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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Mergeay, M. (1969). Physiologie et génétique d'un branchement métabolique: la biosynthèse du carbamyl phosphate chez Escherichia coli (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.

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UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES Faculté des Sciences

Service de Microbiologie

PHYSIOLOGIE ET GENETIQUE D'UN BRANCHEMENT METABOLIQUE :

LA BIOSYNTHESE DU CARBAMYL PHOSPHATE CHEZ ESCHERICHIA COLI

Max MERGEAY

''Ménrii re présenté pour l'obtention du grade légal de Docteur en Sciences Chimiques

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Faculté des Sciences Service de Microbiologie

PHYSIOLOGIE ET GENETIQUE D'UN BRANCHEMENT METABOLIQUE :

LA BIOSYNTHESE DU CARBAMYL PHOSPHATE CHEZ ESCHERICHIA COLI

Max MERGEAY

Mémoire présenté pour l'obtention du grade légal de Docteur en Sciences Chimiques

il m'a introduit dans la jungle des mécanismes cellulaires et attira sans cesse mon attention au-del\ des apparences luxuriantes et touffues vers ce qui est élégant, simple, évident.

André Piérard a dirigé et réalisé les recherches enzymologique dont ce travail constitue le complément génétique. Sa grande expé­ rience et son savoir m'épargnèrent maints faux pas. Je n'ai garde d'oublier son aimable collègue Alexandre Biuret.

Nicolas U. Glansdorff m'a initié au maniement de l'outil gé­ nétique si riche de possibilités insoupçonnées. Son sens critique constamment en éveil me fut d'un grand secours.

La collaboration de Jacques Beckmann fut déterminante dans l'analyse phénotypique des mutants décrits ici et dans les déter­ minations du caractère des mutations.

Je dois aussi beaucoup aux renseignements fournis par Guy Leclercq au cours de son travail et à tous les échanges de vue qui s'ensuivirent.

Ce me fut aussi un grand plaisir d'avoir travaillé avec Madame Gillian Grainger lors de son séjour en Belgique.

L'aide de René Martin me fut précieuse et efficace.

Je remercie le Professeur René Thomas et ses collaborateurs, pour les entretiens que j'eus avec eux et pour le don de souches bactériennes et virales.

Ma reconnaissance va aussi à tous les membres de 1' Institut de Recherches du C, E. R. I. A. pour tout ce que j'ai appris d'eux sur le plan humain et scientifique.

Ce travail a été achevé et édité au Centre d' Etude de 1' Energie Nucléaire à Mol et mes remerciements vont à la Direc­ tion, au Docteur Maisin, chef du Département de Radiobiologie et au Docteur Ledoux, chef de la section de Biochimie Cellulaire, qui m'ont donné toutes les facilités pour achever et présenter ce travail.

Je remercie le Secrétariat du Département de Radiobiologie, Madame Van Harneveldt et le Service d'Edition du C. E. N. pour avoir assuré l'impression de ce mémoire. Merci aussi à Odile Mathieu, Aimée Reuter, Pol Charles et Marius Telia pour leur aide amicale au cours de la rédaction de ce mémoireo

Chapitre I

Chapitre 2

Pa »

avant-propos i

LE CONTROLE GENETIv^UE DE LA BIOSYNTHESE DU CARBAKYL phosphate CHEZ ESCHERICHIA COLI

PROGRESSION DU TRAVAIL 6

I. Le CP et les taboli ~mcs tributaire^ ; La synthèse i^e 1* r.inine et de.; ;A'ri-

idines 7

lo La biosynthèae de l'ar^ininc :

un régulono 7

2. La biosynthsae des pyri;nidines 11

II. -tructure g'-'n'r^le du contr$!t.e de la Carbar.jl phosphate Synth^tase

1. ireriiers matcrisux I3

2. Un seul gène, une seule enzyàe pour

un branchement métabolique ? I5 3. Mutants sensibles à l'uracile (le­

vure et E.coli) et dédoublement en­

zymatique 17

4. Localisation d'une ut-’tion provo­ quant la sensibilité à l'uracile

(pyr.arg n°678) 1^

1. Inhibition complète de l'enzyme du mutant pyr.arg 678 par l'uridine 3’ monophosphate. L'enzyme sauvage

n'est inhib'e qu'à 30 /o I9

6. Exemple de fonctions non dédoublées à régulation balançt-e : l'asparto- kinase et 1'hocos'rine déshydrogé- nase de Rhodospirillum rubrum : enzymes non dédoubl'cs dans un

7. L'ornithine activateur de la GPS et antagoniüte de la rétroînhibition par l'UIiP

8.

6y8,

l'enzyme est inhibée complètement par l'üIiP a-t-il perdu le aite de l'ornithine ?

8. Les sous-unités do la Carbanyl Phos­

phate synthétase, prot'ine allosté- ricue, sont-elles identiqTjes ?

^ue dit l'analyse fonctionnelle ? 10. '.illeurs dans le ronde vivant.

