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Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository

Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Tondeur, M. (1973). Etude ultrastructurale des mucopolysaccharidoses et d'affections apparentées (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté de Médecine – Médecine, Bruxelles.

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1 ^{V) ^ ^}

UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES

/

Service de Pédiatrie de l'Hôpital Universitaire St.-Pierre et Laboratoires d’Anatomie Pathologique et de Microscopie

Electronique de la Faculté de Médecine.

Etude Ultrastructurale des Mucopolysaccharidoses et d’Affections Apparentées

Thèse présentée en vue de l'obtention du grade d'agrégé de l'enseignement supérieur

1973

UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES

Service de Pédiatrie de l'Hôpital Universitaire St.-Pierre et Laboratoires d’Anatomie Pathologique et de Microscopie

Electronique de la Faculté de Médecine.

Etude Ultrastructurale des Mucopolysaccharidoses et d’Affections Apparentées

par

M. TONDEUR

Thèse présentée en vue de l’obtention du grade d'agrégé de l'enseignement supérieur

1973

REMERCIEMENTS

Au moment de tenmtnen. ce mê.motA.e, je tten6 tout d'abo/id

à AendAe hommage au P

^e-66euA A.M.Vatcq qut m'a accuetttt dani> 6on taboAatolAe aloA6 que j’état6 etudiant en tAol&lème candldatuAe et n'a jamal.i> ménagé e^^oAti pouA me {^oAmeA aux dl&clpZlne& de ta pen^iée Scientifique et me peAmettAe de meneA a bien mon pAemleA tAaoalt de AecheAche.

Je déslAe expAlmeA ma tAés gAande gAatltude au PAofesseuA R.Vubols pouA ta quatlté de ta foAmatlon pédlatAlque qu’lt m'a donnée et pouA ta ctalAvoyance dont It a fait pAeuve en me pAO- posant un sujet de AecheAche dont t'IntéAêt n'a cessé de cAoltAz depuis.

Je voudAals également témolgneA ma Aeconnalssance au PAofesseuA P.Vustln qui a bien voulu me donneA t' hospitalité dans Son taboAatolAe et qui, paA son enthousiasme pouA ta Ae­

cheAche médicale, ses suggestions éctalAées et son espAlt

I- tlque A.lgouAeux, m'a été d'un tAéS gAand secouAS dans ta Aéatl- satlon de ce tAavalt.

Le PAofesseuA H.Loeb a suivi pas a pas ta Aéatlsatlon de ce tAavalt et en a oAlenté te développement. Ses conseils judicieux et Son dynamisme m'ont été d'une aide paAtlcutléAement pAécleus e.

Je lui adAesse mes AemeAclements chateuAeux.

UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES

Service de Pédiatrie de l’Hôpital Universitaire St.-Pierre et Laboratoires d'Anatomie Pathologique et de Microscopie

Electronique de la Faculté de Médecine.

Etude Ultrastructurale des Mucopolysaccharidoses et d’Affections Apparentées

par

M. TONDEUR

Thèse présentée en vue de l’obtention du grade d'agrégé de l’enseignement supérieur

1973

I

1

THESES ANNEXES

t. Bien que la maladie de Fabry porte le nom d'"Ang i okeratoma corporis diffusum universale", I 'angiokératome se révèle

inconstant chez l'enfant. D'autres critères de diagnostic sont nécessaires.

2. Le syndrome néphrotique de I'enfant peut être classé en quatre catégories suivant !c meds de réponse au traitement corticoïde. Il n'y a pas de corrélations nettes entre ces catégories et celles qui sont établies sur des critères

histologiques,

3. Le syndrome de Rub i nste i n-Tayb i peut être bien individua­

lisé sur des bases cliniques et radiologiques.

2.

Je n.2

mzKc.lz tz Voctzun. k.'Rzi-iboÂ^i,, zhz^ dz tA.avaux aux Labo^atoxMZ6 d’knator,i-Lz FatkoZogxquz zt dz MZc^.o6copxz Elzc- tAonZquz, aux m'a xvi-it-iz aux tzcknxquz6 dz Z'ê.tudz uttn.a-

&tKuztufialz zt m'a ^att bznz^tctz^ dz& a\jantagz& d’unz zolla- bonatlon ztfioitz. Tout auü-i tmpoAtantz ^ut pouK mot ta cot- tabofiatton du Voztzun. E. i/amo6-HuA.u}ttz, a-66t-6tant au 6ZA.vtcz dz Fzdtatfitz, qui m'a pzA.mt6 dz bznz^tctzn. du matz^tzt dz 6on unttz dz zuZtuKZ dz zt m'a gAandzmznt atdz dan-6 Z'tn- tznpfiztattoYi dz& xziuZtati.

J'zxpfitmz aui,&t ma gfiatttudz aux VoztzuKi, E.Konyan. zt S .UockzZ-PokZ qut m'ont atmabZzmznt communtquz ZzuA6 documznt-i uZtA.a-6t^uctuAaux.

Lz VoctzuA SI.C/Lzmzn. a pn.attquz Z'ztudz KadtoZogtquz dz bzaucoup dz no6 pattznt^ zt Zz Vfi. R.ÿznoZtn-Rzubzn-à Z'ztudz hzmatoZogtquz ; Uadzmot& zZZz G. Jonntaux zt 6 on coZZabon.atzu^

W.l/oe-t ont z^^zctuz, ■àoui Za dVizztton dz4> ?n.o ^z^izun.i

P.E .GAzgotAZ zt J .R.M. FA.anck.6on, Z’ztudz btochtmtquz dz no6

ca6. Je A.zmzA.ctz vtvzmznt cz6 coZZaboA.atzuA.6 6an6 Zz6quzZ6 Z'ap- pàockz muZttdt6ctpZtnatAZ dz no6 pattznt6 n'auKatt pa6 ztz po6- 6tbZz. Je ttzn6 êgaZzmznt à zxpA.tmzA. ma pZu6 vtoz A.zconnat6 6ancz aux coZZaboA.atzuA.6 zxtz>itzuA6 à Z'untozn.6ttz qut m'ont atdz dan6 Za fizaZt6atton dz ce txaoatZ. lz P

^Z66zuh. H.G.H

.6 zt Zz

VoctzuA. F. (/an Hoo^, du LaboA.atotAz dz Chtmtz Phy6toZogtquz dz Z' UntozA.6ttz dz Louvatn ont pAattquz Z'ztudz znzymoZogtquz dz6

btop6tz6 dz no6 pattzntà . A tout momznt, j'at pu appA-ZctzA. Zz6

bznz^tcz6 dz ZzuK coZZabofiatton cZatKooyantz zt dz Z

. gn.andz

expé-t-tenca. Le Vocttixn. E.V.Uzu-izld, du. Natd.ona.Z În4>t^tu.tz

kKtknJiti.i> and HztabolÂ,c Vd.6za-àe.-i>^ a bd.zn vociZa e^^ectuzn. £e typagz do. pZa&lzan.i, dz no4> lignzzi) dz £Zbn.obta6tz6. Je pAo^Ztz

dz zzttz ozza&Zon pou.fi ta fizmzfiztzfi zgatzmznt dz m'avotfi dz- pal6 toKi>, azcuztttl danà -ion tabofiatoViz pou.fi m’tnltlzfi a zz6 tzchntquz6.

Cz tfiavatt n’aufiatt pa6 ztz po66tbtz 6an6 V atdz tzchntquz z^^lzazz dz (Àadamz C.Rtzdt, poufi t'anatç/iz dz6 mazopoly&azzha- fildz6 afitnaVizs, dz Hz6dzmot6zttz6 U.f.Boutangzfi zt E .B fit zou. fit, dz Mz-idamz^ G .Efiomznt-Haiifiagz, R.Mena zt C Aitckot, poafi V ztuidz uttfia6tfiaztu.fialz atnst quz dz Me4dame4 M,F .Cuvttttzfi zt M.Mathy poafi t* ztadz c/e-6 ^tbfiobta^tz^ en zattafiz. IÂz.à6tzafi6 G.Vtznnz zt J .L.Confizufi 6Z 6ont zhofigz-6 dz t'zntfizttzn dz-6 mtzfio-ôzopz^ ztzz- tfiontqaz/s zt da tfiavatt pkotogfiaphtqaz, Madamz Avtva Abztzu) a a66ufié ta daztytogfiaphtz da mana-izfitt, auzz V atdz dz Mz-édamz^

M.Ctoygznbaum, G .Hznfitzt zt V.Ltbzfit. Je tzi> zn fizmzfiztz zhatzu- fiza^zmznt.

Je ttzni, aai&t à zxpfitmzfi ma fizzonnat6 6anzz à ma ^zmmz, mz-6

^tti,'^ma iamtttz zt mz6 amti qut m’ont accoAdë. unz atdz zha- tzafiza&z zt z^^tzazz dan6 ta mt-àz zn pagz dz t’tzonogfiapktz.

