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Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository
Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:
Hanocq, F. (1973). Recherches sur les acides désoxyribonucléiques des oocytes d'amphibiens, au cours de l'oogenèse et de la maturation (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.
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UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES
Faculté des Sciences
Laboratoire de Cytologie et Embryologie moléculaires
RFCU le n J r 1973 Rêp;... .
RECHERCHES SUR LES ACIDES
DESOXYRIBONUCLEIQUES DES OOCYTES D'AMPHIBIENS, AU COURS
DE L'OOGENESE ET DE LA MATURATION
Thèse présentée pour l'obtention du grade légal de Docteur en Sciences Zoologiques
Françoise HANOCQ
1973
1.
INTRODUCTION GENERALE
1. L'embryologie moléculaire et la différenciation cellulaire
Le but de l'embryologie est de comprendre par quels méca
nismes l'oeuf fécondé donne naissance à un embryon, puis à un adulte, par la différenciation ordonnée de ses cellules. On peut formuler le problème en termes de génétique : comment le génotype constitué dans le zygote par l'amphiraixie des 2 gamètes mâle et femelle, peut-il don
ner naissance à plusieurs centaines de phénotypes différents ?
Le développement d'un embryon progresse par des modifications complexes des cellules : modifications de leurs caractéristiques indi
viduelles, mais aussi de leur organisation en tissus et en organes.
Ces interactions cellulaires sont très compliquées ; pour cette raison on se limite le plus souvent à l'étude de l'embryogénèse précoce, qui s'arrête aux stades immédiatement postérieurs à la gastrulation.
La cellule doit ses caractéristiques définitives (métabolis
me, structure, fonction) à la nature de ses protéines ; souvent même, elles résultent de la synthèse d'une protéine majeure, caractéristi
que de la lignée cellulaire : synthèse de l'hémoglobine dans les glo
bules rouges, de l'actine et de la myosine dans les myoblastes ...
Nous savons que la structure des protéines est codée par la séquence des nucléotides qui constituent le DNA . Les progrès de la biologie moléculaire, réalisés principalement grâce à l'étude des microorganis
mes, ont permis de préciser comment un gène, ou mieux, un cistron, exprime l'information génétique qu'il contient, par la synthèse d'une chaîne polypeptidique déterminée. Les mécanismes moléculaires fon.datrien- taux : la réplication de l'acide désoxyribonucléique (DNA), la trans
S'il est donc clair que le phénotype d'une cellule est, en définitive une conséquence de l'expression de gènes détermines, il nous reste à essayer d'élucider, en termes moléculaires, la nature des mécanismes qui régissent cette activité génétique. Actuellement, la différenciation cellulaire est interprétée comme le résultat d'une activité génétique variable, dans le temps et dans l'espace, d'un génome unique : chaque cellule somatique posséderait donc le même DNA que le zygote ; c'est l'activation (ou dérépression) sélective de cer
tains gènes, convenablement sélectionnés, qui déterminerait la synthè
se de protéines spécifiques, dans une cellule déterminée, à un moment précis. Cette théorie a pour origine les observations suivantes :
On sait depuis les travaux de Boivin, Vendrely et Vendrely (1948) et de Mirsky et Ris (1949), que toutes les cellules d'un même organisme contiennent la même quantité de DNA, à l'exception des ga
mètes qui en contiennent deux fois moins.
Il existe cependant des exceptions à cette règle générale.
Dans certains cas, la totalité du génome est multipliée (polyploïdie) ou, au contraire, perdue (exemple : les érythrocytes de Mammifères), Dans d'autres cas, il semble y avoir réplication différentielle de certaines parties du génome : on connaît l'exemple de la réitération et de l'amplification du r-DNA chez Xenopus laevis (Birnstiel et al., 1966 ; Gall, 1968 ; Brown et Weber, 1968, David et al., 1970). Si
l'existence des séquences de r-DNA en plusieurs exemplaires (réitéra
tion) est un phénomène qu'on trouve dans toutes les cellules somati
ques, 1'amplification s'observe exclusivement dans les oocytes (Evans et Birnstiel, 1968 ; Brown et David, 1968 ; Birnstiel et al., 1971) :
3.
chez les Amphibiens, elle est probablement liée à la formation des 1.000 - 1.500 nucléoles qui sont libérés dans la vésicule germina
tive, dont chacun possède un ou plusieurs organisateurs nucléolai- res (Perkowska et al., 1968). Effectivement, dans les cellules somatiques, la quantité de r-DNA est constante, en pourcentage du génome total, quelle que soit l'intensité des synthèse de r-RNA.
Le cas le plus célèbre de perte d'une partie du génome est celui de la diminution chromatique dans les cellules somatiques d'Ascaris : à chaque division de segmentation, une seule des 2 cellules filles conserve la totalité du génome tandis que l'autre perd une partie de sa chromatine dans le cytoplasme.
Ces exemples constituent probablement des cas particuliers : le génome est sans doute identique dans les diverses cellules soma
tiques d'un organisme pluricellulaire d'une espèce donnée. Ce sont les expériences de transplantation nucléaire qui ont démontré le plus clairement la pluripotentialité des noyaux : des noyaux de têtard de xénope, et même des noyaux de cellules adultes différenciées, sont capables d'assurer le développement normal d'un oeuf vierge énucléé
(de la même espèce) dans lequel on a les a microinjectés (Gurdon, 1962 ; Gurdon et Uehlinger, 1966 ; Briggs, 1969).
De plus, des expériences d'hybridation moléculaire DNA - DNA n'ont pu mettre en évidence aucune différence entre les préparations de DNA effectuées à partir de divers tissus de souris (Mac Carthy et Hoyer, 1964) : les séquences majeures de désoxyribonucléotides qui constituent le DNA sont donc toutes présentes dans chaque noyau soma
tique et toujours dans les mêmes proportions relatives. Il est cer
tain cependant que ce genre d'étude dépend fort des moyens techniques dont on dispose et il n'est pas à exclure que des variations plus sub
tiles ne soient un jour décelées par des méthodes plus raffinées .
Au cours des dernières années, on a commencé à "mesurer" la complexité du génome, par des expériences de réassociation du DNA dé
naturé : dans des conditions convenables de salinité, de température, de concentration et de taille des molécules de DNA, on peut estimer que la vitesse de réassociation d'une séquence unique, est inversement proportionnelle à la taille du génome, Corollairement, la vitesse de réassociation d'une séquence déterminée est fonction du nombre d'exem
plaires auquel elle est reproduite dans le génome (Britten et Kohne, 1968).
Dans tout génome d'eucaryote, on trouve des séquences uniques et des séquences répétées un grand nombre de fois (jusqu'à 10 fois). Cette observation permet d'expliquer comment chez les Mammifères, par exem
ple, la quantité d'information contenue dans le génome, est suffisante en principe pour coder 1.000 fois plus de protéines que celles qui sont actuellement connues. Selon Markert et Ursprung (1971), il est peu pro
bable qu'il reste à découvrir un nombre de protéines 1.000 fois supé
rieur à celui que nous connaissons.
Il est clair que la multiplication du nombre de gènes pourrait être un excellent moyen, pour une cellule, d'augmenter la vitesse de synthèse de RNAs messagers, en fonction des besoins.
On peut théoriquement envisager deux possibilités :
1. Toutes les cellules somatiques posséderaient des copies multiples des mêmes gènes (réitération).
2. Dans des cellules déterminées, il y aurait réplication sélective des gènes requis pour la synthèse des protéines spécifiques de la lignée cellulaire (amplification).
5.
1. Le premier type d'hypothèse a rapidement été jugé peu yraisemblable parce que pour pallier les effets des mutations individuelles sus
ceptibles d'intervenir dans chacune des copies, il faut imaginer l'existence d'un système de réparation, maintenant l'uniformité par
mi les multiples séquences d'un même gène. Dans sa théorie d'un gène
"maître" contrôlant la synthèse de plusieurs gènes "esclaves",
Callan (1967) a proposé l'existence d'un mécanisme de correction des erreurs, au cours de la réplication des gènes esclaves, sans en don
ner de preuve expérimentale. Au cours des phénomènes méîotiques, les copies "esclaves" pourraient ne pas participer à la recombinaison et donc ne pas intervenir dans la transmission de l'information.
