Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository
Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:
Molle, L. (1956). Recherches sur l'extraction électrodialytique (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté de Médecine – Médecine, Bruxelles.
Disponible à / Available at permalink : https://dipot.ulb.ac.be/dspace/bitstream/2013/215730/1/051c3c6b-4016-415a-8e70-4ccfa10e1276.txt
(English version below)
Cette thèse de doctorat a été numérisée par l’Université libre de Bruxelles. L’auteur qui s’opposerait à sa mise en ligne dans DI-fusion est invité à prendre contact avec l’Université ([email protected]).
Dans le cas où une version électronique native de la thèse existe, l’Université ne peut garantir que la présente version numérisée soit identique à la version électronique native, ni qu’elle soit la version officielle définitive de la thèse.
DI-fusion, le Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles, recueille la production scientifique de l’Université, mise à disposition en libre accès autant que possible. Les œuvres accessibles dans DI-fusion sont protégées par la législation belge relative aux droits d'auteur et aux droits voisins. Toute personne peut, sans avoir à demander l’autorisation de l’auteur ou de l’ayant-droit, à des fins d’usage privé ou à des fins d’illustration de l’enseignement ou de recherche scientifique, dans la mesure justifiée par le but non lucratif poursuivi, lire, télécharger ou reproduire sur papier ou sur tout autre support, les articles ou des fragments d’autres œuvres, disponibles dans DI-fusion, pour autant que :
Le nom des auteurs, le titre et la référence bibliographique complète soient cités; L’identifiant unique attribué aux métadonnées dans DI-fusion (permalink) soit indiqué; Le contenu ne soit pas modifié.
L’œuvre ne peut être stockée dans une autre base de données dans le but d’y donner accès ; l’identifiant unique (permalink) indiqué ci-dessus doit toujours être utilisé pour donner accès à l’œuvre. Toute autre utilisation non mentionnée ci-dessus nécessite l’autorisation de l’auteur de l’œuvre ou de l’ayant droit.
--- English Version ---
This Ph.D. thesis has been digitized by Université libre de Bruxelles. The author who would disagree on its online availability in DI-fusion is invited to contact the University ([email protected]).
If a native electronic version of the thesis exists, the University can guarantee neither that the present digitized version is identical to the native electronic version, nor that it is the definitive official version of the thesis.
DI-fusion is the Institutional Repository of Université libre de Bruxelles; it collects the research output of the University, available on open access as much as possible. The works included in DI-fusion are protected by the Belgian legislation relating to authors’ rights and neighbouring rights. Any user may, without prior permission from the authors or copyright owners, for private usage or for educational or scientific research purposes, to the extent justified by the non-profit activity, read, download or reproduce on paper or on any other media, the articles or fragments of other works, available in DI-fusion, provided:
The authors, title and full bibliographic details are credited in any copy;
The unique identifier (permalink) for the original metadata page in DI-fusion is indicated; The content is not changed in any way.
It is not permitted to store the work in another database in order to provide access to it; the unique identifier (permalink) indicated above must always be used to provide access to the work. Any other use not mentioned above requires the authors’ or copyright owners’ permission.
■f
L. MOLLE
Recherches
sur l'extraction électrodlalytique
APPLICATIONS AUX SCIENCES PHARMACEUTIQUES
Université Libre de Bruxelles
Laboratoire de Chimie analytique et toxicologique (Professeur L. Maricq)
Laboratoire de Pharmacodynamie et de Thérapeutique (Professeur j. La Barre)
LES EDITIONS «ACTA MEDICA BELCICA »
43, rue des Champs-ElyséesI. La spectrométrie de diffraction des rayons X permet l’identification de sulfamidés dans les comprimés.
II. L’utilisation de trois méthodes physiques, à savoir ; l’analyse thermique différentielle, l’analyse thermogravimétrique différentielle et la spectrométrie de diffraction des rayons X, alliées à l’analyse chimi que, pourrait contribuer à élucider la composition du sous-nitrate de bismuth de la pharmacopée belge IV.
Recherches
Recherches
sur Textraction électrodialytique
APPLICATIONS AUX SCIENCES PHARMACEUTIQUES
Université Libre de Bruxelles
Laboratoire de Chimie analytique et toxicologique (Professeur L. Maricq)
Laboratoire de Pharmacodynamie et de Thérapeutique (Professeur J. La Barre)
*
LES EDITIONS «ACTA MEDICA BELCICA »
43, rue des Champs-ElyséesSOMMAIRE
Introduction.
But du travail... 7
PREMIERE PARTIE Chapitre premier. ■— Applications de Vélectrodialyse... 9
A. Purifications électrodialytiques... 10
B. Extractions électrodialytiques... 11
Cii.tP.i.TRE II. — Dispositif d’électrodialyse... 14
1. Appareil de Fabre... 14
2. Appareil de Maricq-Rochat... 15
3. Présentation d'un nouvel électrodialyseur... 19
Chapitre III. — Influence de divers facteurs sur le comportement électro-dialytique des ions...-26
DEUXIEME PARTIE Chapitre premier. — Applications à l'analyse toxicologique... 33
A. Introduction. Travaux antérieurs... 33
B. L'électrodialyse, méthode générale d'analyse toxicologique ... 34
C. Partie expérimentale... 40
I. Electrodialyse de quelques cations toxiques... 44
Amphétamine... 74 Dolosal... 75 Aconitinc... 77 Cadmium... 80 Thallium... 85 Zinc... 86
II. Electrodialyse de quelques unions toxiques :... 87
Véronal... 87
Gardénal... 89
Cantharidine... 91
D. Conclusions... 93
Chapitre II. — Applications à la recherche de quelques antiseptiques dans les denrées alimentaires... 106
Acide salicylique... 107
Acide benzoïque ... ... 108
Acide cinnamique...108
Acide para-chlorobenzoïque... 109
Esters de l'acide para-oxybenzoïque... 109
Autres antiseptiques... 110
Addendum : Recherche de la saccharine . . . . • . . . 111
Chapitre III. — Applications à l’analyse des médicaments. . . . 113
Travaux antérieurs...113
A. Recherche qualitative de traces d'alcaloïdes de la belladone dans une poudre...114
B. Extraction quantitative d'alcaloïdes à partir de sirops: . . . 115
1. Strychnine...116
2. Dionine... 117
3. Codéine...118
C. Extraction quantitative de principes actifs à partir de suppositoires : 121 1. Quinine... 121
2. Acide phényléthylbarbiturique...122
D. Extraction quantitative d'alcaloïdes à partir de comprimés et de pilules 123 Conclusions... 124
Chapitre IV. — Applications à l'extraction des alcaloïdes des drogues végé tales. ...127 Travaux antérieurs... 127 A. Alcaloïdes du quinquina...129 B. Alcaloïdes de la belladone...137 C. Alcaloïdes de l'ipéca...143 D. Alcaloïdes de la cévadille...145 E. Alcaloïdes du Rauwolfla... 147 Conclusions... 150
Eésumé et conclusions générales...153
INTRODUCTION
La dialyse simple, découverte en 1861 par Th. Graham (1), consti tuait une méthode nouvelle de purification et d’analyse, dont les nom breuses applications sont toujours d’actualité, aussi bien dans l'industrie qu’au laboratoire. Cependant, ce procédé étant assez lent, les cher cheurs ne tardèrent pas à superposer l’électrolyse à la dialyse, et à donner ainsi naissance à l’électrodialyse.
Suivant Prausnitz et Reitsttôter (2), c’est à Maigrot et Sabates, en 1889, que l’on doit le premier électrodialyseur, destiné à purifier le sirop de sucre, tandis que le terme « électrodialyse » est employé pour la première fois par Kollrepp et Wohl.
Les premières expériences essentiellement scientifiques sur l’électro- dialyse ont été publiées en 1903 par Morse et Pierce (3): ces auteurs soumettent une solution de gélatine, limitée par deux membranes de parchemin, à une différence de potentiel de 500 volts, dans le but d’éliminer les impuretés ioniques. Peu après, Tribot et Chrétien (4) utilisaient le même procédé pour éliminer les ions chlorures d’un hydrate de fer colloïdal. Ch Dhéré et M. Gorgolewski (5) ont repris les travaux de Morse et Pierce sur la purification de la gélatine, et ont également obtenu par dialyse électrique un sérum de cheval extrême ment appauvri en électrolytes.
Il convient aussi de signaler les importants travaux de W. Pauli (6): les recherches de ce dernier concernent surtout la purification des corps albuminoïdiques en suspension dans l’eau, de la caséine, des glo bulines, des hydrates de carbone, des matières colorantes et des col loïdes inorganiques.
