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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Vincentelli, J. (1971). Etude conformationnelle du lysozyme à l'état cristallin et à l'état dissous (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.

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UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES

Service de Chimie Générale I

i

ETUDE CONFORMATIONNELLE DU LYSOZYME

A L'ETAT CRISTALLIN

ET A L'ETAT DISSOUS

Thèse présentée pour l'obtention

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de Docteur en Sciences chimiques

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UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES

Service de Chimie Générale I

ETUDE CONFORMATIONNELLE DU LYSOZYME

A L'ETAT CRISTALLIN

ET A L'ETAT DISSOUS

1

i

^

Thèse présentée pour l'obtention

i

du titre

3

de Docteur en Sciences chimiques

Ce travail a pu être effectué avec l'agrément et sous la haute direction de Monsieur J. LEQNIS, Professeur à la Faculté des Sciences et à la Faculté de Mé­ decine de l’Université libre de Bruxelles, Directeur du laboratoire de "Chimie des Protéines". Nous tenons à lui exprimer notre reoonnaissance pour nous avoir aocueil- li dans son laboratoire.

Nous sommes heureux d’avoir l’occasion d’adresser notre gratitude à Mon­ sieur SCFINEK, chef de travaux et collaborateur à la direction de ce laboratoire, pour la sollicitude qu’il nous a sans cesse témoignée.

Nous tenons également à présenter nos remerciements à Madame ENGLERT, à Messieurs BAREL, DÜLMANS, LGDZE et MAES, qui ont accepté de collaborer à la discus­ sion et à la correction de notre thèse.

Nous remercions très chaleureusement Monsieur D.C. PHILLIPS, Professeur à l’Université d’Oxford, Directeur du laboratoire de "Biophysique Moléculaire", pour les multiples et précieux conseils qu’il nous a prodigués pendant nos deux séjours dans son laboratoire, où lui-même et ses collaborateurs. Mademoiselle JOHNSON ainsi que Messieurs BLAKE et NORTH, nous ont apporté une aide considérable pour toute la partie radiocristallographique de ce travail.

Nous sommes particulièrement heureux d’avoir pu bénéficier de l’aide di­ recte et indirecte de l’équipe unie de nos collègues travaillant sur la structure et la physico-chimie des protéines dans le cadre du laboratoire de Chimie des Pro­ téines de cette Université.

Note au lecteur

TABLE DES MATIERES

I

ntroduction

page

2

R

ésumé

page

12

C

hapitre

I

E

tude

en

solution

des

groupes

carboxyles

du

lysozyme

page

C

hapitre

II

E

tude

radiocristallographique

des

interactions

entre

alcool

ET LYSOZYME

page

C

hapitre

III

E

tude

complementaire

de

l

^

effet

des

alcools

sur

le

lysozyme

A

l

' ETAT DISSOUS

page

C

hapitre

IV

E

tude

structurale

par

calorimetrie

différentielle

page

C

onclusion

page

isi

A

nnexe

page

ise

I

ntroduction

La protéine étudiée ici est le lysozyme CEC 3.2.1.17).une enzyme qui peut être obtenue à partir de sources extrêmement variées : le blanc d'oeuf d'oi­ seaux, plusieurs tissus et secrétions de vertébrés ou d'invertébrés, certaines bactéries, des phages et même des plantes.

Le travail entrepris ne concerne que le lysozyme du blanc de l'oeuf de poule. C'est une protéine de masse molaire voisine de 14.500, composée d'une seule chaîne polypeptidique de 129 résidus d'acides aminés dont la structure pri­ maire est connue [Jolies et al., 1963 et 1965 ; Canfield, 1963 j Canfield et Liu, 1965). Sa structure tridimensionnelle a également été élucidée, grâce à l'étude de la diffraction des rayons X par les cristaux tétragonaux du lysozyme de blanc d'oeuf de poule [Blake et al., 1965 et 1967g).

Le succès de la méthode radiocristallographique a marqué sans aucun dou­ te une étape fondamentale dans la recherche des structures spatiales des macromolé­ cules. Elle a également suscité de nombreuses questions, dont celle de savoir com­ ment l'incorporation d'une molécule protéique à l'intérieur du cristal peut affec­ ter sa conformation.

La question posée ici nous semble de première Importance. En effet, si c'est à partir de la connaissance de la structure spatiale réalisée à l'état cris­ tallin que l'on propose le mode d'action enzymatique du lysozyme (Phillips, 1966 et 1967 ; Blake et al., 1967b), ü faut garder à l'esprit que le milieu naturel de cet enzyme est la solution aqueuse.

celle-ci, en première approximation du moins, pourrait ne pas varier lors de la cristal lisation.

C'est dans cette perspective que les nombreuses données relatives à la structure du lysozyme en solution, données acquises bien avant l'utilisation sys­ tématique des méthodes radiocristallographiques, ont été comparées au modèle tri­ dimensionnel valable pour les cristaux. Aucune des caractéristiques générales de la macromolécule (silhouette globale, pourcentage d'hélicité et de forme 6...] n'a fait apparaître de différence notable entre les deux états considérés (cf. Léonis, 1968].

Néanmoins, la possibilité de faibles changements conformationnels n'est certainement pas exclue. Les nombreuses expériences qui visent à comparer les cristaux et les solutions restent donc nécessaires. L'orientation des recherches devra alors se faire en considérant, non plus des caractéristiques globales, mais plutôt des détails conformationnels.

C'est ainsi que Qulocho et al. (1967), étudiant la carboxypeptidase comparativement sous forme cristalline et en solution, constatent une diminution de flexibilité de la molécule dans le cristal. Il faut se rappeler qu'un faible changement de la structure, éventuellement indécelable par les méthodes actuelles peut avoir de grands effets sur la réactivité. Ceci est particulièrement appré­ ciable pour les propriétés catalytiques, où un petit nombre d'interactions sont de grande importance (par exemple, il est Indispensable que le substrat réalise des contacts bien spécifiques avec 1' enzyme pour se maintenir dans le centre actif) .

I.

I

I

i

Fig. tirée de Proc. Roy. Soc. 167B, p. 375 C.C.F. BlaKe et al. (19B7b3■

Le groupe guanidine de l’arginine 114 se trouve étroitement intercalé entre la phénylalanine 34 de la même molécule et la tyrosine 23 de la molécule voisine, avec pour résultat que cette chaîne latérale est très "rigide” et occupe une position bien définie dans l'espace, pour le cristal tout au moins. Dn conçoit aisément que cette même chaîne de l'arginine 114 puisse être en position différen­ te en solution, sans pour autant que la structure tridimensionnelle en soit affec­ tée dans son ensemble. Or, l’arginine 114 fait partie du centre actif de l’enzyme. Elle participe donc au maintien du substrat, comme le montre d’ailleurs la figure ci-après.

Poussant l’idée à la limite, Bishop et al. (1966} suggèrent même la pos­ sibilité d'obtenir des propriétés enzymatiques anormales, en raison de contacts intermoléculaires qui s’établiraient dans le cristal et feraient intervenir le si­ te actif ou une partie de celui-ci.

En règle générale, ce problème peut être abordé de plusieurs façons. Si la structure cristalline de la protéine est déjà oonnue, il suffira d'étudier les caractéristiques de cette même macromolécule en solution pour comparer ensuite les résultats entre eux ; ceux-ci seront parfaitement cohérents ou non. Cette pre­ mière méthode n'est évidemment utilisable que si l'analyse radiocristallographique de la molécule considérée a été réalisée avec succès : ce n'est malheureusement le cas que pour un très petit nombre de protéines. D'une autre manière, la comparai­ son peut se faire par l'étude simultanée du cristal et de la solution. Cet aspect sera également développé dans le présent travail. On réalisera donc diverses ex­ périences de manière identique sur les cristaux et sur les solutions de la protéine. Il faut remarquer que cette approche ne nécessite aucunement la connaissance préa­ lable de la structure établie par diffraction des rayons X. La méthode s'appli­ quera donc à un grand nombre de protéines, en principe toutes celles qui sont cris- tallisables. Nos propres travaux comparatifs s'effeotuent d'ailleurs parallèlement à de nombreuses autres études, réalisées sur un douzaine de protéines différentes.