2. L'hypothèse d'une amplification sélective, dans une lignée cellulaire, des gènes de structure codant pour la protéine majeure ou "protéine de luxe", a été proposée par Lasher et Cahn (1969). Elle repose sur le fait que la 5- bromodésoxyuridine (Brdu) inhibe la différenciation cellulaire et plus particulièrement, la synthèse de la protéine qui peut être considérée comme l'expression de la différenciation spécifi
que de ces cellules. Il est clair que la BrdU peut être phosphorylée et incorporée dans le DNA, où elle remplace la thymidine. L'inhibi
tion est réversible et est fortement réduite par l'addition de thymi
dine en quantité équimolaire. Il n'y a aucune altération apparente de la division cellulaire, ni de la croissance et aucun effet sur les processus de synthèse des RNAs et des protéines autres que celles
"de luxe" (Stellwagen et Tomkins, 1971). Pour inhiber la différen
ciation, il faut que la BrdU soit fournie pendant la phase prolifé
rative qui précède la différenciation (Bischoff et Holtzer, 1970).
Selon Lasher et Cahn (1969), l'effet de la BrdU s'expliquerait par la nécessité d'une synthèse de DNA, en dehors de la phase S de répli
cation normale du DNA ; elle correspondrait à la multiplication du nombre de gènes de structure de la protéine majeure. Outre que ce
mécanisme permettrait une rapide expression d'une partie du génome, il pourrait également stabiliser l'état différencié. On connaît maintenant plusieurs exemples d'inhibition de la différenciation par
la BrdU : c'est le cas des myoblastes (Stockdale et al., 1964 ; Coleman et al., 1970 ; BisèhofEet Holtzer, 1970), des fibroblastes
(Abbott et Holtzer, 1968 ; Holthausen et al., 1969 ; Lasher et Cahn, 1969), du pancréas (Wessels, 1964 ; Rutter et al., 1968), des érythro- blastes d'embryon de poulet (Miura et Wilt, 1971 ; Hagiopan et al.,
1972), des cellules d'hépatome (Stellwagen et Tomkins, 1971).
Toutefois, le schéma proposé par Lasher et Cahn, ne semble pas se vérifier expérimentalement : en effet, il a été éprouvé récemment dans des systèmes où on a pu identifier et isoler un RNA messager codant pour une protéine "de luxe" : c'est le cas de l'hémoglobine de canard
(Bischop et al., 1972) et la fibroîne des glandes séricigènes du ver à soie (Suzuki et al., 1972). Ces auteurs sont arrivés à la même conclu
sion : dans les réticulocytes et les cellules productrices de soie, il n'y a probablement qu'un, au maximum 3 gènes de structure, codant pour chacune des 2 chaînes et ^ de l'hémoglobine ou pour la fibroîne.
Si l'hypothèse de l'amplification sélective des gènes codant pour les protéines "de luxe" ne semble pas correcte, il n'est toutefois pas exclu qu'il puisse y avoir un grand nombre de gènes semblables
(mais non identiques) qui codent pour des familles de protéines homo
gènes, puisque Kedes et Birnstiel (1971) ont mis en évidence une mul
tiplication des gènes qui codent pour les histones.
Un autre type de "différenciation" du DNA, ne comportant pas de multiplication des gènes, a été suggéré par Scarano et ses collabo
rateurs (Scarano et al., 1967 ; Scarano, 1969) : par le jeu d'une mé- thylase de la cytosine, suivie de l'action de la 5- CH^ - cytosine aminohydrolase, on pourrait avoir substitution d'une cytosine par une thymine, dans une chaîne du DNA. Les arguments expérimentaux à l'appui
7.
de cette hypothèse sont très minces. Mais rien ne permet encore d'ex
clure ce type de modification chimique du DNA. Dans l'ensemble, ce genre d'hypothèse n'est pas accueilli favorablement : une méthylation du DNA serait irréversible, ce qui est en désaccord avec les expérien
ces de transplantation de noyaux. Le fait que le degré de méthylation du r-DNA de xénope est différent dans l'oocyte et les cellules somati
ques (Dawid et al., 1970) nous incite cependant à penser que l'hypothè
se de Scarano mérite d'être prise en considération. D'autre part, comme le soulignent Brachet et Malpoix (1971), les expériences de transfert de noyaux donnent des résultats positifs avec un rendement assez faible j on peut penser que les difficultés techniques sont en partie responsa
bles de ce mauvais résultat ; mais il est possible aussi que certains noyaux adultes aient subi des processus irréversibles, de sorte qu'ils ne soient plus totipotents et' identiques au noyau du zygote. A l'heure actuelle, il est donc plus simple de considérer que la différenciation cellulaire résulte de l'activation sélective de gènes déterminés, d'un génome commun. Nous sommes ainsi amenés à étudier les mécanismes de régulation de l'activité génétique.
2. La régulation de l'activité génétique
Il est clair que la différenciation s'accompagne de l'appari
tion de populations de RNAs différents. L'hybridation moléculaire a montré que les RNAs à marquage rapide synthétisés dans les différents
tissus d'un même organisme, sont différents (Mac Carthy et Hoyer, 1964 ; Denis, 1966).
On peut très bien observer cette synthèse de RNA, variable selon les conditions physiologiques, dans le cas particulièrement favorable des chromosomes polytènes. Les "puffs", qui sont des endroits de déconden-
sation des chromosomes, sont le siège d'une synthèse de RNA. La loca
lisation des puffs sur les chromosomes varie dans les divers organes.
De plus, au cours des métamorphoses successives, et en réponse à l'ecdysone (hormone stéroïde), on voit apparaître et disparaître plusieurs puffs différents, traduisant l'activation séquentielle de gènes déterminés (Berendes, 1971).
En 1961, Jacob et Monod ont proposé un schéma permettant d'ex
pliquer l'induction ou la répression d'enzymes spécifiques, en fonction du milieu de culture chez Escherichia coli. Le modèle de 1'opéron, méca
nisme de régulation au niveau de la transcription, est souvent considéré comme constituant une bonne hypothèse de travail pour l'étude de la régulation de ,1a transcription chez les eucaryotes.
Britteri et Davidson (1969) ont imaginé un modèle de régulation de la transcription, valable pour les organismes supérieurs, qui s'ins
pire de celui de Jacob et Monod ; il fait intervenir une hiérarchie très compliquée de gènes. Selon cette théorie, les RNAs nucléaires à marquage rapide (RNAs "activateurs"), produits par des gènes régulateurs
(gènes "intégrateurs") s'hybrideraient spécifiquement avec les nombreu
ses séquences répétitives qui constituent les gènes "récepteurs".
Ensuite commencerait la transcription des gènes de structure ou "pro
ducteurs". Ce schéma a le mérite de proposer une explication pour 2 faits expérimentaux bien connus : la présence de séquences multiples dans le DNA et la synthèse de RNAs nucléaires, à -raarquage rapide, qui ne sont jamais retrouvés associés aux ribosomes dans le cytoplasme, et qui ne remplissent probablement pas la fonction de messager. Elle a cependant le grand défaut de ne pas tenir compte de l'influence du cytoplasme (Brachet, 1971 b).
Georgiev (1969) a proposé une hypothèse assez semblable. D'après celle-ci, en l'absence de répresseur, les nombreux gènes régulateurs qui précèdent les gènes de structure dans le génome, seraient transcrits simul tanément,ce qui expliquerait 1 ' existence des RNAs nucléaires "géants„.Selon Crick (1972)., les gènes de structure codant pour des protéines ne constitue
9.
raient en fait que quelques pourcents du génome total. La majorité des séquences de DNA ne seraient pas transcrites ; elles interviendraient dans les mécanismes de régulation. Certaines séquences répétitives
(celles des régions centromériques, par exemple) joueraient un rôle structurel.
Il est certain que les mécanismes de régulation de l'expression des gènes sont plus complexes et plus variés chez les eucaryotes, paral
lèlement à l'acquisition de structures plus évoluées (association du DNA à des protéines - formation d'organites - scission en compartiments
"noyau" et "cytoplasme")_, que chez les procaryotes.
Chez les organismes supérieurs, tout semble indiquer que, dans la chromatine, la majorité du génome est muette : à chaque instant, la fraction exprimée est très faible. La spécificité de la transcrip
tion semble due, non pas aux histones, mais aux protéines acides : le "démasquage" de la chromatine par les protéines acides serait spé
cifique de l'organe (voir à ce sujet, deux revues récentes par J. Paul, 1970 et 1971).