L’importance considérable que l’on accorde actuellement aux tech niques électrodialytiques est due aussi aux travaux de nombreux autres chercheurs parmi lesquels Ettisch, Bechhold, Reitsttôter, etc.
l'extraction et l’isolement des électrolytes. Les recherches qui suivent ont pour objet principal de démontrer l’intérêt que présentent les extrac tions électrodialytiques appliquées à divers domaines des sciences phar maceutiques.
Dans la première partie de ce travail, nous présentons, après un bref historique, un nouveau dispositif d'électrodialyse, permettant de mener à bien les buts proposés : nous y avons, en outre, exposé quelques con sidérations physico-chimiques de ce phénomène.
C’est dans la seconde partie que nous avons voulu mettre en évidence les nombreuses possibilités d’application de l’électrodialyse à l'extrac tion de substances médicamenteuses ou toxiques à partir de milieux complexes. Dans le domaine toxicologique, notamment, cette technique constitue une méthode de choix pour l’isolement de nombreux poisons organiques et minéraux à partir de milieux viscéraux.
Les problèmes de l’extraction des antiseptiques des denrées alimen taires, ainsi que de l’isolement des principes actifs à partir de formes médicamenteuses diverses, par le même procédé de dialyse électrique, ont également fait l’objet de nos recherches.
Enfin, nous avons insisté sur l’intérêt de l’emploi d’une telle méthode dans la séparation des principes actifs, notamment des alcaloïdes, à partir de poudres végétales.
* ♦ ♦
A notre maître, M. le Professeur L. Maricq, qui, au cours de ce travail, nous a prodigué ses conseils éclairés et ses encouragements bienveillants, nous adressons nos sentiments de profonde gratitude. Qu’il veuille bien recevoir ici l’hommage de notre reconnaissance et de notre respectueux attachement.
PREMIÈRE PARTIE
CHAPITRE I
Applications de l’électrodialyse
Sous sa forme la plus rudimentaire, un électrodialyseur consiste en un vase séparé en trois compartiments A, M et C, par des membranes semi-perméables (fig. 1). Dans les compartiments A et C, appelés res pectivement compartiment anodique et compartiment cathodique,
pion-Fig. 1. — Principe d’un électrodialyseur.
gent les électrodes positive et négative, reliées à une source de courant continu V, de tension appropriée. La cellule centrale M contient la matière à électrodialyser, en solution ou en suspension dans l’eau, tandis que C et A renferment de l’eau distillée. Sous l’effet du champ électri que, les cations et les anions sortiront du compartiment central pour se diriger vers les cellules cathodique et anodique. Les non-électrolytes resteront dans le compartiment médian et ne se répandront dans les compartiments terminaux qu’avec une vitesse très réduite, en subissant la dialyse simple.
Avant d’aborder nos expériences personnelles et afin de les situer dans le vaste domaine des applications de l’électrodialyse. il nous paraît utile de jeter un rapide coup d’œil sur les problèmes que ce pro cédé a permis de résoudre jusqu’à présent.
A. — PurificaMons électrodialyfiques
C’est surtout vers la purification de nombreuses substances que les recherches sur l’électrodialyse se sont orientées, et les travaux basés sur ce principe sont d’une ampleur telle que nous nous bornerons ici à commenter brièvement les diverses applications. Nous nous permet trons toutefois de renvoyer le lecteur, que le sujet intéresse, à deux excellents ouvrages sur l’électrodialyse, qui rapportent une abondante littérature (2, 7).
1° Les protéines et les sérums. — L’utilisation de nombreux produits biologiques comme les antitoxines, les globulines, etc. nécessite une élimination des électrolytes, ajoutés au cours de la préparation. L’élec trodialyse s’est révélée un procédé de choix pour la purification de ces substances, surtout lorsqu’on a pu réaliser des appareils qui permet taient de travailler en milieu parfaitement stérile. Aussi cette technique a-t-elle été utilisée avec succès dans la préparation des sérums, notam ment des sérums antityphique, antitétanique et antidiphtérique.
De nombreuses protéines ont été purifiées au moyen de ce procédé soit en vue de leur utilisation, soit dans le but d’étudier leurs propriétés physico-chimiques. Déjà en 1913, un travail de Locke et Hirsch (8) permettait d’espérer une application industrielle et commode de l’élec- trodialyse au fractionnement de l’insuline protéine. Plus tard, d’autres auteurs se sont attachés au même problème, et ont démontré que ce procédé constitue une excellente méthode de purification de ce médi cament important.
2“ Les ferments. — A la suite des travaux de Dhéré sur l’électrodia- lyse, Lisbonne et Vulquin ont appliqué cette technique à la purification de la maltase : ils obtiennent un produit déminéralisé, mais dépourvu d’activité enzymatique ; toutefois, cette activité est restituée par addi tion subséquente de certains sels. Cette question fut reprise d’une façon approfondie par Frick et ses collaborateurs qui obtiennent finalement une maltase contenant 0,05 % de cendres et dont le pouvoir enzyma tique est sextuplé. La trypsine et l’invertine ont été purifiées de manière analogue.
RECHERCHES SUR l’eXTRACTION ÉLECTRODIALYTIOl’E H amidons, de l’agar-agar, du glycogène, etc C’est également le même principe que l’on utilise pour déminéraliser les matières pectiques, les solutions de saponines, les solutions d’acide humique, les sirops de sucre, etc.
4° Les colloïdes minéraux. — L’électrodialyse constitue un procédé très efficace pour éliminer les électrolytes adsorbés par les précipités gélatineux au cours de leur préparation. L’hydroxyde d’aluminium, l’hydroxyde de chrome, l’hydroxyde de zinc et l’hydroxyde de béryl lium ont été purifiés de cette manière. La même technique convient parfaitement pour la déminéralisation des solutions colloïdales en géné ral, comme les sols d'or, d’argent, et d’acide silicique.
5° Purifications diverses. — Dans bien d’autres domaines encore, la dialyse électrique a été utilisée comme moyen de purification ; citons la purification des alcalo'ïdes en dispersion micellaire (9), l’épuration des eaux et l’élimination des électrolytes des extraits de plantes (10). On fait également appel à l’électrodialyse pour la préparation de la poudre de lait déchlorurée, de la caséine et du lactose (11). Récem ment, ce procédé a été appliqué à la purification des antibiotiques par Fischbach (12) : cet auteur a traité un échantillon de streptomycine fortement souillé de pyrogènes. Par des filtrations répétées sur un filtre de Seitz, la majeure partie des pyrogènes est enlevée. Finalement, la substance est électrodialysée dans des conditions aseptiques bien déterminées. Le produit final est pratiquement apyrogène. Ce cher cheur a également étudié la bacitracine par la même méthode.
B. — Extractions électrodialytiques
Alors que, dans le domaine de la purification, l’électrodialyse a pris rapidement une grande importance, tant dans l’industrie qu’au labora toire, il semble que l’application d’un tel procédé à l'extraction et à l’isolement des électrolytes n’ait pas retenu immédiatement l’attention des chercheurs.
chercheurs, parmi lesquels Bearnhard et Beaver (16), Ettisch et ses collaborateurs (17), Benedetto (18) et Oldfeldt (19).
Les travaux de Macgregor et Thorpe (20) sur l’extraction quanti tative de l’histamine des tissus démontrent clairement la supériorité de l’électrodialyse sur les autres méthodes : le produit extrait est d’une pureté plus grande et le procédé est simplifié. C’est toujours suivant le même principe que d’autres bases, comme la carnosine, la créatine et la créatinine, ont été extraites des milieux biologiques par Séverin (21) et par Shershnev (22). Citons encore, dans ce domaine, le dosage des acides amino-basiques, réalisé en 1940 par Albanese (23).
2“ Analyse toxicologique. — Les premiers essais d’application de l’électrodialyse à l’analyse toxicologique sont dus à R. Fabre et à ses collaborateurs : S. Bazille, J. Tabone et P. Oficjalski (24 à 29). Parmi les toxiques que ces auteurs parviennent à extraire d’une bouillie viscé rale par ce procédé, nous trouvons : les fluorures, l’arsenic, quelques alcaloïdes, des dérivés barbituriques et divers cations minéraux. Cette étude fut reprise et perfectionnée par la suite, par L. Maricq et F. Ro- chat (30 à 32).
Signalons encore les recherches de Callegari relatives à l’électro phorèse des infusions de quinquina, de belladone et de digitale, et à la détection du cuivre dans les milieux biologiques (33).
