléculaire de l'enzyme dénaturé correspondant au poids moléculaire de l'enzyme natif.
Bien que le tARN spécifique ait provoqué une augmen
tation de poids moléculaire inattendue pour le simple complexe Enzyme*tARN, augmentation que d'aucuns ont interprétée comme la conséquence d'une dimérisation de l'enzyme induite par son tARN, aucun fait expérimental n'a apporté la preuve de cette modifica
tion conformationnelle (aj) au cours de la catalyse.
La constante d'équilibre de dissociation du complexe Synthétase«tARN*^® a été évaluée par fluorimétrie (Kd=10 ^-10 ®M)
Par différentes méthodes dont celle de la dénatura
tion thermique de l'enzyme, des phénomènes d'associations ont été observés entre la synthétase et des protéines éliminées au cours de la purification. A défaut d'avoir pu démontrer la spé
cificité de ces interactions, elles expliquent néanmoins les erreurs d'estimation du poids moléculaire de l'enzyme et les dif
ficultés rencontrées pour sa purification.
La réaction d'aminoacylation des tARN est catalysée par les synthétases selon un mécanisme particulier où intervien
nent la fixation de trois substrats (ATP, ac.aminé, tARN) et la libération de trois produits (PPi, AMP, aminoacyl-tARN). En rè
gle générale, la synthétase interagit avec l'ATP et l'acide ami
né, en absence du tARN, pour former le complexe Enzyme«Aminoacyl- AMP (^réaction d'activation) qui transférera l'acide aminé activé sur'lfttARN spécifique lorsque celui-ci aura été ajouté au milieu réactionnel. Dès lors, la plupart des auteurs considèrent ce
complexe comme l'un des complexes intermédiaires naturellement produits au cours de la réaction complète d'aminoacylation. Mais, faute de pouvoir les isoler avec les glutamyl-, glutaminyl- et arginyl-tARN synthétases, que ce soit par des voies directes (fil tration sur gel et sur disque de nitrocellulose) ou indirectes
(catalyse de l'échange ATP:(^^P)PPi en absence du tARN), ce mé
canisme réactionnel ne semble pas convenir pour expliquer la catalyse contrôlée par ces trois synthétases.
Bien que ces approches expérimentales aient été ap
pliquées sans succès à 1'arginyl-tARN synthétase de Bacillus steeirothermophilus et décrites comme telles dans la littérature, les résultats négatifs pourraient être le reflet de l'instabili
té du complexe recherché ou de conditions expérimentales défavo-
-i,-
râbles. Le problème du mécanisme a donc été abordé par des voies cinétiques différentes de la réaction d'échange ATP:PPi, à sa
voir l'étude de la consommation d'ATP par l'enzyme et celle de l'ordre d'addition des substrats et de libération des produits dans la réaction d'aminoacylation du tARN^^®.
La disparition de l'ATP a été mesurée pair le dosage de l'ATP résiduel au moyen d'une technique utilisant la biolu
minescence, et par l'identification et le dosage des produits de dégradation. Aucune consommation d'ATP. ne fut décelée lors- qu'associé â l'arginine et à l'enzyme, il était incubé en absen
ce du tARN. Mais cette étude permit de découvrir qu'une activité ATPasique accompagnait la synchétase. Comme la présence de l'ARN de transfert spécifique de la synthétase inhibait l'ATPase déce
lée dans l'extrait enzymatique le plus pur, l'hypothèse selon laquelle la protéine responsable de l'activité ATPasique s'iden
tifierait à la synthétase elle-même fut proposée. Un contrôle devait cependant révéler que les deux fonctions dépendaient de deux protéines au moins, les poids moléculaires des enzymes na
tifs étant différents. La préparation "pure" d'arginyl-tARN syn
thétase était donc contaminée par une ATPase, mais la consomma
tion d'ATP due à cet enzyme étant nettement inférieure (.0,02%) à celle engendrée par la synthétase dans la réaction d'amino- acylation, elle fut ignorée au cours de cette étude. En revanche, les conséquences de cette contamination sur les résultats de la réaction d'échange ATP:PPi sont importantes lorsque l'extrait protéique utilisé est partiellement purifié, car l'effet inhibi
teur du tA.RIf^^® ne s'y observe plus; dans le cas d'un extrait
"pur", son incidence est négligeable et l'expérience a montré que la réaction d'échange s'effectuait à une vitesse trois fois plus élevée que celle de la réaction d'aminoacylation. La diffé
rence dans la rapidité de ces deux réactions catalysées en pré
sence de tARN'^^® suggère un modèle où ce dernier interviendrait comme un activateur de la synthèse d'un intermédiaire arginyl adénylate.
Après avoir déterminé les conditions optimales de la réaction d'aminoacylation (besoins en MgCl^ et en NaCl, valeur du pH), l'ordre d'addition des substrats et de libération des produits a été déterminé par le dosage de 1'arginyl-tARN produit en vitesse initiale, à des concentrations variables en substrats et en inhibiteurs.
Les résultats cinétiques aboutissent à deux méca
nismes possibles: le processus classique de formation d'un com
plexe intermédiaire Enzyme«Aminoacyl-adénylate précédant le transfert de l'acide aminé sur le tARN (mécanisme ping pong), ou encore celui dans lequel tous les réactifs se fixent à l'en
zyme avant la libération de tous les produits (mécanisme séquen
tiel) . Dans les deux cas, le modèle cinétique fait intervenir une modification conformationnelle de l'enzyme qui survient en
tre la libération du PPi et la fixation du tARN dans le site catalytique (phénomène "iso") pour le premier mécanisme, et entre la fixation de l'arginine et celle du tARN (phénomène
"pseudo iso") pour le second mécanisme.
Néanmoins, la comparaison des vitesses de la réaction d'échange ATP:PPi et de la réaction d'aminoacylation ainsi que d'autres faits expérimentaux actuellement décrits dans la lit
térature à propos des modifications conformationnelles des synthétases induites par leurs tARN spécifiques, sont autant d'arguments favorables au mécanisme ping pong ci-dessous sché
matisé :
-6-
ABREVIATIONS et NOTATIONS.
^260
Aa,(^^C)Aa Aa-
ac.
ac, nucléiques:
AMP,ADP,ATP ATP(32p) GTP ADN
ARN,mARN,rARN
tARN, tARN^^®
Arg(^^C)-t.ARN^^®
tARN(IOj^) ou tARN^^
Aot. sp.
B.sth. , B.sub.
BD-cellulose BSA
°C cm, nm
DEAE-oellulose DEX
DMSO DO DTE
‘^338nm > *^259 F E
E.coli
absorbance à 260 nm (lA
260' absorbance mesurée dans un ml et à pH neutre dans une cuvette de quartz d'icm de chemin lumière), acide aminé froid ou marqué au carbone 14.
aminoacyl- . Chaque acide aminé possède un symbole standard (exemple:Arg- pour arginyl-).
acide.
adénosine 5'-mono-, di-, et triphosphates.