On peut envisager des mécanismes de régulation intervenant à tous les niveaux et notamment au moment du découpage des précurseurs géants de RNAs messagers, ou lors du passage à travers la membrane nu
cléaire.
Il existe certainement aussi une régulation au niveau de la traduction. Elle a été particulièrement étudiée dans les oeufs d'our
sin, au moment de la fécondation. On sait, en effet, que la féconda
tion et l'activation parthénogénétique stimulent très fortement la syn
thèse protéique dans les oeufs (Monroy, I960). Le fait que le même phénomène s'observe lors de l'activation de fragments anucléés de ces oeufs suffit à montrer que le contrôle de la synthèse protéique se fait essentiellement après la transcription (Baltus et al., 1965 ;
Burny et al., 1965). Comme nous le verrons plus loin, des' oocytes énucléés de Rana pipiens sont également capables de synthétiser des protéines ; mais, dans leur cas, la stimulation est réalisée à un stade qui précède la fécondation, au moment de la maturation (Ecker et Smith,
1968).
Dans l'oeuf vierge d'oursin, plusieurs mécanismes semblent coopérer, au niveau posttranscriptionnel, pour inhiber la synthèse des protéines (Mano, 1968) : masquage des m-RNAs stables (Mano et Nagano, 1966 ; Stavy et Gross, 1969), blocage des ribosomes par des protéines basiques (Monroy, 1965 ; Kedes et Stavy, 1969), présence d'un inhibi
teur des synthèses protéiques dans les ribosomes des oeufs vierges
(Metafora et al., 1971), activité réduite des aminoacyl-tRNA synthétases (ïimourian, 1967), absence de facteurs d'initiation (Mac Kintosch et Bell, 1969), quantité limitante des facteurs d'élongation (Felicetti et al., 1972).
Au cours du développement embryonnaire des Amphibiens aussi, ces phénomènes pourraient être particulièrement importants. En effet, la segmentation n'est pas inhibée par 1 'actinomycine celle-ci bloque le développement au début de la gastrulation ; on en conclut donc que de nombreuses mitoses peuvent se dérouler grâce aux RNAs templates synthétisés au cours de l'oogénèse et de la maturation (Brachet et al., 1964). Par contre, les RNAs messagers synthétisés dès la fin de la segmentation sont probablement requis pour la synthèse des protéines spécifiques de la gastrulation (Davidson et al., 1968 ; revue par Denis, 1968).
Selon Spirin (1966), les m-RNAs synthétisés par l'oocyte et conservés pendant un long moment avant d'être traduits, seraient "blo
qués" ou "masqués" sous forme d'informosomes : les m-RNAs seraient ainsi à la fois protégés des dégradations enzymatiques et rendus non disponi
bles pour les ribosomes. Des expériences récentes de Gross et ses colla
borateurs (Gross et al., 1973) confirment cette suggestion.
11.
Pour l'étude de ces m-RNAs, nous renvoyons aux nombreuses revues d'en
semble qui ont traité le sujet (Nemer, 1967 ; Denis, 1968 ; Gross, 1968;
Davidson, 1968).
Très récemment, on a repris l'étude de ces m-RNAs à longue vie, dans le but d'estimer la longueur de leur séquence de poly A. Il semble en effet, que tous les RNAs messagers d'eucaryotes, excepté ceux des histones, contiennent une séquence de poly A à l'extrémité 3'
(Adesnik et al., 1972). On a émis l'idée que la durée de vie d'une molé
cule de m-RNA serait liée à la taille de sa séquence de poly A, mais on n'a acune preuve de cette hypothèse.
Selon Sheiness et Darnell (1973), lorsque le m-RNA a atteint le cytoplasme, la séquence de poly A se raccourcit régulièrement, même si le m-RNA n'est pas engagé dans la synthèse des protéines. Slater et al. (1973) ont étudié l'adénylation des RNAs dans les oeufs d'oursin ; ils ont montré que l'oeuf vierge possède des RNAs adénylés de poids molé
culaire exceptionnellement élevé, et aussi des RNAs non adénylés ou par
tiellement adénylés. Les RNAs adénylés sont localisés surtout dans la fraction subribosomiale des oeufs vierges ; après la fécondation, on les retrouve associés aux ribosomes. L'adénylation pourrait se produire dans
le cytoplasme.
Wilt (1973) a étudié l'adénylation des RNAs pendant les 2 premières heu
res qui suivent la fécondation ou l'activation parthénogénétique des oeuff d'Oursins. Il a pu montrer que le contenu en poly A double pendant ce laps de temps et que cette augmentation d'activité prend place essentiel
lement dans la fraction des ribosomes et polysomes. L'augmentation de la teneur en poly A résulte de l'adénylation de m-RNAs maternels préexis
tants, synthétisés pendant l'oogénèse. Cette polyadénylation a lieu auss:
bien dans les fragments anucléés activés parthénogénétiquement : la réac
tion est donc cytoplasmique. En conclusion de ce travail, Wilt suggère que la polyadénylation n'est pas simplement un mécanisme associé à la transcription ou au transport du RNA, du noyau vers le cytoplasme ; dans les oeufs d'Oursins, elle pourrait jouer un rôle dans la mobilisation des m-RNAs maternels préexistants, en vue de leur traduction.
les qui constituent les fuseaux mitotiques, au cours de la segmentation) est un RNA préformé, synthétisé au cours de l'oogenèse, chez l'oursin en tout cas. Le rôle des autres m-RNAs synthétisés par l'oocyte n'est pas connu, mais il nous semble important de signaler le fait suivant : dans tous les travaux antérieurs à ceux de Britten et Kohne (1968), qui ont porté sur la mise en évidence des m-RNAs stables ou sur la comparaison des populations de m-RNAs aux différents stades du dévelop
pement (par hybridation compétitive), les expériences ont été effectuées avec un DNA total, non fractionné en séquences réitérées et séquences uniques (Davidson et al., 1966 ; Grippa et al., 1967 ; Davidson et al.,
1968 ; Davidson et Hough, 1969). Dans les conditions d'incubation utilisées, il est probable que la majorité des séquences transcrites étaient répétitives. Plus récemment. Davidson et Hough ont montré que, pendant l'oogénèse, il y a transcription, à la fois de séquences non répétitives (Davidson et Hough, 1971) et de séquences répétitives non ribosomiales (Hough et Davidson, 1972). Les séquences répétitives
transcrites ne représentent que 3,5 7<> des séquences répétitives totales.
Elles constituent 2 7» du RNA total de l'oocyte (dont la majorité est du RNA ribosomial) et sont présentes en quantité beaucoup plus importante que les RNAs transcrits sur les séquences uniques. La compréhension de la fonction de ces "messagers" stables est donc liée à celle de la signification des séquences réitérées.
3. Les relations nucléo-cytoplasmiques au cours du développement embryonnaire
Nous rappellerons brièvement quelques aspects du début du développement embryonnaire des Batraciens. Immédiatement après sa fécondation, l'oeuf de Batracien subit, à un rythme accéléré, une série de mitoses, qui le transforment, en quelques heures, en un embryon à plusieurs milliers de cellules. La segmentation n'est accompagnée d'aucun accroissement de masse, en sorte que l'oeuf fécondé est petit à petit morcelé en cellules de plus en plus petites, confinées dans un espace limité par
13.
la membrane vitelline et les gangues muqueuses. La gastrulation voit s'amorcer les mouvements morphogénétiques qui aboutissent à la mise en place des différentes ébauches embryonnaires. Dès ce moment, la desti
née des cellules est fixée : sans intervention expérimentale, la diffé
renciation s'établit de manière ordonnée, dans les diverses régions de l'embryon. Il en résulte des cellules de types divers, caractérisés par une structure, une fonction et un métabolisme définis.
L'une des premières théories de la différenciation a été pro
posée par Weismann: le noyau du zygote subirait un fractionnement du matériel génétique entre les divers noyaux de segmentation. Actuelle
ment, on considère (comme nous l'avons vu) que le génome de tous les noyaux de segmentation est équivalent et totipotent ; il semble donc que c'est l'architecture de la grande masse cytoplasmique, hétérogène, qui détermine la voie métabolique dans laquelle vont s'engager les noyaux. C'est la théorie énoncée par Driessche, puis précisée par Morgan en 1934 comme suit ; à la fin de la segmentation, les nombreux noyaux de la blastula répartis dans les divers territoires, ont un envi
ronnement chimique différent ; celui-ci détermine l'activation de gènes définis, dans chaque cellule. Le produit de l'expression de ces gènes contribue à accroître encore la diversification du cytoplasme, vis-à-vis des cellules voisines. Ainsi, par un jeu constant d'interactions entre
le cytoplasme et le noyau, dans chaque cellule se dessine l'évolution vers un type fonctionnel déterminé.