3° Analyse des sols. — L’électrodialyse a été largement utilisée dans le domaine de l’agriculture pour l’analyse des terrains. Wilson (34), notamment, a étudié un terrain acide en le traitant par du carbonate calcique ; le calcium ayant réagi est ensuite dosé par extraction électro- dialytique. Plus tard, Lôddesol (35) présente un électrodialyseur ori ginal, destiné à l’analyse des sols : par évaluation de l’alcalinité libérée à la cathode et de l’acidité libérée à l’anode, il lui est possible de définir la richesse d’un sol, beaucoup plus rapidement que par l’analyse chimique habituelle.
4° Extraction des alcaloïdes à partir des plantes. — J. Tabone (26) a également tenté d’appliquer la technique d’extraction électrodialy- tique à l’isolement de la strychnine et de la brucine au départ de 10 g de noix vomique. Babitsch (36), en 1947, utilisant un électrodialyseur à trois compartiments, a extrait les alcaloïdes de toute une série de plantes médicamenteuses ; dans tous les cas, il opère sur 5 g de matière première. Une tentative plus importante a été réalisée par Ginzburg et Gavrilov (37) qui réussissent à préparer un « électro-opium » à partir de capsules de pavot.
RECHERCHES SUR L’EXTRACTION ÉLECTRODIALYTIQUE 13 concernant l’extraction des alcaloïdes de la cévadille, du vérâtre, du quinquina et de l'ipéca. Nous reviendrons sur ces recherches, dans le chapitre que nous avons réservé à ce sujet (p. 127).
5° Applications diverses. — Les travaux de R. Fabre et P. Oficjalski concernent aussi l’analyse des médicaments (28) et spécialement l’ex traction analytique des alcaloïdes du quinquina et des strychnées de différentes formes pharmaceutiques.
Babitsch (36), Auterhoflf et Kraft (38 à dO) ont étudié les potentiels de décomposition de nombreux alcaloïdes, espérant ainsi arriver à une séparation quantitative de plusieurs alcaloïdes en mélange. A notre connaissance, ces travaux n’ont pas abouti, du moins en ce qui concerne l’électrodialyse. Ces auteurs ont proposé cette méthode pour l’isolement des principes actifs des médicaments (voir pp. 113 et 124).
Dans un manuel, traitant de l’analyse quantitative organique, publié en 1949, Siggia (41) réserve quelques pages à l’électrodialyse : « Cette méthode, dit-il, peut être appliquée à la séparation des molécules orga niques chargées électriquement, des molécules organiques neutres ; elle peut également être utilisée pour le dosage des sels inorganiques dans des substances organiques. » Cependant, suivant cet auteur, il existe des restrictions dans les deux cas.
Telles sont les principales applications de l’électrodialyse. Il nous a semblé qu’un tel procédé, et notamment l’extraction électrodialytique, pouvait rendre de précieux services dans divers domaines des sciences pharmaceutiques. C’est ce que nous tenterons de démontrer au cours de ce présent travail. Nous avons étudié, entre autres, l’application de l’électrodialyse :
1° A l’analyse toxicologique;
2° A l’analyse des denrées alimentaires ;
3° A l’analyse des médicaments ;
CHAPITRE II
Dispositif d’électrodialyse
Parmi les nombreux types d’appareils décrits dans la littérature, deux électrodialyseurs, de conception d’ailleurs toute différente, ont surtout retenu notre attention : celui de R. Fabre et celui de Maricq- Rochat.
Fig. 2. — D’après J, Tabone.
RECHERCHES SUR l’EXTRACTION ÉLECïRODIALVTIQUE 15 est assurée par un courant d’eau froide passant à l’intérieur des tubes en verre R, sur lesquels reposent les compartiments C et E.
Si, au moyen d’un tel dispositif, Fabre et ses collaborateurs parvien nent à extraire des corps minéraux et organiques, il n’en est plus de même lorsque, parmi ces derniers, ils s’adressent à des molécules plus altérables comme la morphine, la cocaïne et les alcaloïdes de l’ergot : ces derniers ne sont même plus décelables qualitativement. L’isolement de certaines substances, et notamment des alcaloïdes, se révélait donc assez malaisé par l’électrodialyseur de Fabre.
Ce délicat problème fut résolu, en 1940, par L. Maricq et F. Rochat, qui présentèrent un nouveau type d’électrodialyseur à compartiments intermédiaires et à extraction continue (30 à 32). L’appareil se com
vue. » « Les feuilles de cellophane sont fixées par des manchons de caoutchouc, qui servent également à maintenir assemblés l’un contre l’autre les quatre éléments de l’électrodialyseur. »
Des réfrigérants plongent dans les compartiments cathodique et anodique, et tout l’appareil se trouve placé dans un bac métallique alimenté en eau froide par le dernier réfrigérant. Les électrodes sont formées de fils de platine enroulés autour du réfrigérant ou disposés en boucle dans le liquide.
Entre autres avantages, ce nouvel appareil, grâce à son compartiment intermédiaire et son extraction continue, donne surtout la possibilité de capter un cation organique, par exemple un alcaloïde, au fur et à mesure de son passage, et d’éviter ainsi un contact nuisible avec la cathode. Il en est de même dans le cas d’un anion organique, qui, retenu dans le solvant de l’intermédiaire anodique, n’est pas altéré par l’oxydation anodique. C’est ainsi que L. Maricq et F. Rochat réussis sent là où R. Fabre avait échoué : ils parviennent à extraire, de milieux complexes, la cocaïne, la morphine et d’autres alcaloïdes, et obtiennent ces produits sous forme cristallisée.
♦ ♦
Nous avons donc adopté, pour nos premières expériences, le nouveau dispositif préconisé par Maricq et Rochat. Reprenant leurs travaux, et étudiant plus particulièrement la strychnine, alcaloïde se prêtant très bien à l’électrodialyse, nous n’avons pu que confirmer les résultats obtenus par ces auteurs. Toutefois, dans la pratique, l’appareil ainsi conçu ne répondait pas aux exigences que demandait notre travail. En effet :
1“ La petite capacité des compartiments de l’électrodialyseur ne permet pas d’opérer sur un poids de matière assez élevé : or, un des avantages du procédé est de pouvoir isoler des quantités minimes d’une substance disséminée dans une grande masse. C’est ainsi qu’en toxi cologie, par exemple, l’appareil Maricq-Rochat ne peut contenir qu’un maximum de 150 g de matière viscérale.
2“ La manipulation de l’appareil n’est guère aisée, notamment en ce qui concerne la vidange des différents compartiments.
sou-RECHERCHES SUR L’eXTRACTION ÉLECTRODIALYÏigUE 17 vent un courant « vagabond » se propageant dans le bac du refroi- disseur.
4” Cet appareil ne résout pas une question importante qui se pose lors de l’électrodialyse des milieux biologiques : le colmatage des mem branes. Nous avons observé, après chaque opération effectuée, au moyen de ce dispositif, sur une bouillie viscérale, un dépôt très adhé rent et très intense, surtout sur la membrane cathodique.
Colmatage des membranes. — Dans la thèse qu'il a publiée en 1936 (26), Tabone étudie cette importante question et attribue ce phénomène, qui retarde considérablement la bonne marche de l'opéra tion, aux protéines : suivant cet auteur, on peut considérer ces dernières « comme de gros ions qui, suivant le pH du milieu, se comportent soit comme des anions, soit comme des cations II est donc naturel, {x>ur- suit-il, de supposer que, sous l'action du courant électrique, les ions protéines subissent le tAnsport électrique au même titre que les ions des électrolytes du liquide intramicellaire. Mais, tandis que ceux-ci fran chissent la membrane de cellophane, ceux-là sont arrêtés à ce niveau. Il est facile de concevoir que, sollicitées par le champ électrique, ces protéines vont s'engager dans les pores de la membrane, diminuant ainsi la perméabilité de la cellophane employée ». Tabone cherche à remédier à cet inconvénient de plusieurs manières :
1“ En amenant le milieu biologique au pH correspondant au point iso-électrique des protéines qu'il renferme. Mais, comme les nombreuses protéines qu'on trouve dans les milieux biologiques ne possèdent pas le même point iso-électrique, et comme, d'autre-part, le pH de la cel lule centrale évolue constamment, il aboutit à un échec.
2° En donnant à la membrane une plus grande surface, les résultats qu'il obtient ne sont guère satisfaisants. Nous développerons ce point un peu plus loin (p. 18).