Ao Autres systèmes capables de syn­ thétiser le Carbaayl Phosphate B. Universalité de la CPS conso.;.-

mant la glutamine et du rétro­ contrôle par les pyrimidines Go Coup d'oeil chez les procaryotes 1 1 O La régulation de la synthèse du Car-

bamyl Phosphate chez Escherichia cOt li : armature générale

22

28

-S

>0

III. C ''veloppe.ment des études gén-'tiü\ies et

phyEiologi^ues . Reflets du gène pyr.arg 1 1. x^uatre nouvea.ux mutants sensibles à

l'nracile sont obtenus, leurs muta­ tions 60 groupent cornac celle du pre­ mier mutant ura-s au centre du gène pyr.-rg mais ils ne sont pas sensibles à l'ergi'ine et la CO^ peut lover leur

sensibilit' à l'urrcile J2

2o La localisation de cinq mutations pro­ voquant la sensibilité à l'uracile, au centre du gène pyroarg, n'indique-t- elle pas une sous-région au soin du

Chapitre 3

où les mutations par substitution d*acide aminé, s'expriment le plus souvent par des phénotypes non-auxo- trophes•

4. La région centrale contient la majo­ rité des mutations ura-s ^^2^

5» Dans la région centrale, les mutants déphasés donnent lieu à des rWertis

+ ura-s CO^

6. Deux mutants déphasés localisés à la droite du gène donnent des r'vertis sensibles à l'arginine. La sensibi­ lité à l'arginine se retrouve aussi daus des mutants obtenus à la nitro- soguanidine. Effet indirect de l'ar­ ginine O

?• A gauche dans le gène, les mutants déphasés s'expriment par un phéno­ type non-auxotrophe. Indication de la polarité du gène.

8. Nouveaux phénotypes : outre l'ATP et le CO^ un troisième substrat de l'enzyme est mis en cause chez des mutants ; l'ammonium lève la sen­ sibilité à l'uracile de deux mutants: pyr.arg 177 et I78

5. Nouveaux phénotypes : stimulation de mutants par l'ornithine

10. Effet "in vivo" dns purines sur des mutants pyr.arg 11. Le détail du travail. 36 37 33. 37 39 39 40 41 43

LE HECANISiffi D'ACTION DE LA CARBAI'IÏL PHOSPHATE SYNTHETASE. ETUDES BIOGHI>:i(^UES DE L'ENZYrlE

D'ESCHERICHIA COLI (B et Kl^) 43

47 A. Etape A : (réaction I)

B. Etape B ; Intervention du donneur d'azote

(réaction observ-'e il) 49 C. Etape G ; Phosphorylation du carbnr-.ate

(réaction >) 52

D. Réaction globale de synthèse du Carba-rayl Phosphate

1. Action des substrats : le CO^ 93 Action des substrats : la £,lutar.ine

et le ^4

Action des substrats : I'ATP 94 E. Interaction entre les substrats 59 F. Action des effecteurs allostériques

G. Preisiers éléments d*un modèle

allost'-rique 9<^

Chapitre 4 DU MATERIEL ET DEC METHODES 6 I

A. Abréviations £2 B. Souches 1. F678 2. 2000 4. CA^44.i 9* Hfr H 6. KAI98 G. Milieux de culture 69 i’iilieux synthétiques 59 2. è.ilieux complexes ££ 9» Conditions de culture ££ liUtagénèse et enrichissement à la pénicilline £n

Eo Analyse phnotypique des mutants sur boîtes

Analyse ph.notypiqi7e en milieux liqui­

1. Préparation des extraits 70

2.0 Méthode colorim'trique 71

3» i-iéthode radiochimique 72

H. Traitement des mutants pyr-arg pour

l'analyse génétique par transduction 73 I. Réponse aux agents mutagènes 76 J• Réponse aux suppresseurs de nutations

"non-sense" (non signifiantes) 76 K. Analyse fonctionnelle par transduction

abortive 77

L. Analyse fonctionnelle par usage de

mé-rodiploïdes stables 78

Chapitre 3 INVENTAIRE 8l

Chapitre 6 PRESENTATION DES PHENOTYPES NON BIAUXOTROPHES 8^

I . Définition du matériel 82

II O l.utations de régulation all'liques au gène structure de protéines allost'-

riques dans d'autres systèmes 83 III. Remarques sur la détermination 86

IV . Phénotypes observés 87

Chapitre 7 PHYSIOLOGIE DES MUTANTS 9O

I • lir 'liminaires 90

- description des catégories d'expé­ riences

- énumération des études physiologi­ ques

II • P678MI (pyr.arg 678)» Ire-.ier mutant

analysé 02

A. Phénotype gy

B. Recherches sur l'effet de l'arginine 93

C. Analyse enzymatique 94

D. i'Iéthodologie puverte par ]e mutant

P678 95

E. Mutants Ut37 et Ut33 96

97 III. Le P^.X UT3 (pyr.arg 803) et les mu­

tants urn-s *^^2^

A O .Üse en évidence du phénotype 97 B. Analyse enzymatique d'extraits bruts 99 Co Analogie avec la coop'rativité néga­

tive selon Koshland 101

Do Conclusion IO3

IV . Les aut-nts 177 et 17^ stimulés "in

vivo" par l'ammonium IO3

A. Présentation IO3

Bo Effet de l'amœoniuia observ' "in

vitro" 104

C. Effet de l'ammonium confirmé "in

vivo" 104

D. Comparaison des propri't's des deux donneurs d'azote ; gluta­

mine et 105

Eo Déphasage et modification du

reploio-ment IO6

F. Explication du phénotype 107

Go Conclusion I08

V . Les mutants sensibles à 1* rgir.ine I09

A. CAL^4oI RE55 no

B. CA244oI RE36 11I

C. P^X RE 100 112

D. CA244o1 RE81 113

E. Les révertis arg-s 1I3

a. Présentation 1I3

b. Analyse enzymatique 114

c. Analyse de l'enzyme du 175*1 II5

Chapitre 8 ANALYSE GENETIQUE BU GENE PYRoARG II6 I • Cartographie par délations 116

II . Croisements à 3 points II7

III. Lecture des t ble/ux de tr-nsduction 118 IV . Remarçues signalées dsns le tableau

Chapitre 9

B. Carte de la région centrale 121 C. Carte des mutations s’exprimant

par le phenotype ur -s 122

D. Carte des mutations s’exprimant notamment prr une sensibilit" à

l’arginine 123

E. Carte des mutations d-^phasés 1/^4 VI . Longueur du g"ne pyr.arg

A. Longueur 123

B. Contenu en nucléotides du gène pyr..rg 126 VII. Comparaison des cartes gén'tinues des

loci ,,ouvern int la CPS ^ ’ Escheric; in

coli et de Salmonella ty~hilurium 12?