Les expériences de transplantation nucléaire ont apporté la preuve éclatante de ce que le cytoplasme est capable de contrôler l'acti
vité génétique.
Nous avons déjà signalé qu'un noyau d'intestin ou de cerveau de xénope adulte, transplanté dans un oeuf vierge énucléé, permet le développement normal de l'oeuf et que l'embryon donne naissance à un adulte normal, fertile.
On peut montrer que l'activité génétique du noyau transplanté dépend directement du cytoplasme environnant : le métabolisme du noyau étranger est modifié de manière à se conformer à celui de la cellule- hôte.
Par exemple, les noyaux de cerveau adulte, qui ne synthétisent plus de DNA, recommencent à incorporer de la thymidine, dès qu'ils sont trans
plantés dans un oeuf vierge énucléé (Graham et al., 1966). On peut d'ailleurs considérer que c'est le môme phénomène de réactivation qui se produit dans la tête spermatique, après sa pénétration dans l'oeuf.
Transférés dans un oocyte en croissance, où le métabolisme des RNAs est très actif, les noyaux de cerveau synthétisent du RNA, mais pas de DNA (Gurdon, 1968).
Le cytoplasme peut aussi inhiber les processus métaboliques qui se déroulent normalement dans les noyaux : le cytoplasme d'un oeuf vierge énucléé inhibe la synthèse des r-RNAs dans le noyau somatique qui y est introduit (Gurdon et Brown, 1965 ; Gurdon, 1967a ; Gurdon et
Woodland, 1969). La synthèse des r-RNAs reprend plus tard, au mom.ent où l'embryon atteint le stade où cette synthèse se produit normalement.
Dans un oocyte en vitellogénèse, qui n'effectue pas de réplication du DNA nucléaire, des noyaux de blastula cessent toute synthèse de DNA
(Gurdon, 1968). Ces nombreux travaux ont fait l'objet d'une revue dé
taillée par Gurdon et Woodland (1970).
Nous ferons une brève parenthèse pour mentionner les expérien
ces de fusion cellulaire qui démontrent, elles aussi, le contrôle du métabolisme nucléaire par le cytoplasme. Après la fusion d'un érythrocy
te d'oiseau, dont le noyau est pratiquement inerte, avec une cellule HeLa, on peut observer la réactivation du noyau de l'érythrocyte dans 1'hétérocaryon (Harris, 1967) : il recommence à synthétiser du DNA et du RNA.
15.
Il est donc clair que le cytoplasme contient des,substances qui lui permettent de contrôler la différenciation, en activant ou en réprimant certains gènes. Leur nature est probablement protéique, comme tendent à le prouver les arguments suivants. Les noyaux transplantés dans un oeuf vierge énucléé subissent un gonflement rapide et important.
Selon le type de noyau microinjecté, le facteur d'accroissement du volu
me peut varier de 40 à 250 fois (Gurdon, 1968 ; Gurdon et Woodland, 1968) ; et il semble y avoir une corrélation directe entre le degré de gonflement et la capacité de synthétiser du DNA (Graham et al., 1966).
Le gonflement des noyaux injectés ne résulte pas d'une simple hydration en effet, par autoradiographie, on a pu suivre le passage de protéines cytoplasmiques marquées, dans le noyau (Arms, 1968 ; Gurdon et Woodland, 1968 ; Merriam, 1969).
Le passage de protéines du cytoplasme dans le noyau est sans doute un phénomène général (cf. les cytonucléoprotéines chez l'amibe - Goldstein et Prescott, 1968 ; Prescott et Goldstein, 1969). Le fait que l'entrée des protéines cytoplasmiques dans les noyaux coïncide dans le temps avec l'initiation de la synthèse de DNA dans ces noyaux (Merriam, 1969) , suggère que ces protéines sont bien les inducteurs de la synthèse du DNA.
Chez Xenopus laevis, on a rapporté l'existence de facteurs qui réprimeraient la synthèse de r-RNAs : Grippa (1970) a mis en évidence un tel répresseur dans l'oocyte arrivé en fin de croissance. Une équipe de chercheurs japonais, d'autre part, prétend avoir identifié dans le milieu de culture de blastulas dissociées de xénope, une substance qui réduirait la synthèse des r-RNAs (Yamana et Shiokawa, 1966 ; Shiokawa et Yamana, 1967). Selon Gurdon et Woodland (1968), le fait que ce fac
teur soit libéré dans le milieu extérieur suggère qu'il est d'origine cytoplasmique. Le produit mis en évidence par Shiokawa et Yamana (1969) serait acido-sôluble et résistant à l'ébullition : il n'est donc pas de nature protéique. Mais son existence a été mise sérieusement en doute
et, en particulier, il semble très difficile de démontrer la spécifi
cité de son action sur la synthèse des r-RNAs (Landesman et Gross, 1968 et 1969 ; Van Snick et Brachet, 1971). L'inhibiteur de Grippa est protéique et nucléaire ; il est donc probablement différent de celui de Shiokawa et Yamana ; mais son étude n'a malheureusement pas été pour
suivie.
Nous avons longuement parlé du rôle du cytoplasme dans l'éta
blissement de la différenciation. Il est évident que le noyau, déposi
taire du matériel génétique, doit être maintenu intact, pour que le développement aboutisse à un organisme différencié : 1'aneuploïdie abou
tit à la létalité à un stade précoce (blastula). Les embryons haploïdes ou hybrides (obtenus par la fécondation d'un oeuf vierge d'une espèce, par un spermatozoïde d'une espèce voisine) sont souvent létaux, à un stade plus ou moins avancé.
Des mutations ou des déficiences chromosomiales provoquent également l'arrêt du développement.
Enfin, en l'absence totale de noyaux, le cytoplasme peut réaliser au mieuî quelques divisions anormales, aboutissant à la formation de morulas qui meurent rapidement (Brachet, I960).
Chez l'oursin, on a pu étudier le métabolisme des fragments anucléés activés parthénogénétlquement : ils synthétisent autant de protéines que les oeufs entiers fécondés ou activés (Brachet et al., 1963 ; Baltus et al., 1965). Cette observation est souvent considérée comme l'argument majeur en faveur de l'existence de RNAs messagers sta
bles, synthétisés pendant l'oogénèse.
Une autre possibilité n'est pourtant pas à exclure ; la synthè
se protéique qui se déroule en l'absence du noyau, pourrait résulter de la transcription de DNAs cytoplasmiques. La mise en évidence d'une synthèse de RNA dans les fragments anucléés d'oeufs d'oursin, activés parthénogénétlquement, est favorable à cette idée (Chamberlain, 1970 ; Craig, 1970 ; Selvig et al., 1970).
17.
La présence de DNA dans le cytoplasme ne fait plus de doute, puisqu'il est généralement considéré que toute mitochondrie d'eucaryote contient du DNA ; mais le DNA mitochondrial n'est pas le seul DNA présent dans
le cytoplasme des oeufs, comme nous le verrons plus tard.
La caractérisation des RNAs synthétisés en l'absence du noyau s'impose donc, avant de pouvoir conclure qu'ils sont exclusivement de nature mitochondriale, comme l'ont suggéré différents auteurs.
4. L'hétérogénéité cytoplasmique
Les chapitres précédents nous ont montré que la différenciation des cellules et leur association en ébauches embryonnaires dépendent probablement de la mise en place de novo, sous l'influence du cytoplasme environnant., d'une mosaïque d'activités génétiques diversifiées.
Nous envisagerons maintenant quelques faits expérimentaux qui montrent que la grosse masse cytoplasmique de l'oeuf est hétérogène et que le maintien de son organisation est fondamental pour que le dévelop
pement embryonnaire s'effectue de manière harmonieuse.
Il suffit de centrifuger légèrement un oeuf d'amphibien fécondé pour inhiber sa gastrulation ou modifier son organogénèse ; celle-ci, quand elle a lieu, est caractérisée par la microcéphalie de l'embryon.
Des expériences de retournement des oeufs, provoquant une inversion de la polarité normale, peuvent aboutir à la formation de jumeaux siamois.