On trouvera à la page suivante un tableau qui résume les résultats ac­ tuellement acquis. En consultant ce tableau, on s’étonnera sans doute du relati­ vement petit nombre de points de comparaison déjà exploités, Dr, le problème des différences éventuelles entre solutions et cristaux est comparable au problème des critères de pureté des protéines : une unique expérience ne suffit évidemment pas à garantir la réponse. Il faudra donc recueillir le plus grand nombre possible de résultats pour arriver à des oonclusions valables. Aussi des chercheurs tou­ jours plus nombreux s’attaquent-ils à ce problème avec des moyens toujours plus variés. Si en 1957 un seul article scientifique discutait la question (Haggis. 1957], on en trouve déjà plus d'une douzaine en 1966-1967.

Un deuxième aspect du présent travail, aspect qui constitue une sorte de sous-produit de la comparaison solution-cristal, concerne de nouvelles contri­ butions à l'étude structurale des macromolécules biologiques en général.

No significant différences

a. lonizationsofhemoglobin; tyrosines (Rupley, 1964), histidines(Pecoraro and Rupley, unpublished data), and other groups (Rupley, 1968)

b. Binding of saccharides to lysozyme (Butler and Rupley, 1967) c. Binding of azide to mcthemoglobin (Rupley and Gates, 1968) d. Volume of hemoglobin (Krivacic and Rupley, 1968)

e. Histidines of insulin (Pecoraro and Rupley, unpublished data)

f. Hélix contents (by ORD) of heme proteins (Beychok and Blout, 1961 ; Urnes et al., 1961; Samejima and Yang, 1964; Beychok, 1964); a variety of other solution properties aiso are in accord with high résolution crystal structures (see Section VI) g. Spectrum of cytochrome c(Eaton and Hochstrasser, 1967)

h. Isoelectric pH of ^-lactoglobulin (Bishop and Richards, 1968a) Différences

a. Spectra of heme proteins (Day et al., 1967) B. Kinetic properties No significant différences

a. Reaction of iodoacetate with myoglobin (Gurd et al., 1966) b. Hydrogen exchange of lysozyme (Praissman and Rupley, 1968b) c. Enzymic activity of triosephosphate dehydrogenase (Murdock, 1967)

d. Diffusion of solutés in crystalline ^-lactoglobulin (Bishop and Richards, 1968b) Différences

a. Enzymic activity : ribonucléase S (Doscher and Richards, 1963; Winstead and Wold, 1965); carboxypeptidase A (Quiocho and Richards, 1966; Quiocho et al., 1967); chymotrypsin (Sigler and Skinner, 1963; Kallos, 1964)

b. Binding of azide to myoglobin (Chance et al., 1966) and hemoglobin (Chance and Ravilly, 1966)

c. Binding of substrate to alcohol dehydrogenase (Theorell et al., 1966) d. Hydrogen exchange of insulin (Praissman and Rupley, 1964, 1968a) e. Binding of metals to carboxypeptidase (Bishop et al., 1966) f. Photooxidation of ribonucléase (Kcnkare and Richards, 1966)

g. Proton relaxation of mcthemoglobin and mctmyoglobin (Maricic et al., 1966; Mildvan et al., 1968a, 1968b)

h. Recombination of carbon monoxide with crystalline hemoproteins (Parkhurst and Gibson, 1967)

De J.A. Rupley dans "Structure and stability of biological macromolecules"

détaillée des mécanismes chimiques de la cellule à tous ses niveaux. A l'heure actuelle, trois voies principales sont utilisées pour établir les structures spa­ tiales désirées :

1. Les méthodes physico-chimiques opérant sur les macromolécules en solu­ tion. Il s’agit de méthodes soit hydrodynamiques (diffusion, sédi­ mentation, viscosité, temps de relaxation rotatoire, ...), soit opti­ ques (mesure de l'absorption de la lumière, de la diffusion latérale de la lumière, du pouvoir rotatoire, de la dispersion rotatoire, du dichroïsme circulaire, de la fluorescence, de la résonance magnéti­ que nucléaire, .=.]. Ces méthodes, bien que donnant souvent des ré­ sultats importants, ne sont pas encore systématiquement exploitées. Il faut cependant reconnaître que beaucoup présentent le défaut d'en­ registrer des résultats difficiles à interpréter.

2. La radiocristallographie, qui constitue une des méthodes les plus sûres pour l'élaboration complète des structures spatiales. Néan­ moins, elle n’offre aucune possibilité d'étude autre que celle de molécules figées dans un état particulier.

3. Les méthodes basées sur le calcul énergétique, enfin, qui devront permettre de caractériser tant les conformations permises que les voies de passage entre celles-ci.

Cette brève énumération des principales techniques disponibles fait en­ trevoir qu'il faudra recourir à l’ensemole de ces méthodes pour obtenir les meil­ leures solutions aux problèmes posés.

Notre propre contribution dans ce domaine consistera à Introduire les cristaux de protéines comme matériel pour les études physico-chimiques. Si les exemples cités dans le texte concernent uniquement des travaux réalisés sur le lysozyme, nous avons également d'autres protéines à l’étude, telles les hémoglo-, bines humaine et de poule (Lavinha, 1970].

présenter un mécanisme d'action catalytique à l’échelle strictement atomique. Le schéma de ce mécanisme est repris à la page suivante, et plusieurs revues d'ensem­ ble en donnent des explications très détaillées ; par ailleurs, l'équipe de Phil­ lips a réalisé sur ce problème un film particulièrement suggestif. Mais il faut bien garder à l'esprit que le mécanisme enzymatique ainsi proposé est encore spé­ culatif dans certains de ses aspects. 11 est donc clairement nécessaire de réali­ ser encore davantage de travaux expérimentaux pour apporter les preuves définitives. Une des questions qui reste en suspens concerne la nature des étapes intermédiai­ res. Lors de la rupture du lien glycosidique 3(1-4] entre les cycles NAM (D] l’acide N-acétyl muramique et NAG (E] l’N-acétyl glucosamine, les possibilités les plus probables sont :

(a] la formation d'une liaison entre le groupe carboxyle Asp 52 et le carbone n°1 du cycle D ;

(b] la stabilisation de l'ion carbonium intermédiaire, grâce à la charge négative de l'Asp 52 ;

(c] l'apparition d'un nouvel ion, résultant d’un lien intramoléculaire entre le groupe acétamide et le carbone n°1 du cycle D.

(a] (b] Ce]

Science, 1B5 463

ASP 52

LYSOZYME, MAIN CHAIN

^ CARBON ® OXYGEN I ■ HYDROGEN LYSOZYME, MAIN CHAIN WA II K M( Il I CUl L GLU 35

Figure tirée de "Scientific American” Vol. 215 n° 5, page 90

R

Afin de comparer d’une manière valable et dans le maximum de détails possibles les deux formes éventuellement distinctes que peut présenter le lysozy­ me, selon qu’il est en solution ou à l'état cristallin, nous avons envisagé le maximum d'approches expérimentales et méthodologiques utilisables.

Dans une première partie, où seront exploitées différentes expériences et techniques classiques, nous avons fait l'étude en solution d’une particularité conformationnelle de la protéine : le comportement électrochimique de ses 11 grou­ pes carboxyles. Les résultats obtenus ont été confrontés avec ceux acquis grâce au modèle cristallographique.

Après avoir étudié en détail l'électrochimie des groupes carboxyles du lysozyme en solution (étude titrimétrique, évaluation du facteur électrostatique et de ses anomalies, etc...), nous nous sommes proposé de localiser chimiquement les trois types principaux de ces carboxyles, c'est-à-dire ceux à pKg normal, ceux à pKg anormal et ceux appartenant au centre actif. Les résultats ainsi ob­ tenus établissent un très haut degré de similitude entre les structures du lyso­ zyme dans les deux états considérés. Une exception mérite cependant d’être rele­ vée : l’acide aminé Glu 7 aurait un pKg normal en solution, contrairement au cas de la forme cristalline où l'interaction avec la lysine 1 serait responsable d’un pKa anormalement bas.