ATP marqué au phosphore radioactif, guanosine 5 ' “triphosphates.
ac.désoxyribonucléique.
ac.ribonucléique, ARN messager ou ARN ribosomal.
ac.ribonucléique de transfert ou tARN spécifique pour l'arginine.
tARN spécifique pour l'arginine aminoacy- le par de l'arginine marquée au C.
tARN oxidé au périodate.
activité spécifique d'un enzyme(activité par mg de protéine).
Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis.
DEAE-oellulose benzoylée.
albumine sérique de boeuf (ou sérumalbu- mine de boeuf).
degré centigrade.
oenti-, nanomètre.
0-diéthyl-amino-éthyl-cellulose.
dextrane (P.M.: 500000).
diméthylsulfoxyde.
densité optique dithioérythritol.
extinction molaire à 338nm, extinction â 259nm.
Enzyme.
Escherichia coli.
EDTA Enzymes :
AaRS
ArgRS
ATPase RNase PPase
Fig.
gr, mg, ^g
h, min, sec, msec Hepes
1, ml, pl
M, mM, nM, pM
mCi, ^Ci
NAD, NADH
PEG PEP PM PMSF
PPi, (^^P)PPi
RPC rpm, cpm S
SD S TCA Tris U UV, IR
ex]
: éthylène-diamine-tétraacétate.
: désignation générale pour les aminoacyl- tARN synthétases (= enzymes d'activa- tion ou L-Aa:tARN ligases formant 1' AMP). Ces enzymes possèdent une numéro
tation de base: E.C.6.1.1.- .
: AaRS spécifique pour l'arginine (E.C.
6.1.1.19).
; ATP phosphohydrolase.
: ribonucléase.
: pyrophosphatase.
: figure.
: gramme, milligramme, microgramme.
: heure, minute, seconde, milliseconde.
: sulfonate de 4-(2-hydroxyethyl)-l- pipérazine éthane.
: litre, millilitre, microlitre.
: concentration molaire, milli-, micro-, nano-, et picomolaire.
: milli- et microcurie (luCi= 2,22 10^ dés- sintégrations par minute ou dpm).
: nicotinamide adénine dinucléotide, for
mes oxydée et réduite.
: polyéthylène glycol (PM : 6000) : phosphoénolpyruvate.
: poids moléculaire( exprimé en dalton).
: phényl-méthyl-sulfonyl-fluoride.
: pyrophosphate inorganique froid ou mar- que au ^ P.
: résine de polychlorotrifluoro-éthylène.
: révolutions par min., coups par min.
: unité Svedberg.
: dodécylsulfate de sodium.
: ac. trichloro-acétique.
: tris(hydroxyméthyl)amino-méthane.
: unité enzymatique.
: rayons ultraviolets ou infrarouges.
: concentration de la substance X , et X = E, ATP, tARN, Aa, etc...
-8-
CHAPITRE I.
INTRODUCTION .
1. Généralités.
Les aminoacyl-tARN synthétases sont des enzymes déterminants pour le métabolisme cellulaire, ce qui a donné lieu à la publication de nombreux articles généraux à leur su
jet (1-5). Ils rendent les acides aminés disponibles pour la biosynthèse des protéines en les attachant à l'extrémité 3' de la chaîne des tARN spécifiques. Pour mener cette mission à son terme, la réaction enzymatique trouve son énergie dans l'hydro
lyse de l'ATP qui active l'extrémité carboxylique de l'ac.aminé.
Pour catalyser cette réaction, les enzymes d'acti
vation doivent pouvoir fixer trois substrats différents: l'ac.
aminé, le tARN spécifique pour l'Aa et l'ATP. Ils sont aidés dans cette tache par les ions bivalents (Mg ) et par les poly- amines (spermine, spermidine, etc...) qui se trouvent naturelle
ment dans le liquide cellulaire. Les concentrations en magnésium atteignent 1 à 20mM chez les levures, les bactéries et les tissus animaux, mais le magnésium libre directement utilisable pour le fonctionnement des synthétases ne dépasse pas 0,5 à l,0mM (6).
Celles des polyamines sont assez élevées (0,1 à 10 mM) (6); ces substances améliorent la vitesse de biosynthëse des peptides
(7). Les concentrations cellulaires en Aa et en ATP sont res
pectivement de 0,05 â ImM (8) et de 2 à 6mM (9-10). Celles en tARN et en AaRS spécifiques sont sensiblement équivalentes, de l'ordre de 10 ^ à 10”^M pour les premiers et de 10 pour les secondes(11-15)•
Pour chaque acide aminé, il existe un enzyme d' activation spécifique et plusieurs tARN spécifiques dont lès pourcentages cellulaires différents permettent de les classer
en un tARN majeur et plusieurs tARN mineurs (parfois quatre), tous spécifiques d'un seul ao.aminé. Chaque cellule contient au moins une soixantaine d'espèces de tARN pour les 20 ao.aminés différents. Dès lors, la fidélité des synthétases pour cataly
ser la formation des aminoacyls-tARNest l'élément déterminant de la reproduction correcte de l'information génétique.
La spécificité de la reconnaissance entre l'ao.
aminé et les synthétases est partiellement connue (5). On pen
se actuellement qu'elle est le résultat d'un processus qui contrôle la spécificité à plusieurs niveaux de la réaction d' aminoacylation: l'analyse de la reconnaissance de la méthioni
ne par la MetRS d'E.coli (l6) a montré qu'il y avait un contrô
le de la dimension, de la forme et de la nature chimique de la chaîne latérale de l'ao.aminé au moment de sa fixation à l'en
zyme; un second contrôle porte sur la longueur de la chaîne la
térale et s'effectue au moment de l'activation du bout carbo- xylique par l'ATP; et, enfin, un troisième contrôle porte sur la reconnaissance de l'atome de soufre qui s'effectue au stade de formation de l'aminoaoyl-tARN.
La spécificité de la reconnaissance entre la syn- thétase et ses tARN spécifiques est toujours à l'étude (17)*
Rappelons que les tARN ont un poids moléculaire voisin de 25000, une constante de sédime.ntation de 4S et sont composés d'une séquence d'environ 75 nucléotides. Ils portent une séquence pCpCpA à l'extrémité libre 3'OH et le nucléotide G à l'extré
mité 5'- La structure primaire en feuille de trèfle du tARN'^^®
d'E.coli est donnée pour information dans la figure 1. La bou
cle de l'anticodon contient les trois bases qui interagissent avec le codon correspondant du mARN, lui-même copie conforme de l'ADN.