Cz tfiavatt a bznz^tztz dz iabuznttom oztfioytzfi pafi tz

Uafitz-Chfit^ttnz zt pafi ta Fondatton Po6z zt Jean Hoga^t.

L’Etéznhowzfi Exzhangz Fzttomhtp6 Inz. m’a pzfimt6 dz pafi^atfiz

ma ^ofimatton pafi an uoyagz dz 6 moti aax Etat4>-üntf>.

TABLE DES MATIERES

Pages

INTRODUCTION ... ... 1

CHAPITRE I : HISTORIQUE... ... ... 5

CHAPITRE II: MATERIEL ET METHODES... 15

1 . MATERIEL ... 15

2 . METHODES... 16

A. TECHNIQUES DE PRELEVEMENT ... 16

a) Prélèvements hépatiques. . 16

b) Prélèvements rénaux... 17

c) Prélèvements cérébraux ... 17

d) Prélèvements cutanés ... 18

B. ETUDES BIOCHIMIQUES... 18

C. ETUDES DES HYDROLASES ACIDES HEPATIQUES ... 19

D. ETUDES DES ORGANES EN MICROSCOPIE PHOTONIQUE. . . 19

E. ETUDES DES ORGANES EN MICROSCOPIE ELECTRONIQUE. . 19

a ) Co I orat i ons au plomb... ... . ... 19

b) Coloration argentique... 20

c) Coloration à l'acide phosphotungstlque .... 20

d) Coloration au fer colloïdal... 21

P. ETUDES DES F 1 BROBLASTES EN CULTURE... 22

a) Techniques de culture... 22

b) Etude en microscopie photonique... 22

c) Etude en microscopie électronique. 23 d) Etude de la cinétique d'incorporation du soufre marqué et de la correction mutuelle. ... 25

3. SPECIFICITE DES METHODES "D'HISTOCHIMIE ULTRA- STRUCTURALE" ... 25

a) Coloration argentique... 25

b) Coloration à l'acide phosphotungstique .... 28

c) Coloration au fer colloïdal . 29

d) Conclusion... 30

Pages CHAPITRE III : MUCOPOLYSACCHARI DOSES DE TYPES I A III

(MALADIES DE HURLER, DE HUNTER ET DE

SANFILIPPO)... 31

1. OBSERVATIONS CLINIQUES. ... ... 31

2. ETUDE. ENZYMOLOG IQUE... 35

3. ETUDE BIOCHIMIQUE... ... ... 36

4. ETUDE MORPHOLOGIQUE . ... 36

A. FOIE... 37

a) Microscopie photonique... 37

b) Microscopie électronique. . . . . ... 37

Hépatocytes... 37

Cellules de Kupffer... 40

EspacedeDisse ... 40

Sinusoïdes... 41

B. RE IN ... 41

a) Microscopie photonique... 41

b) Microscopie électronique... 41

G I omér U les... 41

Tubes... 42

Tubes contournés proximaux... 42

Anses de Henle et tubes contournés distaux. . 42

Tissu interstitiel... 44

C. CERVEAU... 44

Microscopie électronique... 44

D. VALVULE M ITRALE... 45

a) Microscopie photonique... 45

b) Microscopie électronique... 45

5. ETUDE bUSTOCH IM IQUE EN MICROSCOPIE ELECTRONIQUE, ... 46

6. ETUDE DES FIBROBLASTES EN CULTURE . . ’... 48

a) Microscopie ph-otonique... 48

b) Microscopie électronique... 48

7. DISCUSSION. ... 50

A. DONNEES CLINIQUES, RADIOLOGIQUES ET BIOLOGIQUES. . 50

B. DONNEES ENZYMOLOG 1 QU ES... 55

C. DONNEES MORPHOLOGIQUES... ‘ . 58

D. DONNEES DE LA CULTURE DE FIBROBLASTES. ... 69

E. APPORT ETIOPATHOGENIQUE... ... 71

8. RESUME... 77

Pages

CHAPITRE IV : MUCOPOLYSACCHARI DOSE DE TYPE IV

(MALAD I E DE MORQU 10)...78

1. OBSERVATIONS CLINIQUES... '...79

2 . ETUDE ENZYMOLOG I QUE... 80

3. ETUDE MORPHOLOGIQUE DU FQ I E... 80

a) Microscopie photonique ... 80

b) Microscopie électronique ... 81

Cellules de Kupffer... 81

Hépatocytes ... 82

EspacedeDisse... 83

S i nusoTdes... 83

4. DISCUSSION...84

A. DONNEES CLINIQUES, RADIOLOGIQUES ET BIOLOGIQUES. . . 84

B. DONNEES MORPHOLOGIQUES ... 87

C. APPORT ETIOPATHOGENIQUE...89

5. RESUME... 91

CHAPITRE V : MUCOPOLYSACCHAR I DOSE DE TYPE VI (MALADIE DE MAROTEAUX-LAMY)...92

1. OBSERVATION CLINIQUE. . ...93

2. ETUDE ENZYMOLOG I QUE... ... 93

3. ETUDE MORPHOLOGIQUE DU FO I E... 93

Microscopie électronique... 93

Cellules de Kupffer... 94

Hépatocytes... 94

Espace de D i sse...95

Sinusoïdes... 95

Coloration argentique ... 95

4. ETUDE DES FIBROBLASTES EN CULTURE... 96

5. DI SC.USS ION... 96

A. DONNEES CLINIQUES, RADIOLOGIQUES ET BIOLOGIQUES. . . 96

B. DONNEES ENZYMOLOGI QU ES... 100

C. DONNEES MORPHOLOGIQUES ... 100

D. DONNEES DE LA CULTURE DE FIBROBLASTES...102

E. APPORT ETIOPATHOGENIQUE... 103

6. RESUME... .103

Pages

CHAPITRE VI ; THESAURISMOSES MIXTES . . • • • ... • • 105

I. GANGLIOS IDOSE GMj (MALADIE DE LANDING)... 105

1. OBSERVATION CLINIQUE ... 106

2. ETUDE ENZYMOLOG I QUE...’... 108

3. ETUDE MORPHOLOGIQUE DU FO I E... 108

a) Microscopie photonique... 108

b) Microscopie électronique... 108

Hépatocytes... 108

Cellules de Kupffer, ... . . . . 109

4. ETUDE DES FIBROBLASTES EN CULTURE... 110

5 . DI SCUSS ION... 111

A. DONNEES CLINIQUES, RADIOLOGIQUES, BIOLOGIQUES ET BIOCHIMIQUES... 112

B. DONNEES ENZYMOLOG i QU ES... 115

C. DONNEES MORPHOLOGIQUES... 116

D. DONNEES DE LA CULTURE DE FIBROBLASTES .... 120

E. APPORT ETIOPATHOGENIQUE ... 121

6. RESUME... 123

U. MUCOSULFATIDOSE (MALADIE DE AUSTIN) ... 125

.1. OBSERVATION CLINIQUE... 126

2. ETUDE ENZYMOLOGIQUE ... 126

3. ETUDE MORPHOLOGIQUE... 126

A. FOIE. . . ... 126

a) Microscopie ph.otoni.que... . 126

b) Microscopie électronique... 126

B. REIN... 127

Microscopie électronique... 127

G IomérU les... 127

Tubes contournés dis.taux... 127

Tissu interstitiel... 128

Pages

4. ETUDES DES FIBROBLASTES EN CULTURE...129

5. DI SCUSSION... 129

A. DONNEES CLINIQUES, RADIOLOGIQUES ET BIOLOGIQUES 129 B. DONNEES EN Z YMO LOG I QU E S... ... 130

C. DONNEES BIOCHIMIQUES ... ... 131

D. DONNEES MORPHOLOGIQUES... 132-'

E. DONNEES DE LA CULTURE DE FIBROBLASTES ... 135

F. APPORT ETIOPATHOGENIQUE... . 135

6. RESUME ... ... 137

FUCOSIDOSE (MALADIE DE DURAND) . ... ... 138

1. OBSERVATION CLINIQUE ... 138

2. ETUDE ENZYMOLOGI QUE...140

3. ETUDE BIOCHIMIQUE... ... . 140

4. ETUDE MORPHOLOGIQUE... 141

A. FOIE... ... 141

a) Microscopie photonique ... 141

b) Microscopie électronique... ... . 142

Hépatocytes... 142

Cellules de Kupffer... 144

EspacedeDisse... 144

B. CERVEAU... ... . 144

Microscopie électronique... ... 144

5. ETUDE DES FIBROBLASTES EN CULTURE... 145

6. DI SCUSS ION... 145

A. DONNEES CLINIQUES, RADIOLOGIQUES ET BIOLOGIQUES 145 B. DONNEES ENZYMOLOG I QU ES... 146

C. DONNEES BIOCHIMIQUES ... 147

D. DONNEES MORPHOLOGIQUES... ... 148

E. DONNEES DE LA CULTURE DE FIBROBLASTES... 150

F. APPORT ETIOPATHOGENIQUE ... ... 150

7. RESUME... ... 151

AUTRES LIPIDOSES PEUT ETRE ASSIMILABLES AUX THESAU­ RISMOSES MIXTES (MALADIE DE FABRY ET LEUCODYSTROPH I E METACHROMATI QUE)... 152