Ces résultats, obtenus pour la protéine en solution, suggéraient d'exa­ miner l’effet des mêmes alcools sur le lysozyme à l'état cristallin. Dans ce but, nous avons utilisé la méthode radiocristallographique. Les cristaux dans lesquels on avait fait diffuser les différents alcools ont été examinés par la technique de diffraction des rayons X. En comparant ces cristaux de lysozyme modifié à ceux du lysozyme natif, par la méthode de Fourier différentielle, il a été possi­ ble de localiser certaines de ces molécules d’alcools au sein de la structure pro­ téique. Dans les conditions où le cristal est soumis à une solution contenant 1 % en alcool, on constate :

- pour l’éthanol, la fixation préférentielle d’une molécule au voisina­ ge des acides aminés Thr 40, Gin 41, Tyr 53, Gly 54, Leu 83 et Leu 84j - pour le n-propanol, la fixation préférentielle de deux molécules, l’une

au voisinage des acides aminés Try 108 et Ala 107, l’autre au voisi­ nage de l’acide aminé Try 123;

- pour les alcools de masse molaire plus élevée, par contre, les cartes de densité électronique sont perturbées, ce qui suggère une fixation désordonnée des molécules d’alcools avec désorganisation probable soit de la molécule protéique, soit du cristal, soit du tout.

Les résultats de l’étude radiocristallographique ramenaient, une fois de plus, à considérer la protéine en solution. Les mesures de fluorescence des tryptophanes, perturbés ou non par les alcools, semblent effectivement indiquer une bonne concordance structurale entre lysozyme en solution et lysozyme à l’état cristallin. La mesure des constantes de diffusion et celle de l’activité enzyma­ tique montrent, d’une part que la silhouette générale de la protéine ne varie pas quel que soit l’alcool ajouté et, d’autre part, que son activité reste identique en présence de faibles concentrations d’éthanol ou de n-propanol, et ne varie que très peu pour les alcools de masse molaire plus élevée. Ces deux derniers types de mesures font penser que les alcools de masse molaire relativement élevée exer­ cent leurs effets principalement sur les liaisons intermoléculaires qui existent au sein du cristal.

lin. Ces deux approches ont le désagrément d'employer des techniques expérimen­ tales entièrement distinctes selon que l'on étudie l’un ou l'autre état. L’inter­ prétation des résultats en est rendue difficile et elle doit se faire avec beau­ coup de prudence. Dans la mesure du possible, il était donc souhaitable d'appli­ quer une seule et même technique expérimentale dans chacun des cas. Le problème a pu être résolu en utilisant la calorimétrie différentielle car elle permet de réaliser des expériences identiques, tel l’emploi de dénaturants, parallèlement sur les solutions et sur les cristaux. Nous nous sommes limité à l’étude de deux types de dénaturants, les alcools et l’urée, choisis pour leur mode d’action dif­ férents (Tanford, 1964). Les résultats obtenus dans ces conditions expérimentales permettent d’effectuer une confrontation assez complète et tout a fait directe entre les deux états possibles de la même molécule.

L’étude systématique entreprise pour la comparaison de la molécule de lysozyme en solution et à l'état cristallin montre que les deux états considérés pour cette molécule sont probablement fort proches, et cela jusque dans les détails S'il existe cependant des différences observables, telles par exemple la position de la chaîne latérale Glu 7 ou encore l'action dénaturante de l’urée (qui se mani­ feste différemment en solution et à l’état cristallin), on notera que dans chaque cas, c’est la surface de la molécule protéique qui est concernée.

Nous proposons donc une structure semblable, dans son ensemble, pour la molécule de lysozyme dans les deux états considérés ici, avec des différences pos­ sibles mais qui se localiseraient toutes en surface de la molécule.

structurale desjnaoromqlêqules biologiques

Il nous paraît important de souligner les possibilités de recherches futures amenées par le présent travail. Nous pensons particulièrement à trois voies de recherche qui mériteraient d’être développées.

[1) §0Bl9i_des_cristaux_comme_matériel_0our des_études_thermodynamigues

On trouvera dans ce travail le calcul des grandeurs thermodynamiques relatives au lysozyme à l’état cristallin. L’évaluation de ces paramètres pour d’autres macromolécules cristallisables semble parfaitement réalisable, grâce à la mise en oeuvre de la calorimétrie différentielle. Il y aurait là une abondante source d’informations structurales.

(23 §5yde_de_mgdifications_chlmlgues_au_sein_de_macromolécules

Comme dans la plupart des cas les réactions chimiques peuvent être opérées sur les macromolécules à l’état cristallin, et comme la méthode de Fourier différentielle fournir directement la localisation et l’importance de la modi­ fication réalisée, il serait avantageux d’employer la diffraction des rayons X pour les problèmes chimiques courants que soulèvent les macromolécules bio­ logiques dont la structure spatiale est connue.

(33 §tude_thermodynamigue_des_interactions_intermoléculaires

Nous avons montré, par l’étude du lysozyme à l’état cristallin, la possibilité de calculer non seulement les grandeurs thermodynamiques relatives aux inter­ actions Intramoléculaires (celles propres à la molécule de lysozyme3 mais éga­ lement celles relatives aux interactions intermoléculaires (celles qui main­ tiennent les molécules au sein du cristal3. On entrevoit ici l’application possible à d’autres édifices biologiquement importants. Ce serait le cas, par exemple, pour les complexes macromoléculaires composés de protéine+protéi- ne, protéine+saccharide, protéine+lipide, protéine+acide nucléique ; ou bien encore, protéine+ligand j dans ces divers cas, toutes les grandeurs thermody­ namiques d’interaction pourraient être évaluées. Un tel programme est sans doute ambitieux, mais si on mesure toute l’importance actuellement attachée à ces macromolécules (l’extension des recherches concernant les membranes cel­ lulaires en est un exemple3, on comprend qu’il est nécessaire de développer et d’étendre au maximum le domaine d’étude des structures spatiales.

COMPARAISON ENTRE LA STRUCTURE D’UNE PROTEINE EN SOLUTION ET SA STRUCTURE A L’ ETAT CRISTALLIN

A. ETUDE CLASSIQUE :

B.

C,

En solution

Par radiooristallographie Par aalouls conformationnels

(Les expériences et les méthodes sont différentes]

Après l' ETUDE EN SOLUTION

+ passage à

l’ ETUDE DES CRISTAUX

+ et retour à

l• ETUDE EN SOLUTION

(Les expériences sont identiques, mais les méthodes sont différentes]

ETUDES IDENTIQUES FAITES SIMULTANEMENT SUR LES SOLUTIONS ET LES CRISTAUX

COMPARAISON

9

(Les expériences et les méthodes sont identiques]

CONTRIBUTION AUX ETUDES STRUCTURALES DES NACRONOLECULES BIOLOGIQUES

- Emploi des cristaux comme matériel d'étude thermo­ dynamique

- Etude des réactions chimi­ ques au sein de macromolécules

C

hapitre

I

E

tude

en

solution

des

groupes

carboxyles

du

lysozyme

1. INTRODUCTION page 18

2. ETUDE TITRIMETRIQUE DES GROUPES CARBOXYLES page 20

(a) Matériel et méthodes page 20

(b) Résultats^ discussion et conclusion page 21

3. MODIFICATION CHIMIQUE DES GROUPES CARBOXYLES page 33

(a) Introduction page 33

(b) Concernant la modification chimique des groupes carboxyles page 34

(c) Matériel et méthodes page 37

Cl) Conditions expérimentales page 37

C2) Modification chimique page 41

(3) Analyse de la composition en acides aminés page 43

(4) Fractionnement par chromatographie page 45

C5) Activité enzymatique page 47

[6) Protéolyse au moyen de la trypsine page 47

C7) Cartes peptidiques sur papier page 48

[8) Caractérisation des peptides page 48

1. INTRODUCTION

Rappelons que pour faire la comparaison entre deux formes possibles d’une mime molécule, ici le lysozyme à l'état dissous ou a l'état cristallin, une des méthodes consiste à étudier en solution certaines caractéristiques de la molécule pour les confronter avec le modèle cristallographique.

