- - -
- - -
Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository
Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:
Goffin, V. (2005). Etude de la région cis-régulatrice positive associée à un site hypersensible aux nucléases et localisée dans le gène pol du virus HIV-1 (Human Immunodeficiency virus type 1) (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.
Disponible à / Available at permalink : https://dipot.ulb.ac.be/dspace/bitstream/2013/210907/1/e7a204ab-d225-4d87-b553-8ae68d363086.txt
(English version below)
Cette thèse de doctorat a été numérisée par l’Université libre de Bruxelles. L’auteur qui s’opposerait à sa mise en ligne dans DI-fusion est invité à prendre contact avec l’Université ([email protected]).
Dans le cas où une version électronique native de la thèse existe, l’Université ne peut garantir que la présente version numérisée soit identique à la version électronique native, ni qu’elle soit la version officielle définitive de la thèse.
DI-fusion, le Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles, recueille la production scientifique de l’Université, mise à disposition en libre accès autant que possible. Les œuvres accessibles dans DI-fusion sont protégées par la législation belge relative aux droits d'auteur et aux droits voisins. Toute personne peut, sans avoir à demander l’autorisation de l’auteur ou de l’ayant-droit, à des fins d’usage privé ou à des fins d’illustration de l’enseignement ou de recherche scientifique, dans la mesure justifiée par le but non lucratif poursuivi, lire, télécharger ou reproduire sur papier ou sur tout autre support, les articles ou des fragments d’autres œuvres, disponibles dans DI-fusion, pour autant que :
Le nom des auteurs, le titre et la référence bibliographique complète soient cités;
L’identifiant unique attribué aux métadonnées dans DI-fusion (permalink) soit indiqué;
Le contenu ne soit pas modifié.
L’œuvre ne peut être stockée dans une autre base de données dans le but d’y donner accès ; l’identifiant unique (permalink) indiqué ci-dessus doit toujours être utilisé pour donner accès à l’œuvre. Toute autre utilisation non mentionnée ci-dessus nécessite l’autorisation de l’auteur de l’œuvre ou de l’ayant droit.
--- English Version ---
This Ph.D. thesis has been digitized by Université libre de Bruxelles. The author who would disagree on its online availability in DI-fusion is invited to contact the University ([email protected]).
If a native electronic version of the thesis exists, the University can guarantee neither that the present digitized version is identical to the native electronic version, nor that it is the definitive official version of the thesis.
DI-fusion is the Institutional Repository of Université libre de Bruxelles; it collects the research output of the University, available on open access as much as possible. The works included in DI-fusion are protected by the Belgian legislation relating to authors’ rights and neighbouring rights.
Any user may, without prior permission from the authors or copyright owners, for private usage or for educational or scientific research purposes, to the extent justified by the non-profit activity, read, download or reproduce on paper or on any other media, the articles or fragments of other works, available in DI-fusion, provided:
The authors, title and full bibliographic details are credited in any copy;
The unique identifier (permalink) for the original metadata page in DI-fusion is indicated;
The content is not changed in any way.
It is not permitted to store the work in another database in order to provide access to it; the unique identifier (permalink) indicated above must always be used to provide access to the work. Any other use not mentioned above requires the authors’ or copyright owners’ permission.
DBM 00685
Faculté des Sciences
Institut de Biologie et Médecine Moléculaires Laboratoire de Virologie Moléculaire
Promoteur : Dr Carine Van Lint
Etude de la région c/s-régulatrice positive associée à un site hypersensible aux nucléases et localisée dans le gène pol du
virus HIV-1
(Human Immunodeficiency virus type 1)
ULB - IBMM
BIBLIOTHEQUE
Thèse présentée en vue de l’obtention du grade légal de Docteur en Sciences VERONIQUE GOFFIN 2005
Université Libre de Bruxelles Faculté des Sciences
Institut de Biologie et Médecine Moléculaires Laboratoire de Virologie Moléculaire
Promoteur ; Dr Carine Van Lint
Etude de la région c/5-régulatrice positive associée à un site hypersensible aux nucléases et localisée dans le gène pol du
virus HIV-1
(Human Immunodefîciency virus type 1)
Thèse présentée en vue de l’obtention du grade légal de Docteur en Sciences VERONIQUE GOFFIN 2005
“Et voÜa, ce travaiC toiiche à sa fin, et mes dernières Cignes sont pour tout ceujç, qui m'ont entourée et soutenue. Cette thèse a été une e:i(périence scientifique, mais aussi une grande expérience humaine, travaillèr en groupe permet d’apprendre Beaucoup de choses sur les autres et sur soi
(D’ahord très cher Arsène, merci pour votre sourire mais surtout pour Cintérêt que vous portez à chacun d’entre nous.
Curine, merci de m’avoir accueillie, de m’avoir fait confiance et de m’avoir suioie ces quelques années. IMerci surtout pour nos dernières heures passées ensemSle à finaliser ce travaiC <( au finish ».
Manu, tu as été ma maman Caho, ma complice et mon amie. Merci de m’avoir toujours donné confiance en moi
‘Ensuite vient la clique C^L, par qui commencer? (Peut-être par toi ‘Cincent, Ce coq dans cette Basse-cour.
Merci pour ton écoute, nos fous rires et ton soutien scientifique. Merci aussi pour nos moments déco, nos moments confidence pour confidence.
^lors il y aussi les co-voitureuses de mon coeur, Claire la Blonde et ^nn la Brune. C’est fou ce que ces trajets ensemBCe nous ont rapproché. Ces déBriefings de nos vies matin et soir. Je vous adore. J’espère que la vie ne nous éloignera pas. Merci Claire pour ta douceur, seuls ceux qui te connaissent Bien ont la chance de connaître ce trait de ton caractère. Merci pour ta fidélité, ^nn, merci pour nos nuits new-yoïfgises, je ne lès ouBUerai pas.
Merci Séverine pour tes rires, ta gentillesse, ta Bonne humeur et ton hospitalité. Merci pour tous ces délires ! Je suis contente de continuer à te voir.
Merci à toi aussi ÇaëlCe pour nos moments « grandes Blondes ». JCouvelCe venue dans Ce groupe mais tout aussi fidèle que les autres.
Merci à toi l^my, de près ou de loin, tu es devenu un ami Même si tu vis à Marseille, tu as toujours fait parti de ma clique CVL. J’espère que nous arriverons toujours à garder contact.
Merci aussi à la Bande «enhancer» qui s’est fait de plus en plus grande, dans Cordre d’apparition : Cctro avec qui j’ai commencé en duo, ensuite (Domi nous a rejoint pour le trio... pour ensuite presque former un orchestre, nous avons pris Stéphane, Valérie M, parfois Manou. CBacun jouant de notre instrument, nous avons fait avancer h musique... (Bonne chance pour la suite.