3° En introduisant dans le compartiment central un poids plus petit de substance à électrodialyser, il parvient à réduire le colmatage dans une certaine mesure. Mais cette solution diminue grandement les pos sibilités de l'appareil.
4° En faisant passer un courant de gaz carbonique sur la membrane légèrement inclinée, il parvient à un décapage partiel de la membrane.
ne nécessitait pas de transvasements, parfois désagréables, de matière et un démontage du dispositif.
Dans sa thèse, Rochat (31) parle également d’un colmatage impor tant, s’effectuant sur la cellophane située du côté cathodique. Il essaie de combattre cette difficulté de deux façons : 1“ par agitation méca nique : 2° par addition d’alcool éthylique à concurrence de 40 % en poids de la purée viscérale, ce qui précipite une grande partie des protéines.
Outre la diminution de l’ionisation du milieu, qui retarde nécessaire ment le transport des ions, cette seconde manière d’agir présente encore un grave inconvénient : l’alcool, passant en partie par dialyse simple dans le compartiment intermédiaire, l’extraction par le solvant employé risque de devenir incomplète.
De tous ces procédés, deux d’entre eux nous semblent intéressants : l’agitation mécanique et l’augmentation de la surface des membranes.
Une agitation mécanique convenable, effectuée de préférence au voi sinage de la membrane cathodique, diminue déjà un peu le colmatage : elle agit à peu près comme un courant de gaz qui frôlerait la mem brane. Les protéines ont à peine le temps de se déposer qu’elles sont « arrachées » par une bonne agitation du milieu.
Pour diminuer le colmatage, Tabone cherche à donner à la mem brane une très grande surface. Pour ce faire, il utilise un dispositif spé cial : « un vase cylindrique de 20 cm de hauteur constitue le récipient extérieur. Sur les bords de ce dernier reposent deux cylindres de dia mètres légèrement différents et tous deux également courts. Sur chacun de ces cylindres, sont appliqués, au moyen d’une ficelle, les bords d’un sac de cellophane obtenu en plissant la membrane contre un cylindre de diamètre convenable ; la hauteur du sac cathodique est légèrement plus petite que celle du vase extérieur ; le sac anodique est notablement plus petit. Les électrodes sont constituées, l’une, la cathode, par une plaque circulaire, l’autre par une lame rectangulaire ». L’auteur attribue son échec à une distribution très peu homogène des lignes de force et à un manque de brassage du compartiment médian.
RECHERCHES SUR L’EXTRACTION ÉLECTRODIALYTIQUE 19 à des lois très complexes que Manegold (43) a tenté de mettre en équation : — dCe = --- (it*—D)c,.A L 96.500 dt. où Ce i 96.500 A:* D A la concentration de l'électrolyte ; le volume initial du dialysat ; intensité du courant ;
quantité d’électricité nécessaire au transport d’un équi valent-gramme ;
le coefFicient de perméabilité de la membrane ;
un facteur connu de la diffusion de l’eau à travers la membrane ;
la surface de la membrane ; le temps
On voit que l’accroissement de la surface des membranes influence favorablement l’opération électrodialytique. En outre, l’examen de l’équation montre que l’efficacité de la dialyse électrique peut être augmentée : 1“ par élévation de l’intensité du courant électrique: 2“ par allongement de la durée de l’opération.
Il est évident que d’autres facteurs interviennent : notamment, les propriétés du corps à électrodialyser, la nature et l’épaisseur de la mem brane, le pH. la température, etc.
* * *
Nous avons donc conçu un nouvel électrodialyseur, d’une grande maniabilité, permettant d’opérer indifféremment sur des quantités de matière faibles ou beaucoup plus importantes, et de réduire, dans la mesure du possible, le colmatage des membranes lorsque l’on travaille sur des milieux biologiques. Le dispositif que nous avons mis au point s’inspire à la fois de l’électrodialyseur de Maricq-Rochat et de celui de A. Lôddesol (42).
ouverts aux deux bouts ; B peut être de longueur variable et est destiné à recevoir la matière à électrodialyser. Pour nos expériences, nous avons disposé de trois cellules B de longueurs suivantes : l’une de 15 cm, l’autre de 11 cm et une troisième de 6 cm. Dans le
comparti-Fie. 4. — Klectrod.'alyseur simple (extraction des cations)
Fig. 5. — Electrodialyseur.
longueur, sur laquelle s’adaptent des tuyaux en caoutchouc, munis d’une pince de Hofmann. La tubulure du compartiment central B a un dia mètre assez large (environ 2 cm) permettant une vidange aisée des matières solides ou visqueuses. La tubulure du compartiment le est pro longée par un robinet de verre, en vue d’éviter le contact des solvants avec le caoutchouc.
Chaque élément présente, à son extrémité latérale ouverte, des rebords rodés de 1,5 cm, entourant complètement l’ouverture, et per mettant une adaptation parfaite au compartiment voisin, lorsqu’ils sont accolés. Les membranes de cellophane étant convenablement ajustées sur les rebords rodés, les quatre éléments sont placés dans un châssis où ils sont soumis à une pression assurant l’étanchéité complète du dispositif (fîg. 6): les compartiments C et A reposent, par leur extré mité hémisphérique, sur un disque en caoutchouc souple et épais ; l’un de ces disques étant fixe et l’autre mobile, on peut ainsi régler à sa guise la pression s’exerçant sur l’appareil.
La réfrigération est assurée par un courant d’eau froide qui circule dans les réfrigérants R, plongeant dans les compartiments anodique et cathodique, et qui vient se déverser à l’extérieur du compartiment extracteur le. Ce refroidissement peut éventuellement être renforcé par un courant d’air énergique dirigé sur tout le dispositif et produit par un ventilateur, placé devant l’appareil. Un thermomètre placé à l’inté rieur d'un des compartiments permet d’observer la température à tout moment de l’expérience.
Les électrodes sont fermées soit de disques en toile de platine, soit de disques en nickel, soit encore de plaques de charbon : ces électrodes occupent toute la section du cylindre et permettent ainsi d’obtenir un champ électrique maximum, La distance entre les électrodes varie avec la longueur du compartiment B utilisé : dans nos essais, elle a été de 24 cm, 20 cm ou 15 cm.
L’alimentation électrique (fig. 7) est réalisée par un courant continu provenant soit de batteries d’accumulateurs, sous une tension de 120
RECHERCHES SUR l’EXTRACTION ÉLECTRORIALYTIQUE 23 Au moyen de ce dispositif électrique, il est donc possible d’utiliser des tensions de 120 V, 190 V, 240 V et 380 V ; en outre, par le jeu des résistances, nous pouvons disposer de toutes les tensions inter médiaires.
Parmi les membranes semi-perméables, les membranes de cellophane du commerce (30 g au m^) ont été préférées dans la plupart des cas : le parchemin, les filtres membranes d’après Zsigmondy *, d’un prix beaucoup plus élevé, ne nous ont pas donné de résultats meilleurs. Toutefois, pour l’extraction des anions, il est souhaitable d’utiliser des
membranes positives, c’est-à-dire perméables aux anions, comme par exemple des membranes de gélatine formolisée (voir page 30).
Electrodialyseuc double. — Dans certains cas, notamment lorsqu’il s’agit de cations ou d’anions particulièrement stables, il sera avanta geux d’opérer au moyen d’un électrodialyseur double :
1° Dans le cas d’un cation non altérable par l’oxygène anodique, par exemple la strychnine, et la plupart des cations métalliques, la matière à électrodialyser sera disposée dans un compartiment central contenant aussi l’anode. De chaque côté de celui-ci, sont disposés les
compartiments extracteurs le, si nécessaire, et les compartiments C
(fig. 8).
2° Dans le cas d’un anion non altérable par l'hydrogène cathodique, par exemple un barbiturique, la matière à électrodialyser sera disposée dans un compartiment central contenant aussi la cathode. De chaque côté de celui-ci, sont disposés lés compartiments extracteurs Ia et les compartiments anodiques A.
Fig. 8. — Klectrodialyseur double (extraction des cations).
Fig. 9. — Electrode spéciale pour électrodialyseur double.
Dans ces deux derniers cas, nous utiliserons une électrode de forme spéciale (fig. 9), qui permettra, tout en conservant un champ électrique maximum, un brassage efficace de la matière du compartiment central. Ainsi conçu, cet appareil permettra de réduire approximativement de moitié la durée de l’opération.