Ces anomalies sont accompagnées de modifications cytologiques des cellu
les : variation de la taille des noyaux et des nucléoles, en fonction du cytoplasme environnant (Brachet, 1972).
L'oeuf est une cellule très spécialisée, résultant d'un long processus de développement, 1'oogénèse. L'observation d'un oeuf vierge in toto montre qu'il possède une polarité, rendue apparente par la dis
tribution du pigment et du vitellus. L'étude cytochimique des oeufs
a démontré l'existence d'un gradient de concentration en RNA (corres
pondant à la distribution des ribosomes) décroissant du pôle animal au pôle végétatif. Selon le même axe de polarité animal-végétatif, on observe également une distribution hétérogène des plaquettes vitellines : les plaquettes vitellines sont beaucoup plus petites et moins nombreuses au pôle animal qu'au pôle végétatif, (Brachet, 1941). L'hémisphère végé
tatif est donc beaucoup plus chargé en vitellus que ne l'est l'hémisphère animal. D'après certains auteurs même, la composition chimique des pla
quettes vitellines serait variable, en fonction de leur taille ; Panijel (1950) a décrit une distribution différente du RNA, des phosphoprotéines et de la phosphoprotéine phosphatase dans les plaquettes vitellines de différentes tailles des oeufs de Rana fusca.
On observe également une répartition en gradient des mitochondries, des lipochondries,du glycogène et on peut imaginer que cette distribution ordonnée ne concerne pas seulement les éléments particulaires, mais aussi certains constituants chimiques que nous ne pouvons pas observer par cytochimie (m-RNAs stables, par exemple).
Ce gradient de polarité animal-végétatif est particulièrement important, puisqu'il constitue le futur axe céphalo-caudal de l'embryon.
Lorsque l'oocyte est arrivé en fin de croissance, il subit la maturation : sa vésicule germinative se rompt et il se produit un mélan
ge intime entre le suc nucléaire et le cytoplasme de l'oocyte ; le cyto
plasme s'enrichit donc de nouveaux éléments qui accroissent encore son hétérogénéité et peuvent contribuer à la détermination de territoires embryonnaires.
Il semble notamment que le plasme germinal situé, chez les Batraciens, dans une région restreinte du pôle végétatif, ne devienne décelable qu'au cours de la maturation (Czolowska, 1969) ; cet auteur pense néanmoins qu'une partie au moins du matériel qui le constitue est synthétisé préalablement, pendant l'oogénèse. L'apparition du plasme
19.
germinal typique résulterait, soit de la redistribution de ces éléments préexistants, soit de l'apport de nouvelles substances.
L'origine du matériel qui constitue le plasme germinal est loin d'être claire. On possède des notions un peu plus précises quant à sa nature : on sait depuis les travaux de Bounoure et al.,(1954), qu'il est proba
blement constitué d'acides nucléiques, puisqu'une irradiation aux rayons UV donne naissance à des individus normaux, mais stériles. La cyto
chimie indique qu'il s'agit probablement de RNA (Blackler, 1958 ;
Czoîowska,1969 ; Smith, 1966). Le plasme germinal est aussi particuliè
rement riche en mitochondries (Mahowald et Hennen, 1971).
La mise en place du plasme germinal ne constitue qu'un cas par
ticulièrement favorable pour observer la mise en place d'un territoire embryonnaire hautement spécialisé, grâce à la coloration particulière de ce plasme ; il en va probablement de même pour d'autres localisations cytoplasmiques moins apparentes.
La maturation apporte une nouvelle potentialité au cytoplasme de l'oocyte : celle de pouvoir se diviser. Tout indique que le cyto
plasme de l'oeuf est pratiquement autonome dans le processus de segmen
tation : quelques divisions, quoique anormales, peuvent se produire dans un oeuf de grenouille vierge anucléé, puis activé (Smith et Ecker,
1970 b). Mais la présence d'un noyau normal est requise pour la suite du développement.
L'étude de la mutation "o" de l'axolotl a montré indirectement l'importance de la rupture de la vésicule germinative pour le cytoplas
me de l'oocyte. Cette mutation o exerce un effet de type maternel, qui résulte en une déficience du cytoplasme de l'oeuf (Briggs et Cassens, 1966). Les oeufs d'une femelle homozygote o/o sont bloqués en gastrula.
On peut obtenir la réversion de cet arrêt du développement en injectant à l'embryon muté, soit le cytoplasme d'un oeuf normal, soit le contenu nucléaire d'un oocyte normal (Briggs et Justus, 1968 ; Briggs, 1972).
C'est dans le suc nucléaire que le produit de l'allèle sauvage de o est le plus actif.
La fécondation apporte de nouveaux remaniements dans le cyto
plasme ; ils sont tout aussi importants pour la suite du développement embryonnaire que la restauration de la diploîdie. Le plus important est probablement l'apparition du croissant ^ris, chez les Amphibiens ; celui-ci résulte de la rotation de l'oeuf qui, libéré par la formation de la membrane de fécondation, obéit à la force de la pesanteur.
Le croissant gris détermine le futur côté dorsal de l'embryon ; le plan qui le partage en 2 est le plan de s}nnétrie bilatérale de l'embryon.
Comme on le voit, la fécondation fixe le futur axe dorso-ventral de l'embryon, qui se surimpose au futur axe céphalo-caudal, déterminé par la polarité animale-végétative de l'oocyte.
Les expériences de Curtis (I960) ont montré que la capacité morphogénétique du croissant gris est liée à son cortex : l'enlèvement
d'une couche de cortex de 1 kK. d'épaisseur bloque le développement au stade blastula, en inhibant l'apparition de la lèvre dorsale de gastrula
tion. Au contraire, la greffe de ce cortex, dans la future région ven
trale d'un oeuf fécondé, induit la formation d'un embryon double, avec des structures mésodermiques bien développées. Par des expériences ulté
rieurs, Curtis (1965) a été amené à proposer l'existence d'une hérédité maternelle, liée au cortex de ce plasme. Les expériences récentes de Brachet et Hubert (1972) invitent à la prudence quant à l'interprétation génétique des expériences de destruction du cortex du croissant gris, par simple piqûre, comme l'a fait Curtis (1965) : l'observation cytolo
gique des embryons révèle des anomalies des appareils mitotiques et des chromosomes (haute fréquence d'aneuploïdie, dont on sait qu'elle exerce des effets létaux précoces).
Il paraît certain que la zone du croissant gris contrôle la dif
férenciation des organes axiaux, bien que la localisation corticale de ce facteur de contrôle ne soit pas encore unanimement admise. Tomkins et Rodman (1971) ont montré, par des expériences de greffe,que le cortex du croissant gris a des propriétés inductrices que ne possède pas le cortex des autres régions. De plus, ils ont décelé une différence dans
21.
la composition des protéines du cortex du pôle animal et celui du
croissant gris, sans qu'on puisse toutefois établir de relation directe entre la nature de ces protéines et l'activité morphogénétique.
Selon Grant et Wacaster (1972), par contre, le facteur respon
sable de l'induction neutrale serait subcortical, plutôt que cortical.
Il est détruit par une irradiation aux UV, ce qui indique qu'il s'agit probablement d'un acide nucléique , ou d'une nucléoprotéine. L'effet de l'irradiation est corrigé, avec un succès de 30 7o, par l'injection à la blastula irradiée, d'un extrait de cytoplasme marginal d'un oeuf fécondé, mais pas par l'injection du suc nucléaire de la vésicule ger
minative. Les auteurs ont vérifié que l'irradiation aux UV n'exerce aucun effet nocif sur les noyaux de la blastula : ils sont encore capa
bles, après le traitement, d'assurer un développement normal lorsqu'ils sont transplantés dans un oeuf anucléé.
Les localisations cytoplasmiques que nous venons de décrire sont, en grande partie, le résultat des interactions nucléo-cytoplas- miques qui se sont produites aux stades précoces du développement
(oogénèse, maturation) ou des réorganisations qui suivent la féconda
tion. Néanmoins, dans l'oeuf au début du développement, l'importance des phénomènes épigénétiques n'est pas à négliger : par exemple, l'or
ganisation dorso-ventrale de l'oeuf peut être établie, au gré de l'expé
rimentateur, en lui imposant une rotation dans un plan déterminé (expé
rience d'Ancel et Vintemberger, rapportée par Brachet, I960).