Pages

CHAPITRE VII : THESAURISMOSES DE NATURE MAL DEFINIE...154

I. "MUCOPOLYSACCHARIDOSE GAL +"... 154

1. OBSERVATIONS CLINIQUES ... 154

2. ETUDE ENZYMOLOG I QUE... . 156

3. ETUDE MORPHOLOGIQUE DU FOIE... 157

a) Microscopie photonique... 157

b) Microscopie électronique... ... . 157

Hépatocytes... 157

CellulesdeKupffer ... 158

EspacedeDlsse . . . ... 159

S i nusoTdes... 159

4. ETUDE DES FIBROBLASTES EN CULTURE... 159

5. DISCUSSION... 160

A. DONNEES CLINIQUES, RADIOLOGIQUES ET BIOLOGIQUES . 160 B. DONNEES ENZYMOLOG 1 QUES... 161

C. DONNEES MORPHOLOGIQUES... 161

D. DONNEES DE LA CULTURE DE FIBROBLASTES... 162

E. APPORT ETIOPATHOGENIQUE : ASSIMILATION EVENTUELLE A D'AUTRES CAS DE "CHONDRODYSTROPHI ES ATYPIQUES". 163 F. RESUME... 166

II. "I-CELL DISEASE" (MALADIE DE LEROY)... 167

1.. OBSERVATIONS CLINIQUES... 167

2. ETUDE ENZYMOLOGIQUE ... 169

3. ETUDE MORPHOLOGIQUE ... 169

A. FOIE '... 169

a) Microscopie photonique... 169

b) Microscopie électronique... 169

Hépatocytes... 169

Cellules de Kupffer et cellules endothéliales desvaisseaux... 170

Cellules vacuolisées... 171

Pages

B. REIN... 171

a) Microscopie photonique... 171

b) Microscopie électronique... ... GI oméru I es... ... . . ... 171

Tubes contournés... 172

Tissu interstitiel... 172

C. PEAU ... 173

a) Microscopie photonique... 173

b) Microscopie électronique... 173

D. CERVEAU... 173

a) Microscopie photonique... 173

b) Microscopie électronique... 173

4. ETUDE DES FIBROBLASTES EN CULTURE ... 174

a) Microscopie photonique ... 174

b) Microscopie électronique. .... ... 175

c) Enzymologie et cinétique d'incorporation du soufre marqué... 177

5. DISCUSSION... 178

A. DONNEES CLINIQUES, RADIOLOGIQUES ET BIOLOGIQUES. 178 B. DONNEES ENZ YMO LOG I QU E S . ... 179

C. DONNEES MORPHOLOGIQUES ... 180

D. DONNEES DE LA CULTURE DE FIBROBLASTES... 182

E. APPORT ETIOPATHOGENIQUE... 185

6. RESUME... 187

CHAPITRE VIN : CONCLUSIONS GENERALES . ... 189

B I BL I OGRAPH I E... 199

Abréviations utilisées

DS HS GM^

MRS QD

Dermatan-suIfate Héparan-suIfate Gang Iioside GM ^ MucopoIysaccharides

Quotient de développement a-ara

a -f UC a-ga I a-g I UC

a-arabinosidase ou a-L-arabinosidase a-fucosidase ou a-L-fucosidase

a-gaIactosidase ou a-D-gaIactosidase a-g1ucosidase ou a-D-gIucosidase

&-gIucosidase : 6 -D-gIucosidase

g-glucur : g-gIucuronidase ou B-D-gIucuronidase a-man : a-mannosidase ou a-D-mannosidase

N-acétyl- g-gaI : N-acétyl-S -ga I actosaminidase ou N-acétyl-6- -D-ga I actosam i n i dase N-acétyl- S-gluc : N-acétyl- 6_-g I ucosam L n i da se

ou N-acétyl- 6-D-gIucosaminidase -D-xyI os Ldase

: 6--g I yceroph-osphatase acide.

6, -xylosldase : S Phosphatase acide

INTRODUCTI ON

Les grands progrès réalisés depuis une trentaine d’années dans la connaissance et le traitement des maladies ont modifié profondément la nature des préoccupations du pédiatre hospita­

lier. Celui-ci a pu s'attacher d'avantage à l'étude de certaines affections dont 1'importance relative n'a cessé de croître en raison de la diminution de la mortalité infantile.

Parmi elles, le groupe des erreurs métaboliques congéni­

tales conduisant à la mort précoce ou à la détérioration men­

tale progressive et apparemment inéluctable a été considéré comme particulièrement préoccupant car il est apparu assez ra­

pidement que, pour certaines de ces affections, la connaissance précise du trouble métabolique permettait d'instaurer une thé­

rapeutique prévenant l'apparition des signes morbides, pour autant qu'un diagnostic précoce ait été posé. Ainsi, dans la phénylcéto- nurie, dans la galactosémie et la fructosémie, l'administration d'un régime adéquat empêche le développement des diverses mani­

festations pathologiques, tandis que dans Tathyréose, une théra­

peutique hormonale appliquée dès les premières semaines de la vie prévient l'apparition du crétinisme.

II est dès lors bien évident que, pour le très grand nombre de maladies héréditaires encore incurables, les espoirs théra­

peutiques sont conditionnés par une connaissance précice du trouble

2 .

métabolique ainsi que par la.possibilité d'un diagnostic pré­

coce.

Dans les deux dernières décades, les affections caracté­

risées par une accumulation de glycogène ont été bien étudiées dans cette optique, et plusieurs types caractérisés par un dé­

ficit enzymatique différent ont été définis. Dans la glycogé- nose de type II ou maladie de Pompe, Hers (1963) a pu montrer qu'il existait un déficit en un enzyme lysosomial glycogénoly- tique, la maltase acide. L'étude ultrastructurale d'un fragment biopsique de foie, prélevé chez un enfant atteint de cette af­

fection investigué dans le Service de Pédiatrie de l'Hôpital St.Pierre à Bruxelles, a permis à Baudhuin et co1I. (1964) de montrer, pour la première fois, la localisation intra-I ysoso- miaie d'un matériau stocké, en l'occurence le glycogène. Sur la base de ces constatâtions, Hers (1965 ) a introduit la notion de maladie lysosomiale congénitale à propos des affections dans

lesquelles la carence en une hydrolase lysosomiale conduit à l'accumulation, au niveau de l'appareil vacuolaire, du ou des substrats normalement dégradés par cet enzyme.

Les études enzymatiques et ultrastructurales se révélaient dès lors indispensables, aux côtés des investigations cliniques, histochimiques et biochimiques, à une définition précise des maladies de stockage.

3 .

L'étude U 11rastrUCtUra[e est d'un apport particulièrement important. Elle permet en effet, à partir d'un petit fragment d'organe souvent aisément prélevé par ponction biopsie, de voir

la substance stockée ainsi que le type d'organite dans lequel s'effectue l'accumulation. Les images obtenues étant souvent spécifiques de chaque type de maladie, cette technique permet souvent d'approcher le diagnostic et d'orienter dès lors le bio­

chimiste ou I ' enzymoIogiste vers le type de dosages à effectuer.

Elle constitue, de ce fait, un élément partieu 1ièrement utile pour essayer de préciser la nature exacte du trouble métabolique.

De plus, ce moyen direct et relativement rapide de détection des stockages intraceI 1 u 1 aires permet la définition d'entités mor­

bides nouvelles ainsi que l'établissement de diagnostics précoces Cette double perspective - apport à la connaissance du trou­

ble métabolique et possibilité de diagnostic précoce - confère à ce type d'étude un grand intérêt en clinique pédiatrique.

Au moment de notre entrée dans le Service de Pédiatrie, deux cas de mucopo1ysaccharidoses avaient subi une biopsie hépatique, et les études enzymo1ogiques et ultrastructurales des fragments avaient permis à Van Hoof et Hers (1964) d'apporter des argu­

ments en faveur de l'assimilation de ce type d'affection au groupe des maladies lysosomiales congénitales.

Nous avons alors entrepris, à l'instigation du Prof. R.Dubois, un programme d'étude des chondrodystrophies dans lesquelles un

trouble du métabolisme des mucopoIysaccharides pouvait être sus­

pecté en portant plus particulièrement notre effort sur i'étude U ItrastructuraIe des biopsies.

Dans ia suite, ies travaux de Danes et Bearn (1966 a) ayant montré l'intérêt de la culture de fibroblastes dans ce type de ma­

ladie, nous avons pu, avec la collaboration du Dr. E.Vamos, ajouter cette technique à la mise au point des cas qui nous étaient confiés.