* * *
L’électrodialyseur que nous proposons présente tous les avantages du dispositif préconisé par Maricq et Rochat, à savoir :
RECHERCHES SUR l’EXTRACTION ÉLECTRODIALVTIOl’E 25 » 2° Il simplifie les manipulations et permet ainsi de réaliser un gain de temps, l’extraction se faisant parallèlement à l’électrodialyse.
» 3“ Il sépare éventuellement les ions minéraux et organiques, les ions organiques demeurant fixés dans le compartiment intermédiaire par dissolution dans un liquide extracteur judicieusement choisi
» 4“ Il supprime pratiquement le phénomène retardateur de la dialyse inverse, en éliminant l’ion considéré au fur et à mesure de son passage dans le compartiment intermédiaire.
» 5° Il permet la réalisation de toute une série de dispositifs, spéciale ment adaptés pour l’extraction quantitative, lorsque la substance recher chée a été décelée qualitativement.
» 6“ La matière à électrodialyser est agitée d’une manière efficace et se trouve ramenée constamment dans le champ électrique... »
Notre électrodialyseur présente en outre les qualités suivantes :
1“ Il permet de traiter des quantités de matière allant de quelques grammes à un kilo.
2” Il est d'une manipulation particulièrement aisée : le montage de l’appareil ne nécessite qu’un minimum de temps (environ 10 minutes), et la vidange de l’un des compartiments peut s’effectuer très facilement à n'importe quel moment de l’expérience.
3° Grâce à la surface relativement grande des membranes (63,5 cm^) par comparaison avec celles utilisées par Fabre (28,2 cm^) et Maricq- Rochat (19,6 cm^), et au champ électrique bien réparti, obtenu par l’utilisation d’électrodes occupant toute la section des cylindres, l’effi cacité de l’électrodialyse est amenée à son maximum.
4° A part une exception [extraction des alcaloïdes du quinquina (page 129)], dans toutes les opérations effectuées jusqu’à présent, le colmatage des membranes est pratiquement négligeable.
CHAPITRE III
Influence de divers facteurs
sur le comportement électrodialytique des ions
Il n’entre pas dans notre intention d’étudier ici les phénomènes très complexes qui régissent l’électrodialyse ; nous nous bornerons unique ment à discuter quelques principes qui peuvent être d’une grande utilité pour prévoir le comportement des électrolytes soumis à l’action d’un courant électrique.
On appelle vitesse d’électrodialyse d’un ion, la rapidité avec laquelle cet ion, dissous dans un milieu convenable, s’élimine du compartiment central d’un électrodialyseur.
On sait que seuls les électrolytes, c’est-à-dire les composés ionisables, soumis à l’influence d’un champ électrique, se dissocient en cations et en anions, qui se dirigent, respectivement, vers les cellules cathodique et anodique (fig. 10).
R—OH R—COOH
1,
cathode R+ + OH--- ^ anode anode RCOO'“ + HH—cathode
[
PiG. 10. — Electrodialyse des bases et des acides.
1° Influence de la constante de dissociation. — Il est évident que le phénomène de l’électrodialyse est sous la dépendance étroite de l’ioni sation des électrolytes, ou mieux de la constante de dissociation de
(R+)(OH-) ceux-ci, c’est-à-dire pour un cation de : Kroh =
(RCOO-)(H+) (ROH)
(a) et
pour un anion de Kb
(RCOOH) (b).
KhXHERCHES SUR l’EXTRACTION ÉLECTRODIALYTIQI E 27 heures suffit pour extraire, par électrodialyse, la spartéine avec un rendement de 98,2 %, d’une solution aqueuse de 20 mg de sulfate de spartéine ; tandis que, pour une opération identique, effectuée sur
10 mg de colchicine, salifiée par l'acide acétique, on n’extrait que 44 % de colchicine base, en sept heures.
On peut conclure avec Tabone (26) que « la quantité de substance transportée par le champ électrique est directement proportionnelle au coefficient de dissociation de cette substance ». Il est donc possible de prévoir la vitesse relative avec laquelle l’ion migrera de la cellule centrale vers l’anode ou vers la cathode. D'après les expériences que nous avons effectuées, il nous semble raisonnable d’admettre, comme le propose Tabone, la division des ions, au point de vue électrodialy- tique, en deux catégories : les « ions rapides » et les « ions lents ». On peut, à notre avis, ranger parmi les « ions rapides », ceux qui se rattachent à une molécule dont la constante de dissociation est égale ou supérieure à 10“®; et parmi les « ions lents », ceux qui se rattachent
à une molécule dont la constante de dissociation est inférieure à 10“®. Nous avons, en effet, effectué l’électrodialyse d’une solution aqueuse contenant 20 mg de chlorhydrate de papavérine ( = 8 x 10“®): nous avons pu extraire la papavérine base, avec un rendement de 94,1 %, en cinq heures (voir p. 123). Ce résultat, intermédiaire entre celui obtenu pour la spartéine et la colchicine, est satisfaisant. C’est pourquoi nous rangeons encore la papavérine parmi les « ions rapides ».
De tout ceci, il résulte nécessairement que l’extraction électrodialy- tique quantitative d’un « ion lent » exigera une durée plus longue que l’extraction d’un « ion rapide »,
2“ Influence du pH du compartiment central. — De l’examen des équations (a) et (b), il est facile de prévoir qu’une modification du pH joue un rôle important dans la dissociation et, par conséquent, influence la vitesse d’électrodialyse.
a) Cas d'un cation. L’étude de l’équation (a) montre que, si l’on ajoute des ions H+ au milieu dans lequel l’électrolyte est dissous, on augmente la dissociation ; on favorise donc ainsi la vitesse d’électro dialyse. Une addition d’alcali amènerait, au contraire, un recul de l’ionisation et retarderait, par le fait même, l'élimination du cation de la cellule centrale. C’est pourquoi, lors de l’extraction électrodialytique d’un cation, il convient d’acidifier le milieu de départ. Il est, d’autre part, préférable de choisir un acide faible, comme l’acide acétique, dont K= 1,86 X 10“5, afin d’éviter le départ trop rapide des ions H+ du com partiment central.
montre que, pour l’extraction électrodialytique d’un anion, il est néces saire d’alcaliniser le milieu de départ, une acidification amenant un recul de l’ionisation des acides, comme par exemple d’un barbiturique, et retardant ainsi la vitesse d’électrodialyse. Dans ce cas, on alcalinisera donc le contenu du compartiment central par addition d’une base faible, comme l’ammoniaque (K= 1,75 x 10“^).
3° Influence des substances secondaires. — La principale application de l’extraction électrodialytique est l’isolement de certains électrolytes contenus dans un milieu plus ou moins complexe. Il est évident que le milieu ambiant exerce une influence sur l’opération ; c’est pourquoi il convient d’en dire quelques mots. Tabone (26) a montré l’effet néfaste, dû aux milieux biologiques et apportant un retard considérable à l’ex traction des ions étudiés ; il impute ce retard principalement : a) aux électrolytes dialysables, autres que les ions à extraire, notamment aux sels minéraux, comme le chlorure de sodium; b) aux protéines qui viennent colmater les pores de la membrane. Dans des milieux autres que les milieux biologiques, nous avons pu observer que des substances diverses peuvent également venir colmater les membranes et allonger la durée de l’opération. Ce sont en général des molécules qui précipitent soit sur la membrane, soit à l’intérieur des pores de celle-ci ; citons, par exemple, les tanins du quinquina, l’hémoglobine, les protéines du lait. Toutefois, en utilisant l’électrodialyseur que nous préconisons, ce col matage ne nous a apporté de sérieuses difficultés que lors de l’extrac tion des alcaloïdes des écorces du quinquina.
4° Influence de la nature de l'ion à extraire. — Certains ions peuvent subir des transformations dues à des phénomènes d’hydrolyse, et sus ceptibles de rendre difficile ou même impossible leur extraction quan titative ou même leur caractérisation. Le cas de l’aconitine est typique à cet égard (voir p. 77).
D’autres ions sortent aisément du compartiment central, sous l’action du courant électrique, mais réagissent ensuite avec l’alcalinité ou l’aci dité du compartiment extracteur ou des compartiments terminaux. C’est ainsi que le cation morphine, pénétrant dans le milieu alcalin de la ce’lule extractrice cathodique, se transforme en anion morphinate, et tend donc ainsi à refluer vers l’anode. Rentrant dans le compartiment de départ, à réaction acide, elle reprend son caractère de cation et se dirige à nouveau vers la cellule cathodique, où le cycle recommence. Le cation zinc agit de façon à peu près analogue Ces ions « hésitants » sont généralement des substances amphotères.