DETERMINATION DU CARACTERE DES MUTATIONS PIE. \RG

I . Préliminaires et définitions A. Délétion

B. Mutation de substitution "mis-sense" C. Mutation d’arrêt de lecture ("non-

sense")

D. Mutations de déphasage

II . Buts des déter-inations de rut, tiens III. Critères de détermination

IV . r.utants obtenus k la nitrosoguanidine V . i.utants obtenus aux rayons UV et a VI . Mutants spontanés

VII. A.utants obtenu- ' l’ICR 19» A

A. Mise en évidence d’un déphasage probable chez un mutant NG~, DES^ ICR191‘^

E. Rcle du diéthyl sulfate

Chapitre 10 ANALYSE PHYSICL0GI;^UE DES REVERTIS

ET SUPPRIMES i50

A. iiutants "non sense" (non si.nifiante)

suppri.nés 1 et 602 15 i

Bo Révertis de mutante déphasés centr ux 1^4 C. Révertis des 2 mutants déphasée

localisés à 1'extrèrae-drcite du locus

pyr.arg 121 et l?5 155

D. Révertis du 122 I56

Chapitre 11 ANALYSE FONCTIONNELLE DU LOCUS PYRoARG ;

UN OU ILUSLEURS CISTR0N3 ? 15F

I . .lOd'les h2/7oth-ticues 15g

A. Duplication de la fonction I58 B. Souo-unités diff'rentes I60 II • La transduction abortive et l*usp,ve

de mérodiploîdes stables 160

A. La tr-nsduction abortive I60 B. Analyse fonctionnelle par usage de

mérodiploîdes stables 16 1

Chapitre ic. BILAN ET PERSPECTIVES 164

I . Bilan l64

1. La Carbamyl Phosph:te Synthétase:

Fonctionnement et structure l64 2. La CPS ; Régulation physiologique I66 J. Un matériau pour étudier une pro­

téine allo!*térique les mutants

partiels et leur physiologie 167 4. La carte génétique du gène pyr.rrg 16°

5* Révertis et supprimés I70

6. Un matériau pour l'étude du mode d'action des mutagènes : mis en évidence du déphasage par l'ICRIS'lA

et le diéthylsulfrte 17 1

II • La répression lyy

!• i reraières données : la répression

a. Répression et mutants pyr.rg 174 b O Répression de la CPS et gènes arg i75 111 • i erspectives et d:Wcloppements 175 Ao L'effet du bicarb n. te . ubstr-t 176 1. CO^ et mutants ura-s 176

2. Effets indirects 476

B. Effet des purines I77

Co Etude des mutants "non sense"

supprimés 478

D. Complémentation intrrcisironique 17E

1

CHAPITRE 1

AVANT - PROPOS:

La régulation du métabolisme chez les microorganismes nous parait assurer au moins deux fonctions:

- elle permet de répondre à des demandes accrues de métabolisme. - par les rétrocontrôles elle assure une consommation minimale

d'énergie, ainsi dans les processus anaboliques.

La régulation est génotrope et enzymotrope. La régui: tion ^~énotrope assure un réglage large: elle agit sur l'ensemble d'un séquence métabolique autonome en réglant la production des enzymes catalysant les diverses étapes d'une voie métabolique. Elle assure l'économie dans la synthèse des protéines (transcription et traduc­ tion) et est complétée par un ajustement fin d'effet immédiat: la régulation enzymotrope.

ou

Les effets régulateurs peuvent être positifsV'négatifs: induc­ tion et répression dans la régulation génotrope, activation et in­ hibition dans la régulation enzymotrope.

Les enzymes soumises à cette dernière sont appelées protéines régulatrices :

Dans le réseau enchevêtré des réactions du métabolism.e, la plupart d'entre elles correspondent à des activités enzymatiques, sises à des points stratégiques

- qui rendent leur régulation plus importajite que d'autres pour le maintien de l'équilibre cellul-iire.

- catalysant la première étape spécifique de la synthèse d*un métabolite essentiel

- ou bien sises à une bifurcation métabolique et catalysant la formation d'un précurseur commun à plusieurs métabolites.

La caractéristique essentielle des protéines régulatrices est que les métabolites activateurs ou inhibiteurs de ces protéines ne participent pas à la stoechiométrie de la réaction catalysée par la protéine et qu'ils se fixent en des sites distincts de celui du substrat.

La protéine a donc des sites spécifiques pour des ligands dif­ férents du substrat. Ces spécificités sont liées à son haut contenu informatif. Les relations de la protéine vis-à-vis de ses ligands

(substrats, activateurs, inhibiteurs) obéissent aux mêmes lois physico- chimiques.

La découverte de oes spécificités indépendantes, " qui ne se recouvrent pas", a donné naissance à l'adjectif allostéri.ue ( MONOD, CHANGEUX et JACOB, 19Ô3)» qui met en relief le fait que l'effecteur, rétroinhibiteur n'est pas un analogue stérique du substrat.

Le choix du terme allostériquerappelle que la biochimie des protéines, était une province lointaine, la marche de Bretagne de la Chimie organique, une chimie où substratset inhibiteurs étaient souvent " frères ennemis".

Ayant décrit 1' "effet allostérique", MONOD, WYMAN et CHANGEUX ont présenté en 19é5 un modèle de protéine allostérique, dont voici les principales affirmation^

3

-un axe de symétrie,

2o A chaque ligand capable de former avec la protéine un complexe stéréospécifique, correspond un seul site par protomère. La symétrie de chaque groupe de récepteurs stéréospécifiques est identique à celle de la molécule.