Merci à ma super ‘Kflfj, du même style que moi, je dirai simplement qu’on nous entendait de Coin. Je suis contente d’avoir toujours pu venir te voir pour papoter, rire auxécCats et ouvrir mon coeur.
Merci Jean-Marc pour tes grands et surtout longs débats philosophiques, Jfanh pour nos pauses cCopes.
Merci aussi aux autres tnemBres du laBo que je n’ai malheureusement que croisé : Miriam, Valérie <P., ÇiHes.
Merci aussi à Edwige, Jinna et Antoine, toujours souriants !
Maintenant passons auxgens que j’aime en dehors de lenceinte de Cl(BMM.
Merci à toute ma super Bande de nanas, qui m’ont toujours changé lès idées, merci à toi ma si chère Caro, merci Jiline, merci Hélène, merci (^rrine, merci Eeggy, merci %fithleen, merci Verena. (jue de super délires avec vous et quel soutien positrf!
Merci aussi à ma nouveOe équipe de travail^ merci M. Leunis de m’avoir accueiCRe dans votre équipe et m’avoir permis de finaliser mon travail Merci à ma déjà si chère Cindy, ma nouvelle confidente et amie, qui sait allier douceur, écoute et gentillesse. (Bref encore une super natta Merci à Joseph, ton soutien informatique et ta patience m’ont Beaucoup aidé ces derniers jours.
Merci à aw(_dew(_ Biologistes de mon cœur: (Bérengère et Magali Jfous formions un Beau trio pendant nos études! Merci à toi (Berengère de me faire confiance, tu me Cas Bien démontré, je ne te décevrai pas! Merci Magali mon coach de Cépoque qui m’a éclairci la Biologie !
Merci à mes dewçfrères que j’aime tout simplement parce qu’ils sont mes frères.
Merci à mes parents, vous êtesformidaBles ! Je vous aime, je suisfière d’être votre fille. Je vous dois tout.
Merci à mes grands-parents qui ne sont plus là aujourdhui pour me féliciter mais qui m’ont toujours montré qu’ils étaient fiers de moi Merci de m’avoir transmis ton goût pour la science <Papa<Pierre... Merci Çrany de m’avoir appris le Bonheur, l^ous êtes tous les deusç_dans mon cœur.
<Et maintenant, toi, mon SeB, celui qui partage ma vie, mes rires, mes projets, mes rêves, mes doutes, mes joies, mes peines. Tu es toujours là pour moi, mon amoureujç. Je te remercie pour ton soutien douj^ et
constant. Tu me permets d’être moi J’ai la chance de t’avoir. Je t’aime.
RESUME
La vitesse de réplication de HIV-1 (Human Immunodeficiency virus type 1), qui semble être corrélée de façon directe à la vitesse de progression du SIDA, est contrôlée essentiellement au niveau de la transcription. Ce contrôle transcriptionnel est médié par des séquences spécifiques agissant en cis localisées dans les longues répétitions terminales (LTRs) virales, par la protéine virale /ra«5-activatrice Tat et par des facteurs de transcription cellulaires. En plus de ces éléments, notre laboratoire a précédemment identifié un nouvel élément de régulation de la transcription du virus HIV-1, actif en cellules lymphoïdes et monocytaires/macrophagiques et associé à un site hypersensible (SH7) aux nucléases présent dans la partie du gène pol codant pour l’intégrase. Un fragment comprenant ce site (nt 4481 au nt 4982) confère une augmentation transcriptionnelle au promoteur de HIV-1 lors des expériences de transfection transitoire de cellules T-lymphoïdes et promonocytaires. De plus, quatre sites de reconnaissance pour des protéines nucléaires ont été définis dans cette région par des études de liaison in vitro : le site B, la GC-box, le site C et le site D (Van Lint et al., 1994).
Le but de la présente thèse vise à améliorer la compréhension des mécanismes moléculaires régulant la transcription du virus HIV-1 dans les cellules infectées. Nous nous sommes attachés à un aspect de ces mécanismes de contrôle : caractérisation physique et fonctionnelle et la détermination du rôle physiologique dans le cycle réplicatif de HIV-1 de la région c/5-régulatrice intragénique associée au site hypersensible SH7 localisé dans le gène pol.
Nous avons caractérisé physiquement les facteurs nucléaires se liant aux différents sites du SH7 et avons montré que les facteurs de transcription Oct-1, Oct-2, PU.l, Spl et Sp3 interagissent in vitro avec la région pol. Par des expériences d’immunoprécipitation de chromatine en utilisant des lignées cellulaires infectées par HIV-1, nous avons montré dans un contexte chromatinien que les protéines Oct-1, Spl, Sp3 et PU.l sont recrutées in vivo à la région SH7. Pour chacun des sites, nous avons identifié des mutations ponctuelles abolissant la liaison des facteurs nucléaires au SH7 sans altérer la séquence en acides aminés sous-jacente de l’intégrase.
Nous avons ensuite démontré par des expériences de transfection transitoire que les sites de liaison du SH7 sont fonctionnellement impliqués dans l’activité transcriptionnelle positive de la région SH7. De plus, nous avons étudié le rôle de chaque site du SH7 multimérisé séparément (c’est-à-dire en l’absence des autres sites du SH7) par des expériences de surexpression dans un contexte hétérologue.
Nous avons montré que les facteurs de transcription PU.l, Spl, Sp3 et Oct-1 exprimés de manière ectopique régulent l’activité du promoteur hétérologue HSV-TK via leur site de liaison respectifs du SH7.
Finalement, nous avons étudié le rôle physiologique de cette région dans la réplication du virus HIV-1.
Pour ce faire, nous avons muté chacun de ces sites individuellement ou en combinaison dans le contexte d’un clone moléculaire infectieux de HIV-1 et avons étudié les cinétiques de réplication des virus sauvage et mutés. Nos résultats démontrent que ces sites sont importants pour la réplication virale dans des lignées cellulaires d’origine T-lymphoïdes et monocytaires/macrophagiques.
La caractérisation d’une telle région c/5-régulatrice dans la région transcrite du génome de HIV-1 apporte un facteur supplémentaire à un réseau déjà complexe de régulateurs affectant le degré de transcription virale. Ces études devraient contribuer à une connaissance plus approfondie des mécanismes de régulation transcriptionnelle de HIV-1 et donc à une meilleure compréhension de la pathogenèse du SIDA.