KhXHERCHES SI:r L’eXTKACTION ÉLECTRODIALYTIQfE 29 sent travail, nous avons utilisé des membranes en cellophane ( 30 g/m^), facilement accessibles dans le commerce. De telles membranes avaient été utilisées par la plupart des chercheurs, dans l’électrodialyse d’ex traction, et il nous semblait logique de continuer dans ce sens. Ce n’est qu’après avoir acquis une réelle expérience dans le domaine de l’électro- dialyse que nous nous sommes rendu compte de l’influence considérable qu’excerçaient ces membranes, tant sur la vitesse d’élimination des ions que sur la stabilité du pH dans les différents compartiments de l’électro- dialyseur.
a) Variations du pH au cours de l'électrodialyse.
Lors de l’extraction électrodialytique d’un cation organique, par exemple un alcaloïde, en solution aqueuse pure, dans un appareil à quatre compartiments, opération que nous avons généralement effectuée de la manière suivante :
Compartiment A : 350 ml d'eau distillée.
Compartiment B : la substance à électrodialyser(de 0,010 g à 0,100 g) + 300 ml d’eau distillée+ 2 ml CH^CO^H 2N.
Compartiment Ic:70 ml HCCL + 250 ml d'eau distillée+ 2 ml NH4OH 2N Compartiment C : 350 ml d’eau distillée.
nous avons toujours observé, après une durée de deux heures et demie à trois heures, une acidification du compartiment le. Celle-ci vient évidemment perturber la bonne marche de l’opération, puisque, à ce moment, le cation poursuit son chemin vers la cellule cathodique, échappant ainsi au solvant extracteur et risquant de s’altérer au contact de la cathode. Faute de mieux, nous avons remédié à cet inconvénient en ajoutant toutes les heures 1 ml NHjOH2N dans la cellule le, deux heures et demie après le début de l’opération *.
De même, lors de l’électrodialyse d’un anion organique, par exemple un barbiturique, en solution aqueuse pure ou en milieu biologique, dans un appareil à quatre compartiments, opération réalisée dans les con ditions suivantes :
Compartiment C : 350 ml d’eau distillée.
Compartiment B : la substance à électrodialyser (de 0,050 g à 0,100 g) + 300 ml d’eau distillée + 2 ml NH,OH 2N.
Compartiment la ; 100 ml d'un mélange éthéro-chloroformique + 250 ml d’eau distillée+ 2 ml CH3CO2H 2N ;
Compartiment A : 350 ml d’eau distillée.
nous avons toujours observé, après quelques heures, une acidification du compartiment B. Celle-ci, en diminuant la dissociation de l’anion, retarde considérablement l’évacuation de ce dernier vers l’anode. Nous avons évité cette difficulté en alcalinisant fortement le contenu de la cellule B, par addition de 5 à 10 ml d’ammoniaque concentrée.
b) Vitesse d’électrodialyse du véronal.
Nous avons vu plus haut (p. 26) que la vitesse d’électrodialyse d’une substance était directement proportionnelle à sa constante de dissocia tion. Or, si l’on effectue l’électrodialyse du véronal dans les conditions indiquées ci-dessus, on constate que cette loi est tout à fait en défaut, puisque ce composé, dont la constante de dissociation est égale à 3,7 X 10~*, n’est extrait qu'à concurrence de 52 % en dix-huit heures, l abone (26) et Rochat (31) avaient également constaté cette lenteur particulière des barbiturates, mais les avaient simplement classés parmi les « ions lents » sans en rechercher l’explication. Nous avons d’abord tenté de remédier à cette lenteur en faisant usage de l’électrodialyseur double (pp. 23 et 89).
Ces phénomènes perturbateurs — acidification des cellules centrales et lenteur des anions — sont connus depuis longtemps déjà dans la technique de purification électrodialytique : ils sont dus à la nature des membranes. En simplifiant le problème à l’extrême, on peut considérer qu’il existe pour celles-ci une perméabilité sélective, certaines mem branes étant plus perméables aux cations qu’aux anions ou inverse ment. Si, lors d’une électrodialyse, on utilise des membranes négatives, c’est-à-dire perméables aux cations — comme le parchemin, la cello phane, etc. —, ceux-ci se déplacent plus rapidement que les anions et il s’ensuit une acidification des compartiments centraux (d4, 45). D’au tre part, la cellophane, peu perméable aux anions, ralentit considérable ment la vitesse d’électrodialyse de l’ion véronal. Ainsi, les deux diffi cultés rencontrées s’expliquent uniquement par la nature de la mem brane employée. Dans ces conditions, nous avons cherché à utiliser des membranes positives ou perméables aux anions : de telles membranes sont rares dans le commerce, du moins à notre connaissance. Cepen dant, les substances amphotères, comme la gélatine ou l’hémoglobine par exemple, peuvent se comporter comme des membranes positives en milieu faiblement acide, si elles se trouvent placées du côté anodique ; tandis qu’elles se comportent comme membranes négatives en milieu alcalin, si elles sont utilisées comme membranes cathodiques (45, 46).
RECHERCHES SCR l’eXTRACïION ÉEECTRODlALYTIQCE 31 tiède de gélatine à 10 % pendant environ dix minutes. Après essorage, le papier ainsi préparé est immergé pendant douze heures dans une solution de formaldéhyde à 4 %. Après lavages répétés à l’eau distillée, nous obtenons des membranes de gélatine, prêtes à l’emploi.
L’extraction électrodialytique du véronal a été alors reprise en intro duisant une membrane de gélatine ainsi préparée entre les comparti ments la et B de l’électrodialyseur, toutes les autres membranes étant constituées par de la cellophane. En opérant sur 0,100 g de véronal, non seulement nous n’avons pas observé d’acidification du comparti ment B, mais, de plus, nous avons obtenu un rendement de 78 % en six heures. Au moyen d’un arrangement spécial (voir p. 88) et en utilisant les mêmes doses de barbiturique, Rochat aboutissait à un rendement de 27 % en sept heures et Tabone devait poursuivre l’opé ration pendant quarante heures pour en extraire la totalité.
En ce qui concerne l’extraction des cations, il semble, d’après nos premières recherches, que l’introduction d’une membrane de gélatine entre les compartiments B et C exerce une influence favorable sur le maintien du pH alcalin du compartiment extracteur le.
Par l’utilisation de membranes sélectives, nous espérons pouvoir améliorer encore le procédé d’extraction électrodialytique ; c’est dans ce sens que nous comptons orienter nos futures recherches.
Résumé de la première partie
L’électrodialyse est à la base de deux catégories d’applications :
1° Les purifications électrodialytiques, domaine qui a été exploité intensément depuis le début du siècle ;
2“ Les extractions électrodialytiques, où l’on a pour but l’isolement et la récupération des électrolytes à partir de la matière à traiter.
C’est ce second aspect que nous avons tenté d’appliquer à divers domaines des sciences pharmaceutiques.
Dans ce but, après avoir décrit et critiqué deux appareils d’électro dialyse, utilisés pour les mêmes fins, nous avons présenté un nouvel électrodialyseur, conçu par nous et susceptible d’atteindre les objec tifs que nous nous sommes fixés.
DEUXIÈME PARTIE
CHAPITRE PREMIER
Applications à l’analyse toxicologique
A.
— Introduction
C’est à l'école de Fabre que sont dues les premières tentatives d’ap plication de l’électrodialyse à l’analyse toxicologique. En 1935, dans scs Leçons de toxicologie (24), R. Fabre souligne l’intérêt de cette nou velle technique, pour la séparation du baryum, du zinc, du cuivre, de l’acide fluorhydrique, etc. S. Bazille (25) publie, la même année, une étude très poussée sur l’extraction du fluor à partir d’organes frais et putréfiés, et sur le dosage de cet élément dans les phanères, la salive et diverses glandes. Un peu plus tard, J. Tabone (26) communiquait le résultat de ses recherches sur le sulfate de strychnine, l’acide diéthyl- barbiturique et l’arséniate bisodique. La recherche toxicologique de la strychnine fit également l’objet d’un article de R. Fabre et P. Oficjal- ski (29).