Les fonctions biologiques des tARN sont variées (19): si leur rôle essentiel consiste à conduire l'ao.aminé activé sur les lieux de la biosynthèse des protéines (mARN des particules ribosoraales), ils ont d'autres activités au sein de cette protéosynthèse (au moins 10), mais aussi dans le mé
tabolisme des ARN et dans le transfert des ao.aminés à travers la membrane cellulaire (19,20).
La reconnaissance des tARN par les AaRS oonsti-
-10-
A
C 0 G
6
A
A.
C C A pG • C C • G A • U U • A C • G C • 0 G • C s* U
OH
C U C 6 G A G U
C C U C C
• • • • •
6 G A 0 G C
X
> mfe
7 IV
C ' C . G 0 U • A C • 0 0 • C G • C
9% A
boucle
U
1 anttcodon
Figure 1» Séquence nucleo- tidique du tARN^^® d'E.coli
(référence 18).
tue le premier évènement de la synthèse des protéines où 1' information d'un ao.nucléique (tARN) est transmise dans un ac.
aminé. Comme l'anticodon est unique pour chaque tARN et pour chaque ac.aminé, on peut supposer que la synthétase reconnaît cet anticodon. Mais cette hypothèse ne s'est pas entièrement confirmée expérimentalement car d'autres régions du tARN in
terviendraient tout aussi activement dans cette reconnaissan
ce. Malgré l'abondance des recherches, le problème n'est pas encore résolu quoique de sérieux progrès ont apporté leurs con
tributions dans la compréhension de ce phénomène. Nous aurons encore l'occasion d'en discuter dans le chapitre traitant de nos résultats expérimentaux et dans le §3 du présent chapitre.
2. Structure moléculaire des AaRS.
Les structures primaires ont été déterminées pour de nombreuses synthétases (5). La prédominance des ao.
dicarboxyliques (glutamique et aspartique) sur les ao.aminés basiques (lysine et arginine) est une caractéristique généra
le qui catalogue les AaRS dans les protéines acides. A pH neu
tre, elles migreront éleotrophorétiquement vers l'anode.
La forme générale et les dimensions occupées par
les synthétases en solution sont mal connues. Les unes auraient la forme d'ellipsoïdes aplatis et les autres d'ellipsoïdes asy
métriquement étalés (5). Certains enzymes ont pu être cristal
lisés.
La structure quaternaire montre que la popula
tion des synthétases est très hétérogène, quatre grandes clas
ses structurales pouvant les distinguer:
A. Synthétases monomériques à courte chaîne (PM$70000).
Type a.
B. Synthétases monomériques à longue chaîne (PM autour de 110000). Type a .
C. Synthétases dimériques à sous-unités identiques. Type CI2 C.l. Le PM des sous-unités est faible, autour de
40000.
C.2. Le PM des sous-unités est important, autour de 80000.
D. Synthétases asymétriques de structure tétramérique.
TypeajPj-
La plupart des synthétases actuellement purifiées ont été classés dans le tableau 1 selon leur appartenance ma
joritaire à l'une des quatre classes. Nous y avons indiqué in
tentionnellement les dates de publication de la structure et du poids moléculaire apparent, car l'expérience a montré une disparition des hétérogénéités apparentes avec l'amélioration des techniques de purification et l'usage d'inhibiteurs de pro
téases. Nous pouvons trouver de tels exemples dans chacune des classes :
- l'ArgRS d'E.coli présentée comme un dimère symétrique en 1969 a été purifiée sous sa forme monomérique actuelle en 1975;
une purification insuffisante de la GluRS d'E.coli a fait croire erronément qu'il s'agissait d'un dimère asymétrique CtP - la ValRS d'E.coli peut être isolée sous une forme apparem
ment dimérique et asymétrique (aP) à cause d'une protéase qui contamine l'extrait cellulaire brut.
- la MetRS d'E.coli était considérée en 1968 comme un enzyme tétramérique ou dimérique a2 de la classe Cl. Cinq ans plus tard, l'utilisation d'un inhibiteur de protéases classe cet enzyme en C2.
- la PheRS d'Eicoli initialement prise pour un tétramère symé
trique en 1970, fut décrite en 1974 comme un enzyme de struc- -12-
ture ajP2 simultanément par deux laboratoires différents.
Dans les organismes supérieurs, les synthétases sont généralement associées entre elles sous la forme de com
plexes polyenzymatiques (5>71), mais aucun complexe de ce gen
re n'a encore été mis en évidence à ce jour chez les organis
mes procaryotes.
CLASS2S AaKS Origine PM Sous-unités Type Année Références
A Arg- E.coU "2000 2
»2 1969 e
63000 non a 19?5 21
6C000 non a 1979 22
Le’A^re 73000 non a 1976 23
Neurcspcra 85000 non a 197* 24
S.sth. 78000 non a 1972 25
germe blé 70000 non a 1978 26
lupin lUQOOO 2
=2 1979 27
Cys- 3.sth. 5>i000 non a 1979 26
Gin- £.coli 69300 non a 1971 29
Glu- E.coli 102000 2;a:56000
È:i*60ûC ap 1972 30 62000
+3000 non a 1976 31
56000 non a 1979 32
6 Val- E.coli 110000 non a 69-70 5,33
II5OCC non a 1975 3*
125000 2;a:70000
3:46500 ap 1975 34
125000 non 1579 35
B.sth. 39000 non a 1978 36
110000 non a 197* 37
Levure 113000 — 1966 38
125700 non a 1978 39
Leu- E.coli 104000 non a 1970 40
IO5OOÛ non a 1970 41
B.sth. IlOOOC non a 197* 37
Ctndida 128000 non a 1975 42
lie- E.coli 112000 — 1966 43
114000 non a 1970 44
Ala- Levure 128000 non a 197* *5
C Aan- 3.sth. 127000 2x 51000
“2 1978 36
Asp- E.coli 119000 Jx 61000
i 132000 2x 6*000 ^2 1978 46
His- E.coli S5OOC 2x 49500 “2 1974 *7
Salm.typhi 80000 2x 39000 <^2 1973 5 Réticulocyte
de rat 120000' 2x 6*000 1978 *8
Lys- B.sth. 112000 2x 56000 .
“2 1978 36
Tableau 1. Structure sous-unitaire des AaRS.