Nous nous proposons de comparer des détails conformationnels de la macro molécule plutôt que ses propriétés globales, telles la silhouette générale ou

l’organisation hélicoïdale par exemple. A cet effet, nous étudierons les chaî­ nes latérales de résidus d'acides aminés particuliers. A première vue, n'im­ porte quelle chaîne latérale pourrait être choisie pour cette étude. Il nous a cependant paru judicieux de fixer notre choix aux groupes carboxyles (La dis­ cussion de ces groupes trouve place dans le présent chapitre ; l'étude des chaî nés latérales tryptophanes figure au chapitre III) . En effet, la détermination de la structure spatiale du lysozyme à la résolution de 2 Â, par l'équipe de Phillips (Blake et al., 1965 et 19B7aJ,a permis de proposer, pour cette protéi­ ne, un mécanisme de l'activité enzymatique où deux des groupes carboxyllques se voient attribuer le rôle fondamental (Phillips, 1966 et 1967 ; BlaKe et al., 1967 b).

Les pKa des groupes carboxyles sont habituellement voisins de 4,6. Dr, dans le cas du lysozyme il semble que plusieurs de ces groupes aient des pKa anormaux ; leur situation serait d’ailleurs normalisée en présence de dénatu­ rants (8 N en chlorure de guanidinium ou 5 N en chlorure de guanidinium plus 1,2 N Urée) (Donovan et al., 1960). De cette étude, il faut notamment retenir que la protéine soumise aux dénaturants cités serait essentiellement sous for­ me déroulée.

chlorure de guanidinium sur les résidus tryptophanes par exemple. C'est

pour-[1

]

quoi Tanford s'est proposé de réétudier la titration du lysozyme.

* *

En ce qui concerne le présent travail, les groupes carboxyles ont été étudiés également par titration, mais en choisissant les alcools comme agent dénaturant. On verra dans la conclusion qu'en employant ce dénaturant à fai­ ble concentration (7,4 % en poids], dans des conditions bien précises, il est possible de normaliser le pKa de certains carboxyles qui se comportent effec­ tivement de manière anormale. Ceci peut être obtenu sans même réaliser une grande désorganisation de la macromolécule.

D'un autre côté, il paraissait intéressant de pouvoir repérer individuel­ lement la localisation des carboxyles anormaux au sein de la structure du lyso­ zyme. Cette opération a été réalisée par modification chimique, en exploitant la propriété qu'ont les carbodiimides solubles d'être, dans certaines conditions des réactifs spécifiques des groupes carboxyles (Riehm et Scheraga, 1966 j Hoare et Koshland, 1967].

Le modèle tridimensionnel du lysozyme, construit d'après les coordonnées obtenues par diffraction des rayons X, donne non seulement la position exacte de chacun des 11 carboxyles, mais aussi le détail de leur environnement au sein de la molécule. Nous comparerons donc, pour chacun des groupes CODH, les résul­ tats obtenus par l'étude en solution avec ceux que l'on peut déduire du modèle radiocristallographique.

(1]

2. ETUDE TITRIMETRIQUE DES GROUPES CARBQXYLES

(a) Matériel et méthodes

- Le lysozyme utilisé est de provenance Sigma, 3 fois cristallisé, dialysé

et lyophilisé, lots 15 B - 8530 et 102 B - 068.

Nozaki et Tanford [1967] ont montré qu'il n'est pas nécessaire de désio- niser la protéine avant la titration. Aussi employons-nous le lysozyme après simple dialyse d'une nuit contre de l'eau et lyophilisation.

- Tous les alcools utilisés ont été distillés avant l'emploi.

- Les autres produits sont de pureté analytique.

- La solution titrante de NaOH, exempte de CO2, est préparée selon la mé­ thode de Kolthoff [1922] et standardisée par le phtalate acide de potas­ sium. La solution de HCl est ensuite standardisée par NaOH.

- La cellule de titration, thermostatisée à ± 0,5 °C, est celle décrite dans la thèse de doctorat de Wikler [1965].

- Le pHmètre, Radiometer type TTT-lb, est préalablement étalonné à 20 °C à l'aide des tampons de référence préconisés par le National Bureau of Stan­ dards [Bâtes, 1954] .

- Technique opératoire :

alors par addition continue soit de soude, soit d'acide chlorhydrique. C1} au moyen d'une microseringue Agla actionnée par un moteur synchrone Les courbes de titration sont enregistrées automatiquement. Chacune des courbes présentées dans ce travail résulte de la différence entre la cour­ be de titration de la solution de protéine et celle du solvant effectuée dans les mêmes conditions : par conséquent, elles sont corrigées pour les effets dus à l’ionisation du solvant.

- Choix des agents dénaturants :

Parmi les alcools suffisamment dénaturants, nous avons examiné l’alcool benzylique, le n-butanol et le n-propanol. Seul le n-propanol en concen­ tration voisine de 0 % (essais faits à 8,4 % et 7,4 donne de bons ré­ sultats, sans entraîner de complications comme la précipitation de la protéine par exemple. Les résultats relatifs au n-propanol seront donc les seuls présentés et discutés ici.

(b) Résultats ^ discussion et conclusion

Les résultats obtenus en solution purement aqueuse, pour la partie basique de la courbe électrotitrimétrlque (pH de 6,0 à 12], et pour les températures de 40 - 50 - 53 - 57 et 60 °C, montrent soit que le nombre des groupes titrables augmente régulièrement mais faiblement avec la tem­ pérature, soit que le Pka des groupes amines varie [cf. Fig. 1, où l’on a porté en fonction de 1/T le pH atteint par la solution après addition d’une quantité arbitrairement fixée à 4 moles de NaüH par mole de lysozyme]. Par contre, les courbes de titration du lysozyme en présence de 8,4 % de n-pro- panol présentent une nette discontinuité à partir de 53 °C. La présence de cette discontinuité correspond fort bien avec l’évolution de la courbe

traduisant le pouvoir rotatoire de la protéine en fonction de la tempéra­ ture, pour une solution de lysozyme examinée dans des conditions expérimen­ tales identiques à celles de la titration (Iser-Vincentelli, 1963 ; Iser- Vincentelli et Léonis, 19641 .

Mais c’est la partie acide des courbes de titrations (pH de 6 à 11, pour le lysozyme en l’absence ou en présence de n-propanol, qui sera étudiée avec le plus de détail en raison de son intérêt.

Expériences faites pour l’étude de la partie acide des courbes de titration

Lysozyme dans H2O contenant KCl 0,15 M Températures de 40, 50, 55 et 65 °C Lysozyme dans 7,4 % n-propanol + KCl 0,15 M Températures de 40, 50, 55 et 65 °C

Relevons que, dans la courbe de titration du lysozyme, considérée glo­ balement, il est assez aisé de distinguer la partie correspondant à l’ioni­ sation des carboxyles (Tanford et al., 19541. En effet, le groupe ionique le plus voisin possède un pKa (6,5 : Imidazolel suffisamment éloigné de celui des carboxyles.

Les courbes de titration obtenues pour le lysozyme soumis à des températu­ res croissantes, en présence et en l’absence de n-propanol, sont rassemblées dans le graphique 2 j le nombre des groupes titrés y est porté en fonction du pH.

-1____________________________ I____________________________ I____________________________ L_

2

3

4

5

Fig. 2 : Titration du lysozyme a diverses températures dans l'eau ou dans n-propanol 7,*4 % (KCl Dans l'eau : x a 40 °C, û à 50 °C, o à 55 ‘’C, o à 65 °C,

Par contre, lorsqu'on se place au voisinage de la température de transi­ tion, il apparaît progressivement des carboxyles nouveaux. On verra cepen­ dant que la présence du dénaturant est nécessaire pour accéder à la totali­ té des 11 groupes acides que la structure primaire du lysozyme renseigne. Il semble donc bien établi que la protéine possède effectivement trois grou­ pes carboxyles à pKa anormal.

Une expérience de titration entièrement différente, qui est décrite ci-des- sous, nous a donné le même résultat.

A 25 °C, une solution renfermant 6,75 mg/ml de lysozyme (soit 4,66 x lO"'* M), en présence de KCl 0,15 M et de 7,4 % n-propanol, a été portée à pH 2,30 ;

(1} chauffée Jusqu’à 65 °C, son pH apparent était de 1,90

La même opération a aussi été réalisée sur le solvant sans protéine (KCl 0,15 M et 7,4 % n-propanol). Une diminution du pH a également été observée dans ce cas : de 2,30 (25 “"C) à 1,76 (65 °C)

- Dans l'expression pH = -log a^. = -log Yu+ " ^lj+ « Is terme log Yl,.

ri n h li

varie très peu avec la température (Harned et Owen, 1950).