Le présent travail concerne les résultats que nous avons obtenus après sept ans d'application de ce programme d'étude.

H I STORIQUE

Depuis les descriptions cliniques de Hunter (1917) et de Hurler (1919), un groupe de maladies associant une chondrodys- trophie généralisée, un faciès particulier, un nanisme, des anomalies viscérales et, le plus souvent, de la débilité men­

tale a pu être isolé. Ellis et coI1. (1936) ont proposé le terme de "gargoylisme" pour caractériser cette entité, étant donné l’as pect part i cU I i êrement dysmorphique du visage. En 1952, Brante a démontré biochimiquement la présence d'une surcharge en mucopoly- saccharides dans les tissus de patients atteints de gargoylisme et, dans la suite, Dorfman et Lorincz (1957) ainsi que Meyer et coll. (1958) ont mis en évidence une élimination urinaire accrue de ce type de substances.

De nombreuses études ont été consacrées depuis lors aux chon drodystrophies liées à un trouble du métabolisme des mucopolysac- charides. Ces travaux ont permis la définition de plusieurs types distincts (Meyer et Hoffman, 1961 ; Sanfilippo et coll., 1963 ; Scheie et coll., 1962 ; Maroteaux et coll., 1963) ainsi que l'as­

similation de la maladie de Morquio à ce groupe d'affections (Maroteaux et Lamy, 1961, 1963).

Six types différents, dont les caractéristiques principales sont résumées au tableau I, ont ainsi pu être isolés sur des bases cliniques, génétiques et biochimiques (Maroteaux et Lamy,1965 ; Maroteaux, 1 967 ; McKusick et coll.,1965 ; McKusick,1966,1969) .

L'emploi de techniques d'investigation nouvelles a permis d’é­

lucider Progres sivement les mécanismes étiopathogéniques de ces maladies.

C'est ainsi que les études ultrastructurales de Van Hoof et Hers (1964) ont apporté les premiers arguments en faveur de la lo­

calisation intraIysosomia Ie du stockage de mucopoI ysaccharides dans le foie. Aleuet coll.(1965) ont montré que, dans les neu­

rones, les lipides étaient accumulés dans des inclusions similaires Plusieurs auteurs ont tenté, dans la suite, de définir le type de déficience enzymatique responsable de ce stockage. Une diminu­

tion souvent profonde de l'activité de la B -ga1actosidase a été rapportée au niveau de plusieurs organes dans la plupart des cas de mucopoIysaccharidoses de types là III (Van Hoof et Hers,1968 b Ockermann,1968). Ho et O'Brien (1969) ont montré que cette anomalie correspondait à une carence totale en certains iso-enzymes et

MacBrinn et coll. (1969 a) ont suggéré que ce trouble enzymatique pourrait être responsable de l'accumulation intratissulaire de muco polysaccharides. Plus récemment Patel et coll.G1970) ont décrit au

Tableau I. Classification des mucopoIysaccharidoses et CO I I ., 1965 )

(selon McKusick

Type Eponyme T ransmission Anomalies osseuses

Déficit menta1

MPS urinaires

1 Hur1er Autosomique

récessive

Sévères Sévère ^ Héparan-su /I Dermatan-su

f at e f at e 1 1 Hunter Liée au sexe Sévères Modéré à

sévère

Héparan- su

■/i Dermatan-su

f at e f at e 1 1 1 Sanfi1ippo (ou

01igophrénie po 1 ydyst roph i que)

Autosomique récessive

Modérées Sévère Héparan-su f at e

IV Morqui0 Autosomique récessive

Sévères Absent Kératan-su fat e

V Scheie (ou forme tardive)

Autosomique récessive

Modérées Modéré Héparan- su / Dermatan-su

fat e f at e VI Maroteaux-Lamy

(ou nanisme

po 1 ydyst roph i que)

Autosomique récessive

Sévères Discret / Dermatan-su f at e

7 .

niveau du foie une diminution de l'activité de I 'hyaIuronidase dans les types 1 à III, ainsi que de celle de la p-nitrophényl- sulfatase dans le type I. Le rôle étiologique de ces anomalies ne paraissait cependant pas certain à ces auteurs.

Parallèlement, l'application à l'étude de ces maladies de la technique de culture de cellules a apporté des perspectives de compréhension nouvelles.

En 1966, Danes et Bearn (1966 a) ont montré, dans les quatre premiers types de mucopoI ysaccharidoses, que les fibroblastes en culture sont métachromatiques au bleu de toluidine et colorables par le bleu alcian. L'existence ainsi suggérée d'une accumulation de mucopo1 ysaccharides dans ces cellules a été confirmée dans la suite, b 1ochimiquement, par plusieurs auteurs (Danes et Bearn, 1966 b ; Matalon et Dorfman,1966 ; Schaffer et co I I . , 1 966, j^968 ) . Ce stockage est provoqué par un ralentissement de la dégradation

intracellulaire de ces substances (Fratantoni et coll.,1968 a).

Fratantoni et coll. (1968 b) ont par ailleurs démontré que, dans un type de mucopoI ysaccharidose donné, l'anomalie métabolique disparaît si les cellules sont mises en contact avec des cultures de sujets normaux ou atteints d'un autre type de mucopolysaccha- ridose. Le trouble métabolique est également corrigé par la simple présence d'un milieu nutritif ayant été au contact de la culture

8 .

allotypique. Des travaux complémentaires (Fratantoni et coll., 1969) ont montré que [es facteurs de correction étaient des substances protéiques, dialysables dans le milieu extracellu­

laire , d i f f é re nt s de la 3-ga I actosidase et des acides nucléiques et assimilables à des enzymes lysosomiaux (Neufeld et coll.,

1971). Il suffit donc d'explorer la correction éventuel le du trouble métabolique d'une souche donnée de fibroblastes mise en contact avec les différents facteurs correcteurs pour con­

naître le type de mucopoI ysaccharidose auquel appartient cette souche. Cette méthode a montré qu'il existe une identité appa­

rente du trouble biochimique dans les maladies de Hurler et de Scheie (Wiesmann et Neufeld, 1970), ainsi qu'une hétérogénéité du syndrome de Sanfilippo (Krésse et coll., 1971).

Dans la plupart des mucopoIysaccharidoses, la nature du déficit enzymatique est actueIIement bien connue (tableau II ;

Bach et coll., 1972, 1973 a et b ; Kresse et Neufeld, 1972 ; Matalon et coll., 1971 ; Matalon et Dorfman, 1972 ; O'Brien,

1972 b) et l'identité de certains de ces enzymes avec les facteurs correcteurs correspondants est bien établie (Bach et coll., 1972 ; Kresse et Neufeld, 1972 ; Von Figura et Kresse, 1972).

L'implication clinique de ces notions récentes commence à apparaître clairement. L'existence de facteurs correcteurs dif­

fusibles de nature enzymatique permet en effet d'entrevoir la

Tableau II. Classification actuelle des mucopoIysaccharidoses Déf i c i,t

en zymatique Type Eponyme C hondro-

dystrophie

Déficit menta 1

Substance accumulée ou excrétée

a-iduronidase

1

V

Hur1er

Scheie

+++

+

+++ Héparan-sulfate +

Dermatan-sulfate Sulfo-iduronate

su 1fatase 1 1 Hunter + à ++ - à +4- Héparan-sulfate

, +

Dermatan-sulfate Héparan-sulfatase

"'a Sanfi1ippo A + +++ Héparan-sulfate

N-acéty1 -

a-g1ucosaminidase

MIb Sanfi1ippo B + +++ Héparan-sulfate

•p 1 V Morquio ++-f ^- Kératan-sulfate

(Facteur correcteur spécifi que)

VI Maroteaux-Lamy + à +++ ^- Dermatan-sulfate (+ héparan-su1fate)

7 VI 1 Dygvve ++ ++ Mucopo1ysaccharIdes

désu 1 fatés

(P-glucuronidase) ChondroTtine-4-su1 faturie + - ChondroTtine-4-sulf.

7 Chondro7tine-6-sulfaturie + + ChondroTtine-6-sul f.

9.

possibilité de thérapeutiques spécifiques et iI a été démontré à propos des types I et II, que les transfusions de plasma

(Di Ferrante et coll., 1971) ou de leucocytes (Knudson et coll., [971) provenant d'individus normaux induisaient une améliora­

tion clinique et biochimique chez les patients. Bien que l'effet de ce type de thérapeutique soit contesté par certains (Crocker,

1972 ; Dekaban et coll., 1972 ; Erickson et coll., 1972), il est vraisemblable que, dans l'avenir, la purification des enzymes correcteurs puisse rendre possible des traitements efficaces par substitution enzymatique.

A côté de ces six types de mucopolysaccharidoses , la I i 11 é - rature récente rapporte de nombreux cas qui, sous l'angle clinique, radiologique, biochimique, enzymoIogique et/ou ultrastructural ne peuvent pas entrer dans cette classification.