Met- E.coXi 190000 ___ ___ 1967 49 96000 2x 48000
=‘2 1968 50 173000 llx 43000 ^4 1968 51 172000 2x 86000
'^2 1973 52
170000 2x 85000 a 1974 53
170000 2x 85000
=^2 1979 59
B.sth. 135000 2x 66000 1974 37
165000 2x 82000
“2 1976 55
Pro- E.coli 94000 2x 47000
«2 1969 56
Ser- E.coll B 103000 2x 53000 aa 1973 57
E.coli K12 95000 CI9 1970 58
â 100000 2x 50000
B.sth. 88000 2x 49000 aj 1978 36
Thr- E.coli 152000 2x —
“2 1977 95
7rp- E.coli TtOOO 2x 37000
<^2 1971 59
B.sth. 70000 2x 35000 a. 1974 37
Levure 110000 2 aa 1974 95
Puicrias bov.* 120000 2x 60000 aj 71-72 5 Placenta hun. 118000 2x 60000 aa 1973 5
Tyr- E.coli 95000 — 1966 60
90000 — — 1975 61
95000 2
»2 1973 5,95 74000 2x 37000 as 71-76 62,63
5.sth. 90000 2x 45000 aa 1974 64
95000 2x 47500 aa 1974 37
3.sub. 8B000 — 1966 60
Levure boulan-
ger 100000 2x 40000
“2 1977 65
fl bière 116000 4x 31500 a4 1973 5
Poie rat 1211000 2;a: 62000
3:61000 OG 1978 95
150000 2x 68000 aa 1978 66
D Gly- E.coli 220000 4;0:33000
p;80000 Oj3a 1970 5
225000 4;0:33000 aa32 1974 67
3=80000
Phe- E.coli 181000 _____ — 1967 68
181000 4x 43000 a4 1970 5
270000 4ja:370003=98000 aa0a 1974 69
B.brevis 226000 4;a:8l000
“2P2 1975 70
3=30000
Levure 262000 4;a=6l000 a-3-, 1971 5
3=70000 2^2
Poie de rat 287000 4;0= 69000 a,3. 1973 95 3=75000
Tableau 1 (suite). Les PM ont été indiqués sous réserve d'une protéolyse possible au cours de la purification.
3. Activité catalytique et mécanisme des AaRS.
La réaction catalytique globale valable pour toutes les aminoacyl-tARN synthétases peut s'écrire:
Aa + ATP + t:ARN ^ ^Aa-tARN + AMP + PPi [l]
' AaRS
-14-
Généralement, la réaction [l] se scinde en deux étapes, l'activation de l'Aa par hydrolyse de l'ATP pré
cédant sa fixation sur le tARN. Cette réaction est classique et peut être représentée selon l'équation [21 ou se schémati
ser comme sur la figure 2.
Aa + ATP + E ^ E»Aa-AMP + ppi
E«Aa-AMP + tARN -—^ E + Aa-tARN + AMP ^
La première étape de l'équation [21 indique la formation d'un aminoacyl adénylate (aminoacyl-AMP) qui reste attaché à l'enzyme d'activation, et la libération de PPi.
Cette réaction est réversible car, en présence de PPi radioac
tif, on peut observer l'incorporation de la radioactivité dans l'ATP; et cette mesure porte le nom de réaction d'échange ATP:
PPi. Elle ne nécessite pas la présence du tARN bien que trois enzymes d'activation fassent exception à cette règle: l'ArgRS, la GluRS et la GlnRS.
Dans les catalyses classiques en deux étapes, le complexe E»Aa-tARN réagit avec une molécule de tARN spécifi
que pour former le tARN-aminoacyl. Comme l'indique la figure 2, le site d'attache de l'Aa sur le tARN n'a pas été clairement défini. En effet, on peut trouver des Aa-tARN où l'Aa est fi
xé en position 2' ou en position 3' du ribose de l'adénosine 3' terminale. En fait, ce n'est pas l'enzyme qui décide de 1' endroit de la liaison ester, mais uniquement la molécule de tARN (72b,73). Pour permettre à la biosynthèse des protéines de s'accomplir, le tARN acylé doit se complexer à un facteur d'élongation Tu, et ce dernier a la particularité de ne faire aucune distinction entre les deux types d'Aa-tARN (7^)-
Les cas des synthétases catalytiquement dépen
dantes du tARN dans la réaction d'échange ATP:PPi ont servi d'arguments à Loftfield (3) pour proposer un mécanisme concer
té. Ce mécanisme peut se confondre avec l'équation [11; il suppose une catalyse qui ne passerait pas par la formation du complexe intermédiaire E»Aa-AMP, mais libérerait simultanément les trois produits après qu'il y ait eu fixation préalable des trois substrats sur l'enzyme. Ce mécanisme pourrait être généralisé à l'ensemble des synthétases.
R I
NH.-CH-COT + ATP
Enzymft d'ectivatlon
spécifique R O O
I // I NHt-CH-C-O-P-O-CH.
Adentne
“P
OH OH“Enzyme
Figure 2. Activation d'un acide aminé et sa fixation au tARN.
Le schéma a été tiré du livre de Grunberg-Manago (72a).
Mehler et son équipe (1) ont pourtant mainte
nu le principe d'un mécanisme d'aminoacylation selon un pro
cessus fait de plusieurs étapes dont celle de formation obli
gatoire du complexe E»Aminoacyl-adénylate. Le cas particulier des synthétases inaptes à catalyser la première étape en ab
sence du tARN s'expliquerait par la nécessité qu'auraient ces enzymes à être d'abord activés avant de pouvoir catalyser cet
te réaction, et ce rôle d'activateur serait tenu par le tARN spécifique.
Les réactions d'aminoacylation sont à ce point spécifiques que les erreurs enregistrées in vivo sont extrê
mement rares (5). Néanmoins, des expériences réalisées in vi
tro ont montré la possibilité pour certaines synthétases de fixer leur ac.aminé spécifique sur des tARN non spécifiques ("misacylation reaction"). L'aspécificité de l'activité enzy
matique s'observe d'une part dans des systèmes hétérologues (le tARN et la synthétase proviennent de deux organismes dif
férents) plutôt que dans des systèmes homplogues, et d'autre part lorsque l'expérimentateur utilise le préparation d'un tARN pur et non spécifique en lieu et place d'une préparation qui contiendrait plusieurs tARN dont le tARN spécifique (75)- Habituellement, ces aminoacylations incorrectes sont des réac
tions lentes et incomplètes, une partie seulement du tARN ayant fixé l'Aa (76). Dans la cellule, ces réactions sont peu proba
bles car les tARN spécifiques entrent en compétition avec les tARN non spécifiques, la maximale) de la réaction catalytique en présence des premiers étant supérieure à celle enregistrée en présence des seconds (77)- De plus, l'enzyme qui aurait catalysé la formation d'un Aa^-tARN 2 hydrolysera A â rapidement cet ester (78,79) bien que le facteur Tu puisse en
traver la fonction correctrice en complexant 1'aminoacyl-tARN incorrect (78).
Les erreurs d'aminoacylation peuvent également s'effectuer entre un tARN spécifique de l'enzyme et un Aa non spécifique, mais à condition que celui-ci ne nuise pas stéri- quement à sa fixation sur le site enzymatique prévu pour l'Aa correct ("misactivation reaction") (80). Dans ce cas d'erreur, la fonction hydrolytique éliminera aussi l'Aa-tARN incorrect en favorisant le positionnement de la molécule dans le site du
Phe . , ^
tARN. On sait, en effet, que le Phe-tARN se liera preferen- tiellement sur le site Phe où l'activité hydrolytique est im-
Ph® • productive alors que l'Ile-tARN se liera sur le site du tARN^^® qui déclenche l'activité d'hydrolyse (8l).