- Pour le solvant à pH 2,30 la concentration en H"'' est de 5,0 x 10“^ M.

- Pour le solvant, le passage de 25 °C à 65 °C fait apparaître une varia­ tion du potentiel électrique de - 0,54 (exprimé en unité de pH).

- Cette correction de - 0,54 est donc appliquée à la solution de lysozyme. A 65 °C nous lisons un pH apparent de 1,90 , qui une fois corrigé pour la température de 25 °C donne un pH de 2,44.

- A ce pH de 2,44 la concentration en H’' est de 3,6 x 10”^ M.

- La concentration en H’’’ absorbée par la protéine sera donnée par 5,0 X 10-3 M - 3,6 X 10"3 M = 1,4 x 10"3 M.

(1)

- Nous obtenons ainsi une appréciation du nombre de groupes titrés 1.4 X 10"3

4,66 X 10"‘*

soit environ 3 groupes COO"

Remarque :

Les mesures effectuées sont parfaitement reproductibles. Cependant l’effet total mesuré, c'est-à-dire la faible différence entre le pH réel et le pH apparent de la solution de lysozyme à 25 °C

(2,44 ± 0,02 - 2,30 ± 0,02 = 0,14 ± 0,04], entraîne une grande erreur sur ces mesures.

*

Abordons maintenant certaines considérations structurales. Les courbes de titration de la fig. 2 étant réversibles, elles permettent de pousser plus loin l’interprétation théorique des observations. Pour oe faire, nous avons recouru à l'équation qui a été déduite en premier lieu par Linder-strdm-Lang (1924] et dont l'usage a été développé par Cannan ("1942] et par Tanford (Tanford et al., 1955 ; Tanford, 1961 et 1962] :

a

pH - log = pKint - 0,868 wZ. (I] Pour les groupes ioniques d’un type donné, la fraction dissociée à un cer­ tain pH est représentée par x = r/n±, où ni est le nombre total des groupes du type (ici les carboxyles] et où r est, pour un pH donné, le nombre d'ions hydrogène dissociés par molécule de protéine. Le terme 0,868 wZ trouve son origine dans l'interaction électrostatique entre le proton et la molécule protéique de charge nette Z ; pKint est donc une valeur rame­ née à charge nulle, Z = 0. Le facteur électrostatique w est considéré ici comme une grandeur expérimentale.

Lorsque l'on étudie la relation qui existe entre la grandeur (pH - log et la grandeur Z, pour le lysozyme en présence de 7,4 % n-propanol et de

(11

KCl 0,15 M à 40 ou 55 C, on obtient les courbes qui figurent dans la

figure 3.

On verra que pour le lysozyme comportant 0 groupes carboxyles titrables,

y

0’est-à-dire à 40 °CJ.a grandeur (pH - log fonction linéaire de Z. La pente de la droite donne w ; dans le cas présent, la valeur de ce para­ mètre est constante et égale à 0,145. Pour la même force ionique que celle utilisée ici, mais en solution purement aqueuse, Tanford (1954) avait obte­ nu pour ce facteur électrostatique des valeurs comprises entre 0,08 et 0,12 dans une région de pH voisine du point isoélectrique de la molécule. Com­ me le facteur électrostatique est inversément proportionnel à la constante diélectrique du solvant, il est normal que la grandeur w évaluée en présen­ ce de n-propanol soit supérieure à celle observée en solution aqueuse.

L’ordonnée à l’origine de la droite de la figure 3 correspond à une va­ leur de pKint = 4,7 , valeur très raisonnable pour un groupe carboxyle

(par exemple l’acide glutamique et l'acide aspartique auraient respective­ ment des pKint probables de 4,50 et de 4,05 (Nozaki et Tanford, 1967 .

Tels sont les résultats des observations à 40 °C. Par contre, lorsque l'on considère la température de 55 °C pour laquelle la totalité des 11

y groupes carboxyles sont titrés, on constate que la grandeur (pH - log est fonction linéaire de Z uniquement dans le domaine où la charge nette de la protéine est inférieure à 16-17; pour des valeurs supérieures la

re-(1 )

lation n'est plus linéaire et ^ cesse d’être constant . Ceci pourrait s’expliquer par une certaine expansion de la molécule et par sa pénétra­ tion par le solvant (Tanford, 1961g). Nous verrons que cette vue a pu être confirmée par des mesures hydrodynamiques.

Il est donc maintenant établi que, dans des conditions expérimentales bien particulières, on peut démasquer les trois carboxyles à pKa anormaux j on observe que la normalisation de leur comportement va de pair avec une variation importante du facteur électrostatique w. Aussi semblait-il opportun de vérifier par une mesure directe, dans les mêmes conditions ex­ périmentales (solution de lysozyme dans KCl 0,15 M à pH 2, en présence de

TT7

lysozyme, en présence de 7,4 % de n-propanol KCl 0,15 M ^ à 40 °C, Q à 55 °C, selon l’équation (1], page 26.

7,4 % de n-propanol, et à 60 °C], si la désorganisation structurale de la macromolécule est également importante. On peut s'en rendre compte en cal­ culant le paramètre f/f* , qui traduit la forme hydrodynamique de la parti­ cule et sa déviation par rapport à une sphère, ainsi que le paramètre ,

tenir ces deux grandeurs séparément. Tanford [1961a^ ^ proposé d'utiliser la relation suivante

où v-^ et n sont respectivement le volume spécifique partiel et la viscosité du solvant pour une température donnée.

Nous utiliserons la relation de Tanford pour calculer, d'une part la va­ leur de qui correspond à la solvatation maximum (cas où f/fo est supposé égal à 1) 1 et, d'autre part, la valeur de f/fo , qui correspond à l'asy­ métrie maximum (cas où l'on suppose 6^ = 0).

En se référant à la fig. 4, tirée de Tanford (1961aK on verra que la valeur du terme f/fo permet d'avoir une idée du rapport axial a/b qui tra­ duit l'ellipsoïde hydrodynamique de la protéine.

La constante de diffusion a été déterminée expérimentalement au moyen (1J

d’un micro-interféromètre Zeiss . Le volume spécifique partiel du lyso­ zyme (V2) a été mesuré expérimentalement par picnométrie. Les résultats sont rassemblés dans le tableau I.

qui traduit le degré de solvatation. Il est cependant très difficile

friction d'ellipsoïdes dont le rapport axial a/b est relativement petit.

Courbes reproduites d’après Tanford [1961 ) p. 326.

Solution de lysozyme Volume spécifique partiel du lysozyme Cv2Î Constante de diffusion (D) Solvatation maximum (si f/fo=1] ôl(g/g) Asymétrie maximum (si 61=0) f/fo Ellipsoïde allongé a/b 7,4 % n-propanol pH 2 25 °C 0,661 12,0 X lO"”^ 0,319 1,14 d 2,5 ± 0,5 7,4 % n-propanol pH 2 60 °C 0,726 c 9,9 X 10"^ 0,999 1,35 d 5,6 ± 0,5 H2O pH 6,0 20 °C a 0,688 a 10,4 X 10"^ ^ D 11,0 X 10"'7 a 0,890 a 1,32 a 6,1

a. Tanford [1961 en admettant pour le lysozyme M = 14.100 â

b. ce travail, en admettant pour le lysozyme M = 14.500 c. ramené à 25 °C

d. valeurs déduites de la fig. 4.