Dans certains cas, il existe une discordance entre le tableau clinique et la nature de la mucopoIysaccharidurie. Ainsi, Clausen et coll. (1963) et Pena et coll. (1965) ont rapporté deux obser­

vations cliniquement typiques de maladie de Hurler avec élimination exclusive de de rma ta n--s u 1 f a te tandis que McKusick et coll. (1972) ont décrit des patients présentant des signes cliniques suggestifs de maladie de Maroteaux-Lamy alors qu'il existait une excrétion urinaire accrue d'héparan- et de dermatan-su Ifate et que le déficit

10.

enzymatique était identique à celui qu'on observe dans les maladies de Hurler et de Scheîe, ainsi qu'un patient dont l'as­

pect suggérait un syndrome de Scheie mais dontlle typage au moyen des facteurs correcteurs a permis l'assimilation au syn­

drome de Maroteaux-Lamy. Dans les deux cas décrits par Loeb et

CO I [ . (1969 b) et repris dans la présente étude (cas 22 et 23), [es signes de chondrodystrophie étaient particulièrement modé­

rés ; la mucopo1ysaccharidurie était normale chez l'un des pa­

tients. tandis que l'autre présentait une excrétion accrue

d'héparan- et de dermatan-suIfa te ; mais surtout, l'étude enzy- mologique et uItrastructuraIe du foie a révélé des anomalies très différentes de celles observées dans les mucopoI ysaccha- r i doses typiques.

Plusieurs syndromes caractérisés par une mucopoIysaccharidur i e de nature différente ont pu être définis (tableau 11). En 1962, Dyggve et co11. ont décrit, chez 3 patients d'une même fratrie,-

l'association d'une chondrodystrophie rappelant le syndrome de Morquio et d'une débi1ité mentale profonde. Comme iI a été démon­

tré plus tard, les urines contiennent un excès de mucopo1 ysaccha- ridss désulfatés (Clausen et coll., 1970). Par ailleurs, Thompson et coll. CI968, 1971), Philippart et Sugarman (1969) ainsi que

Spranger et coII. (1971 a) ont isolé une entité morbide carac­

térisée par une chondrodystrophie modérée, des signes importants d’envahissement viscéral et une élimination urinaire accrue de chondroTtine-4-suIfate ; I 'u I trastructure hépatique s’est révélée très similaire à celle qui a été décrite dans les mucopo1ysaccha- ridoses de types I à lil (Freitag et col!., 1971 c). Enfin, une excrétion accrue de chondroTtine-6-suIfate a été décrite chez un patient présentant des signes de chondrodystrophie accompagnés d'un déficit de l’immunité cellulaire et d’un syndrome néphro­

tique (Schimke et coII., 1971).

De nombreux cas de mucopoIysaccharidoses sans mucopolysac- charidurie ont été rapportés dans la littérature. Certains res­

tent des entités cliniques isolées et assez mal définies (Langer et coll., 1966 ; Steinbachet coll., 1968 ; Marchai et coll.,

1968 ; Winchester et coll., 1969 ; Goldberg et coll., 1971).

D'autres ont été classés sous le vocable de "mucopo1ysaccha r i doses focales". Il s’agit du nanisme géIéophysique (Spranger et coll., 1971 b) et du "stiff skin syndrome" (Esterly et McKusick, 1971).

Un autre groupe de patients associent à un degré variable des signes de chondrodystrophie et de lipidose, et les études biochimiques et ultrastructurales des tissus décèlent une thé­

saurismose mixte, mucopoIysaccharidique et lipidique. Ainsi, la gang1iosidose GMj a d'abord été individualisée par Norman et coll.

(1959) comme une "maladie de Tay-Sachs avec envahissement viscéral

tandis qu'elle était considérée par Craig et coll. (1959) comme une "variante du syndrome de Hurler". La mise en évidence d'une

accumulation combinée de.;ga ng 1 i os i de GMj (O'Brien et coll., 1965) et de kératan-suIfate (Suzuki, 1968) a confirmé son caractère de thésaurismose mixte. Ainsi encore, dans la mucosu1 fatidose définie par Austin (1963 a), des signes modérés de chondrodystroph i e sont associés à une IeucoencéphaIopathie, et l'étude biochimique montre

l'accumulation à la fois de sulfatides (Austin, 1963 a) et de muco- polysaccharides similaires à ceux qui sont stockés dans les muco- poI ysaccharidoses de types I à III (Bischel et coll., 1966). Enfin,

la fucosidose a été définie par Durand et coll. (1967 a et b) chez deux enfants présentant un tableau de 1eucoencéphaIopath i e sugges­

tif de lipidose tandis que, dans un cas que nous avons observé

(Loeb et coll., 1969 c), l'attention avait été attirée par un degré modéré de dysmorphie associé à de la débilité mentale. La nature mixte de I a’ thésaurismose (lipides et mucopoIysaccharides ou gly­

coprotéines) a été confirmée par les études biochimiques (Van Hoof et Hers, 1968 a ;Philippart, 1969 a et b) et ultrastructurales

(présente étude).

Spranger et Wiedemann (1970) ainsi que Maroteaux et coll.

(1970 b) ont classé, sous le vocable de "mucoIipidoses génétiques", un groupe d'affections comprenant les thésaurismoses mixtes envi­

sagées ci-dessus ainsi que des maladies de nature moins bien définie

13.

qui, sur le plan clinique, présentent des signes suggestifs de mucopoIysaccharidose et de lipidose (tableau III). Comme nous le verrons dans les chapitres VI et VII, ce groupe comprend en fait des maladies de nature très différente, pour lesquel les un sto­

ckage mixte de mucopoIysaccharides et de lipides n’est pas tou­

jours prouvé. Cette nomenclature nous paraît donc sujette à cau­

tion et ne sera pas utilisée dans la classification des maladies étudiées dans le cadre du présent travail.

Il apparaît ainsi que les techniques d'investigation modernes ont permis de démembrer le "gargoylisme" en de nombreux syndromes distincts. Certains sont actuellement bien définis par la mise en évidence de la déficience enzymatique étiopathogénique. D'autres ont pu être isolés sur des bases biochimiques et/ou ultrastructu­

rales ainsi que par la culture de fibroblastes. La plupart peuvent entrer dans le cadre des maladies lysosomiales congénitales.

Au cours de nos investigations, nous avons souvent pu établir des corrélations entre les signes cliniques, les résultats des études biochimiques et l'aspect morphologique des tissus et des

fibroblastes en culture. Il nous est ainsi apparu que l'aspect ultrastructural était très souvent spécifique du type de substance

Tableau III. Classification des thésaurismoses mixtes et des thésaurismoses de nature mal définies reprises sous le nom de "mucolipidoses"

Groupes Type - Nom Chondro- Déficit Siibstances Déficit dystrophie mental accumulées enzymatique

THESAURISMOSES MIXTES

Gang 1 iosidoses GM^

P-ga1actosidase

~ général isées (type l) + à +++ ++4- GM^ et fractions A,B,C kératan-su 1f.

- tardive (type II) - +++ hyposulfaté P-ga1actosidase fractions B, C Mucosu 1 fat i dose + +++ Dermat an-sulf. ary 1-su 1 fat ases

héparan-su1f. A, B, C su 1 fatides

Fucosidose + +++ Fucosyl— a-fucosidase

g 1yco1 iPides &

glycoprotéines

THESAURISMOSESOE NATUREMAL

D E F IN IE S

Type 1 :

1ipomucopo1ysaccharidose (ga!+)

-sous-type A + à ++ +++

sous-type B (mannosidose?) + à + +++ mannosides ? a-mannos i dase ?

Type II : 1-cell disease +++ +++ multiple

Type III : pseudopoly- ++ + dystrophie de Hurler-**^

* Maroteaux et Lamy, 1966

14.

accumulée et, de ce fait, de la maladie considérée. De plus, l'utilisation de plusieurs techniques, notamment d'histochimie et d ' histoenzymoIogie, dans l'étude des altérations ultrastruc­

turales a permis d'apporter des arguments très utiles à la com­

préhension des mécanismes étiopathogéniques de ce type de maladies.

C'est pourquoi il nous a paru intéressant de rapporter ici les résultats d'une étude réalisée chez 29 enfants présentant di­

verses formes de thésaurismoses entrant dans le cadre qui vient d'être délimité. Nous envisagerons d'abord le groupe des rnucopoly- saccharidoses :types I à III, de type IV et de type VI. Les

"thésaurismoses mixtes" seront ensuite traitées, et nous parlerons en dernier lieu de certains cas de chondrodystrophies non assimi­

lables à ces formes bien définies.

MATERIEL ET METHODES

I . MATER I EL

La liste des cas étudiés et la nature des investigations principales effectuées sont indiquées autableau IV.