ABREVIATIONS
aa ADN ADNc ARN ARNm ARN pol II ChIP EMSAs GAPDH GTFs H HAT HDAC HIV-1 HSV Ig kb kDa LTR NaBut nt PIC
RNA pol II SH
SIDA TAF TAR Tat TBP TK IPX TSA
Acides Aminés
Acide DéoxyriboNucléique ADN complémentaire Acide RiboNucléique ARN messager ARN polymérase II
Chromatin ImmunoPrecipitation Electrophoretic Mobility Shift Assay
GlycérAldéhyde 3-Phosphate DésHydrogénase Facteurs de Transcription Généraux
Histone
Histone-AcétylTransférase Histone-DéACétylase
Human Immunodeficiency Virus type 1 Herpes Simplex Virus
mmunoglobuline Kilo base
Kilo Dalton
Long Terminal Repeat Butyrate de Sodium NucléoTide
Complexe de Préinitiation ARN Polymérase II Site Hypersensible
Syndrome d’ImmunoDéficience Acquise TBP Associated Factor
Trans-Activation Response élément Trans-Activator of Transcription TATA box Binding Protein Thymidine Kinase
Trapoxine Trichostatine A
Table des matières
Résumé Abréviations Table des matières
Introduction_______________________________________________________________________ 1
1. Le rétro virus HIV-1: généralités 1
1.1. Pathogenèse de HIV -1 2
1.2. Structure de la particule rétrovirale 3
1.3. Le génome de HIV-1 3
1.4. Cycle réplicatif de HIV-1 6
1.4.1. La phase d'établissement 6
1.4.2. La phase d'expression 7
2. Régulation de la transcription chez les eucaryotes - Naissance d’un ARN messager 8 2.1. Les éléments essentiels à la transcription de base 8
2.1.1. ADN et chromatine 8
2.1.2. Le promoteur minimal et les facteurs de transcription généraux 13
2.2. Les éléments régulateurs 15
2.2.1. Les éléments cw-régulateurs spécifiques — les enhancers 15 2.2.2. Les facteurs de transcription comme régulateurs: architecture modulaire 16
2.2.3. Les co-facteurs 18
2.2.4. Les enhanceosomes 21
3. La régulation transcriptionnelle de HIV-1 22
3.1. Les régions cw-régulatrices du LTR 5 ’ et de la région leader 22
3.2. La protéine Tat de HIV-1 24
3.2.1. Les différentes formes de la protéine Tat et sa séquence cible TAR 24
3.2.2. Le mécanisme d’action de Tat 25
3.2.3. Tat est fonctionnellement régulé par acétylation post-traductiormelle 26 3.2.4. Fonctions additionnelles de la protéine Tat 26 3.3. Rôle de la structure chromatinienne dans la régulation transcriptioimelle de HIV- 1 : positiormement précis des nucléosomes dans la région 5’ du génome viral 27 3.4. L’enhancer intragénique localisé dans le gènepol de HIV-1 30
But du travail 33
Résultats 36
1. Caractérisation physique des facteurs nucléaires se liant dans la région du site
hypersensible 7 de HIV-1 36
1.1. Localisation des séquences d’ADN nécessaires pour la liaison des facteurs aux sites B et C du SH7 par mutagenèse substitutionnelle 36 1.2. Les facteurs de transcription Oct-1 et Oct-2 lient les sites B et C 39 1.3. Le facteur de transcription PU.l interagit spécifiquement avec le site B du SH7
42
1.4. Les facteurs de transcription Spl et Sp3 interagissent spécifiquement avec la
GC-box du SH7 43
1.5. Le(s) facteur(s) de transcription se liant au site D semble(nt) contenir une protéine à doigts de zinc, ce qui n’est pas le cas pour le(s) facteur(s) de transcription
formant les complexes B3/C3 44
1.6. L’expression de la protéine Tat n’affecte pas la liaison des facteurs nucléaires
aux sites de liaison du SH7 45
1.7. Les facteurs Oct-1, PU.l, Spl et Sp3 sont recrutés in vivo au niveau du SH7 de
HIV-1 46
1.8. Identification de mutations ponctuelles abolissant la liaison des protéines au site
hypersensible 7 47
2. Etude du rôle fonctionnel ex vivo de la région intragénique SH7 49 2.1. Activité transcriptionnelle globale de la région SH7 49 2.2. Analyse fonctionnelle de chacun des sites de liaison du SH7 séparément par des
expériences de surexpression 51
2.2.1. L’expression ectopique des facteurs de transcription Oct-1 et Oct-2 régule négativement l’activité du promoteur TK via des sites B et C multimérisés 52 2.2.2. L’expression ectopique du facteur de transcription PU. 1 augmente l’activité
du promoteur TK via des sites B multimérisés 53
2.2.3. L’expression ectopique des facteurs de transcription Spl et Sp3 augmente l’activité du promoteur TK à travers le site Sp multimérisé 54 3. Les sites de liaison du SH7 sont critiques pour l’infectivité de HIV-1 55 3.1. Propriétés réplicatives d’un virus HIV-1 muté au niveau de l’ensemble des sites
de liaison du SH7 55
3.2. Propriétés réplicatives de virus HIV-1 mutés au niveau des sites de liaison
individuels du SH7 56
3.3. Les mutations dans les sites du SH7 n’affectent pas l’intégrité des particules
virales 58
Discussion 59
1. Rôle fonctiormel ex vivo et in vivo des sites de liaison du SH7 dans la transcription de
HIV-1 60
2. Rôle fonctionnel ex vivo et in vivo de la région SH7 dans la transcription de HIV 68 Bibliographie_____________________________________________________________________ 71 Annexe I : Matériel et Méthodes
Annexe II: Publications
Introduction
Introduction
OCCII
million 1 million
,1 millioni
1 million:
,7 milliol
f* riq ord et Proche-O Vnt Caraïbes
440000)
millions
25 4
de l’Est
Pacifique^^j^
Afrique sub-saharienne
Figure I.l: Estimation du nombre de personnes infectées par HIV-1 à travers le monde en 2004.
Introduction
1. Le rétrovirus HIV-1: généralités
Découvert en 1983-1984, le virus HIV-1 (Human Immunodeficiency Virus type 1) est un rétrovirus humain complexe exogène appartenant au genre des Lentivirus (Barre-Sinoussi et al., 1983; Gallo et al., 1984; Levy et al., 1984; Samgadharan et al., 1984). Répandu dans la plupart des pays du monde, HIV-1 est l’agent étiologique responsable du syndrome d’immunodéficience acquise (SIDA). L’infection par HIV résulte, après une longue période asymptomatique, en un syndrome d’immunodéficience dû au mauvais fonetionnement de plusieurs compartiments effecteurs du système immunitaire et caractérisé par des infections opportunistes, une incidence accrue de tumeurs et ime profonde dégénérescence du système nerveux eentral (revu dans Saag, 1997). Sur base d’analyses phylogénétiques de séquences nucléotidiques, il a été proposé que le virus HIV-1 aurait été introduit dans la population humaine par transmission inter-espèces à partir du chimpanzé Pan troglodytes troglodytes infecté par un variant du virus simien SIVcpz (Chen et al., 1996; Corbet et al., 2000; Gao et al., 1992; Gao et al., 1999; Hirseh et al., 1989). Les modes connus de transmission entre humains sont: la voie sanguine [infection périnatale, transfusion, injections intraveineuses (personnes droguées p.ex.), injections de produits d’origine sanguine (lors d’hémophilie p.ex.)] et la voie sexuelle.