In vitro, la réaction d'aminoacylation produit des quantités d'Aa-tARN proportionnellement au temps de la réaction lorsque la concentration en enzyme est suffisamment basse. Cependant, cette proportionnalité disparaît inévitable
ment après un certain temps et fait place à une courbe en forme de plateau: la quantité d'Aa-tARN mesurée dans le milieu réactionnel reste constante au cours du temps. Le plateau sur
vient avant la charge de tous les tARN spécifiques (réaction incomplète), aussi bien dans le cas des aminoacylations cor
rectes que dans celui des aminoacylations incorrectes. On sait actuellement que ce phénomène est la résultante d'un équilibre qui s'établit entre la réaction d'aminoacylation et les trois réactions de déacylation de l'Aa-tARN. Ces dernières se dis
tinguent en déacylation spontanée, en déacylation enzymatique indépendante de l'AMP et du PPi (=fonction hydrolytique des AaRS dans le cas des aminoacylations incorrectes) et en déacy
lation enzymatique correspondant à la réaction inverse d'ami
noacylation. Celle-ci survient lorsque la concentration en AaRS est élevée (76>82-84).
BUTS DE NOTRE TRAVAIL.
L'ArgRS de B.sthearothermophilus a déjà fait 1' objet d'une étude expérimentale (25>85-87) qui avait décrit la probabilité d'un mécanisme concerté pour 1'aminoacylation du tARN^*^®, et suggéré la possibilité d'une dimérisation induite de l'enzyme par son tARN spécifique.
Le but de notre recherche était d'aborder ces problèmes par d'autres voies d'investigation aux fins de con
firmer les résultats proposés.
-18-
CHAPITRE II.
MATERIELS
ET METHODES
1. Culture de Bacillus stearothermophilus.
La souche lyophilisée de B.stearothermophilus (NCA 1518) provient du laboratoire du Professeur Wiame (Micro
biologie. Université Libre de Bruxelles, CERIA, 1070 Bruxelles).
Les cultures ont été réalisées à 65°C sur milieux riches et stériles selon Friedman et Weinstein (88). On a d'abord lancé une préculture de 500ml contenant 5 grs de Bactotryptone (Difco) , 2,5grs d'extrait de levure (Yeast extract Difco) et 4grs de NaCl. Après réveil des spores et une croissance d'une nuit dans la préculture, celle-ci a été mélangée dans une cuve en verre à 17 litres d'un milieu enrichi (I80grs de bactotryptone; 90 grs d'extrait de levure; 153grs de NaCl; 126mg de FeCl^; 270 mg de MgClj et l8mg de MnClj). Une solution de glucose stéri
lisée séparément (500ml; l8grs), 27grs de CaCl^, 300mg de L-méthionine, l8mg de vitamine B1 et 27nig d'ac.nicotinique ont aussi été ajoutés dans le milieu de culture soumis ensuite à une agitation constante sous aération forcée. Des prises régu
lières de liquide ont permis de suivre la croissance par den
sitométrie (DO: 650nm) et d'ajuster régulièrement le pH à 7,0 par adjonction de NaOH IM. La croissance a été brutalement ar
rêtée en fin de période exponentielle en refroidissant le mi
lieu par de la glace pilée. Les cellules ont été récoltées par centrifugation continue (Sorvall, 1200 rpm) et lavées avec
deux litres de tampon Tris-HCl lOmM pH 7,4 contenant lOmM de MgCl2 et, si les cellules étaient destinées à une purifica
tion enzymatique, l4mM de 2-mercaptoéthanol (protecteur des radicaux -SH) et 9 NaCl. Les cellules humides (rendement:
3,3grs par litre de culture) peuvent être conservées au free
zer à -20®C.
2. Isolement et Purification de l'Acide Ribonuoléique de Transfert ou tARN.
Les tARN utilisés proviennent d'Escherichia coli ou de Bacillus stearothermophilus. Les quantités de tARN ont été déterminées par la mesure de l'absorbance dans l'UV à 260 nm (AggQ) à l'aide de cellules de quartz (trajet lumineux: 1 cm) et d'un spectrophotomètre Perkin Elmer. En accord avec Mitra et Mehler (89), une solution de tARN d'Img par ml cor
respond à une mesure de 24 On a estimé le PM à 25000 dalton.
2.1. tARN total d'E.coli.
__________________________________ t
Le tARN provient de la firme Schwarz Bioresearch et a été purifié par chromatographie sur DEAE-cellulose (DE 52 Whatman) selon Stephenson-et Zamecnick (90). Le tARN dissous dans lOmM Tris-HCl pH 7,4 a été dialysé contre le même tampon et fixé sur une colonne de DEAE-cellulose conditionnée dans lOOmM Tris-HCl pH 7s4. La résine a été lavée par ce même tam
pon contenant 250mM de NaCl. Ces opérations ont été contrôlées par la mesure de l'absorbance à 260nm de chacune des fractions récoltées à la sortie de la colonne. Le tARN a été élué en NaCl
IM et les fractions dont l'absorbance était supérieure à 1 AggQ ont été rassemblées: les ac.nucléiques y ont été précipités par l'éthanol (2 volumes) pur et à basse température (-2Q°C). Le tARN précipité a été centrifugé, lavé deux fois par un mélange éthanol:eau(80:20), séché au lyophilisateur à 4°C, redissous dans du Tris-HCl 1,8M pH 8,0 et incubé à 37°C pendant 1 h pour décharger les tARN de leur ac.aminé selon Sarin et Zamecnick
(91). Du NaCl a été ajouté pour obtenir une concentration fina
le de 0,1M et permettre une nouvelle précipitation du tARN avec 2 volumes d'éthanol. Lavé et séché comme décrit ci-dessus, le tARN déacylé fut dissous et dialysé dans l'eau bidistillée.
. -20-
Il a été conservé à -20°C. Au moment de son utilisation, il peut être réactivé en présence d'ions magnésium par une incu
bation de 3niin à 60°C.
Notons que les sacs à dialyse qui ont été uti
lisés ont- tous été préalablement traités selon la technique de Lemoine et coll.(92)
2.2. tARN de B.stearothermophilus.
2.2.1. tARN total.
Les ac.nucléiques ont été extraits sur cellules entières par la méthode au phénol décrite par Brubaker et Mc Corquodale (93). Les cellules ont été mises en suspension dans un volume du tampon Tris-HCl (lOmM; pH 7,k) contenant lOmM de MgClj et auquel on a ajouté un volume équivalent de phénol.