Les patients i à 6, 9 à 11, 14 à 17 et 21 à 24 ont été ad­

mis de 1964 à 1971 au Service de Pédiatrie de l’Hôpital Univer­

sitaire St.Pierre.à Bruxelles (Prof. R.Dubois). Dans tous ces cas, l’étude radiologique a été réalisée par le Dr. N.Crémer au Département de Radiologie Pédiatrique du Service de Radiologie de l’Hôpital Universitaire Saint-Pierre (Prof. A.Bollaert) et l’étude hémato1ogique par le Dr. R.Deno1in-Reubens au Départe­

ment d’HématoIogie du Service de Microb i oIogie-HématoIogie-I m- munologie de l’Hôpita! Universitaire Saint-Pierre ( Prof.R.Linz) . L’analyse quantitative et qualitative des mucopoIysacchar i des urinaires a été effectuée par Mme C.Riedl au Laboratoire de Recherches Pédiatriques.

Les patients 7 et 18 ont été mis au point par le

Prof. C.Lambotte, Clinique et Polyclinique des Maladies de l’En­

fance (Prof. A.Lambrechts) de l’hôpital de Bavière,Université de Liège, et le dosagedes mucopolysaccharides urinaires a été pratiqué, dans ces cas, par le Dr. R.Winand (concernant le cas 7, cf. Lambotte et Winand, 1971 ; Winand et Lambotte, 1971). L’ob­

servation du cas 8 a été effectuée par le Dr. M.Bersez, Hôpital Civil de Renaix. Les cas 12 et 25 ont été mis au point par les

Tableau IV. Liste des cas étudiés et nature des investigations principales pratiquées

M a 1 adie Cas Hydro1ases hépat i ques^^

M i croscopie électron i oue Culture de tissus Fo i e Rein Cerveau Peau Optique E1ectronique Mucopo1

type 1

ysaccharidose 1 + 4- 4-

Mucopo1 ysaccharidose 2 + 4- type 1 précoce

Mucopo1 ysaccharidose 3 + 4- 4-

type II probab1e 4 4- 4* 4-

Mucopo1 ysaccharidose 5 +

type 11 6 + 4- 4- 4-

7 . + 4- 4- 4-

8 + 4- 4- 4- 4-

Mucopo1 ysacchar!dose 9 + 4-

type 11 1 10 + 4- 4- 4-

11 + 4- 4- 4-

12 + 4-

13 4- +

14 4- + 4-

Mucopo1ysacchar tdose 15 4- •4-

type 1V l6 4- 4-

17 ^O. 4-

Mucopo1 ysaccharidose l8 4- 4- 4-

type VI

Tableau IV. (Suite)

Ma 1 adie Cas Hydro1ases Microscopie électronique Cu1ture de tissus Foie Rein Cerveau Peau Optique E1ectronique hépat i ques-*^

Gangllosidose GM^ 19 ^{+ + + +}

Mucosulfatidose 20 ^{+ + + + +}

Fucosidose 21 ^{+ 4-}

Mucopo1ysaccharidose 22 ^{+ + +}

Gal + 23 ⁺ + + +

"! -ce II d i sease " 24 + -f- 4* 4“ 4- + +

25 + + + + +

26 + + 4- ^•K-

27 + + +

28 + + +

29 + 4* +

* Etudes effectuées par le Dr. F. Van Hoof au Laboratoire de Chimie Physiologique de'I'Université de Louvain.

Drs. G.De Montis et P.Garnier, Hôpital Saint Vincent de Paul à Paris (Prof. A.Rossier). Le cas 13 a été étudié par le

Prof.Agr.J.P.Farriaux, à la Clinique Pédiatrique de la Cité Hos­

pitalière de Lille (Prof. G.Fontaine), le cas 19 à la Clinique de Génétique médicale de l’Hôpital des Enfants Malades à Paris

(Prof. P.Maroteaux). Le cas 20 a été investigué par le Dr.

S.Rampini (Rampini et coll., 1970) au Kinderspital de Zürich (Prof. A.Prader). Le matériel concernant le cas 26 nous a été aimablement fourni par le Prof. R.Eeckels, K i ndergeneeskunde, Katholieke Universiteit Leuven et par le Dr. F.Van Hoof du La­

boratoire de Chimie Physiologique de I’Université de Louvain (Prof. H.G.Hers), et celui du cas 27 par le Dr. U.Wiesmann, Spital fur Kinderkrankheiten, Bern. Le cas 28 a été étudié par

le Dr. J.P.Gubert à l’hôpital Hérold à Paris (Dr. P.Grenet), et le cas 29 par le Dr. R.Walbaum, Chef du Service de Pédiatrie du Centre Hospitalier de Roubaix.

Nous tenons à exprimer ici notre plus vive reconnaissance aux Chefs de Service et à leurs collaborateurs qui ont bien voulu

nous permettre de participer à la mise au point des cas qui leur étaient confiés. Sans leur précieuse aide, il ne nous aurait pas été possible de réaliser ce travail.

2 . METHODES

A. TECHNIQUES DE PRELEVEMENT a. Prélèvements hépatiques

Dans tous ies cas, excepté le cas 26, les prélèvements ont été pratiqués par ponction biopsie sous anesthésie locale ou générale. Les fragments ainsi obtenus ont été divisés en deux parties. L’une d’entre e1 I es, destinée à l’étude enzymo1ogique,

a été refroidie immédiatement à 0°C et stockée à -40°C après un temps variant de 20 minutes à 6 heures ou congelée dans de la glace salée ou de la carboglace avant le stockage. L’autre par­

tie a été fixée suivant !a technique indiquée à propos de l’étude U 1trastructurale.

Dans les cas 3 et 21, des biopsies chirurgicales de foie ont été pratiquées pour étude biochimique, après que l’étude ultrastructurale de la ponction biopsie ait révélé la présence d’un stockage anormal. Du matériel autopsique a été obtenu, moins de 40 minutes après le décès, chez les patients,6, 24 et 26.

b. Prélèvements rénaux

Ceux-ci ont également été effectués à I ’aigui I le, sous narcose, soit à l’aveugle (cas 8, 10, 11, 24, 25), soit sous contrôle radiologique après injection d’un produit de contraste

iodé (cas 20). Dans les cas 6 et 26, seul le matériel autopsique aétéexaminé.

c. Prélèvements cérébraux

Les biopsies cérébrales (cas 1, 3, 11, 21, 24) ont été ef­

fectuées sous narcose au niveau d'un lobe frontal au Service de Neurochirurgie de l’Hôpital Universitaire St.Pierre (Prof.

J.Brihaye) pour les cas investigués à Bruxelles. Pour l’étude biochimique, les substances grise et blanche ont été séparées et les fragments ainsi obtenus, enveloppés dans du parafilm, ont été immédiatement refroidis à 0°C et stockés, moins de deux heures plus tard, à -40°C. Des échantillons des deux types de substances ont été fixés immédiatement suivant la technique décrite à pro­

pos de l’étude ultrastructurale.

d. Prélèvements cutanés

Ceux-cî, essentiellement destinés à la mise en culture, ont été effectués sans anesthésie, entre les mors serrés d’une pince courbe. Dans le cas 24, un fragment a été fixé pour l'étude ultra- structurale.

B. ETUDES BIOCHIMIQUES

L’étude des lipides cérébraux a été réalisée sur des prélè­

vements biopsiques (cas 1, 3, 21) et autopsique (cas 6) par Melle G.Jonniaux, au Laboratoire de Biologie Médicale

(Prof.P.E.Grégoire - Prof.J . R.M.Franekson) de l'Hôpital Universi­

taire Saint-Pierre à Bruxelles. Des études similaires ont également été pratiquées sur deux prélèvements biopsiques de foie (cas 3 et 21) ainsi que sur un prélèvement autopsique de foie et de rein (cas 6). Les techniques, décrites antérieurement CLoeb et coll., 1968 a, Grégoire et coll.,1969), ne seront pas reprises dans le cadre de ce travaiI.

Le taux de mucopo1ysaccharides du foie (cas 1, 3, 9, 21) a été déterminé par le Dr.F.Van Hoof au Laboratoire de Chimie Physiolo­

gique (Prof.H.G.Hers) de l'Université de Louvain (Van Hoof et Hers, 1968 b). La technique dose l'acide hexuronique des mucopoIysaccha- rides ; toutefois, elle n'est pas absolument spécifique des acides uroniques et donne également une réaction positive avec les oses neutres (Van Hoof, 1972).

Le dosage de l'acide uronique et la séparation chromatogra- phique des mucopolysaccharides urinaires ont été réalisés selon des techniques rapportées précédemment (Dodion et coll., 1966).

C. ETUDE DES HYDROLASES ACIDES HEPATIQUES

Ces études ont été effectuées par le Docteur F.Van Hoof au Laboratoire de Chimie Physiologique de l'Université de Louvain

(Prof. H.G.Hers). La plupart des techniques ont été décrites par ailleurs (Van Hoof et Hers, 1968 b) et dosent l'activité totale des enzymes au moyen de substrats synthétiques, sauf pour I 'et - glucosidase, mesurée par la libération de glucose à partir de maltose. La détermination des aryI-su 1fatases a été effectuée dans le cas 20 au moyen de substrats p-nitrocatécho1 et méthy I- umbelliféryl (Van Hoof, communication personnelle).