On sait, d'autre part, que les protéines qui constituent l'es
sentiel du vitellus, ont une origine extra-oocytaire (voir plus loin).
L'établissement du gradient de distribution des plaquettes vitellines est-il donc un phénomène purement cytoplasmique ?
On ignore tout du déterminisme de la polarité. Crick (1970) a proposé que la formation de ces gradients s'explique par un simple mécanisme de diffusion. Selon Brachet et Malpoix (1971), cette hypo
thèse s'appliquerait mieux aux petites molécules qu'aux macromolécules.
Il est possible que l'établissement des gradients de polarité soit, en dernière analyse, sous contrôle génétique. Van Gansen et Weber (1972) ont émis l'hypothèse que la polarité résulterait des relations nucléo
cytoplasmiques aux stades précoces de l'oogénèse, peut-être au stade pachytène. Les mêmes auteurs ont mis en évidence, des structures très particulières, en forme de disques, dans le cortex du pôle végétatif des oeufs de batraciens. Elles pourraient constituer des récepteurs pour le matériel vitellin apporté par le sang des femelles ; le vitel- lus entrerait donc préférentiellement au pôle végétatif. Ainsi pourrait s'établir le gradient végétatif-animal de distribution du vitellus.
Le gradient de basophilie (répartition des ribosomes) serait une consé
quence de l'accumulation préférentielle du vitellus au pôle végétatif (Brachet, 1971 a).
Pour tenter d'expliquer, en termes de biologie moléculaire, les faits déjà découverts par l'embryologie expérimentale, Brachet (1967 b) a proposé le schéma suivant : au cours de la gastrulation, la dérépression de certains gènes commencerait du côté dorsal ; au gradient préexistant de distribution des ribosomes (gradient céphalo-caudal) se surimposerait, dans la gastrula, un gradient de synthèse de RNAs messagers, gradient dorso-ventral, cette fois. Le résultat de l'inter
action de ces 2 gradients serait donc une synthèse protéique plus grande dans la région dorsale que ventrale et dans la tête que dans les terri
toires caudaux.
Dans ce contexte, on comprend toute l'importance que pourrait revêtir la mise en évidence d'un DNA associé aux plaquettes vitellines.
En particulier, on peut se demander si un tel DNA constitue simplement un matériel de réserve pour la synthèse du DNA nuclé. ^.re au cours du développement, ou s'il pourrait jouer un rôle morphogénétique lié à la distribution hétérogène des plaquettes vitellines. La première partie de notre travail constitue un essai de caractérisation du DNA vitellin
23.
des oocytes de Xenopus laevis,réalisé en collaboration avec E. Baltus, J, Hanocq-Quertier, M. Kirsch et G. Steinert. Nous verrons que de nombreuses difficultés techniques ne nous ont pas permis d'aborder les problèmes fondamentaux du rôle et de l'origine de ce DNA.
La seconde partie du travail, pour laquelle nous avons bénéfi
cié de la collaboration d'A. De Schutter, concerne une étude du méta
bolisme du DNA au cours de la maturation des oocytes de Xénope.
PREMIERE PARTIE
Mise en évidence d'un DNA associé
aux plaquettes vitellines des oeufs d'Amphibiens :
II DNA vitellin n
25.
RESUME
Nous avons montré que les plaquettes vitellines des oocytes mûrs et des oeufs vierges de Xenopus laevis contiennent 50 % du DNA total de ces cellules.
La quantité de "DNA vitellin" correspond à celle contenue dans 3.000 noyaux diploïdes.
Nous avons pu isoler le DNA vitellin à partir des plaquettes vitellines d'oocytes de Xenopus laevis, qui ont ovulé in vitro :
c'est un DNA bicaténaire, linéaire, de poids moléculaire élevé. Il pos
sède la même densité de flottaison en gradient de CsCl que le DNA nu
cléaire et le DNA mitochondrial de la même espèce : 1.699 g/cm3.
Par sa forme et sa faible vitesse de renaturation, on peut facilement le distinguer du DNA mitochondrial ; par contre, nous n'avons pu mettre en évidence aucune différence physico-chimique entre le DNA nucléaire et le DNA vitellin. Par des expériences indirectes, nous avons cepen
dant pu raisonnablement éliminer l'hypothèse d'une contamination du DNA vitellin par le DNA nucléaire des cellules folliculeuses.
Chez Ambystoma mexicanum, le DNA vitellin des oocytes a une densité (1.699 g/cm3) différente de celle du DNA nucléaire (1.704 g/cm3) et de celle du DNA mitochondrial (1.696 g/cm3) : ceci nous paraît
constituer un argument sérieux en faveur de l'existence d'un DNA origi
nal, associé aux plaquettes vitellines des oeufs d'Amphibiens.
Les tentatives d'extraction de DNA vitellin à partir des oeufs vierges de Xenopus laevis et d'Ambystoma mexicanum n'ont pas donné de résultats reproductibles : il se pourrait que les variations métaboli
ques et les modifications de la balance ionique qui ont lieu au cours de l'ovulation in vivo et de la ponte, soient responsables de l'irré
gularité des résultats.
Les difficultés rencontrées pour préparer du DNA vitellin purifié en quantité suffisante, ne nous ont pas permis de mener à bien sa caractérisation : courbes de fusion, de renaturation (courbe de Cot), expérience d'hybridation moléculaire entre le DNA nucléaire et le
DNA vitellin, etc.
Seules ces expériences nous auraient permis de progresser dans la compréhension du rôle et de l'origine du DNA vitellin.
27.
I. INTRODUCTION
A. PRESENCE D'UN EXCES DE DNA DANS L'OEUF ET DANS L'OOCYTE MDR D'AMPHI BIEN
1. Dosage du DNA dans les oeufs de [Batraciens
a) Après la fécondation, l'oeuf d'Amphibien est morcelé en cel
lules de plus en plus petites, par une succession très rapide de mitoses et sans aucun accroissement de volume de l'embryon, ainsi que nous
l'avons déjà rappelé. Ce rythme intense des mitoses est possible grâce à la disparition presque complète des phases et du cycle cellu
laire, aboutissant à un raccourcissement considérable de l'interphase.
On doit à Hoff-J^rgensen et Zeuthen (1952) la première étude de l'évolution de la teneur de l'oeuf en DNA, au cours du développement embryonnaire des Amphibiens. Ces auteurs ont dosé le DNA par une métho
de microbiologique, pendant les 100 premières heures du développement d'un Batracien anoure, Rana temporaria. Ils ont constaté que la quanti
té totale de DNA présente dans 1'embryon reste constante pendant les 18 premières heures de développement (stade blastula), alors que, dans cet intervalle de temps, les noyaux se sont multipliés, jusqu'à devenir plusieurs milliers (5.000). En admettant la règle de la constance de la quantité de DNA (2c) dans tous les noyaux diploïdes des divers types cellulaires d'une même espèce (Vendrely et Vendrely, 1948), on ne peut expliquer ce résultat que de la manière suivante : l'oeuf nouvellement fécondé, pourvu d'un seul noyau diploïde, posséderait une grande quan
tité de DNA extranucléaire ; ce DNA excédentaire serait utilisé progres
sivement au cours de la segmentation pour la multiplication des noyaux.
Hoff-J^rgensen et Zeuthen ont donc recherché la présence de DNA dans le cytoplasme de l'oocyte mûr (qui contient la même quantité de DNA que l'oeuf vierge de la même espèce) ; ils ont dosé le DNA, d'une part.
dans la vésicule germinative ou noyau de l'oocyte et, d'autre part, dans le cytoplasme énucléé. Ils ont retrouvé la quasi-totalité du DNA de l'oocyte dans le cytoplasme. Avant même la fécondation, l'oeuf
vierge de Batracien contient donc une quantité de DNA largement en excès par rapport à la valeur attendue 2c (effectivement, l'oeuf vierge pondu n'a éliminé qu'un seul globule polaire et possède donc encore 2 jeux de chromosomes) ; elle serait de l'ordre de 5.000 fois supérieure à la quantité de DNA trouvée dans le spermatozoïde (c).
De nombreux travaux ultérieurs ont été effectués sur d'autres espèces de Batraciens, en utilisant diverses méthodes de dosage du DNA.
Nous en avons résumé les résultats dans le tableau I.
Les résultats montrent que, dans une espèce déterminée, les valeurs va
rient très fort, selon les méthodes d'extraction et de dosage utilisées.