On aura pris soin d'éliminer la substance conservante du phé
nol (ac.phosphoreux) par plusieurs lavages en présence de 100 mM de Tris-HCl à pH 7,4. Le mélange phénol/tampon est homogè
ne pour un rapport de 90/10 (volume/volume).
Après agitation lente à la température ordinai
re pendant 30min, on a centrifugé à 10000 g (30min) et la pha
se aqueuse a été recueillie et ajustée à 2% d'acétate de K.
Les ac.nucléiques ont été précipités par 2 volumes d'éthanol pur à -20®C, lavés par un mélange éthanol:eau (80:20), cen
trifugés et séchés sous vide à 4°C. Dissous dans lOmM de Tris- HCl pH 7,4, les tARN ont été dialysés contre le même tampon, soumis à une chromatographie sur DEAE-cellulose et déacylés comme décrit précédemment pour le tARN d'E.ooli. Le rendement était de 3mg de tARN par gramme de cellules humides.
2.2.2. Isolement du tARN spécifique pour l'arginine.
Deux techniques ont été utilisées.
Toutes les étapes de purification ont été sui
vies au spectrophotomètre par mesure de l'absorbance à 260nm des fractions récoltées au cours des chromatographies succes
sives .
Le tARN total a été chargé sur une colonne de BD-cellulose échangeuse d'anions (Schwarz Bioresearch) et chro- matographié selon la méthode décrite par Gillam et coll.(94).
A noter qu'en dépit de la grande capacité de la BD-cellulose à fixer le tARN, ce dernier peut aussi agir comme éluant puis
qu'il est un polyanion: pour cette raison, nous n'avons pas dépassé une charge en tARN de l-2mg/ml/cm de la surface de, 2 section de la colonne (95)-
La résine a été conditionnée dans lOmM de tam
pon acétate de Na à pH 4,8 qui contenait lOmM de MgCl2 et 300 mM de NaCl (^Tampon A). Le tARN total a été chargé sur la BD- cellulose et lavé avec le tampon A. La majeure partie du tARN'^^®
ayant été élué par le tampon de lavage contenant IM NaCl (=tam- pon B). Cette fraction a été précipitée par 2 volumes d'étha
nol pur à -20°C, lavée à l'éthanol:eau (80:20), séchée au lyo- philisateur et resuspendue dans lOmM de Tris-HCl pH 7,4 avec lOmM de MgClj.
De 1'arginine(^^C) (50pCi/pM; Schwarz Bioresearch) a été chargée sur le tARN^^® dans les conditions expérimenta
les décrites au § 4.1.1. et à l'aide d'un excès d'arginyl-tARN synthétase purifiée, dans un volume de 1ml incubé à 37°C pen
dant 30min. On a porté ensuite le mélange réactionnel à 0°C en y ajoutant 30pl d'acétate(Na) IM de pH 4,5 et 250pl de NaCl 5M froids. Les ac.nucléiques ont été précipités à l'éthanol pur (2 volumes à -20°C), lavés et séchés comme précédemment.
Le précipité fut suspendu dans 1,5ml de triétha- nolamine (lOOmM; pH 4,3) et de MgCl2 lOmM à 0°C. En agitant,
150pl de phénoxyacétyl ester de N-hydroxysuccinimide (lOmg dans 1ml de tétrahydrofurane) ont été ajoutés, et le pH ajus
té à 8,0 par adjonction de NaOH IM. Après 10min, le pH était ramené à 4,5 par addition d'ac.acétique glacial et les ac.
nucléiques précipités par 2 volumes d'éthanol froid, lavés (éthanol/eau; 80/20) et séchés sous vide. Ils ont été redis
sous dans 1ml d'une solution d'acétate de Na (lOmM; pH 4,5), de MgCl2 (lOmM) et de NaCl (300mM).
Le tARN'^'^® ainsi aminoacylé et phénoxyacétylé (phénoxyacétyl-arginyl( C)-tARN) a été chromatographié sur 1 11 une nouvelle colonne de BD-cellulose conditionnée avec le tam
pon A. Le tampon B a lavé la colonne du tARN^^® qui n'avait
-22-
pas été phénoxyacétylé et le même tampon, contenant lOt d' éthanol en supplément, a élué l'arg( C)-tARN phénoxyacétylé l4 qui fut précipité et déacylé selon le schéma décrit pour le tARN d'E.coli.
La préparation de tARN^'^® ainsi purifiée a été appelée tARN^^®"^! (Tableau 2).
Le tARN total de Bacillus a été chromatographié sur une colonne (90cm de longueur; 1,2cm de diaunètre) de RFC 5 (Ugine Khulmann) selon la technique décrite par Roe et ooll.
(96). Le RFC 5 est une résine de polychlorotrifluoroéthylène recouverte d'Adogen 464, un chlorure de tri.alkylméthyl ammo
nium. Le conditionnement de la résine a été réalisé par une solution lOmM en acétate(Na) pH 4,5, lOmM en MgCl2, ImM en Na2S20j et 450mM en NaCli Quarante mg de tARN total ont été dialysés contre le même tampon, chargés sur la colonne et sou
mis à un gradient linéaire (500x500ml) de NaCl (0,45 I 0,9M).
Le tARN a été recherché dans les .fractions par leur capacité d'aminoaoyler l'arginine( C) en présence du mileu réaction
nel décrit en 4.1.1., mais dans lequel aucun tARN n'avait été ajouté (fig. 3). Les fractions les plus actives ont été ras
semblées et le tARN précipité à l'éthanol(2 volumes; -20°C), lavé (éthanol:eau ; 80:20), lyophilisé et solubilisé comme dé
crit plus haut. Le tARN enrichi en tARN^^® a été appelé tARN^^®'^II. Le rendement fut de 7*.
Les fractions contenant peu ou pas de tARN^^®
ont été rassemblées, traitées de façon identique avec un ren
dement de 31Ï. L'extrait ainsi obtenu a été appelé tARN'^^® to
tal.
Les différentes préparations de tARN utilisées au cours de ce travail sont décrites dans le tableau 2. Les concentrations en tARN*^® ont été calculées à partir de la ca- paoité maximale des extraits à fixer 1'arginine( C) en pré14 sence d'un excès d'airginyl-tARN synthétase, dans les conditions décrites au § 4.1.1. et à pH 6,0 .
260
total
Figure 3- Chromatographie de tARN total de B.stearothermo- philus sur RPC5 .
Mille A^gQ de tARN total dialysé contre un tam
pon d'aoétate(Na) lOmM, pH 4,5 , contenant du MgCl^ lOmM, du Na2S20j ImM et du NaCl 450mM, ont été chargés sur une colon
ne de RPC5 conditionnée dans le même tampon. Le tARN est sou
mis à un gradient de NaCl (— --- ) avec un débit de 90ml/h.