Il est manifeste que le passage de la structure Initiale (25 à la struc ture partiellement dénaturée (60 peut s'interpréter selon deux vues extrêmes. Si l'on suppose la solvatation toujours nulle, le rapport axial de l'ellipsoïde hydrodynamique équivalent passerait de 2,5 à 5,6 ; en ad­ mettant une forme toujours sphérique, par contre, le facteur de solvatation pourrait augmenter jusqu'au triple (0,3 à 1 g/g]. Ces valeurs, qui doivent évidemment être prises comme des limites supérieures, montrent de toute ma­ nière que la normalisation des trois carboxyles particuliers résulte d'une certaine désorganisation de la structure protéique ; c'est bien ce que mon- traient déjà les courbes exprimant (pH - log ':i~^] en fonction de Z. Mais ces mesures hydrodynamiques nous apportent un complément d'information, à savoir que cette désorganisation est relativement limitée. En effet, les valeurs rassemblées dans le tableau I montrent qu'à 25 °C le n-propanol pris à faible concentration (7,4 %j semble renforcer la symétrie de la mo­ lécule de lysozyme. Dans le même solvant il faut chauffer la protéine à 60 °C pour retrouver les valeurs de 6i (solvatation maximum] et de a/b (rap port d'axe de l’ellipsoïde allongé] données par Tanford pour le lysozyme à 20 °C dans l’eau. Bien que le lysozyme en présence de 7,4 % en n-propa-nol à pH 2 ait une température de transition thermique de 50 °C (Barel,

«

1965], la désorganisation observée lors de la normalisation des 3 carbo­ xyles supplémentaires, ne se traduirait pas par un effondrement de la macromolécule. Celle-ci garderait une forme compacte due probablement à

3. MODIFICATION CHIMIQUE DES GROUPES CARBOXYLES

(a) Introduction

Les études électrotitrimétriques des carboxyles en solution, qui vien­ nent d’être discutées, seront très utiles pour aborder le problème des mo­ difications chimiques. Mais, en outre, il semble approprié de rappeler brièvement ce que l'on connaît d'une manière générale au sujet des 11 grou­ pes carboxyles du lysozyme.

Le modèle radiocristallographique permet d'étudier la situation exacte de chacun des groupes carboxyles, notamment en ce qui concerne leur envi­ ronnement et leurs interactions directes avec d'autres groupes (Brown et al., 1969]. On voit ainsi que le résidu Glu 7 forme un pont salin avec le rési­ du Lys 1 ; le résidu Glu 35 a pour voisin le résidu Trp 106 et est en con­ tact avec le résidu Ala 110 ; le résidu Asp 52 forme un lien hydrogène avec le résidu Asn 59 j le résidu Asp 66 forme un lien hydrogène avec les résidus Tyr 53 et Thr 69 j le résidu Asp 101 forme un pont salin avec le résidu Lys 97 ; et, finalement, le carboxyle terminal 129 forme un pont salin avec le résidu Lys 13. Il semble que les carboxyles 18, 48, 87, 103 et 119 ne forment aucune liaison particulière avec d'autres chaînes latérales d’amino- acides.

Dans une optique assez différente, divers chercheurs ont proposé de clas­ ser les groupes carboxyles d'après leur pKa. Déjà, l'allure très "étirée" de la courbe de titration du lysozyme (cf. fig. 2) suggère qu'il existe plusieurs types de groupes carboxyles dont les pKa seraient différents

(Tanford, 1954]. Donavan et al. [1964] admettent que deux de ces groupes auraient des pKa égaux, respectivement, à 3,15 et 6,20. SakaKibara et

le groupe de Raftery [1969} confère les valeurs 4,2 , 4,7 et 6,1 aux pKa des résidus 101, 103 et 35, respectivement. Par comparaison de la courbe de titration du lysozyme natif avec celle obtenue après transformation du résidu Asp 52 sous forme de B'éthylester, on peut attribuer la valeur de 3,5 au pKa du résidu transformé. A la suite d’études physico-chimiques, l'équipe de Tanford (Aune, 1960 j Aune et al., 1969} suggère que le lyso­ zyme posséderait deux carboxyles à pKa voisin de 1,9 ; du modèle cristal­ lographique, ces auteurs déduisent qu'il s'agirait du résidu Glu 7 et de, soit un des résidus Asp 52 ou Asp 103, soit le carboxyle terminal 129.

Toutes les valeurs des pKa ainsi estimées sont résumées dans le tableau II TABLEAU II COÜH 7 18 35 48 52 66 87 101 103 119 129 pKa 1,9 ? 6,1 ? . 3.5 ? (1.9} 7 CM _4,7 (1,9} 7 _(1,9}

{bj Conoemant la modification chimique des groupes carboxyles

La modification chimique des résidus d’acides aminés dans les protéines est une technique assez habituelle pour aborder l'étude des rapports entre la structure et l'activité (enzymatique par exemple}. Ici, nous visions à localiser spécifiquement les carboxyles anormaux que décèle la titration, en vue d'une confrontation avec le modèle cristallographique.

Jusqu’à présent, bien que de nombreux travaux aient été publiés à ce sujet, il n'existe pas de méthode réalisant de manière entièrement satisfaisante la modification chimique des carboxyles j nous voulons dire par là,une

Tïl

'

modification que l’on pourrait caractériser facilement, et qui serait aussi d'application générale aux protéines.

Les solutions d'acide chlorhydrique dans l'alcool méthylique anhydre permettent d'obtenir avec de bons rendements les esters méthyliques [Frie- den, 1956 j Fraenkel-Conrat et al., 19453 ; mais les conditions expérimen­ tales sont malheureusement très dénaturantes pour les protéines. On-arrive à se placer dans des conditions beaucoup moins brutales en employant les dérivés diazo [méthyl-diazo-acétate, diazo-acétamide, diazo-acétylglycinami de3 CChibnall et al., 1958 Doscher et al., 1961 ; Oelpierre et al., 1965 Rojagopalan et al., 1966} j malheureusement, l'intrinsèque instabilité de ces dérivés limite grandement le rendement de la réaction.

Les carbodiimides, qui sont utilisés dans ce travail, peuvent donner de bons résultats bien qüe la caractérisation des produits reste difficile et que le rendement ne soit guère élevé. Dans notre cas, cependant, le choix du réactif était dicté essentiellement par la nécessité d'opérer dans des conditions expérimentales très douces, en évitant si possible toute dénaturation susceptible de libérer des groupes "cachés".

La réaction chimique d’un carbodiimide avec un groupe carboxyle peut, selon Khorana C1953, 1955}, s’interpréter de la manière suivante :

Cette o-acylisourée peut alors subir le réarrangement suivant P’ 0 m_I RC'- 0 - C NH'' I R" RC -.0 NR' □ = C + H I NH I R" (N-acylurée3 (1)

Cii) En présence d’un réactif nucléophile [autre que l'eau] , ü RC^---- - NR’ I □ = C + HX I NH I R” 0 NHR’ Il / RC-X + G = C H-h-* \ NHR" [2]

(iü3 Réaction parasite 0 ---□ = NR’ I C + H2O I NH I R” NHR’ RCQOH + 0 = C + H'*' [3] N NHR"

On remarquera que cette réaction peut se dérouler avec un cours légère ment différent, soit en la présence (équation (2)], soit en l’absence

(équation (1)), de réactifs nucléophiles.

Il est évident que la réaction opérée sous l’effet d’un réactif nucléophi le, comme l’ester éthylique de la glycine par exemple, est de loin préfé­ rable : on peut alors apprécier correctement l’amidification réalisée. Si nos propres expériences ne font pas appel aux réactifs nucléophiles, c’est qu’au moment de leur réalisation les seuls travaux publiés dans le domaine des protéines étaient ceux de Riehm et Scheraga (1966] ; or, ces auteurs venaient d’obtenir d'excellents résultats dans le traitement de la ribonucléase dont la structure est très proche de celle du lysozyme. Un peu plus tard, les travaux de Hoare et al. (1967], de Wilchek et al.

Lin et al. C19B9) faisaient intervenir les réactifs nucléophiles et appor­ taient ainsi une nette simplification dans l'estimation du nombre des grou­ pes modifiés au sein de la protéine. Nos travaux étaient trop avancés pour envisager l’essai de la modification chimique des groupes carboxyles par le carbodiimide en présence d’un réactif nucléophile.

(

a

Matériel

et

méthodes

Le lysozyme utilisé est de provenance Sigma Chemical Co., lot 10S-B-8700. Il est employé sans autre purification.

[1

]

La WSC est un produit de Aldrich Chemical Corp. Inc. Product, lot 010661. L’alcool méthylique est distillé avant l'emploi. Le dithiothrei- tol [grade A, lot 840332!) est un produit Calbiochem, l’acide iodoacétique est un produit Merck. Les autres produits sont de pureté analytique.