3. La conformation de chaque protomère dépend de son associa­ tion avec les autres protomères.

4. Les d-igomères disposent d*au moins deux états réversibles qui diffèrent par la distribution et (ou) l'énergie des liens in- terprotomériques. Ces états différent par les contraintes conforma­ tionnelles omposées aux protomères.

5. L'affinité d'un (ou plusieurs) sites stéréospécifiques vis-à-vis du ligand correspondant est mo'^'ifiêe si a lieu une tran­ sition d'un état à l'autre.

60 Lors d'une transition allostérique, la symétrie moléculaire est conservée ( MONOD, WTKAN et CHANGEUX, 1965 p.90)

Le modèle de MONOD, WYKAN et CHANGEUX rend compte des cinétiques sigmoïdes de saturation observées dans les protéines allostériqueso

Ces cinétiques sont dues à des effets coopératifs homotropes ou hétérotropes des ligandssubstrats, activateurs ou inhibiteurs.

( Par effets hofnotropes, ou entend les interactions entre ligands identiques. Celles correspondant à des ligands différents sont des effets hétérotropes ).

Attirant l'attention sur la nature oligomérique des enzymes, le modèle s'est montré fécond et a considérablement stimulé les recherches sur la régulation enzymotrope.

D'autres modèles existent ( 10, 46, 73» 79» 1ô2....) qui

rendent compte des cinétiques sigmoïdes observées dans ces protéines allostcriques: ainsi KOSHLAND voit les transitions allostériques comme une isomérisation séquentielle ( et non concertée): la fixa­ tion de ligands sur une sous-unité induit un changement conforma­ tionnel d'une sous-unité proche (73): le changement de conformation se poursuit séquentiellement à travers tout l'oligomère.

NICHOL, JACKSON et WINZOR proposent un modèle mathématique pour les systèmes où les transitions allostériques effectuent le passage entre deux états multimériques distincts. Ces auteurs ont calculé qu'une variation de l'état multimérique est plus effective qu'une isomérisation pour provoquer le caractère sigmoïde d'une courbe de saturation.(91 » 92).

D'autre part, leur modèle mathématique peut rendre compte aussi des phénomènes d'isomérisation.

En fait, on a observé d'innombrables effets allosteri ;ues (80) et décrit des protéines baptisées allostériques qui ne répon­ daient que partiellement aux prédictions du modèle de MONOD, V.’ïl'AN et CHANGEDX. (85,

Il en est résulté une incontestable confusion au point

qu' tJMBARGER (19^9), dans une récente revue distingue les protéines allostériques comme répondant au modèle de MONOD et al., des :~irotéines régulatrices, terme générique comprenant notamment les rrotéines

5

-Les protéines régulatrices constituent un matériel de choix pour l'étude des mécanismes évolutifs:

- leur étude permettra de comparer et d'inscrire dans la phylogénie, diverses solutions aux problèmes que pose la régulation cellulaire, des procaryotes aux eucaryotes.

- on étudiera aussi l'acquisition et le maintien des spécifi­ cités au sein des protéines riches en ligands fonctionnels et dont la structure spatiale est capable de diverses modifications. Du point de vue évolutif, l'accent sera mis aussi sur les avantages sélec­ tifs liés aux interactions entre les protéines et aux changements de conformations qui peuvent s'ensuivre ( KOSHLAND et NEET,73 )•

Ainsi, il serait possible d'approcher les évènements primi­ tifs qui ont conduit à l'élaboration des processus biosynthétiques et à la formation des macromolécules biologiques.

Dans les organismes vivants, on pourra étudier le contenu informatif des protéines et l'évolution des mécanismes régulateurs au niveau de certaines étapes-clefs du métabolisme.

Ces étapes -clefs sont par exemple les branchements métabo­ liques où s'opère la synthèse d'un produit destiné à entrer dans plusieurs voies métaboliques régulées indépendamment.

En effet, si l'enzyme qui gouverne un branchement métabolique est unique, il est probable qu'elle possède plusieurs spécificités distinctes de ses propriétés catalytiques et qui correspondent à des ligands dont les actions permettent de la réguler.

CHAPITRE 2

LE CONTROLE GENETIQUE DE LA SYNTHESE DU CARBAMYL PHOSPHATE

CHEZ

ESCHERICHIA COLI

PROGRESSION DU TRAVAIL

Ce chapitre décrit le chemin parcouru en équipe pour explorer dans Escherichia coli le contrôle de la synthèse du Carbam^l ghosghate: branchement métabolique gouverné par une protéine allostérique.

Dans la mesure du possible, nous avons tenu à décrire les divers degrés de notre approche de ce mécanisme régul-teur et à illustrer ainsi la solidarité des travaux génétiques et biochimiques.

Aussi évoquerons-nous dans les trois parties de ce chapitre:

I. LES METABOLISMES LIES A CELUI DU CP, CEUX DE L*ARGININE ET DES PYRIHI- DINSS, afin de replacer le CP dans son contexte physiologique.

II. Ensuite, LES EXPERIENCES GENETIQUES ET BIOCHIMIQUES, qui nous donneront la silhouette et les traits principaux du contrôle de la carbamyl phos­ phate synthétase

III. Et enfin, LE DEVELOPPEMENT DES ETUDES SUR LE GENE de structure contrô­ lant l'enzyme et sur les perturbations de sa régulation provoquées par mutation.