Des fractions (5nil/fraotion) ont été récoltées à la sortie de la colonne: la mesure de l'absorbance à 260nm {%) et le dosa
ge de la capacité de charge du tARN^^® (O) y ont été réalisées comme décrit dans ce chapitre. Les fractions 30 à 55 (extrait tARN total Arg ) et 75 à 95 (extrait tARN*^®"*^!!) ont été ras
semblées séparément. (Nos remerciements vont à Mme Suzy De Henau pour la réalisation de cette colonne ; les figures ont été réalisées avec la collaboration technique de Mme Grandmaire et Mr Dumont).
-24-
2.2.3. Oxydation du tARN au périodate.
Le tARN a été oxydé à pH 4,8(tampon acétate de sodium, lOOmM) avec du métapériodate de sodium (NalO^j, 2mM) selon la technique décrite par Goodman et coll.(97). A condi
tion d'avoir déchargé le tARN de son ac.aminé, le périodate clive oxydativement le lien carbone-carbone entre les grou
pes 2' et 3'-hydroxyles dans le ribose de l'adénosine termina
le, lequel est précisément le lieu de fixation de l'ac.aminé.
Après 15min à la température ambiante, la réaction a été ar
rêtée par un excès d'éthylène glycol et les ac.nucléiques ont été précipités à l'éthanol, lavés, séchés et redissous dans du Tris-HCl lOmM, pH 7,4 ou dans de 1'acétate(Na) lOmM pH 4,3.
Le tARN(IOjj) a été stocké à -20°C après avoir contrôlé qu'il était devenu incapable de fixer encore un ac.aminé.
Préparations de tARN
tARN totaux mg/ml nanomoles/ml
tARN^^S nancmoles/ml %
tARN total 34,4 1376 77,1 5,6
tARN^^S"! 1.0 40 16,0 40,0
tARN^^’^'^II 6,95 27« 92,5 33,26
tARN^^®~
total 12,4 495 0,83
Tableau 2. Purification de tARN de B.stearothermophilus.
La représentation de tARN total décrite ei-dessus ne représente q'une seule des préparations de "tARN total" uti
lisées au cours de ce travail, lesquelles ont présenté quel
ques variations les unes par rapport aux autres.
3. Purification de l'Arginyl-tARN Synthétase de Baoillus stearôthermophilus (ArgRS).
Deux méthodes de purification ont été appliquées.
La première correspond assez précisément à celle décrite an
térieurement par Parfait et Grosjean (25)> tandis que la se
conde .a fait appel â un inhibiteur de protéases ajouté aux extraits protéiques en cours d'extraction, et à un plus grand nombre d'étapes de purification.
Tout a été réalisé à 4°C en présence de l4mM de 2-mercaptoéthanol, sauf observations contraires, et à l'aide de tampons dégazés.
Notons que des extraits enzymatiques riches de la totalité des enzymes d'activation (Extrait Brut) ont aussi été purifiés selon la technique modifiée de Zubay (98), le Tris- HCl remplaçant le tampon phosphate.
3.1. Purification sans inhibiteur de protéases.
Les cellules de B.stearothermophilus qui avaient été récoltées en phase exponentielle et gardées à -20°C, ont été mises en suspension (120grs de cellules humides dans 400ml de Tris-HCl (pH 7,4) lOmM contenant du MgCl^ lOmM et du NHjjCl 60mM) et lysées à la presse de French (10 psi). On a centrifu
gé le lysat pendant 45min à 1200 rpm dans des tubes Corex de 30ml pour éliminer les débris cellulaires. Le surnageant (ex
trait cellulaire brut ou EC) a été soumis à une étape de par
tage dans un système biphasique aqueux utilisé par Lapointe et 3311 (30) pour l'isolement de la GluRS et mis au point anté
rieurement par Albertson (99) et Cappechi (100) pour séparer les ac.nucléiques des protéines. Ce système était composé d' une phase dextrahe à 1,5!5 (DEX; PM:500000) (Pharmacia) et d' une phase polyéthylène glycol à 7Î (PEG; PM: 6000) (Pluka).
L'ArgRS se retrouvait dans la phase PEG qui a été dialysée contre un tampon suocinate(Na) lOmM à pH 6,0 ; les ribosomes ont été éliminés dans la phase DEX.
Les protéines de la fraction enrichie en ArgRS ont ensuite été adsorbées sur gel d'alumine (Sigma, 98B-8040) et extraites par sept tampons phosphate(K) de pH et de con
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centrations différentes: l'ArgRS s'est décrochée conformé
ment aux observations antérieures (25>85)- Les fractions les plus riches en activité enzymatique (réaction d’aminoacylation) ont été rassemblées, dialysées contre un tampon phosphate(K) lOmM à pH 7,0 et chromatographiées sur une colonne de DEAE- cellulose (diamètre;3,5cm;longueur:20cm) conditionnée en tam
pon phosphate(K) 13ÛmM à pH 7,0 . La colonne fut lavée par ce même tampon jusqu'à obtenir une diminution significative de 1' absorbance mesurée dans les fractions de lavage à l'aide d'un spectrophotomètre Perkin-Elmer réglé en UV sur 280nm. L'élu- tion de la synthétase s'est faite par un gradient linéaire
(500x500ml) de concentration du tampon phosphate(K) de pH 7,0 (130 à 300mM). Cette chromatographie doit permettre l'élimi
nation des ac.nucléiques et des RNases. Les fractions qui ma
nifestaient l'activité enzymatique la plus intense (AaRS), ont été rassemblées et dialysées contre lOmM de tampon phos
phate pH 7,0.
Une dernière chromatographie sur une colonne d'hydroxyapatite (diamètre : 3,5cm; longueur : 20cm) a éliminé les synthétases autres que l'ArgRS. L'hydroxyapatite préparée se
lon Tiselius (101) avait été conditionnée dans un tampon phos- phate(K) 20mM pH 7,0,et la colonne soumise à un gradient li
néaire de concentration du même tampon (20 à lOOmM). Les frac
tions présentant une activité élevée en AaRS spécifique pour l'arginine ont été rassemblées, concentrées par filtration sous pression d'azote (3Kg/cm ) à l'aide d'une membrane PM-IO P
(système-Amioon). Dialysé contre un tampon Tris-KCl de pK 7,4 (lOmM) où le 2-mercaptoéthanol a été remplacé par le dithio- érythritol (DTE; ImM), l'extrait enzymatique d'ArgRS concen
trée a été conservé à -70°C dans des ampoules de 250 à 500jil.
Au gré des besoins, l'enzyme a été décongelé et gardé à -20°C en glycérol à 50Ï(volume/volume). Cet extrait enzymatique ob
tenu sans inhibiteur de protéases et ayant comme dernière é- tape de purification une chromatographie sur hydroxyapatite, a été appelé 1' "extrait HAP" .