Comme on peut s'y attendre, les chiffres sont d'autant plus élevés que la méthode est peu spécifique. Ceci est surtout évident lorsqu'on com
pare les valeurs obtenues par un même auteur, pour un matériel identique, à l'aide de méthodes différentes (Haggis, 1964 ; Bieber et al., 1959).
b) Nous n'entreprendrons pas ici une étude approfondie des di
vers procédés utilisables pour doser le DNA dans des cellules ; nous nous limiterons à la discussion de quelques points qui nous paraissent importants.
Des 3 méthodes généralement employées pour le fractionnement des macromolécules et l'extraction du DNA :
- extraction du DNA par du TCA 5 7o, 15 min. à 90° (Schneider, 1945)
- extraction du DNA par du PCA 0.5 N, 20 min. à 70° (Ogur et Rosen, 1950) - extraction du DNA par KOH 0.3 N, 1 h. à 37°, suivie d'une précipita
tion par un acide minéral (Schmidt et Thannhauser, 1945),
c'est le procédé de Schmidt-Thannhauser qui est considéré comme le meil
leur (Munro et Fleck, 1966). Néanmoins, la séparation du DNA des autres
Tableau 1, - ESTIMATION DE LA QUANTITE DE DNA CONTENUE DANS LES OEUI^S ET LES OOCYTES MURS D'AMFHIBIENS,
Espèce Fraction dosée Méthode utilisée DNA total par DNA = 2c Facteur de
(matériel) i oeuf ou oocyte multiplication
AUTEURS (en
Kg)
/
(en yttg) 2c dans oeuf ou oocyte
Rana temporaria acido-insoluble (fraction coloration à l'indole 0.26 (24 X lO"^) * (10.000) Brachet (1954) Ogur et Rosen) (Ceriotti)
Rana temporaria acido-insoluble + acido- dosage microbiologi- 0.065 24 X lo"^ 2.500 Hoff-J^rgensen et
soluble que des désoxyribosi- Zeuthen (1952)
des (Hoff-J0rgensen)
Rana temporaria idem idem 0.073 17 X 10"^ 4.250 Hoff-Jj!5rgensen
(1954)
Rana pipiens acido-insoluble (Schmidt- dosage du phosphore 1.2 (10.4x10"^) (115.000) Kutsky (1950) Thannhauser)
Rana pipiens acido-insoluble (Schneider dosage du phosphore 0.96 10.4x10"^ 95.000 Sze (1953) (oeuf fécondé ou Schmidt-Thannhauser)
stade 2 cels)
Rana pipiens acido-insoluble (Schneider) coloration à la p - 0.63 (15 X lo'^) (42.000)
(oeuf vierge) nitrophénylhydrazine
idem idem méthode fluorométri- 0 53 (15 X 10“^) (35.250) ( Haggis
que au DABA (1964)
idem idem méthode fluorométri- 0.22 (15 X 10"^) (14.500)
que à l'AMBA
y
Rana pipiens acido-insoluble (Schneider) coloration à l'indole 0.18 7.2x10"^ 25.000 1 (oocyte ova
rien mûr)
(ceriotti)
\
V Bieber et al.(1959)
idem idem dosage microbiologi
que de la thymine
0.032 7.2x10 4.500 y
Rana pipiens acido-insoluble + acido- dosage microbiologi- 0.07-0.16 (15 X lO"^) (4.500- Mezger - Freed
(oeuf vierge soluble que des désoxyribo- 10.000) (1963)
énuclée) nucléosides
Rana pipiens acido-insoluble (Schneider) coloration à la diphé- 0.084 15 X 10 ^ 560 Dawid (1965) nylamine ÎSurton modifié)
VO
cléosides Bufo vulgaris
(oeuf vierge)
acido-insoluble
— \
dosage microbiologi
que des désoxyribonu- cléosides
0.032 (7.33x10“^) 4.250 Kuriki et Okazaki (1959)
Xenopus laevis (oocyte ova
rien mûr)
acido-insoluble méthode fluorométri- que au DABA
0 .0435 (6.3x10“^) 7.000 Hanocq-Quertier et al. (1968)
Triturus pyrrhogaster (oeuf vierge)
acido-insoluble dosage microbiologi
que des désoxyribonu- cléosides
0.027 - - Kuriki et Okazaki
(1959)
Pleurodeles waltlii
acido-insolùble méthode fluorométri- que au DABA
0.069 - - Baltus et Brachet
(1962)
Ambystoma mexicanum
acido-insoluble + acido- soluble
dosage microbiologi
que des désoxyribonu- cléosides
0.1 (96) (1.000) L«5vtrup (1955)
1
V
ît Les valeurs entourées d'une parenthèse n'ont pas été fournies par les auteurs respectifs, mais déduites par nous-même en fonction des valeurs "2c" trouvées dans la littérature.
COO
31.
macromolécules phosphorées n'est pas suffisamment spécifique pour per
mettre de le déterminer quantitativement par une méthode telle que la mesure de l'absorption en U.V. ou un dosage de phosphore. Il faut donc utiliser des réactions colorimétriques ou fluorométriques spéci
fiques du désoxyribose ou de la thymine pour obtenir des valeurs qui aient une signification. La difficulté de doser le DNA dans les oeufs de Batraciens est d'autant plus grande que l'abondance du vitellus y détermine un rapport DNA/protéines particulièrement faible : il est donc d'autant plus important d'utiliser une méthode sensible et spéci
fique .
La méthode qu'on est unanime à considérer comme la plus spéci
fique, est certainement la méthode "microbiologique" : le matériel à doser est hydrolysé en désoxyribonucléotides, par une DNase pancréati
que et on estime la quantité de dérivés solubles ainsi libérés, par leur capacité à faire croître une souche bactérienne déficiente en désoxyribonucléosides, Thermobacterium acidophilus (Hoff-
26
Jurgensen, 1952). Cette méthode, cependant, n'a pas échappé aux cri
tiques : toutes semblent indiquer que les valeurs obtenues par un do
sage microbiologique pourraient être fausses, par défaut. La diffi
culté majeure, en effet, consiste à hydrolyser quantitativement le DNA à doser. Sugino et al. (1957, I960) ont préconisé l'hydrolyse simul
tanée par la DNase pancréatique et la phosphodiestérase de venin de serpent : c'est ainsi que, chez l'oursin, ces auteurs ont pu mettre en évidence des composés désoxyribonucléotidiques "masqués", inactifs microbiologiqueraent et qui, dans l'oeuf vierge, constituent une quan
tité de dérivés désoxyribosiques 2,5 fois supérieure à la quantité li
bérée par la DNase seule. Malgré ce traitement combiné, le pourcentage de thymidine libérée par un DNA purifié ne dépasserait pas 80 °L de la valeur attendue et pour un extrait brut, cette proportion pourrait descendre à 40-50 7» (Grant, 1958 a). Lç^vtrup (1959) a également trouvé 50 à 70 % d'hydrolyse par le traitement enzjmiatique double. L{5vtrup
et Roos (1957) ont constaté l'existence d'interférences dahs le dosage microbiologique et ils ont été amenés à utiliser un milieu parfaitement défini pour la culture des bactéries, augmentant ainsi la sensibilité et la reproductibilité de la méthode.
Une autre cause d'erreur de la méthode semble être le fait que la double digestion enzymatique fournit des désoxyribonucléosides et des désoxyribonucléotides mono-, di- et triphosphates, en proportions varia
bles (Grant, 1958 a); or, il est bien établi que ce sont les nucléosides qui sont les plus actifs au point de vue microbiologique (Hoff-Ji^rgensen 1952).
La méthode microbiologique fournit donc probablement des valeurs inférieures à la réalité ; mais, par sa spécificité, elle constitue le procédé de dosage le plus sur et il est dommage que son emploi malaisé et fastidieux l'ait fait abandonner.
c) On a reproché à Hoff-J{5rgensen et Zeuthen d'avoir effectué leurs dosages sur un extrait total d'oeufs, sans faire de différence en
tre les matériels acido-soluble et acido-insoluble. Ces auteurs affir
ment cependant que l'extrait des oeufs ne manifeste aucune activité microbiologique s'il n'a pas subi au préalable une digestion à la DNase.
Mezger-Freed (1963), qui a utilisé la même méthode, a chiffré à 10 % au maximum la quantité des désoxyribosides totaux existant sous forme libre.