Nos résultats génétiques et physiologiques seront décrits dans le détail et de façon analytique à travers 7 chapitres expérimentaux

> 7

-Ce chapitre-ci sera suivi d’un autre décrivant, la structure, le fonctionnement et les principales études biochimiques "in vitro" réalisées sur la Carbamjl ghosghate synthétase, principalement par ANDERSON, KEISTER et al et des chercheurs du laboratoire de microbio­ logie de 1’ ULB,

I. Lg CP ET LES METABOLISMES TRIBUTAIRES; LA SYrTHESE DE L’ARGININE ET DES PYRIMIDINES.

Le carbamyl phosphate est un précurseur commun à deux biosyn­ thèses:

1. La biosynthèse de l'arginine où il intervient lors de la sixième étape, la carbamylation de l'ornithine en citrulline (fig. 2.6)

2. La biosynthèse des nucléotides pyrimidiques dont la première étape, est la carbamylation de l’aspartate en carbamyl aspartate appelé aussi uréidosuccinate. Ce produit subit alors une cycli­ sation qui fournit le noyau pyrimidique.

Ces deux biosynthèsersont soumises à une régulation spécifique et autonome. L'existence d’une étape métabolique commune: la synthèse du carbamyl phosphate, pose donc le problème des interactions de ré­ gulation entre ces deux biosynthèes.(l4y)

Pour mieux décrire l'éclaircissement progressif de la régulation de la synthèse du carbamyl phosphate, il nous faut résumer au début de ce travail ce qu’on connaît de la régulation de ce secteur du métabo­ lisme o

1, LA BIOSYNTHESE DE L'ARGININE: ÜN REGULON.

issu du cycle de Krebs et en outre précurseur de la glutamine et de la proline. La séquence chimique de la biosynthèse de l'arginine est pratiquement inchangée à travers le règne vivant: signalons toutefois que pour de nombreux organismes, en particulier, les champignons, l'économie chimique est différente: la cinquième étape, la désacéty­ lation de 1'acétyl-ornithine en ornithine s'accompagne d'une

régé-y

neration d'une nouvelle molécule de glutamate qui participe donc à

cette cinquième étape catalysée par la transacétylase. (DE DEKEN, I963). Ce chemin cyclique constitue un critère d'évolution métabolique intéressant et ne se retrouve pas chez les entérobactéries. En parti­ culier, chez Escherichia co^, Salmonella T^ghimurium et Proteus

(ref. 104), les huit enzymes opèrent séquentiellement. L'arginine^métabolite terminal.exerce un contrôle sur sa bio­ synthèse, par la répression de la synthèse de ses huit enzymes, et par la rétroïnhibition de l'activité de la première enzyme.

Ce double contrôle sur l'activité et la synthèse des enzymes, illustre le schéma classique de la régulation anabolique et tend bien vers la dissipation minimale de l'énergie libreo

En effet, l'arginine en excès intracellulaire inhibe de façon immédiate la première enzyme spécifique de son anabolisme. Aussitôt s'interrompt le flux de métabolites le long de la chaîne des huit enzymes dont le taux intracellulaire diminue progressivement au cours du temps du fait de l'arrôt de leur synthèse (régulation génotrope). Les gènes contrôlant les diverses étapes de la synthèse de l'arginine constituent donc un REGULON. ( 1^0 )

9

-Quatre d'entre eux (gouvernant respectivement les étapes 5« 3» 2 et 8) forment un groupe de gènes liés arg. E, C, B, H (135» 139» 1^0) dont les 3 derniers forment un OPERON arg.C, B, H,(refo110) qui co­ ordonne leur expression (refo 136, 137)» Les quatre autres gènes sont dispersés sur le chromosome (ref.139), cette situation curieuse des huit gènes de l'arginine semble intermédiaire entre les OPERONS des 9 gènes de l'histidine et des 5 gènes du tryptopheine bien connus et la dispersion de 10 sur 11 gènes gouverneint la biosynthèse des purines par exemple (refoH9» fig.2o2)( à l'exception cependant des deux gènes spécifiques de la biosynthèse de la guanosine 5' mono- phosphate (GMP) qui constituent un OPERON, NIJKAMP et DE HAAN, 196?).

La génétique comparée de la biosynthèse de l'arginine pour­ rait donc être précieuse pour suivre l'évolution de la dispersion des gènes vers les OPERONS organisés (ou vice versa selon les hypo­ thèses). Effectivement chez Salmonella Tjr2himurium,une entérobactérie voisine d'E. coli, on retrouve le groupement des quatre gènes E, C, B, H, (ref. I4l).

Bien plus , chez PROTEUS, de la même famille et dont les loca­ lisations génétiques présentent aussi plusieurs similitudes, (ref.103) ce groupement de quatre gènes s'accroît d'une unité, le gène G gouver­ nant la septième étape, et devient ainsi un groupement arg. E, C, G, B, H (PROZESKY, 196?).

Il nous reste à évoquer la répression; l'expression du régulon arginine peut être altérée par des mutations R"arg. dans un gène régulateur unique; ces mutations peuvent modifier partiellement la répression ou provoquer une synthèse constitutive des enzymes.

( arg Rg) est parfaitement allélique de son homologue arg R de la souche E. coli K (ref. 65, 70).

Par exemple, une substitution d'un seul aminoacide peut changer le contrôle du gène arg R du type B en le type K: cela a été démontré par l'usage de mutants arg Rg ambre suppressibles (ref.65, 70)o

D'autre part, les gènes arginine de la souche E.Coli B mise à croître à haute température deviennent répressibles; l'augmentation de la température fait perdre le caractère inducteur.

Par d'autres arguments encore, JACOBY, KARLSTROM et GORINI (1969) ont vérifié que dans les deux souches le contrôle de la syn­ thèse de l'arginine est le môme; répression déclenchée par le méta­ bolite terminal. Ces études sont intéressantes pour approcher l'évolu­

tion des mécanismes régulateurs.

D'autre part, la notion môme de régulon de la biosynthèse de l'arginine a été renforcée par la découverte de mutations supprimant spécifiquement le contrôle par répression pour certains gènes seule­ ment (soit: arg F : JACOBY et GORINI, 1969 et 1'OPERON arg B, C, H: ELSEVIERS, CUNIN, SAND et GLANSDORF, 1968 { ref. 1^2, 110, 132, l43).