La pandémie du SIDA a déjà provoqué plus 20 millions de décès, et le nombre d’individus infectés à la fin de l’année 2004 à travers le monde était de 39,4 millions (Figure 1.1) , dont 25,4 millions (64,5%) en Afrique sub-saharienne, 7,1 millions (18%) en Asie du Sud et du Sud-Est, 1,7 millions (4,3%) en Amérique latine, 1,4 millions (3,5%) en Europe Orientale et en Asie centrale, 1,1 millions (2,7%) en Asie de l’Est, 1 million (2,5%) en Amérique du Nord, 610.000 (1,5%) en Europe occidentale et centrale, 540.000 (1,4%) en Afrique du Nord et Moyen-Orient, 480.000 (1,3%) en Afrique du Nord et Proche-Orient, 440.000 (1,1%) dans les Caraïbes, et 35.000 (0,1%) en Australie et Nouvelle-Zélande (Figure 1.1) .
mort
semaines années
temps après l’infection
Figure 1.2: Evolution typique de l’infection par HIV-1 (Fauci et Desrosiers, 1997).
ARNdeHIV(copies/mldeplasma)
1.1. Pathogenèse de HIV-1
Les deux types cellulaires représentant les cibles majeures de HIV-1 in vivo sont les lymphocytes T CD4+ et les monocytes/macrophages. Alors que dans les cellules T CD4+ le cycle réplicatif de HIV-1 est normalement un cycle lytique caractérisé par un taux transitoire élevé de production virale, l’infection des macrophages est généralement chronique ou persistante et caractérisée par im taux peu élevé mais permanent de production virale (revu dans Gendelman et Morahan, 1992; Meltzer et Gendelman, 1992; Ho et al., 1994).
L'infection par HIV-1 est caractérisée par une phase initiale de virémie aiguë, qui coïncide avec un rapide déclin des cellules T CD4+ (Figure 1.2). Cette phase d’infection aiguë est généralement contrôlée par des réponses spécifiques du système immunitaire de l'hôte, avec comme conséquences une diminution drastique de la charge virale et vme restauration du taux de cellules T CD4+. La phase initiale, qui dure six à huit semaines, est caractérisée par des syndromes pseudo-grippaux tels que fatigues, fièvres, malaises, occasionnellement accompagnés d'éruptions cutanées ou d'encéphalopathies réversibles.
Cependant, chez certains patients, elle est asymptomatique (revu dans Fauci et Desrosiers, 1997; Saag, 1997). Ensuite, les patients entrent dans une phase asymptomatique (latence clinique) pouvant durer trois à dix ans, et caractérisée par relativement peu de manifestations cliniques, une diminution constante et progressive du nombre de lymphocytes T CD4'*', et une augmentation graduelle de la charge virale (Figure 1.2). Des études ont démontré une réplication virale continue et hautement productrice durant cette période: l’infection par HIV- 1 implique alors par jour la production et la destruction de milliards de cellules T CD4+ (Ho et al., 1995; McCune, 2001; Perelson et al., 1996; Wei et al., 1995). Malgré une vigoureuse réponse immime cellulaire et humorale, l’infection n’est pas éliminée et le système immunitaire va inexorablement à l’épuisement. La charge virale augmente à nouveau et atteint un taux comparable à celui observé pendant la phase initiale de l'infection avant le déclenchement de la réponse inmumitaire. Cette reprise de la production virale est accompagnée par une diminution rapide du nombre de lymphocytes T CD4''‘ (Figure 1.2). Le patient entre dans la phase SIDA caractérisée par des troubles du système nerveux central et par une profonde immunodépression qui rend la personne contaminée incapable de réagir aux agents pathogènes. La phase SIDA aboutit à la mort des individus infectés par HIV-1, due à des maladies opportunistes (dont des formes graves de pneumonie à Pneumocystis carinii, le muguet, la toxoplasmose ou des infections à cytomégalovirus) ou à des cancers (dont le
3’
Q—G— tev -GG
ARN génomique Membrane
d’origine cellulaire
- -gag T'- vif
HCD- Q-
tat -0
-□
rev LTR 3’
env. 2
gp41 gp120 p32 p66/p51 p11
LTR 5’
Figure 1.3: Représentation schématique du génome et de la particule virale de HIV-1.
sarcome de Kaposi, le cancer du col utérin, divers lymphomes et des carcinomes de la langue et du rectum) (revu dans Saag, 1997).
1.2. Structure de la particule rétrovirale
Le virion (ou particule virale) de HIV-1 a une structure icosahédrique complexe d'environ 110 nanomètres de diamètre (Figure 1.3). Il est constitué d'une enveloppe externe, d'une matrice et d'une capside. Les composants du virion sont encodés par les trois gènes de structure gag,pol et em caractéristiques de tous les rétrovirus (voir section 1.3.).
L’enveloppe virale est composée d’une bicouche lipidique d’origine cellulaire dans laquelle sont insérées 72 spiculés constituées d’un trimère de la glycoprotéine transmembranaire gp41, attachée de manière non covalente à la glycoprotéine de surface gpl20. Ces deux glycoprotéines sont produites à partir d’ime glycoprotéine précurseur, la gpl60, codée par le gène env. Directement sous l’enveloppe, se trouve la matrice formée par la protéine pl7, l’un des produits du gène gag. Au centre de la particule est localisée la capside conique, constituée par la protéine p24, également produite à partir du gène gag. La capside contient le génome viral (deux molécules monocaténaires d'ARN existant sous forme d'un complexe ribonucléoprotéique contenant des protéines virales de structure p7 liées à l'ARN), ainsi que plusieurs protéines jouant un rôle catalytique important durant le cycle réplicatif de HIV-1. Il s’agit de la protéase virale pli, responsable de la maturation des précurseurs polyprotéiques viraux, de la transcriptase inverse p66/p51 et de l'intégrase p32, toutes trois codées par le gène viral pol. Les deux dernières enzymes interviennent lors des deux étapes essentielles et caractéristiques du cycle réplicatif des rétrovirus: la transcription inverse de l’ARN génomique viral en ADN bicaténaire et l’intégration subséquente de cet ADN dans le génome de la cellule hôte (revu dans Li et al., 1997; Wang et al., 2000b).
1.3. Le génome de HIV-1
Le génome diploïde de HlV-1 est constitué de deux molécules identiques d’ARN monocaténaire linéaire, de même polarité que les ARN messagers (+) et d’une longueur approximative de 9,7 kilobases. Dans chaque particule virale, ces deux molécules d’ARN génomique sont liées l’une à l’autre de manière non covalente et présentent les modifications
ARN du virion 5’ CAP
C
R U5
AAA3’
U3 R
LTR LTR
rrovirus
' H
...■
U3 R US U3 R US
5’ CAP
R US
Transcrit
AAA3’
U3 R
Figure 1.4: Comparaison des formes ARN et ADN du génome de HIV-1 (adapté deVogt, 1997).
post-transcriptionnelles classiques des ARNs messagers cellulaires, c’est-à-dire une structure CAP à l’extrémité 5’ et une extrémité 3’ polyadénylée (Figure 1.4).