Si, jusqu’alors, le procédé électrodialytique permettait de nombreux espoirs dans le domaine de l’analyse toxicologique, ceux-ci s’amenui sèrent de beaucoup, lorsque ces mêmes auteurs étudièrent le comporte ment de certains alcaloïdes plus fragiles, notamment la cocaïne, la morphine, l’atropine et les alcaloïdes de l’ergot (28). Au cours de l’électrodialyse, ces substances subissent des altérations, augmentant avec la durée de l’opération, et attribuables à des réactions électro lytiques secondaires.
que nous l’avons décrit dans la première partie de ce travail (p. H), ne permettait pas l’extraction de composés assez fragiles, comme le sont notamment de nombreux alcaloïdes. Il apparaissait donc nécessaire de capter de tels corps avant qu’ils soient soumis au contact nuisible de la cathode. Il en est, d’ailleurs, de même pour les anions facilement oxydables, comme par exemple l’acide salicylique, qui doivent être écartés avant de subir une oxydation éventuelle par l’oxygène anodique. C’est ce que L. Maricq et F. Rochat réussissent à réaliser en présen tant un nouvel électrodialyseur à compartiment intermédiaire et à extraction continue : la description de cet appareil a été donnée plus haut (p. 15). Grâce à celui-ci, F. Rochat (31) parvient à isoler de milieux biologiques toute une série de cations et d’anions toxiques : mercure, zinc, plomb, barym, arsphénamine, cocaïne, morphine, strych nine, vératrine, — oxalate, fluorure, arsenic, sulfamidé, acide phényl- éthylbarbiturique et acide diéthylbarbiturique. F. Rochat termine son travail en insistant « sur la facilité, la rapidité et la simplicité de la méthode pour la mise en évidence des poisons à propriétés d’électro lytes, comparativement aux méthodes classiques ».
Si ces dernières recherches.consacraient la méthode en toxicologie, il nous a cependant semblé nécessaire d’approfondir cette technique et de résoudre certains problèmes que les premiers chercheurs avaient laissé de côté ou n’avaient pu résoudre. Parmi ceux-ci, citons : 1“ l’utilisation d’un appareil facilement maniable, permettant d’opérer sur des quan tités normales de matières viscérales : 2° la suppression du colmatage, phénomène retardant considérablement l’opération ; 3° la recherche de petites doses de toxiques dans un poids relativement élevé de viscères ; 4° l’emploi de l’électrodialyse comme méthode générale pour l’analyse toxicologique.
B. — L’électrodialyse, méthode générale d’analyse toxicologique
Nous avons montré dans la première partie (p. 25) l’extrême mania bilité du nouvel électrodialyseur et la possibilité de traiter, au moyen de celui-ci, des quantités de matière allant de quelques grammes à un kilo. Nous n’y reviendrons pas.
Première expérience : Nous avons effectué l’électrodialyse de 50 g d’une bouillie viscérale humaine, dans les conditions suivantes :
Compartiment B : 50 g de bouillie viscérale + 200 ml d'eau distillée+1 ml CH^CO.H 2N.
Compartiment le : 250 ml d’eau distillée+ 2 ml NH4OH2N + 7O ml HCCI3.
Compartiments A et C : dans chacun, 350 ml d’eau distillée.
Maintenant la tension constante, nous avons relevé les valeurs de l’intensité toutes les demi-heures au début de l’expérience, puis toutes les heures de la quatrième à la dixième heure, puis enfin après vingt- deux heures. A ce moment, nous avons ajouté, dans le compartiment
RECHERCHES SUR l’EXTRACTION ÉLECTRODIALVTIQUE 35
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30
t en heures.
Fig. 11. — Etude du colmatage.
de départ B, 250 mg de chlorure sodique. Si les pores de la membrane étaient colmatés par les protéines du milieu biologique, le passage de l’électrolyte vers les compartiments terminaux ne s’effectuerait pas, et l’intensité indiquée par l’ampèremètre resterait stationnaire. C’est le phénomène inverse que nous observons, preuve que la membrane de cellophane reste perméable aux ions. Le graph’que ci-dessus (fîg. 11) illustre bien ce fait ; nous voyons, au début, l’intensité augmenter sous l’influence des électrolytes qui quittent la cellule centrale ; puis, au fur et à mesure de l’appauvrissement en ions de ce compartiment, la courbe s’abaisse pour atteindre finalement un palier. Après addition de chlorure sodique, nous voyons la courbe prendre la même allure qu’au début, puis s’incliner avec l’élimination des ions de la cellule médiane.
Après une durée de vingt-deux heures, nous avons introduit, dans le compartiment B, 20 mg de nitrate de strychnine. La base strychnine se dirige vers la cathode et est captée, au fur et à mesure de son passage, par le chloroforme contenu dans la cellule intermédiaire.
Après avoir poursuivi l’électrodialyse pendant quatre heures, nous avons retrouvé, par évaporation du solvant, un résidu pesant 16,6 mg, soit 98,8 % de la strychnine mise en jeu, et présentant les réactions caractéristiques de cet alcaloïde. Cette dernière expérience prouve de façon certaine que la membrane cathodique reste perméable, même aux ions de structure assez complexe et de poids moléculaire assez élevé, comme les ions alcaloïdiques.
D'autre part, tous les auteurs qui ont tenté d’appliquer l’électro- dialyse à l’analyse toxicologique, opèrent sur des doses de toxiques relativement élevées, qu’ils essaient d’isoler à partir de quantités d’or ganes frais ou putréfiés peu importantes. C’est ainsi que F. Rochat recherche des alcaloïdes à des doses de 50 à 100 mg dans 150 g de pulpe de foie ou de rate. R. Fabre, dans son étude sur l’isolement de la strychnine, utilise, comme dose minimum, 2 mg de strychnine base pour 70 g de foie.
Il est évident que la tâche de l’expert toxicologue devient très déli cate lorsqu’il doit extraire, de la masse relativement énorme d’un cadavre, quelques milligrammes d’un poison, surtout lorsque celui-ci est un composé assez altérable, comme le sont en général les alcaloïdes. C’est ce que, à l’aide du nouvel électrodialyseur, nous nous sommes efforcé de réaliser, en tentant de rechercher des doses d’alcaloïdes de l’ordre du milligramme, contenues dans des bouillies viscérales d’un poids d’environ 500 g. Pour nous rapprocher au maximum des cas réels se présentant dans la pratique courante, nous avons toujours utilisé, au cours de nos recherches, des bouillies viscérales humaines, composées d’un échantillon moyen de foie, reins, rate, cœur et poumons, auquel était additionné préalablement le toxique à étudier. Des recherches sur des animaux intoxiqués ont été également pratiquées. De plus, à diverses reprises, nous avons eu l’occasion d’expérimenter la méthode électrodialytique, lors d’expertises toxicologiques réelles.
RECHERCHES SUR L’eXTRACTION ÉLECTRODIALYTIQUE 37 y contribuer et avons pu étudier, à ce point de vue, une trentaine de composés, parmi lesquels nous avons réservé la part la plus importante aux alcaloïdes. En outre, la généralisation de la méthode exige des conditions opératoires toujours identiques, afin de pouvoir extraire, sans aucune modification chimique ou technique, n’importe quel poison élec trolyte du milieu biologique à étudier. C’est pourquoi, sauf indication contraire, nous avons mené toutes nos expériences de manière iden tique, en établissant évidemment une distinction entre une recherche cationique et une recherche anionique. Nous avons donc utilisé — suivant en cela la proposition de F. Rochat — deux appareils à quatre compartiments, l’un destiné à l’isolement des cations, l’autre à celui des anions.
1“ Recherche d’un cation organique ou minéral. On utilise l’appareil type suivant : A-B-Ic-C.
Compartiment A ; 350 ml d'eau distillée.
Compartiment B : la bouillie viscérale humaine (de 450 à 500 g) conte nant le toxique à isoler + solution CHjCO^H 2N q.s. pour acidifier
(généralement 1 à 2 ml).
Compartiment le : 250 ml d’eau distillée+ 2 ml NH,OH 2N + 70 ml HCCI3.
Compartiment C : 350 ml d’eau distillée.
L’intensité du courant est réglée au moyen des résistances variables, et doit être limitée à un maximum de 500 mA. De cette façon, la tempé rature des compartiments n’a jamais dépassé 32°. Pour éviter la dialyse inverse et des altérations pouvant provenir des oxydants dégagés à l’anode (notamment du chlore), le compartiment anodique est prélevé entièrement après trois heures, huit heures et vingt-quatre heures d’électrodialyse, et remplacé par de l’eau distillée.
Le contenu du compartiment cathodique est aussi prélevé, entière ment après trois heures, de moitié après huit heures et de nouveau entièrement après vingt-quatre heures d’électrodialyse, et remplacé par de l’eau distillée. Ces liquides cathodiques seront éventuellement con servés pour la recherche d’un toxique minéral. A la fin de l’opération, il convient d’analyser le dépôt métallique recouvrant la cathode.