Ces mutations sont étroitement liées génétiquement aux gènes dont le contrôle de l'expression est ainsi affecté.

Leur effet cis-dominant permet de les désigner comme des muta­ tions affectant l'opérateur de ces gènes, qui ne peut donc plus re­ connaître le répresseur produit du gène arg R.

11

Dans le chapitre 12 (discussion générale et perspectives), nous discuterons des relations entre la répression de la Carbamyl Phosphate Synthétase et le Régulon de la Biosynthèse

2. LA BIOSYNTHESE DES PYRIMIDINES;

Cinq étapes enzymatiques sont nécessaires depuis la carbamy­ lation de l'aspartate (lui aussi sorti du cycle de KREBS et précur­ seur de plusieurs métabolites) jusqu'à la formation de l'uridine 5'. monophosphate ÜMP, Ce nucléotide sert de précurseur aux autres nucléotides pyrimidiques ( CMP, dCKP, TMP....)«

Les cinq gènes pyr B, pyr C, pyr D, pyr E et pyr F ( pyr A représente le locus gouvernant la synthèse du Carbamyl phosphate d'après la nomenclature utilisée par TAYLOR et TROTTER, 196?) sont répressibles; mais leur répression est mal connue bien que des mu­ tants génétiquement déréprimés semblent avoir été signalés .Deux ces cinq gènes sont liés sur le chromosome d' S.Coli et de Salmonel­ la (voir fig.2.2. carte du chromosome d'E,Coli,les loci pyr sont entourés d'un cercle).

La première enzyme spécifique de la biosynthèse des pyrimi- dines: l'aspartate transearbamylase est une enzyme allostérique qui a joué un rôle historique dans la compréhension des mécanismes ré­ gulatrices allostériques.

Cette enzyme est retroïnhibée spécifiquement par un trinucléo- tide le CTP (cytidine triphosphate)et l'ATP en est l*effecteur acti­ vateur.

L'enzyme natif (poids moléculaire: 310*000) peut-être dissocié en sous-unités catalytiques portant les sites de liaison des substrats (l'aspartate et Carbamyl Phosphate) et en sous-unités régulatrices portant le site de liaison des effecteurs (CTP: inhibiteur et ATP activateur)( CHANGEUX, GERHART et SCHACHMAN, I968).

Ces auteurs ont suggéré que l'aspartate transcarbamylase ATC soit un tétramère de quatre protomères identiques, chaque protomère comportant une sous-unité datalytique (poids moléculaire: 5O.OOO) et une sous-unité régulatrice (poids moléculaire: environ 30.000) Toutefois, une nouvelle détermination des poids moléculaires des deux types de chaînes polypeptidiques accompagnée de la déter­ mination de la séquence d'acides aminés de la chaîne régulatrice indique que la molécule d'ATC contient six copies de la chaîne ca­ talytique (p.m= 33*000) et six copies de la chaîne régulatrice (p.m» 17.000) (WEBER K,, I968). Les travaux cristallographiques de WILEY et LIPSCOMB, I968, confirment ees déterminations de poids molé­ culaires et suggèrent que la protéine est un hexamère.

L'étude cinétique et structurale de l'ATC n'a malheureusement pu être accompagnée d'une étude détaillée des déterminants génétiques de cette enzyme: ainsi, n*a-t-on pas encore localisé de locus respon­ sable de la synthèse de la sous-unité régulatrice»

Une analyse topographique du locut, pyr.E responsable de l'ATC n'a été faite que chez Salmonella Typhimurium (YANHON et DEMEREC, 1965) où 15 mutations (dont quatre délétions) ont été cartographiées sans études complémentaires.

13

-d'entamer ce travail?

La première observation qui a conduit à étudier plus à fond la régulation de ce branchement métabolique est la mise en évidence d'une interaction entre les biosynthèses de l'arginine et des pyrimi- dines.

Cette interaction est due à la participation du Carbamyl Phos­ phate à ces deux séquences et a été observée de la manière suivante ( GLANSDORFF, BOURGEOIS, WIAME, 1962; réf. l4?) ( WIAME, 1965):

une souche pyr C d'E.Coli (bloquée dans la 2ième étape spécifique de la biosynthèse des pyrimidines catalysée par la dihydroorotate dés- hydrogènase) est cultivée en chemostat, le facteur limitant étant l'uracile.

On observe dès lors un accroissement important du taux dejs en­ zymes de la biosynthèse de l'arginine: ce qui s'interprète comme le résultat d'un appauvrissement secondaire du pool d'arginine, créé par la dérepression de la séquence des pyrimidines drainant le Qscr- baimyl Phosphate. Cet effet n'est pas observé si le mutant pyr est bloqué au niveau de l'aspartate transcarbamylase, l'enzyme qui uti­ lise le CP pour la synthèse des pyrimidines (WIAME J*M., 1965)»

Cette interaction entre les biosynthèses de l'arginine et des pyrimidines étant aussi établie, on a recherché l'enzyme responsable de la synthèse du Carbamyl Phosphate:

II. STRUCTURE GENERALE DU CONTROLE DE LA CARBAMZL PHOSPHATE '^YNTHETASE

1. PREMIERS MATERIAUX:

Voici les éléments au départ desquels s'est construit le présent travail:

physio-Il existait une autre activité enzymatique capable de synthétiser le Carbamyl Phosphate, cette activité nommée carbamate kinase a trait en fait à 1'acétokinase ref. 67 • Cette acétokinase peut phosphoryler le carbamate "in vitro" et ne joue aucun rôle physiologique "in vivo" dans la synthèse et la régulation du Carbamyl Phosphate, de l'arginine et des pyrimidines

Des mutants ont été isolés en une seule étape mutagenique qui exigent simultanément l'arginine et les pyrimidines. Dans ces mutants, aucune activité de la Carbamyl Phosphate synthétase utilisant la glu­ tamine comme donneur d'azote n'est décelable.