Le génome de HIV-1 contient les gènes de structure classiques des rétro virus (gag, pol et env) qui codent pour des polyprotéines qui sont processées et assemblées en virions
(voir section 1.2.). Le génome de HIV-1 contient des cadres ouverts de lecture additionnels qui flanquent le gène env et encodent plusieurs protéines de régulation (Tat et Rev) et accessoires (Nef, Vpr, Vpu, Vif et Tev/Tnv) dont les fonctions sont reprises ci-dessous. Les régions codantes de cet ARN génomique sont bordées par des extrémités non- codantes contenant une courte répétition R (Repeat) présente aux deux extrémités ainsi que les régions U5 (Unique en 5’) et U3 (Unique en 3’) présentes respectivement aux extrémités 5’ et 3’ (revu dans Li et al., 1997) (Figure 1.4).
-Le gène tat encode la protéine /ran5-activatrice de la transcription Tat {trans-activator of transcription). Par liaison à une séquence enhancer d’ARN appelée TAR, Tat active très fortement l’initiation et l’élongation transcriptionnelles à partir du promoteur de HIV-1.
-Le gène rev encode la protéine de régulation post-transcriptionnelle Rev {régulation of virion protein) qui permet l’exportation nucléo-cytoplasmique des transcrits non- ou partiellement épissés.
En l’absence de Rev, la traduction des transcrits non-épissés et mono-épissés est inhibée par des séquences CRS (cw-acting repression sequence) présentes dans les gènes gag, pol et env du génome de HIV-1 (Figure I.5A). Ces séquences CRS agiraient comme des signaux de rétention nucléaire par un mécanisme encore inconnu. Par conséquent, seuls les ARNm multiplement épissés, qui codent pour les protéines régulatrices et accessoires et qui sont dépourvus de ces séquences, s'accumulent dans le cytoplasme et sont traduits en protéines.
Quand la protéine Rev est présente, elle se lie sous forme d'un multimère à une séquence d'ARN cible appelée RRE {Rev responsive element) qui forme une structure secondaire complexe et qui est localisée dans la région codante du gène env (Figure I.5A). L'action de Rev mène à l'accumulation des ARNm non épissés ou mono-épissés dans le cytoplasme où ils sont traduits pour former les protéines de stmcture du virion. Cependant, comme la concentration de Rev doit atteindre un seuil critique avant que ce /raw^-activateur ne soit fonctionnel, l'expression des transcrits non-épissés et mono-épissés est retardée par rapport à celle des transcrits multiplement épissés (Figure I.5A et I.5B). L'action régulatrice post- transcriptionnelle de Rev divise donc l'expression des ARNm de HIV-1 en deux phases temporelles: une phase précoce d'expression des gènes de régulation et des gènes accessoires.
A.
Phase précoce: faible concentration de Rev B. /fh---lyifl D Itat^
D rev—□ l—U vpu
1—^ à r-^
5l=l
ARNm tardifs
ARNm gag ARNm gag-pol ARNm vif ARNm vpr ARNm tat ARNm env/vpu
ARNm précoces
--- --- 1.4.7 --- --- --- 1.2.4.7
“ --- --- 1.3.4.7 --- --- 1.4A/4B.7 --- --- --- 1.2.4A/4B.7
— --- --- 1.3.4A/4B.7 --- 1.7 --- — --- 1.2.5.7
— — --- 1.3.5.7
Figure 1.5: (A) L’expression des ARNm de HIV-1 est divisée en deux phases temporelles en fonction de la concentration en protéine Rev (voir détails dans section 1.3.) (Kjems et Askjaer, 2000). (B) Organisation des exons et pattern d'épissage du virus HIV-1.
T, TAR; C, CRS; R, RRE. Le site donneur d'épissage majeur (SD) est représenté par un triangle, et les sites accepteurs d'épissage (SA) par des triangles inversés, fs indique le site de changement de cadre de lecture des ribosomes qui a lieu durant la traduction de l'ARNm gag-pol.
et une phase tardive d'expression des gènes de structure (revu dans Rabson et Graves, 1997;
(Kjems and Askjaer, 2000).
-Le gène nef encode la protéine myristylée Nef {négative factor), qui joue un rôle essentiel pour la propagation virale et la progression de la maladie in vivo. En effet. Nef peut augmenter le niveau des transcrits et ainsi augmenter la réplieation virale en affectant l’expression de certains facteurs de transcription tels que NFAT, NF-kB et AP-1 qui auront un effet positif sur l’expression des transcrits mais aussi sur l’activation des lymphocytes T (Marminen et al., 2000; Wang et al., 2000a). Nef régule négativement l’expression de molécules CD4 et des molécules du MHC {Major histocompatibility complex) de classe 1 (Levesque et al., 2004).
-Le gène vpr encode la protéine Vpr {virion protein R) pour laquelle plusieurs fonctions ont été proposées dont un rôle dans l’import nucléaire des complexes viraux de préintégration, l’arrêt de la croissance cellulaire en phase G2, la /raw^-activation de gènes cellulaires et l’induction de la différenciation cellulaire (Gummuluru and Emerman, 1999; Vanitharani et al., 2001). 11 a gaiement été montré que Vpr coopère avec Spl (Amini et al., 2004) et Tat (Sawaya et al.,2000) et recrute p300 (Kino et al., 2002).
-Le gène vif encode la protéine Vif {virion infectivity factor) qui augmente la maturation et l’infectivité des particules virales. La protéine Vif agit en inhibant l’action d’une protéine cellulaire appelée APOBEC3G (ou CEM15). Cette protéine de l’hôte APOBEC3G, encapsidée dans les particules virales, a pour action d’inhiber la réplication de HIV et aussi des autres rétrovirus. En effet, cette protéine change les cytosines en uraciles au moment de l’étape de rétrotranscription. Vif inhibe donc l’action de APOBEC3G en empêchant son encapsidation dans les particules virales et permet ainsi l’infection par HIV (revu dans Navarro and Landau, 2004).
-Le gène vpu encode la protéine Vpu {virion protein U). Cette protéine augmente l’efficacité de la production virale en facilitant la libération des particules virales hors de la cellule infectée. De plus, Vpu induit la dégradation dans le réticulum endoplasmique des molécules CD4 néo-synthétisées (Levesque et al., 2004).
-Le gène tev encode une protéine de fusion entre des portions de Tat, Env et Rev. Tev a in vitro des fonctions similaires à celles de Tat et Rev. En raison de sa très faible concentration, son rôle in vivo n’est pas clair.
Figure 1.6: Cycle de réplication de HIV-1.