(1) Conditions expérimentales

La préparation des dérivés est faite selon une version modifiée de la méthode de Riehm et Scheraga [1966). En effet, nous avons remarqué que dans les conditions décrites par ces auteurs, la WSC ne réagit que faiblement avec le lysozyme. Opérée en solution aqueuse à pH 4,5 , la réaction donne moins de 0,5 % de protéine modifiée [évaluation faite

[D

”Water soluble carbodiimide" [carbodiimide hydrosoluble)

après chromatographie sur Amberlite CG 50). L’étude que nous avons (1)

entreprise par spectrophotométrie IR en a montré la raison : le carbodiimide s'hydrolyse en très peu de temps en l'urée

correspondan-(2)

te (cf. fig. 5). Il y avait donc lieu de modifier les conditions expérimentales. Le pH de travail (4,5) a été maintenu, de manière à conserver l'avantage de la spécificité réactionnelle au niveau des groupes carboxyllques. Par contre, un solvant hydroalcoollque a été

[31 utilisé dans le but de limiter l’hydrolyse de la WSC CBO % méthanol) Ces nouvelles conditions expérimentales nous imposaient de vérifier l’état de la structure moléculaire de la protéine au sein de ce sol­ vant. Le contrôle a été effectué en mesurant la température de tran­ sition thermique (T.Tr) du lysozyme dans le méthanol à BO %, à pH 4,5 et à pH B,0 . Le relevé du pouvoir rotatoire à 43B nm indique des températures de transition de 59-BO °C et de 62 °C, respectivement à ces deux pH (cf. fig. B) j la réversibilité de ces mesures est d'ail­ leurs excellente. A titre de comparaison, la température de transition du lysozyme dans l'eau est de 75 °C (Iser-Vincentelli, 19B3). Comme

Les spectres infrarouges ont été réalisés dans le service du Profes­ seur R.H. Martin, auquel vont tous nos remerciements.

(2) Hydrolyse du carbodiimide : R - N = C = N - R' + H2O R - N = C - OH NH - R' + H^O ^ R NH C -/ V NH - R’ -> R - NH - CII - NH - R’ ÜH GH 0

La dissociation du méthanol est particulièrement faible en milieu acide (ici, à pH 4,5)

T

ra

n

s

m

it

a

n

c

e

Figure B

la réaction considérée est opérée à une température voisine de 1

c'est-à-dire bien inférieure au début de la zone de transition, on peut admettre que la molécule protéique conserve durant ce traitement une structure organisée. Les conditions expérimentales ainsi modifiées nous ont permis d’obtenir une quantité de matériel suffisante pour pou­ voir faire l’étude des peptides trypsiques de la macromolécule après le marquage de ses carboxyles.

[2} Nodlflcation chimique

250 mg de lysozyme (17 ymoles] sont dissous dans 50 ml d’une solu­ tion aqueuse à 60 % de méthanol, à 1 '^C ± 0,5 °C. Le pH est ajusté puis maintenu à la valeur 4,5 pendant toute l’expérience, au moyen d'un pH-stat. La réaction se fait par additions successives d’environ 400 mg de WSC, ce qui représente un rapport molaire lysozyme/WSC de 1/100. Après la 4ème addition, la réaction semble fortement ralentie (cf. fig. 7).

Au cours de l’opération, 6 prélèvements ont été faits après des durées de 15 min, 30 min, 3 h 15 min, 5 h 15 min, 6 h 45 min et 11 h. Pour arrêter la réaction, chacun de ces six échantillons a été aussitôt dilué dans 5 ml d’eau à température ordinaire, dialysé durant 24 h contre de l’eau, puis lyophilisé.

Addition de WSC en en œ 'Û) »H E E O en e O ü en e O O U CL O du prélèvement en CM 0 \Q3^ U -H ti­ en “H œ *o *-H O O £ £ en œ 0 TD •-* œ E >> N O en >î 0 a E O >) œ X X) O n CD t-# (0 O O E 11

Action du carbodiimide [WSC] sur le lysozyme (17 ymoles] en présence de BO % méthanol, à pH 4,5 et à 1 °C C1] enregistrés lors de l’expérience

(2) calculés tenant compte des 66 % d'ionisation et de la quantité de lysozyme prélevés successivement.

TABLEAU III

Prélèvement n°

Temps Estimation du nombre des groupes modifiés* 1 1 5 min 1,1 2 30 min 2,2 3 3 h 15 min 4,2 4 5 h 15 min 5,6 5 B h 45 min 7,0 6 11 h 8,2

* Le calcul tient compte de la quantité de lysozyme préle- levée successivement au cours de la réaction.

(3) Analyse de la composition en acides aminés

Cette analyse a été faite pour vérifier d'une part que la modifica­ tion chimique des carboxyles par la WSC s’effectue bien par la forma­ tion d'une liaison amide et d'autre part pour voir si éventuellement d'autres chaînes latérales d'aminoacides n'ont pas subi une altération

(2Ü irréversible. L'analyse de la composition en acides aminés

(Spackman et al., 1958) a été réalisée pour l'échantillon le plus modi­ fié par la WSC (prélèvement n° 6). Dans le tableau IV, les valeurs ainsi obtenues sont comparées avec celles connues pour le lysozyme natif.

Nous tenons à remercier Nademoiselle Claudine PAUL, à qui nous som­ mes redevable de ces analyses.

Acides aminés

Résidus par molécule, d'après le modèle cristallographique

Résidus par molécule, pour la fraction n“ B Lys 6 5.82 Mis 1 1.15 Arg 11 12.00 Asx 21 20.05 Thr 7 5.87 Ser 10 7.34 Glx 5 5.00 Pro 2 1.84 Gly 12 11.85 Ala 12 12.00

Cys 8 non déterminé

Val 6 5.50 Met 2 1.50 Ile B B.17 Leu 8 8.17 Tyr 3 3.17 Phe 3 3.33 Trp B non déterminé

La grande similitude entre les deux compositions en acides aminés jus­ tifie. en ce qui concerne les résidus glutamiques et aspartiques, la formation de liaisons amides lors de la modification chimique des car- boxyles par la WSC. Ces liaisons s'hydrolysent de la même manière que les liaisons peptidiques.

(4) Fractionnement par chromatographie

Chacun des six échantillons prélevés au cours de la réaction a été fractionné par chromatographie sur Amberlite CG 50 (gradient disconti­ nu, 0,2 et 0,5 n en phosphate, à pH 7,15). Pour chaque chromatographie on observe quatre pics distincts (cf. fig. 8). Le premier s'identifie au lysozyme non modifié ; les trois autres correspondent à des molécule plus ou moins profondément modifiées par la WSC. Sur chacun des six chromatogrammes la position des pics indique que le nombre de groupes carboxyles modifiés augmente de la fraction B vers la fraction 0.

L'aspect cinétique de la modification peut-être envisagé à partir des résultats donnés par la même figure 8. Les renseignements que l'on peut tirer du graphique ci-dessous (où l'on a porté la surface relative des pics chromatographiques correspondant aux différentes fractions A, B, C et D en fonction de la durée de la réaction)sont compatibles avec la séquence réactionnelle suivante :

A B C -> D

A

b

s

o

rb

a

n

c

e

_A

1

V. . . 1

Lysozyme non modifié par la WSC

Volume d’élution (ml] 200 0,3

-A

J

Lysozyme modifié par la WSC

(t = 15 min) Volume d'élution (ml) 200 400 Prélèvement n°2 (t = 30 min) Volume d'élution (ml) 400 , (t = 3h15min) Volume d'élution (ml) 400 (t = 5h15min) Volume d'élution (ml) 4Ô0 Prélèvement n°5 (t = 6h45min) Volume d'élution (ml) 400 Prélèvement n°6 (t = 11 h) Volume d'élution (ml) 400 Figure 8

Avant d'envisager l’étude des différentes fractions, nous avons été forcé, vue le peu de matière obtenue, de rassembler après dialyse et lyophilisation les pics de même nature, ce qui constitue quatre échan­ tillons différemment modifiés, appelés A*, B*, C* et □*.

(5) Activité enzymatique

La mesure d'activité enzymatique des fractions A*-B*-C*'-D*, ainsi que celle du lysozyme natif pris comme référence, a été faite en utili­ sant comme substrat une suspension de micrococcus lysodeiKticus. Les résultats figurent dans le tableau V.