La synthèse de cette Carbamyl Phosphate synthétase est sujette à répre'ssion. Celle-ci est quasi totale lorsque la bactérie croît sur milieu pourvu d'arginine et d'uracile, représentant les métabolites

terminaux des deux biosynthèses où intervient le Carbamyl Phosphate. Mais on n'observe qu'approximativement 505^ de répression lors­ que la croissance s'effectue dans un milieu supplémenté d'arginine seule ou d'uracile seule.

Les deux métabolites terminaux exerceraient donc chacun un rétro­ contrôle partiel sur la sj-nthèse de la Carbamyl Phosphate synthétase.

Ces rétrocontrôles semblent s'additionner: ce serait un cas de répression cumultative qui intégrerait donc la régulation de la synthèse

V

15

-En milieu de répression pourvu d’arginine et d'uracile,on retrouvfc chez ce mutant arg R 50% de l’activité observée en milieu de dére— pression (milieu minimal) au lieu d'avoir une activité quasi nulle comme chez l'organisme sauvage. Au cours de ce travail nous n'avons guère pu accroître les données sur la répression et nous nous sommes surtout attachés au contrôle de l'activité de la CPS. (Dans le cha­ pitre terminal, toutefois les problèmes relatifs à la répression seront discutés dans le détail).

Nous avons entamé cette étude relative au contrôle génétique de la biosynthèse du CP par la localisation d'une dizaine de mutations s'expriment par une exigence simultanée d'arginine et de pyrimidines (mutations pyr.arg)

Ces mutations ont été situées par transduction dans un locus sis entre la région thréonine et la région leucine du chromosome d'Esche- richia coli K 12 (fig.2.1 et 2.2) (PIERARD, GLANSDORFF, MERGEAY et WIAME,1965).

La première estimation de la longueur de ce locus la porte à 8% de recombinaison entre les mutations pyr.arg situées aux extrémités du locus ( GLANSDORFF, THESE, 1965; ref. 136).

2. DN SEUL GENE, UNE SEULE ENZYME POUR UN BRANCHEMENT METABOLIQUE ?

L'existence de ce locus suggère fortement qu'il y ait une seule enzyme fabriquant le Carbamyl Phosphate pour les deux biosynthèses, à tout le moins qu'il y ait un élément génétique comm\in aux deux biosynthèses.

Nous aurions donc un branchement métabolique gouverné pair un système enzymatique unique.

commune essentielle en unités enzymatiques distinctes et spécifiquement contrôlées par un métabolite.

Plusieurs cas classiques sont connus: chez Eocoli les 5 aspar- tokinases (étape commune de la biosynthèse de 4 aminoacides, figo2.3) sont contrôlées l'une par la thréonine (rétroïnhibition et répression), la seconde par la lysine (rétroïnhibition et répression) la troisième par la méthionine (répression) (ref. 27, 117, 1^9, 150, 151)o

Citons chez E.coliî-2 thréonine désaminases, dont l'une a une fonction catabolique tandis que l'autre est biosynthétique ( COHEN et BROWN, 1958; ref.152).

“2 malate synthétases dont l'une appartient au cycle glyoxylique et l'autre à la voie glycérique (FALKAQNE, P., VANDERV/INKEL, E. et WIAME, J.H., 1965).

J

Chez Bacillus subtilis, il existe deux pyrroline-deshydrogé- nases, l'une appartenant au catabolisme de la proline, l'autre au catabolisme de l'arginine.

Ces deux enzymes sont régulées indépendamment ( DE HAUWER, LAVALLE, WIAME, 1964)

Chez Pseudomonas Fluorescens, il existe deux ornithine trans- carbamylases dont l'une est anabolique et l'autre catabolique ( IO6, 118). ( STALON-, RAMOS, PIERARD et WIAME, 196?).

Chez EoColi encore, la première étape de la biosynthèse des aminoacides aromatiques est démultipliée (fig.2.4) en trois enzymes contrôlées respectivement par le tryptophane, la phénylalanine et la tyrosine (113, 40, 102).

Dans le cas qui nous intéresse, la fonction n'apparaît pas dédoublée , ce qui passait presque pour une absence de régulation efficace possibleo

N'y avait-il pas toutefois des éléments qui auraient permis de croire à un dédoublement partiel de la biosynthèse du Carbamyl Phosphate?

Un indice éventuel allait être fourni par la découverte de mutants affectés dans la synthèse du CP mais dont le phénotype était particulier.

3. MUTANTS SENSIBLES A L'ÜRACILS (LEVURE ET ESCHTCPICHIA COLI) ET DEDOUBLE!-ENT ENZYMATIQUEo

En effet, NOVICK et MAAS (I961) signalent l'existence d'un réverti d'un mutant biauxotrophe qui est sensible à l'uracile; c'est à dire que ce réverti est capable de croître sur milieu minimal, comme un prototrophe mais en milieu pourvu d'uracile, sa crois­ sance est inhibée. D'autre part, GORINI et KALKAN (1963) trouvent par mutagénèse aux rayons ultra-violets, un mutant sensible à l'iira- cile, qui semble aussi modifié dans le métabolisme du Carbamyl

Phosphatée

Cette sensibilité à l'uracile signalée ainsi chez Escherichia coli attire donc l'attention sur un rétrocontrôle plus particulier des pyrimidineso

Or chez la levure, LACROUTE, F., GRENSON, K., PIERARD, A,, WIAI-tE, J. et al. ont également découvert des mutants sensibles à l’uracile.

les gènes qui les contrôlent sont non liés, elles utilisent toutes deux la glutamine comme donneur d*azote et sont I'udfsous contrôle

de l'arginine l'autre sous celui des pyrimidines (fig.2o4).