1.4. Cycle réplicatif de HIV-1
On distingue deux phases majeures dans la réplication de HIV-1: une phase précoce d'établissement et une phase tardive d'expression (Figure 1.6) (revu dans Vogt, 1997, Li et al.,
1997; Wang et al., 2000b).
1.4.1. La phase d'établissement
L'infection par HIV-1 commence par la liaison de la glycoprotéine virale d'enveloppe gpl20 au récepteur cellulaire CD4 et ensuite, après un changement de conformation de la gpl20, à un co-récepteur aux chimiokines spécifique. Cette double reconnaissance libère le peptide de fusion N-terminal de la glycoprotéine transmembranaire gp41, induisant la fusion de l’enveloppe virale avec la membrane cellulaire et l’internalisation de la capside dans le cytoplasme de la cellule cible (Figure 1.6). HIV-1 utilise une variété de récepteurs aux chimiokines, dont les principaux sont CXCR4 (pour les isolats X4 et R5X4 à tropisme pour les cellules T) et CCR5 (pour les isolats R5 à tropisme pour les macrophages) (revu dans Pierson and Doms, 2003).
Une fois internalisée dans le cytoplasme, la capside virale migre jusqu’au noyau. Pendant la migration, l’ARN génomique viral est rétrotranscrit en ADN bicaténaire par la transcriptase inverse de HIV-1. Les longues répétitions terminales (LTRs) virales sont générées durant ce processus de rétrotranscription (Figure 1.4). Les LTRs sont divisés en trois régions appelées U3, R et U5 en raison de leur origine respective dans l'ARN génomique viral (Unique en 3', Répété aux deux extrémités et Unique en 5'). Après la rétrotranscription, l'ADN génomique rétroviral bicaténaire linéaire migre dans le noyau où il est intégré dans le génome cellulaire et appelé provirus. Cette intégration est médiée par les LTRs et par l'intégrase virale. Le provirus acquiert alors la même stabilité génétique et le même statut qu’un gène cellulaire, il est exprimé et répliqué grâce à la machinerie enzymatique de la eellule hôte. Le provirus peut être soit complètement silencieux (latence après intégration ou post-intégrationnelle), soit activement exprimé en nouveaux virions. La latence post-intégrationnelle résulte d’un blocage au niveau de la transcription.
De plus, dans certaines conditions, l'ADN viral peut rester de façon stable dans la cellule sous une forme linéaire non intégrée (latence avant intégration ou pré-intégrationnelle) (Brussel et al., 2004). La latence pré-intégrationnelle résulte d’une rétrotranscription incomplète et/ou d'une intégration inefficace. Ces deux formes d'infection latente par HIV-1
sont très probablement critiques pour la survie et la propagation de HIV-1, puisqu'elles permettent au virus d'échapper à l'élimination immune (Blankson et al., 2002; Pierson and Doms, 2003; Sharkey and Stevenson, 2001).
1.4.2. La phase d'expression
La seconde phase du cycle réplicatif de HIV-1, à savoir la production de nouveaux virions, n'est pas systématique et n'a lieu que dans une petite proportion des cellules infectées. En effet, l'expression des gènes viraux est déterminée au moins en partie par l'état de prolifération et d'activation cellulaire (section 3.1.). On parle, pour les cellules infectées qui ne produisent pas de virions, de latence pré- ou post-intégratioimelle (voir ci-dessus).
Après stimulation de la cellule infectée de manière latente par des signaux d'activation (tels que des antigènes ou d’autres stimuli extérieurs), le provirus est transcrit par l'ARN polymérase II (ARN pol II) cellulaire en molécules d'ARN, qui migrent vers le cytoplasme.
La transcription commence au premier nucléotide de la région R du LTR 5’ et se termine au dernier nucléotide de la région R du LTR 3’. Donc, malgré leur séquence nucléotidique identique, les deux LTRs ont des rôles fonctionnels différents. Le LTR 5’ se comporte comme im promoteur transcriptionnel et le LTR 3’ comme un site de polyadénylation. Une trentaine d'ARNm viraux distincts a été identifiée à ce jour dans les cellules infectées par HIV-1. Ces messagers sont générés à partir d'un transcrit primaire unique via un processus complexe d'épissage alternatif utilisant les quatre sites dormeurs et les six sites aecepteurs d'épissage présents dans le génome viral (Figure 1.5B). De plus, l'expression des protéines de HIV-1 exploite des cadres ouverts de lecture multiples et souvent chevauchants.
L'organisation des exons et le profil d'épissage sont illustrés à la figure I.5B. Ces transcrits servent soit d'ARNs messagers viraux traduits en protéines virales structurales ou enzymatiques, soit d'ARNs génomiques emballés dans les nouveaux virions (Figure 1.5A).
Après leur synthèse, les polyprotéines d'enveloppe sont modifiées par des enzymes cellulaires et les protéines résultantes sont transportées à la membrane cellulaire.
L'assemblage du virion immature a lieu à la surface interne de la membrane cellulaire où les polyprotéines Gag et Gag-Pol se sont agrégées. Deux moléeules d'ARN génomique s'associent à ces polyprotéines et sont encapsidées par un processus impliquant l'interaction spécifique d'un motif en doigts de zinc localisé dans le domaine p6 de Gag avec le signal d'emballage {packaging signal) localisé dans la région leader de l'ARN génomique viral.
Simultanément à l'assemblage du précurseur de la capside, le virus bourgeoime à la surface
7
externe de la cellule au niveau de structures appelées radeaux (rafts) (Ono and Freed, 2001), emportant avec lui un morceau de la bicouche lipidique dans laquelle sont insérées des molécules de la protéine virale d'enveloppe (Figure 1.6).
Pendant ou peu après le bourgeonnement, la protéase virale est activée et catalyse le clivage des polyprotéines Gag et Gag-Pol en protéines structurales individuelles, ce qui conduit à la formation du virion mature. Cette étape de maturation, qui implique des changements détectables de la morphologie du virion, est essentielle à l'infectivité virale (revu dans Vogt, 1997).
2. Régulation de la transcription chez les eucaryotes - Naissance d*un ARN messager
La deuxième partie de cette introduction décrit brièvement la régulation de la transcription des gènes de classe II chez les eucaryotes. Nous nous attacherons aussi au rôle de la structure chromatinienne. Cette revue ne prétend pas être exhaustive, ce qui est d’ailleurs pratiquement impossible dans un domaine aussi vaste et évoluant aussi rapidement, mais elle facilitera la compréhension du contrôle transcriptiormel de HIV-1 traité dans la troisième partie de l’introduction et faisant l’objet de cette thèse.
2.1. Les éléments essentiels à la transcription de base
La transcription d’un gène correspond à la première étape du processus d’expression d’im gène. In vivo, cette étape est régulée par des mécanismes complexes et dépend de nombreux éléments structuraux du noyau et de F ADN, ainsi que de nombreux autres facteurs qui seront décrits dans les sections qui suivent.