D. ETUDE DES ORGANES EN MICROSCOPIE PHOTONIQUE

Le matériel a été fixé et enrobé suivant la méthode décrite à propos de l'étude uItrastructuraIe (paragraphe Ea ) . Des coupes semi-fines ont été colorées au bleu de toluidine à pH 7,4.

E. ETUDE DES ORGANES EN MICROSCOPIE ELECTRONIQUE^

a. Coloration au plomb (cas 1 à 4, 6 à 29)

Les spécimens de foie, de rein, de peau et de substance grise ont été coupés en fragments d'environ 1mm de côté,ceux de substance blanche ont été divisés en languettes parallèles au sens des fibres myéliniques. Ms ont ensuite été fixés pendant

lh30 à 4°C, dans du g 1utaraIdéhyde 4,2^ tamponné à pH 7,4 selon la méthode préconisée parMillonig (1962). A la fin de la fixation.

L'étude des biopsies cérébrales a été effectuée par les Drs.

A.Résibois (cas 1 et 3) et S.MockeI-PohI (cas 11, 21 et 24) aux Laboratoires d'Anatomie Pathologique et de Microscopie Electronique de la Faculté de Médecine et l'Université de Bruxelles (Prof. P.Dustin).

20 .

les languettes ont été recoupées en fragments de moins de 1 mm de côté. Après un rinçage d'environ 20h à 4°C dans le tampon Millonig 0,1M contenant 0,54g de glucose pour 100ml, les frag­

ments ont été postfixés dans du tétroxyde d'osmium à 2% en tam­

pon Millonig glucosé, déshydratés à l'alcool et à l'oxyde de propylène, puis enrobés dans de l'Epon. Dans le cas 20, un enro­

bage en araldite ‘ a également été réalisé. Dans le cas 21, cer­

tains fragments ont été enrobés dans du méthacrylate.

Les coupes ultrafines ont été contrastées, soit par l'acé­

tate d'uranyl et par le citrate de plomb (Reynolds, 1963), soit par l'hydroxyde de plomb selon Karnovsky (méthode A, 1961). Elles ont ensuite été recouvertes d'un film de carbone et examinées aux mi­

croscopes Siemens Elmiskop 1 et Eimiskop 101, à 80KV, à des gros­

sissements variant entre 3.000 et 40.000.

b. Coloration argentique (cas 9,10,11,18,21,22,24) Les coupes ultrafines de fragments fixés en enrobés dans l'Epon suivant la méthode décrite plus haut ont été colorées par une solution alcaline d'argent ou d'argent méthénamine avec ou sans oxydation préalable par l'acide périodique, suivant les méthodes préconisées par Marinozzi (Marinozzi, 1961 ; Marinozzi et Gautier, 1961). Dans le foie du cas 21, un bloquage des radicaux aldéhydes a été réalisé par la dimédone et les coupes ont été colorées

par une solution alcaline d'argent méthénamine (Picket-Heaps,1967).

Une oxydation à ^'^2^2 (Sautier, 1961) a également été réalisée avant l'action de l'acide périodique.

c. CO 1 Oration à l'acide phosphotungstique (cas 9,16,21) Les fragments, fixés au g 1uturaIdéhyde suivant la méthode préconisée plus haut, ont été déshydratés dans de l'acétone et enrobés dans du vestopaI avec ou sans post-fixation osmiée préa­

lable. Les coupes ultrafines des tissus non post-fixés ont été

21 .

colorées à pH 1,5 par l'acide phosphotungstique en solution aqueuse à 10/S (Marinozzi et Gautier, 1961), celles des tissus post-fixés ont été colorées de la même manière après une oxydation préalable de 45 minutes par l'eau oxygénée à 2%, dans le but de faire dispa­

raître l'osmium réduit, selon la technique préconisée par Marinozzi et Gautier (1961).

d. Coloration au fer colloïdal (cas 14)

Cette réaction a été pratiquée par ie Dr. E.Konyar, selon la méthode préconisée par Hardin et Spicer (1971). Après fixation pen­

dant Ih. à 4®C au g IutaraIdéhyde 6,25% tamponné à pH 7,4 par du cacodylate de sodium 0,1 M, les fragments ont été coupés au

cryostat. Une partie des coupes, d'une épaisseur d'environ 70jj, a été immergée pendant 1 à 3 heures dans une solution de fer col­

loïdal, préparée selon Rinehart et Abul Haj (1951) et amenée à pH 1,8 par adjonction d'acide acétique glacial. Après un bref rin­

çage dans ie tampon cacodylate 0,1 M contenant 7,5 g de sucrose pour 100ml, les coupes ont été post-fixées pendant 1 heure au té­

troxyde d'osmium 2% à pH 7,4 (tampon cacodyiate), déshydratées à l'aieool et enrobées dans l'Epon. L'autre partie des coupes a été traitée de manière identique après une méthylation préalable de

18 heures à 60°C, selon la méthode de Fischer et Lillie (1954) ou après une digestion à I ' h ya I uronidase selon la méthode de Hardin et Spicer (1971). Les coupes ultrafines ont été colorées à l'acé­

tate d ' u ra ny I .

22 .

F. ETUDE DES FIBROBLASTES EN CULTURE^

a , Techniques de culture

Les biopsies cutanées ont été coupées en plusieurs fragments et mises en culture dans un coagulum de plasma (Paul, 1965) en flacons de Carrel ou en flacons plastiques Fa Icon . Elles ont été nourries par le milieu essentiel minimum de Eagle additionné de

15^ de sérum de veau foetal ou nouveau-né ainsi que de 200 U/ml de pénicilline et de 50jjg/ml de streptomycine. Après 4 à 6 semaines, elles ont été trypsinisées et subcultivées dans des nouveaux fla­

cons contenant des lamelles de verre. Dans la suite, plusieurs subcuitures ont été effectuées, suivant ia même technique, 3 à 7 jours après ia fin de la phase logarithmique. Les cellules vivantes ont été examinées à tous ies stades en contraste de phase. Les

fixations destinées aux études en microscopie photonique et élec­

tronique ont été pratiquées 3 à 7 jours après la fin de la phase logarithmique, sur des subcultures résultant de la première à la dixième trypsinisation.

b. Etude en microscopie photonique

Les techniques de coloration suivantes ont été pratiquées sur les lamelles :

- fixation au méthanol et coloration par le bleu de toluidine 0,\%

en méthanol 30^ ;

- fixation en tétrah ydrofurane-acétone (1 : 1) et coloration par le bleu de toluidine 0,1^ en acétone 255^ ;

Les cultures de fibrobIastes,ainsi que leur étude en microscopie photonique ont été effectuées par le Dr. E.Vamos, aux Labora­

toires d'Anatomie Pathologique et de Microscopie électronique de la Faculté de Médecine (Prof. P.Dustin). Elles ont étéréalisées à partir des cas mentionnés au tableau I, ainsi que de deux cas de maladie de Hurler et de trois patients atteints de maladie de Sanfilippo qui ne fonf' pas partie de notre série étant donné que nous n'avons pas pratiqué d'autres investigations pour ces malades.

23.

méthode ci-dessus, avec un traitement de 1 heure, à 37°, dans un mélange de chloroforme et de méthanol (2-1) entre la fixation et

la coloration (cas 24) ;

- fixation au méthanol et coloration au bleu alcian 0,5% en acide acétique 5% (pH 3) ;

- fixation au formol calcique et coloration au PAS ou au rouge Soudan ;

- fixation au méthanol et coloration de Haie suivait la technique modifiée de Rinehart et Abu I Haj (1951). Cette coloration a été réalisée par le Dr. E.Konyar.

Pour la mise en évidence de l'activité de la phosphatase acide, les cellules ont été fixées et incubées suivant la méthode décrite plus loin pour la microscopie électronique, en employant du 6-D-gIycérophosphate comme substrat, et révélées par un bref passage dans une solution diluée de sulfure d'ammonium. Des con­

trôles, incubés en l'absence de 3-D-gI ycérophosphate , ont été sys­

tématiquement réalisés.

c. Etude en microscopie électronique - Çoj_orat_[on_è__[^u rany_[-g j_omb

Les cellules trypsinisées, centrifugées pendant 3 minutes à 1000 tours dans des gelules plastiques ont été remises en suspen­

sion à deux reprises dans de la solution saline de Hanks puis re­

centrifugées. Le culot a été fixé pendant 1 heure à 4°C dans du g IutaraIdéhyde 2,5^ tamponné à pH 7,4 selon Millonig. Après un

rinçage d'environ 10 heures dans le tampon Mlllonig contenant 0,54g de glucose pour 100 ml, il a été post-fixé au tétroxyde d'osmium 2% (tampon Millonig 0,1 M glucosé), déshydraté à l'alcool et en­

robé dans l'Epon suivent la technique décrite au paragraphe Ea.