Le compartiment le est prélevé et remplacé entièrement après huit heures et vingt-quatre heures. Les solutions chloroformiques peuvent contenir le toxique organique éventuel, tandis que les solutions aqueu ses sont jointes aux liquides cathodiques destinés à la recherche d’un cation minéral.
En ce qui concerne les toxiques minéraux, cette technique n’est que qualitative. Une opération quantitative nécessite, pour ces derniers, l’utilisation d’un appareil à trois compartiments (voir partie expéri mentale).
2“ Recherche d’un anion organique ou minéral. On utilise l’appareil type suivant ; A-Ia-B-C.
Compartiment C : 350 ml d'eau distillée.
Compartiment B ; la bouillie viscérale humaine (de 450 à 500 g) con tenant le toxique à isoler + solution d'ammoniaque concentrée, jusqu'à réaction franchement alcaline (environ 5 ml).
Compartiment : 250 ml d’eau distillée+ 2 ml CH3CO2H 2N+100 ml d’un mélange éthéro-chloroformique
(HCCI3
65 vol., éther 35 vol.). Compartiment A : 350 ml d’eau distillée.L’intensité du courant est limitée, au moyen des résistances variables, à un maximum de 500 mA.
Après trois heures, huit heures et vingt-quatre heures d’électrodia lyse, on prélève entièrement le compartiment anodique, que l’on réserve à la recherche des anions métalliques (arséniate, par exemple), et on le remplace par de l’eau distillée. Le compartiment Ia est prélevé et remplacé aux mêmes heures : dans les solutions aqueuses, on recherche les composés anioniques peu solubles dans les solvants (sulfamidés, oxalates, etc ); dans les solutions éthéro-chloroformiques, on recherche les composés anioniques solubles, par exemple les barbituriques.
La durée de l’opération est également de vingt-quatre heures ; mais, en raison, soit de la lenteur du déplacement de certains anions, soit de leur manque de solubilité dans le solvant, les rendements ne sont pas toujours quantitatifs, tout en étant supérieurs à ceux obtenus par les méthodes classiques. Il est possible, dans certains cas, d’obtenir des résultats meilleurs en prolongeant la durée de l’électrodialyse ou en utilisant le dispositif double (voir partie expérimentale).
C’est en restant fidèle à ce mode opératoire et en étudiant le compor tement du plus grand nombre possible de toxiques, que nous espérons pouvoir aboutir à une méthode générale d’analyse toxicologique, où l’électrodialyse jouera un rôle important.
On pourrait, en effet, concevoir une expertise menée suivant le schéma ci-dessous :
1° Recherche des poisons volatils : suivant la méthode classique: poids de matière à utiliser : 500 g.
RECHERCHES SUR l’EXTRACTION ÉLECTRODIALYTIOUE 39 3° Recherche des poisons anioniques organiques et minéraux : par électrodialyse (appareil A-Ia-B-C); poids de matière à utiliser : 500 g*.
4“ Recherche des poisons non électrolytes (par exemple, les gluco- sides) : suivant la méthode classique: on opérera alors sur les matières qui ont déjà été électrodialysées.
Nous avons, en effet, vérifié expérimentalement qu’un glucoside (la digitaline) ne migrait ni vers l’anode ni vers la cathode, ainsi que la théorie le laissait prévoir ; en outre, nous nous sommes assuré que ce glucoside, préalablement mélangé à une bouillie viscérale, et soumis dans ces conditions à un courant électrique pendant vingt-quatre heu res, n’était pas altéré et pouvait, par conséquent, être extrait à partir de ces viscères par la méthode classique. Pour ce faire, nous avons intro duit 500 g d’une bouillie viscérale, additionnée de 70 mg de digitaline dans le compartiment B d’un électrodialyseur du type A-B-Ic-C. Le mode opératoire, décrit à la page 37, a été suivi.
Intensité du courant : 80 à 500 mA. Durée de l’opération : 24 heures.
Poids des résidus chloroformiques : 8,7 mg.
Les réactions de Keller-Kiliani et de Lafon (47), effectuées sur les résidus chloroformiques, se sont révélées négatives, ce qui prouve que, même par dialyse simple, la digitaline ne passe pas — ou du moins en quantité très minime — dans la cellule le.
Les viscères, ayant été électrodialysés pendant vingt-quatre heures, ont ensuite été prélevés et soumis à l’extraction alcoolique, suivant le procédé de Stas-Otto. La solution aqueuse acide, obtenue finalement, a été purifiée par l’éther de pétrole, puis épuisée par trois fois 25 ml d’éther, et enfin, pour parfaire l’extraction du glucoside, par trois fois 25 ml de chloroforme. Les solutions éthérées et chloroformiques réunies ont fourni, par évaporation, un résidu fortement coloré en brun et pesant 75,4 mg II nous a été pratiquement impossible de rechercher sur celui-ci la digitaline par les réactions classiques de Keller-Kiliani et de Lafon ; en effet, ces deux réactifs étant constitués principalement par de l’acide sulfurique concentré, il se produit, au contact du résidu, un charbonnement intense, masquant toute coloration. Aussi, pour prou ver la présence de digitaline dans l’extrait, avons-nous préféré la mé thode pharmacodynamique, utilisant la propriété que possède ce glu coside d’amplifier les contractions cardiaques.
A cet effet, nous avons dissous le résidu dans 5 ml d’alcool à 94°; 0,5 ml de liquide ont été additionnés de 2 ml de solution de Tyrode et la majeure partie de 1 alcool a été éliminée par évaporation jusqu’à obtention d’un volume de 2 ml. L’expérimentation physiologique réa- lisée sur oreillette isolée de lapin a été effectuée sur 0,25 ml de cette dernière solution, par comparaison avec 0,25 ml d’une solution de pantocardine P, correspondant à 0,06 mg de digitaline. Le diagramme obtenu (fig. 12) indique nettement la présence de glucoside dans l’ex trait viscéral et nous permet son estimation à une valeur de 3,9 mg pour la totalité de l’échantillon : ce rendement de 39 % concorde bien avec les proportions de toxique que l’on extrait habituellement en utilisant la méthode de Stas-Otto.
Fig. 12.
Les recherches menées de cette façon — tout en restant conformes aux règles générales de l’analyse toxicologique — apporteraient à l’expert des avantages appréciables : gain de temps, économie de sol vants, rendements meilleurs et pureté plus grande du toxique isolé.
Les expériences que nous avons effectuées jusqu’ici ne suffisent certes pas à conclure à la validité certaine de cette méthode hypothétique, mais permettent de nombreux espoirs quant à sa réalisation.
Ce sont surtout les composés cationiques, et principalement les alca loïdes, qui font l’objet du présent travail. Nous n’avons fait qu’effleurer les poisons anioniques. Nous espérons pouvoir continuer les recherches dans ce domaine et mener à bien la réalisation de cette méthode géné rale d’analyse toxicologique.
C. — Partie expérimentale
RECHERCHES SUR L'EXTRACTION ÉLECTRODIALYTIQUE •11 exempte de poison, suivant les conditions générales établies plus haut et d'en comparer les résultats avec ceux obtenus par la méthode de Stas-Otto. Dans ce but, un kilo et demi de bouillie viscérale humaine a été divisé en trois parts égales ; la première partie a été traitée par la méthode de Stas-Otto et les deux autres ont été extraites par électro
dialyse : l’une suivant le procédé décrit pour l’analyse des cations (p. 37), l’autre suivant le procédé décrit pour l’analyse des anions (p, 38). Les résultats obtenus sont consignés dans le tableau I et mon trent clairement la supériorité du procédé électrodialytique.
TABLEAU I
Comparaison entre le poids des résidus obtenus par la méthode Stas-Otto et par le procédé électrodialytique
au cours de l'extraction de 500 g de bouillie viscérale.
Méthode Stas-Otto Méthode électrodialytique
Poids résidu éther de pétrole : 153 mg —
Anions.
Poids du résidu éthéro-ohloroformique acide :
après 24 h... 19,4 mg après 48 h... 7,5 mg
Poids du résidu éther acide : 109 mg Total... 26,9 mg
Cations.
Poids du résidu chloroformique alca lin :
Poids du résidu éther alcalin. 17 mg après 8 h...2,2 mg Poids du résidu HGClj alcalin 29 mg après 24 h...2,6 mg
Total extraction alcaline 46 mg Total extraction alcaline. 4,8 mg