3.2. Purification en présence de PMSF.
Le phénylméthylsulfonyl fluoride ou PMSF (PM:
174,2 ; Calbiochem) est un inhibiteur hautement spécifique et
irréversible des protéases possédant les résidus sériques in- habituels dans un site actif, c'est-à-dire un -OH libre à 1' intérieur de ce site (102). Ceci est le cas des estérases du genre de la trypsine et de la chymotrypsine.
La spécificité du PMSP peut être maléfique vis- à-vis d'autres enzymes qui auraient aussi la particulairité de posséder un résidu séryl sensible à l'inhibiteur. Néanmoins, la figure 4 nous renseigne que l'activité de 1'arginyl-tARN synthétase n'a pas été contrariée par la présence du PMSP, mais fut même protégée par lui malgré l'addition de trypsine(EC 3.
4.4.4.).
Figure 4. Effet inhibiteur du PMSP sur l'activité trypsique détruisant les molécules d'ArgRS par protéolyse.
L'ArgRS (extrait HAP) a été incubée à 37°C en pré
sence d'un milieu réactionnel adéquat et des aliquotes de 60pl ont été prélevées au cours du temps pour mesurer les quantités, d'arginyl-tARN radioactif (carbone 14) synthétisées (cpm x 10 en absence
(O)
ou en présence de 2,2mM de PMSP(0), mais en absence de trypsine.
-28-
De la trypsine (30)ig/ml) a été incubée 20min â 37°C en présence de sérumalbumine bovine (lOOpg/ml) ou en pré
sence de 6mM de PMSF avant d'avoir été mise en présence d'ArgRS et incubée avec elle dans le milieu réactionnel d'aminoacylation.
La concentration finale en trypsine était de llMg/ml(A;A) et en PMSF de 2,2mM (A) •
L'addition de trypsine (ll^g/ml) au milieu réac
tionnel d'aminoacylation, après incubation préalable de la syn- thétase et du PMSF pendant 20min à 37°C, a donné les résultats expérimentaux de la courbe intermédiaire (□).
La solubilité du PMSF est faible dans l'eau, mais il se dissout facilement dans l'éthanol: nos solutions concentrées de départ contenaient 40mM d'inhibiteur dans 95?
d'éthanol. Une demi-vie d'environ lOOh à pH 7,0 , plus courte encore aux pH plus élevés, contraint l'utilisateur à préparer les solutions au moment de l'emploi. La solution concentrée (40mM) a été mélangée aux solutions protéiques (1:40) en évi
tant des concentrations locales élevées en éthanol (102).
Il est parfaitement évident qu'une fraction mi
nime des protéases pourra être inhibée puisqu'elles ne con
tiennent pas toutes des groupes hydroxyles dans leur site ca
talytique .
Le second schéma de purification de l'ArgRS est identique à celui décrit au § 3-1- à l'exception de l'étape d' adsorption sur gels d'alumine qui a été abandon.née à cause d'un rendement insuffisant. Le PMSF a été utilisé à la dose d'ImM dans le tampon de suspension des cellules de culture du Eacil- lus et dans l'extrait cellulaire brut (EC). En lieu et place de la presse de French, la bombe à lyser a été utilisée: les cellules sont mises en suspension homogène (200 à 400ml) avant d'être déposées dans la bombe pour y subir pendant un quart d' heure la pression de 1500Kg/cm d'un gaz neutre, l'azote.
L'opération de lyse a été répétée trois fois pour chaque sus
pension de cellules. Les tampons de l'étape PEG/DEX et ceux utilisés pour les dialyses des extraits enzymatiques obtenus avant et après la chromatographie sur DEAE-çellulose, conte
naient 0,lmM de PMSF. La DEAE-cellulose a été conditionnée sans inhibiteur de protéases et la chromatographie s'est réa
lisée dans les conditions décrites au § 3.1. (fig.5).
Figure 5- Chromatographie sur DEAE-cellulose.
La ligne en pointillé indique la concentration molaire en POjj(K) à pH 7,0 . L'absorbance à 280nm {%) a été mesurée pour cha
que fraction (12ml) ainsi que la capacité d'ami- noacylation du tARN'^^® par l'arginyl-tARN syn- thétase
(O)
(Ipl dans 60pl de milieu réactionnel/15min/37®C).
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L'hydroxyapatite a été conditionnée dans lOmM de PO||(K) à pH 7,5 et l'extrait enzymatique y a été fixé, puis lavé dans le même tampon. La synthétase fut éluée par un gra
dient linéaire de concentration du tampon phosphate (K) à pH 7,5 (10 à 70mM). Les fractions contenant le maximum de l'activi
té de 1'arginyl-tARN synthétase ont été rassemblées et concen
trées, comme précédemment décrit, pour donner 1' "extrait HAP- PMSF" (ou extrait n*IV).
Ce dernier extrait a enfin été soumis à deux nouvelles étapes de purification: une filtration moléculaire sur acrylamide agarose et une chromatographie sur phosphocel- lulose.
Une colonne Pharmacia (diamètre : 3cm ; longueur:
90cm) a été comblée d'acrylamide agarose (Ultrogel de type Ackkki produit LKB) conditionné dans lOOmM de tampon phospha
te (K) à pH 7,0 . L'extrait HAP-PMSF a été dialysé contre le même tampon, chargé sur la colonne et filtré, dans les mêmes conditions, à travers l'ultrogel. Les fractions capables d'a- minoacyler le tARN*^® ont été rassemblées, concentrées par filtration sur une membrane PMIO (système Amicon) et dialysées contre lOmM d'un tampon POjj(K) de pH 6,0 qui contenait 10% de glycérol (volume/volume).
L'extrait ainsi obtenu a été chargé sur une nou
velle colonne (diamètre : 3,8cm; longueur :l8cm) contenant de la phosphocellulose (Whatman Pli) équilibrée dans le tampon de dialyse. Après un lavage abondant (3x le volume mort de la co
lonne), on a élué spécifiquement l'ArgRS à l'aide de tARN^^®
dissous dans le tampon phosphate (lOmM; pH 6,0) contenant 10^
de glycérol, selon la technique décrite par von der Haar (10) et adaptée à notre purification en utilisant du tARN total d' E.coli à raison de 0,lmg/ml. .
Finalement, le tARN a été éliminé de la prépa
ration enzymatique par une nouvelle chromatographie sur DEAE- cellulose: après fixation et lavage de l'extrait sur une colon
ne, conditionnée en tampon POjj(K) (lOmM; pH 1,1), l'ArgRS est éluée par du NaCl 0,25M et le tARN reste fixé à la DEAE-cel- lulose.
L'‘ArgRS a été dialysée contre lOmM de Tris- HCl à pH 7,4 , et concentrée selon la technique décrite plus
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