2.1.1. ADN et chromatine
2.1.1.1. L’ADN nucléaire est empaqueté sous forme de chromatine
Le génome des eucaryotes est condensé plus de 10^ fois en association avec les histones et les protéines chromosomiques non-histones sous forme de chromatine, ce qui permet un stockage efficace de l’information génétique (van Holde, 1989). Cependant, cet empaquetage
P a a a a m 3 S K K K K K
1 5 8 12 16 20 H4
H2A
m a mp a a a m
K KS K K K K
4 9 10 14 18 23 27
m K
36 H3
P a a
S K K
H2A
r a a a a
EK K K K
2 5 12 15 20
P P _S___ S
32 36 H2B
Figure 1.7: Organisation d’un nucléosome.
A. Représentation schématique d’un nucléosome vu du dessus. Un tétramère constitué de deux histones H3 et de deux histones H4, est flanqué de deux dimères H2A/H2B. Le deuxième dimère se trouve en dessous du tétramère. L’histone H1 est localisée en dehors du nucléosome, associée à l’ADN linker.
B. Représentation schématique du même nucléosome vu de face. Les queues amino-terminales des histones sont représentées.
C. Les modifications post-traductionnelles des queues amino-terminales des quatre histones du coeur sont indiquées: acétylation (a), phosphorylation (p), polyADP-ribosylation (r) et méthylation (m).
empêche également la machinerie transcriptionnelle d’accéder à l’ADN (revu dans Elgin et Workman, 2000).
L’unité structurale de hase de la chromatine est le nucléosome. Un nucléosome est constitué d’un segment d’ADN de 146 paires de bases (pb) enroulé 1,75 fois autour d’un octamère d’histones (contenant deux molécules de chacune des quatre histones du core nucléosomal:
H2A, H2B, H3 et H4) (Figure 1.7). Cet octamère d’histones est constitué d’im tétramère central (H3/H4)2 flanqué de deux dimères H2A/H2B (Arents et al., 1991; Arents and Moudrianakis, 1993; Richmond et al., 1984). Deux cores nucléosomaux adjacents sont séparés par une région d’ADN linker (14-44 pb). Une molécule unique d’histone H1 est associée à cet ADN linker (Zhou et al., 1998) (Figure 1.7A). Une particule sous- nucléosomale contenant le core nucléosomal, l’histone H1 et 168 pb d’ADN (c’est-à-dire le core nucléosomal et ~20 pb interagissant avec l’histone Hl) est appelée im chromatosome.
Durant ces 25 dernières armées, de nombreux détails de la structure nucléosomale ont été élucidés (revu dans Komberg and Lorch, 1999; Pruss et al., 1995). Ces découvertes ont culminé avec la détermination d'une structure cristallographique à haute résolution du core nucléosomal (Luger et al., 1997). Chaque histone du core possède deux domaines:
1) un domaine globulaire à l’extrémité carboxy (C)-terminale qui forme le core du nucléosome et qui est impliqué dans des interactions histone-histone et dans la liaison avec l’ADN ;
2) une queue basique chargée positivement à l’extrémité amino (N)-terminale pouvant potentiellement interagir avec des protéines non-histones et avec l’ADN chargé négativement.
Les queues amino-terminales des histones de l'octamère interagissent avec l'ADN par des interactions électrostatiques entre les acides aminés basiques chargés positivement de ces queues et le squelette phosphodiester de l'ADN chargé négativement. Ces queues sont les sites de multiples modifications post-traductionnelles covalentes telles que la méthylation, la phosphorylation, l’acétylation, l’ubiquitinylation, la sumoylation et la polyADP- ribosylation ; ces modifications pouvant modifier les interactions entre les queues amino
terminales des histones et l’ADN. Les quatre histones du core nucléosomal sont sujettes à l’acétylation réversible, et cette modification est la plus étudiée des modifications post- traductionnelles de la chromatine (revu dans Davie et Spencer, 1999; Wolffe and Hayes, 1999).
NRE NE1 (A) TATA
Figure 1.8: Stimulation de la transcription à partir du promoteur de la vitellogénine B1 par un nucléosome positionné de manière précise (Schild et al., 1993).
L’enroulement de l’ADN autour du nucléosome crée une boucle statique, qui facilite l’interaction du récepteur aux oestrogènes avec les facteurs de transcription présents dans le promoteur proximal (flèche noire), ce qui potentialiserait la transcription.
2.1.1.2. Le remodelage de la chromatine est essentiel à l’initiation de la transcription L’organisation de la chromatine dans les régions régulatrices eucaryotes est de plus en plus reconnue comme im facteur déterminant pour la régulation de l’initiation et de l’élongation transcriptiormelles in vivo. L’empaquetage de l’ADN en nucléosomes modifie fortement son accessibilité et sa conformation, et pourrait par conséquent interférer avec ces processus en modulant les interactions des facteurs de transcription avec les régions régulatrices des gènes (revu dans Elgin and Workman, 2000; Wolffe, 1998; Workman and Kingston, 1998).
De nombreuses études biochimiques et génétiques ont démontré que les protéines structurales de la chromatine jouent des rôles régulateurs spécifiques dans le processus de transcription.
D'une part, de multiples expériences in vivo et in vitro indiquent que les nucléosomes peuvent inhiber l'initiation de la transcription soit en entravant la formation des complexes d'initiation au niveau de la boîte TATA, soit en empêchant la liaison des facteurs de transcription régulateurs (revu dans Aalfs and Kingston, 2000; Elgin and Workman, 2000;
Workman and Kingston, 1998). De plus, des preuves directes en faveur du rôle inhibiteur des nucléosomes in vivo proviennent d'expériences génétiques sur la levure. Ces études ont montré que l'inhibition de l'expression du gène codant pour l'histone H3 ou H4 perturbe l'organisation nucléosomale et conduit à l'activation de plusieurs promoteurs normalement réprimés par leur organisation en chromatine (Han et al., 1988; Han and Grunstein, 1988). De plus, des études in vivo de la structure et de l’activité des gènes ont révélé que des changements dans l'organisation chromatinierme, comme le remodelage d'un ou plusieurs nucléosome(s), précèdent ou accompagnent l'activation transcriptioimelle dans plusieurs systèmes biologiques hautement inductibles (revu dans Smith et Peterson, 2004)
A l'opposé du rôle inhibiteur général des nucléosomes, des expériences ont rapporté un effet positif de la structure chromatinierme sur l'initiation de la transcription (Schild et al., 1993). Cette étude a démontré qu'un nucléosome positioimé de manière précise dans le promoteur du gène de la vitellogénine B1 génère une boucle statique, permettant ainsi la juxtaposition de sites de liaison distants et l'activation transcriptioimelle par le récepteur aux oestrogènes (Figure 1.8). Un tel modèle a également été proposé par Elgin (1988) pour l'activation du gène hsp26 de la drosophile. Ces résultats suggèrent que l'empaquetage de l'ADN sous forme de chromatine pourrait être nécessaire à l’activation transcriptioimelle à longue distance, telle que l’action des enhancers (voir section 2.2.1.).