24 .

Les coupes ultrafines ont été contrastées par l’acétate d'uranyl et par le citrate de plomb.

- Co I ora ti^on _a rgen t j_gu e

Dans le cas 24, les coupes ultrafines de culots traités comme ci-dessus ont été colorées à l'argent après oxydation à

l’acide périodique suivant la technique préconisée par Marinozzi (1961).

- Co I orat^on _au_f er_ço|J^oTda|

Cette réaction a été mise au point par le Dr.E.Konyar et pratiquée dans 4 cas (cas 8 et 19 +1 cas de maladie de Hurler et 1 cas de maladie de Sanfilippo). Après trypsinisation et cen­

trifugation, les cellules ont été remises en suspension dans du milieu de Eagle contenant 1555 de sérum de veau foetal, recentri­

fugées puis fixées pendant 30 minutes dans du tétroxyde d'osmium à 2% (tampon cacodylate 0,2 M ; pH 7,4). Après deux rinçages de 5 minutes dans du tampon cacodylate 0,2 M à pH 7,4, les cellules ont été resuspendues en flocons et incubées pendant 3 à 5 heures dans du fer colloïdal préparé suivant la technique décrite plus haut. Le matériel a été ensuite postfixé, déshydraté et enrobé suivant la technique classique et les coupes ultrafines ont été colorées à l'acétate d'uranyl.

- M i se_en_év i dence_de

Les cellules ont été fixées pendant 1 heure à 4°C sur la­

melles de verre, dans du g 1 utaraIdéhyde distillé à 2,5^ (Fahiml et Drochmans,1968 , modifié par Vienne et Conreur,1973 ) en tampon cacodylate 0,4 M (pH 7,4). Après un rinçage de 1 heure dans le tampon cacodylate 0,4 M, les lamelles ont été incubées pendant 30 minutes a 37°C, dans le mélange suivant :

25 .

Tampon acétate 0,03M à pH 5 B -glycérophosphate de Na Nitrate de plomb Ig/lOOml

10 ml.

30 mg . 0,6ml.

Ce mélange avait été préalablement chauffé pendant 30 minutes à 37°, le pH terminal étant alors aux environs de 5,2. Après

l'incubation, les lamelles ont été rincées dans le tampon acé­

tate puis dans le tampon cacodylate, postfixées au tétroxyde d'osmiurn (tampon cacodylate) et déshydratées à l'alcool. Elles ont ensuite été recouvertes d'Epon. Après la polymérisation,

les lamelles de verre ont été séparées de.l'Epon par un refroi­

dissement brusque dans de l'azote liquide suivi d'une immersion dans de l'eau bouillante. Les coupes ultrafines ont été prati­

quées soit parallèlement soit perpend i eu I a i rem.ent à la surface de laculture.

d. Etude de la cinétique d'incorporation du soufre marqué et

Ces investigations ont été pratiquées par E.Neufeld et ses

CO I I aborateurs. Les techniques en ont été publiées par ailleurs (Fratantoni et coll., 1968 a et b, 1969).

3 : . SPECI F ICITE DES METHODES D'"H ISTOCHIMIE ULTRASTRUCTURALE", a . Coloration argentique

Cette réaction est considérée comme analogue à la réaction au PAS en microscopie photonique. Elle caractérise en principe

les groupements 1-2 glycols des cycles osidiques des polysaccha­

rides : l'oxydation à l'acide périodique transforme ces groupe­

ments en aldéhydes susceptibles de réduire les complexes d'argent (Rambourg et Leblond, 1967 ; Swift et Saxton, 1967 ; Thiéry, 1967).

de la correction mutuelle

26.

Pour Marinozzi (1961), auteur des techniques que nous avons prin­

cipalement employées, ce procédé révèle essentiellement les muco- polysaccharides. Dans l'étude très complète de Thiéry (1967), un procédé similaire révèle les polysaccharides simples, neutres' ou acides (et notamment le glycogène), les mucopoI ysaccharides et

les mucoprotéines. La spécificité n'est cependant pas entière, un certain nombre de petits grains d'argent se déposant sur des struc­

tures ne contenant vraisemblablement pas de polysaccharides.

Pour certains auteurs, la coloration argentique peut également révéler des groupements a -amino-a1cooI s (Hambourg et Leblond,

1967 ) ainsi que des groupements sulfhydriles (Pickett-Heaps , 1967 ).

Une moindre spécificité de la réaction pratiquée après fixation g IutaraIdéhydique est suspectée par Thiéry (1967), mais cette dif­

ficulté peut être toutefois contournée par l'emploi d'agents blo­

quants des groupements aldéhydes comme la dimédone (Pickett-Heaps , 1967).

Une difficulté d'interprétation peut également être intro­

duite par la postfixation osmiée. Marinozzi (1961) a en effet mon­

tré que l'osmium réduit pouvait être responsable d'une coloration argentique aspécifique. L'oxydation par l'acide périodique solu­

bilisant probablement l'osmium sous la forme de tétroxyde permets en principe, de l'éviter, mais il reste difficile d'affirmer que ce traitement seul est capable de prévenir entièrement la réaction aspécifique.

Un des problèmes majeurs d'interprétation réside dans le fait que, suivant les auteurs, des résultats parfois assez différents sont obtenus. Le glycogène, notamment, est décrit par Thiéry

(1967) comme très colorable alors que, dans les travaux de Hambourg

27 .

et Leblond (1967), cette substance n’est pas contrastée. Une cer­

taine hétérogénéité dans les techniques employées explique proba­

blement de semblables divergences.

Il est donc indispensable de discuter la signification de la technique que nous avons employée à la lumière de nos propres ré­

sultats. Par l’imprégnation argentique sans oxydation à l’acide périodique, la plupart des structures cellulaires sont contrastées.

Après oxydation, par contre, la réaction se révèle beaucoup plus spécifique : certaines portions de membranes plasmatiques, comme par exempie la membrane bordante des pédicelles des cellules épi­

théliales glomérulaires sont bien contrastées. Par contre, les membranes des mitochondries et du réticulum endoplasmique ne le sont pas. Lorsque des lysosomes normaux sont reconnaissables, la face interne de leur membrane limitante est colorée par un chapelet continu de grains argentiques, fait explicable par l'existence d'une couche glycoprotéique ou polysaccharidique tapissant la paroi in­

terne de ces organites (Daems et coll.,1969). Les particules de glycogène sont particulièrement colorables et les fibres de colla­

gène sont nettement imprégnées. Il existe, dans le reste du cyto­

plasme, un fin précipité argentique, probablement aspécifique, qui se présente sous la forme de grains beaucoup plus ténus et n'amène aucune difficulté d’interprétation.

Le bloquage par la dimédone ou l’action de avant l'oxy­

dation périodique n’apportent aucune modification. Par contre, l’ac­

tion de la dimédone après l'oxydation périodique amène une négati- vatlon quasi totale de la coloration.

Onpeutdonc conclure que:

1. nos résultats quant à la nature des structures colorées sont très semblables à ceux que Thiéry (1967) a obtenus avec une technique d'ailleurs similaire ;

28 .

2. l’oxydation périodique a une action suffisante sur la solubi­

lisation de l'osmium réduit puisque le traitement préalable à considéré par Marinozzi et Gautier (1961) comme sus­

ceptible de solubiliser totalement cette substance, ne diminue pas le nombre des structures colorables ;

3. la fixation au g 1 utara1déhyde n'introduit pas d'erreur notable, puisque le bloquage par la dimédone avant oxydation périodique est sans effet ;

4. la réaction est quasi spécifique des groupements aldéhydes apparus par l'oxydation à l'acide périodique, puisque le blo­

quage par la dimédone après cette oxydation amène une négati- vation presque totale.

On peut donc considérer que les techniques argentiques que nous avons employées colorent assez sélectivement, après oxydation par l'acide périodique, les groupements 1-2 glycols des oses con­

tenus dans les polysaccharides simples ou complexes. Dans la des­

cription des résultats nous n'envisagerons, dès lors, que ceux des techniques à l'acide periodique-argent ou argent méthénamine.

b . Coloration à I 'acide phosphotungstique

La spécificité de ce colorant a fait également l'objet de con­

troverses. Pour Pease (1966,1970), Marinozzi (1967) et Rambourg (1967,1971), il réagit avec les groupements hydroxyl des mucopoly- saccharides, des glycoprotéines et d'autres hydrates de carbone complexes. Pour d'autres auteurs (Hodge et Smith,1960 ; Benedetti et Berto1ini,1963 ; Silverman et Gllck,1969 ; Quintarelli et co 1 I . ,

1971 a et b), il serait spécifique des groupements aminés des pro­

téines.

La remarque faite à propos de la coloration argentique peut également s'appliquer à la présente technique : il paraît très