TABLEAU V

Echantillon Activité Lysozyme natif Arbitrairement

égal à 100 %

A* 100 %

B* 50 %

C* 48 %

D* 27 %

(6) Protéolyse au moyen de la trypsine

Après réduction des ponts disulfures par le dithiothreitol selon la méthode de Cleland M9B4], et blocage des groupes sulfhydryles par l’acide lodoacétique, chacun des échantillons A*-B*- C*-D* ainsi que le lysozyme natif ont été soumis à l'action de la trypsine traitée au TPCK*’^^ (Kostka et al., 1964).

CD

[7} Cartes peptidiques sur papier

Environ 3 mg du mélange des peptides trypsiques sont d’abord soumis à la chromatographie descendante sur papier Whatman 3 MM, en utilisant comme éluant le système pyridine + acide acétique + n-butanol + H2O

C50-15-75-B0 en volume). On opère ensuite l’électrophorèse sous haute tension (2.000 Volts ; montage décrit par Katz et al., 1959), en présen­ ce de tampon pyridine + acide acétique + H2O (1-10-89 en volume ) à pH 3,5.

En général, les peptides ont été révélés par pulvérisation d’une solution de ninhydrine (0,5 % dans l'acétone) et séchage à l'air. Dans d’autres cas, des acides aminés particuliers ont été mis en évidence par des réactifs spécifiques j éventuellement, il a été procédé à l’a­ nalyse de la composition en acides aminés pour certains de ces peptides trypsiques (cf. (8)).

(8) Caractérisation des peptides

Canfield (1963) a établi la carte de la plupart des peptides obtenus par digestion trypsique du lysozyme natif. En une première approxima­ tion, nous avons confronté la position de nos peptides avec celle des cas examinés par Canfield (cf. tableau VI). Les taches qui semblaient correspondre aux peptides T3, T7, Tg» Tg et T'\'\ ont été découpées, éluées dans HCl 5,7 N, et analysées pour leur composition en acides aminés. La très faible quantité de produit disponible pour cette ana­ lyse ne nous a cependant pas permis d’obtenir des résultats très nets. Seuls les peptides T3 et Tg ont pu être identifiés avec certitude par cette méthode. Les réactions spécifiques de la tyrosine et du

trypto-(1 )

phane furent également utilisées , pour confirmer la position et la

(1)

nature de certains peptides (Block et al., 1958 ; Easley, 19B5K L'identification du peptide T0 repose d'ailleurs entièrement sur le fait qu'il donne la coloration spécifique de la tyrosine.

TABLEAU VI

Structure chimique des unités trypslques du lysozyme [d’après la séquence des acides aminés de Canfield, 1963].

T ~ 1 _{NH2 ~ Lys}

T - 2 Val - Phe - Gly - Arg

T - 3 Cys - Glu - Leu - Ala - Ala - Ala - Met - Lys T - 4 Arg

T - 5 Mis - Gly - Leu - Asp - Asn - Tyr - Arg

T - 6 Gly - Tyr - Ser - Leu - Gly - Asn - Try - Val - Cys - Ala Ala “ Lys

T - 7 Phe - _{Glu - Ser - Asn - Phe - Asn - Thr - Gin - Ala - Thr}

Asn - Arg

T - 8 Asn - Thr - Asp - Gly - Ser - Thr - Asp - Tyr - Gly - Ile Leu - Gin - Ile - Asn - Ser - Arg

T - 9 Try - Try - Cys - Asn - Asp - Gly - Arg T - 10 Thr - Pro - Gly - Ser - Arg

T - 11 _{Asn - Leu - Cys - Asn - Ile - Pro - Cys - Ser - Ala - Leu}

Leu - Ser - Ser - Asp - Ile - Thr - Ala - Ser - Val - Asn Cys - Ala - Lys

T - 12 Lys

T - 13 Ile - Val - Ser - Asp - Gly - Asp - Gly - Met - Asn - Ala Try " Val - Ala - Try - Arg

T - 14 Asn - Arg T - 15 Cys - Lys

T - 16 Gly - Thr - Asp - Val - Gin - Ala -Try - Ile - Arg T - 17 Gly - Cys - Arg

Les fingerprints des fractions , B*, C* et D* sont reproduits dans la figure 9.

Rappelons que le pic chromatographique correspondant à la fraction A* occupe dans le diagramme d’élution une position identique à celle du lysozy­ me non traité (cf. fig. 8]. En outre, on observe que cette fraction A* a une activité bactériolytique inaltérée par rapport à l'enzyme de départ (cf. tableau V). Comme on pouvait s'y attendre, elle présente effectivement une carte peptidique qui se superpose à celle obtenue à partir du lysozyme na­ tif.

La fraction B* est la seule forme de lysozyme modifié qui, au cours de la chromatographie sur Amberlite, peut être éluée au moyen de tampon phos­ phate 0,2 n J ceci pourrait suggérer que la modification de la protéine est légère, en comparaison des fractions C* et □* dont l'élution nécessite une concentration 0,5 M en phosphate (cf. fig. 8). On constate aussi que l'ac­ tivité enzymatique de la fraction B* est réduite à 50 % (cf. Tableau V], ce qui est compatible avec la modification de l'un ou l'autre parmi les carboxy- les impliqués dans le mécanisme enzymatique. Effectivement, la carte pep­ tidique de cette fraction ne montre qu'une très légère altération du lyso­ zyme. On observera que tous les peptides sont identiques à ceux de la pro­ téine native, mis à part le cas du peptide T13 qui a disparu ; ce dernier contient les résidus aspartiques 101 et 103. Or Balke et al. (1967p] ont montré que le résidu 101 participe au maintien du substrat dans le site catalytique, lors de la fixation de l'hexamère de la N-acéty1-glucosamine

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(NAG). Dans le substrat, le résidu NAG "A" est lié à l'enzyme par des Interactions non polaires, ainsi que par une liaison hydrogène entre son groupe -NH- et la chaîne latérale du résidu aspartique 101 j de plus, le

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]

résidu NAG "B” , maintenu également par des interactions non polaires, forme à son tour une liaison hydrogène avec le résidu 101 de l'enzyme. La substitution du carboxyle 101 expliquerait donc aisément la diminution

ITT

d’activité enzymatique de la fraction considérée, sans impliquer pour au­ tant l'abolition totale de cette activité. Très accessible au solvant, les chaînes latérales des résidus 101 et/ou 103 sont bien placées pour réagir avec la WSC avant tout autre groupe carboxyle. Au total, l'étude de la mo­ dification chimique opérée en solution fournit donc des résultats en fort bon accord avec ce que renseigne le modèle radiocrlstallographique de la protéine. Rappelons que les carboxyles 101 et 103, ou l'un d'entre eux seulement, auraient d'ailleurs un pKa normal (cf. tableau II].

Lorsque l'on étudie la fraction C* par la technique du fingerprint, il est étonnant de oonstater la disparition de certains peptides qui ne

com-t1 ]

portent cependant pas de groupe carboxyle en chaîne latérale . Sans doute les conditions que nous avons utilisé sont-elles choisies de manière telle que le carbodiimide réagisse spécifiquement avec les groupes carboxyles. Il faut cependant garder à l'esprit que selon Khorana (1954] ce réactif peut atteindre la thréonine, la sérine et même la tyrosine, quoique assez faiblement dans nos conditions expérimentales. L'analyse de la composition en acides aminés effectuée sur la fraction n° 6 (cf. tableau IV] montre que, si la plupart des acides aminés y sont présents en quantité inchangée par rapport au lysozyme natif, il existe des différences significatives dans le nombre des résidus thréonine et sérine ; par contre, les résidus tyrosine sont tous présents. Il faudra tenir compte de l'action possible du carbo­ diimide avec ces deux résidus thréonine et sérine.

Relevons encore que l'activité enzymatique de la fraction C* est semblable à celle de la fraction B* (cf. tableau V]. Il est donc possible qu'aucun des autres groupes carboxyles nécessaire à l'activité n'y ait été modifié. Si l'on reprend les données concernant les carboxyles de l'acide glutamique 7 et de la leucine C-terminale 129, données établies à la lumière des tra­ vaux de Tanford, il faut attribuer à ces deux fonctions des pKa anormaux de

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