L’ensemble de ces observations révèle un nouvel aspect de la régulation transcriptionnelle: la chromatine joue un rôle actif dans cette régulation en modulant la liaison et l’activité des facteurs de transcription (revu dans Elgin and Workman, 2000; Tyler and Kadonaga, 1999; Workman and Kingston, 1998).
2.1.1.3. La chromatine est hétérogène dans le noyau
De par ce rôle actif de la chromatine dans la régulation transcriptionnelle, il est important de remarquer que la chromatine est donc hétérogène dans le noyau: les gènes transcriptionnellement actifs sont caractérisés par une structure plus diffuse de la chromatine (chromatine active ou euchromatine), alors que les gènes inactifs sont empaquetés dans une configuration chromatinienne fortement condensée (chromatine inactive ou hétérochromatine) (Weintraub and Groudine, 1976).
La chromatine active est moins compacte et donc définie par une sensibilité générale aux nucléases dix fois plus élevée que celle de la chromatine inactive. Cette sensibilité s’étend généralement sur plusieurs kb de part et d’autre du gène potentiellement actif ou activement transcrit. Les causes précises de cette sensibilité généralisée de l’euchromatine ne sont pas connues. Cependant, le contenu plus élevé en histones acétylées et en certaines protéines chromosomiques non-histones, ainsi que l'instabilité accrue des dimères H2A/H2B et l’hypométhylation relative de l’ADN dans les gènes actifs pourraient être impliqués dans ce processus.
Certaines régions de la chromatine active présentent une hypersensibilité aux nucléases (régions 100 fois plus sensibles à la digestion par les nucléases que la chromatine inactive).
Ces sites hypersensibles (s’étendant sur 100-200 pb), localisés dans les régions de sensibilité généralisée, correspondent en général aux régions cw-régulatrices des gènes actifs telles que des promoteurs, des enhancers, des UASs (Upstream Actîvating Sequence chez la levure), des silencers, des terminateurs, des loci de recombinaison, des télomères et des centromères (Gross and Garrard, 1988). De tels sites hypersensibles aux nucléases in vivo sont probablement dus au déplacement ou à l’altération locale de la structure nucléosomale par des facteurs de transcription liés à l’ADN. Dans certains systèmes, des variations dans la sensibilité d'un site hypersensible particulier précèdent ou accompagnent l'activation ou la répression des gènes, ce qui renforce la corrélation entre ces sites et la régulation génique.
Afin que la machinerie transcriptionnelle puisse accéder à l’ADN, la structure compactée de la chromatine doit être altérée. Les cellules eucaryotes ont développé au moins
11
■"NH3
I CH2
I CH2
I CH2
I CH2
I -N-C-C-
I I II H H O
CH3
I
c=o
I S
Coenzyme AI
SH I
Coenzyme A
acétyltransférases
désacétylases CH3
I C=0
I OH
trichostatine A
T
acide valproïque butyrate de sodium
trapoxine
H2O
CH3
I
c=o
I NH
I
CH2
I
CH2
I
CH2
I
CH2
I _N-C-C-
I I II H H O
Figure 1.9: Le niveau d’acétylation des résidus lysines des protéines acétylables résulte d’une compétition entre deux familles d’enzymes: les acétyltransférases et les désacétylases. La trichostatine A, l’acide valproïque, le butyrate de sodium et la trapoxine sont des inhibiteurs de désacétylases.
deux mécanismes généraux permettant un remodelage de la structure chromatinienne ; ces mécanismes sont basés sur l’utilisation de complexes enzymatiques altérant le reploiement, la fluidité ou la structure de base de la chromatine (revu dans Jones and Kadonaga, 2000;
WolfTe and Guschin, 2000).
Le premier de ces mécanismes implique l’altération de la structure chromatinienne par l’action directe et ATP-dépendante de complexes de remodelage, ces derniers parcourant efficacement les brins d’ADN tout en distordant les structures nucléosomales rencontrées sur leur passage grâce à leur activité hélicase intrinsèque (Pazin and Kadonaga, 1997). Plusieurs complexes de remodelage ont été purifiés à partir de différents organismes :
les complexes SWI/SNF (mating-type SWItchîng/Sucrose Non-Fermenting) et RSC (Remodels the Structure of Chromatin) chez la levure ;
les complexes NURF (NUcleosome Remodeling Factor), CHRAC (CHRomatin Accessihility Complex), ACF {ATP-utilizing, Chromatin assembly and remodeling Factor) et Brahma chez la drosophile ;
le complexe SWI/SNF chez l’homme (revu dans Aalfs and Kingston, 2000;
Kadonaga, 1998; Struhl, 1999; Tsukiyama and Wu, 1997; Varga-Weisz and Becker, 1998).
Le second mécanisme fait intervenir un ensemble de modifications post- traductionnelles des constituants de la chromatine (revu dans Cheimg et al., 2000; Grunstein,
1997; Strahl and Allis, 2000), en particulier l’acétylation des histones.
Depuis plus de quarante ans, des corrélations ont été établies entre le niveau d’acétylation des histones et l’activité transcriptionnelle des gènes (Allirey et al., 1964). Les mécanismes moléculaires engagés dans un tel processus ont été élucidés il y a seulement quelques années (Davie, 1998; Gregory et al., 2001; Komberg and Lorch, 1999; Roth et al., 2001; Strahl and Allis, 2000).
Les queues amino-terminales des quatre histones du core nucléosomal contiennent des résidus lysines susceptibles d’être acétylés de manière réversible. La réaction d’acétylation consiste en un transfert du groupement acétyl de l’acétylcoenzyme A (AcetylCoA) sur le groupement s-amino de la lysine, neutralisant ainsi sa charge positive (Figure 1.9). Le niveau d’acétylation de chaque lysine résulte d’ime compétition entre deux familles d’enzymes: les histone-désacétylases (HDACs) et les histone-acétyltransférases (HATs). Une première hypothèse quant au rôle de l’acétylation des histones dans la régulation transcriptionnelle consiste à penser qu’une augmentation du niveau d’acétylation diminue les interactions
12
Figure I.IO: Deux modèles non mutuellement exclusifs de modification du recrutement des facteurs de transcription (FT) suite à l’acétylation des queues amino-terminales des histones.
A. Les queues hypoacétylées, chargées positivement, interagissent avec l’ADN chargé négativement et restreignent stériquement l’accès à l’ADN. L’hyperacétylation neutralise la charge positive et lève cette restriction.
B. Les queues hypoacétylées, chargées positivement, interagissent avec certains facteurs de transcription chargés négativement. L’hyperacétylation de ces queues réduit les interactions avec les facteurs chargés