Si les nucléosides sont les substrats les plus actifs au point de vue microbiologique (comme nous venons de le signaler), les autres dérivés acido-solubles du désoxyribose donnent aussi une réaction positive.
Selon les auteurs (Grant, 1958 a ; Kuriki et Okasaki, 1959 ; Sugino et al., I960) et les méthodes de dosage utilisées, l'estimation de la pro
portion des composés désoxyribosiques totaux qu'ils représentent varie fortement. En particulier, pour Bieber et al. (1959), et pour Dawid
(1965), la fraction soluble représente 85 % de la totalité des dérivés du désoxyribose.
33.
d) Le second problème à résoudre pour le dosage du DNA dans les oeufs, est d'éliminer toute source de çpntamination :
- les oeufs doivent être parfaitement dégangués (soit manuellement, soit à l'aide d'un traitement chimique par la papaîne-cystéine), puisqu'il est certain que de nombreux microorganismes adhèrent à la gangue.
Lorsqu'on pratique la fécondation in vitro, il faut également veiller à éliminer les spermatozoïdes surnuméraires.
- le travail sur les oocytes n'est pas plus aisé : il faut se débarrasser manuellement des nombreuses cellules folliculeuses qui entourent
l'oocyte durant toute l'oogénèse. Cela n'est généralement possible qu'après avoir fait subir aux oocytes un court ■'traitement chimique ou enzymatique (Hanocq-Quertier et al., 1968). Les embryologistes,
conscients de ces difficultés, se sont efforcés de travailler dans des conditions où ces risques de contamination sont les plus réduits ; il est cependant possible que certaines discordances entre les diffé
rents auteurs puissent être expliquées de cette manière.
De l'analyse du tableau I et des considérations que nous venons d'émettre, nous pensons pouvoir conclure que l'oeuf vierge (ou l'oocyte mûr) de Batracien possède de 0,01 à 0,1 >aO, de DNA, selon l'espèce :
cette quantité, largement en excès par rapport à la valeur 2c, est équi
valente à celle contenue dans 1.000 à 10.000 noyaux diploïdes.
Avant de poursuivre notre discussion du DNA des oeufs d'Amphi- biens, nous signalerons, sans entrer dans les détails, que la présence d'une quantité de DNA, supérieure à la quantité de DNA chromosomial d'une cellule diploïde, a été rapportée dans les oeufs d'espèces très éloignéee dans l'évolution ; selon Grant (1965), ce serait même la règle chez tous
les animaux dont le développement embryonnaire est extra-utérin.
Espèce ou groupe zooloRique Facteur de multiplication de la valeur 2c Ascaris (ver)
Ilyanassa (mollusque) Oursins (échinodermes) Drosophile
Poissons Amphibiens
Poulet
116 64 5 - 150
250- 7.500 (selon les méthodes) 75.000
1.000 à 10.000 10^ à 10^
(pour une revue générale à ce sujet, voir Williams, 1965)
Il semble intéressant de constater qu'il existe une corrélation, certes assez vague, entre l'importance de cet excédent de DNA et la
quantité de vitellus présent dans les oeufs : l'oeuf d'Oursin, pauvre en vitellus, posséderait l'équivalent du DNA de quelques dizaines de noyaux, tandis que l'oeuf de poule contiendrait une réserve qui lui permettrait,
7 8
théoriquement, de construire 10 à lO noyaux. Entre ces deux cas ex
trêmes, l'oeuf d'insecte et l'oeuf d'Amphibien disposeraient d'une quan
tité de DNA équivalent à quelques milliers de cellules diploïdes.
2. Localisation intracellulaire de l'excédent de DNA
a. Distribution entre noyau et cytoplasme
Plusieurs chercheurs, après Hoff-J?Srgensen et Zeuthen, ont es
sayé de confirmer la localisation cytoplasmique du DNA trouvé en excès.
Leurs résultats sont rassemblés dans le tableau 2. Il montre que,
après avoir éliminé la vésicule germinative d'un oocyte mûr, on conserve 85 à 100 % du DNA total de l'oocyte dans le cytoplasme.
Tableau 2. - DOSAGE DU DNA DANS LA VESICULE GERMINATIVE ET LE CYTOPLASME DE L'OOCYTE DE BATRACIEN
Espèce Matériel Méthode DNA total DNA = 2c Vésicule Cytoplasme
AUTEURS
dosé utilisée par oocyte germinative énuclé
en en quant.
de DNA
% DNA total
quant.
de DNA
% DNA total
Rana acido-inso- microbiolo- 0.098 17.2x10"^ - que 7 % 0.1 100 % Hoff-J«<rgen- temporaria lubie + aci-
do soluble
gique 1
c.
0.007 sen & Zeuthen
(1952)
Rana acido-inso- dosage à la - 14 X 10 13.27 - - England et
temporaria lubie
(Schneider)
diphényla- mine (Burton)
xlO-6 Mayer (1957)
Rana pipiens acido-inso- dosage du 0.96 10.4x10"^ - que 1 % — Sze (1953)
Rana pipiens
lubie
(Schneider) acido-inso- luble
phosphore dosage à l'indole
0.179 7.2x10“^
0.01
0.029 15 % 0.15 84 % Bieber et al.
(1959)
(Schneider) (Ceriotti) -fi
Rana pipiens acido-inso- dosage du 0.065 8 X 10 ® 0.006 10 % - - Finamore et lubie
(Schmidt - Thannhauser)
phosphore
-fi
al. (1960)
Rana pipiens
Rana pipiens
acido-inso- luble
(Schneider) acido-inso- luble + aci- do-soluble
dosage fluo- rométrique à l'AMBA
idem
0.22
0.22
15 X 10 °
15 X 10“^
0.005
0.015
2 7o
6 7o - -
) Haggis
J
(1964)Triturus vi- acido-inso- dosage fluo- _ (89x10"^) 0.0016 _ Izawa et al.
ridescens lubie métrique au DABA-matériel sensible à la DNase
(1963)
Xenopus
laevis microspectro-
photométrie Feulgen
- (6 X lo ^ 42x10"^ MacGregor
(1968)
-Ojy
Les résultats obtenus pour les dosages dans la vésicule germi
native isolée sont plus difficiles à interpréter : le matériel dosé représente toujours une faible proportion du DNA total de l'oocyte
(2 - 15 %)J mais il est toujours présent en quantité beaucoup plus im
portante que dans un noyau diploïde (plusieurs centaines de fois 2c).
Seuls England et Mayer (1957) ont trouvé dans le noyau de l'oocyte, la même quantité de DNA que dans une cellule de foie.
Au cours des dernières années, nos connaissances sur les DNAs de la vésicule germinative de Xenopus laevis ont beaucoup progressé.
Le DNA chromosomial est répliqué très tôt au cours de l'oogénèsE avant V pendant le stade pachytène de la méîose (Gall, 1968 ; Mac Gregor, 1968 ; Ficq, 1968) : c'est ainsi que, pendant toute la vitellogénèse, l'oocyte est tétraploïde et ses chromosomes "plumeux" diplotènes sont organisés en bivalents méïotiques.
C'est au stade pachytène que le DNA nucléolaire (ou r - DNA) est amplifié. Ce phénomène a lieu dans une calotte ("cap"), qui coiffe le noyau de l'oocyte (Gall, 1968 ; Mac Gregor, 1968 ; Ficq, 1968 ;
Bird et Birnstiel, 1971 ; Coggins et Gall, 1972). La démonstration en a été faite avec l'ingénieuse technique de l'hybridation moléculaire in situ : le r-RNA radioactif s'hybride spécifiquement avec la région du "cap", dans les oocytes pachytènes (Gall et Pardue, 1969 ; John et al., 1969). Au stade diplotène, les multiples copies du r - DNA sont libérées dans le suc nucléaire (Van Gansen et Schram, 1972) et partici
pent à la formation des 1.500 nucléoles présents dans l'oocyte mûr de Xenopus laevis (Perkowska et al., 1968). Mac Gregor (1968) a dosé le DNA par microspectrophotométrie après coloration de Feulgen, dans la vésicule germinative des oocytes de Xénope, peu après le stade pachy- tène : elle contient 42 pg (42 x lO g) de DNA. Se référant à la -12
quantité 2c déterminée par Dawid (1965), de 6 pg, Mac Gregor a donc estii à 30 pg, la quantité de r - DNA présente dans l'oocyte, puisque celui-ci est tétraploïde à ce stade. Effectivement, Brown et Dawid (1968) ont