Cette seconde enzyme est rétroïnhibée complètement par l'uri— dine-tri-Phosphate (en outre cette CPSase spécifique des pyrimidines est gouvernée par le môme locus que celui de l'Asgartate transcar— bamylase. Ce locus fabrique donc une protéine multifonctionnelle correspondant à 2 étapes consécutives d'une même biosynthèse. ( comme chez Neurospora et Coprinus radiatus).

Chez d'autre encaryotes, Coprinus Radiatus et Neurospora Crassa la synthèse de Carbamyl hosphate s'organise en gros selon les mêmes principes.

Comment obtient—on chez la levure des mutants sensibles aux pyrimidines?

Par la perte de la CPS spécifique de l'arginine dans les mutants cap-arg: de pareils mutants conservent une Carbamyl phosphate s^nthé- tase qui est capable de fournir le Carbamyl Phosphate aux deux biosyn thèses. Sur un milieu minimal pourvu de pyrimidines, celles-ci rétroïn hibent l'enzyme restante spécifique de leur biosynthèse et provoquent du coup l'exigence vis à vis de l'arginine (ref.75).

Il était évidemment tentant de rapprocher les mutants ura-s de la levxire des mutants ura-s d'Escherichia coli, et de voir dans ceux-ci l'indice d'un dédoublement de la fonction conduisant par exemple à une situation intermédiaire entre 1 seule enzyme et deux enzymes à régulation complètement autonome.

Les hypothèses quant à cette "situation intermédiaire" n'étaient pas très claires.

-

1^-LOCALISATION D»ÜNE MUTATION (PYR. ARG n° 678) PROVOQUANT LA SENSI­ BILITE A L'URACILE.

Ce mutant a été sélectionné et pour sa capacité de croître sur milieu minimal et pour sa sensibilité à l'uracile. Son phénotype s'exprime par une croissance régulière en milieu minimal (90' de temps de génération), nettement meilleure si on lui fournit l'argi­ nine et les pyrimidines, il est très sensible à l'uracile qui en 30’ inhibe une croissance exponentielle en milieu minimal; mais il est aussi sensible à l’arginine à un degré moindre mais encore très neto Ceci est imprévu.

La mutation de ce P 6 78M^ (pyroarg n®678) en plein milieu du locus pyr.arg: 3 mutations à sa droite, 4 à sa gauche et deux toutes proches.

Cette localisation rendait inutile une théorie recherchant un cistron spécifique de la biosynthèse des pyrimidines ..

D'autant plus que des essais de complémentation d'extraits enzymatiques de mutants pyroarg distaux se sont avérés négatifs. C'était pour nous le premier indice d'une unité fonctionnelle au sein du locus pyr.arg.

Il fallait donc rechercher ailleurs que dans la comparaison avec ces mutations cap-arg (ura-s) de la levure, l'explication du phénotype ura»sd'E.coli.

L'analyse enzymatique nous apporta des renseignements nouveaux.

5. INHIBITION COMPLETE DE L'SNZYNE DU MUTANT P678 ?!1 PAR L'HEIDIN»^ 3* MONO PHOSPHATE; L'ENZYME SAUVAGE N'EST INHIBEE QU'A 50%:

à 50% l'enzyme. Il est bon de signaler ici les conditions de dosage: l'activité de la Carbamyl Phosphate synthétase est mesurée par couplage avec l'ornithine transcarbam^lase ajoutée en excès dans le mélange r réactionnel qui outre les substrats, contient aussi l'ornithine.

La citrulline formée est dosée par colorimétrie. D'autre part, la rétroïnhibition semble totale chez le mutant P 678 dont la mu­ tation semble avoir accru la sensibilité à l'Uridine 5* Mono Phosphate, par exemple, l'enzyme aurait acquis plus d'affinité pour l'inhibiteur.

Nous verrons plus loin que l'effet de la mutation est d'avan­ tage imprévu. Signalons en outre que ni l'enzyme sauvage ni l'enzyme mutée ne montrent la moindre sensibilité à l'arginine: l'arginine n'aura effectivement aucun effet inhibiteur ou autre sur l'enzyme.

Comment expliquer dès lors la sensibilté à l'arginine observée "in vivo" chez Ce C« problème irritant restera longtemps en suspens avant d'#tre résolue

Entretempj^ un mécanisme régulateur nouveau était découvert dans la famille aspartique (voir figo 2.3). L'aspartate est le pré­ curseur commun de 4 aminoacides: la lysine, la méthionine, la thré­ onine et 1'isoleucine. Chez Escherichia coli, (et aussi chez Saccha- romyces Cerevisiae) la première enzyme catalysant une étape commune à l'anabolisme de ces quatre aminoacides, l'aspartokinase est démulti­ pliée en trois enzymes soumises au contrôle respectivement de la

thréonine, de la méthionine et de la lysine (27, 117» 149, 150, 151)• De même, l'homosérine deshydrogénase (voir fig.2.ô ) d'Escherichia coli est également dédoublée qui catalyse une étape commune aux bio­ synthèse de la thréonine et de la raethionine.

21

terminaux: qu'en eet-il donc chez les b cteries photosynthetiques

S.

ou ce nouveau mécanisme a été découvert?

6. EXE::FLE DS

REaULATIOn

:

L'ASPARTOKINAGE ET L'HOHOSERINE DESKYDROGENASE DE RH0D0EPI5ILLUK RU3RUM, ENZYKES NON lEDOUBLEES DANS UN ERAKCHEKEl'T EETABC'LI ^UE. LA THRECNINE LES INHIBE COIIFLETEKENT, L'ISCLEUCINE CONTRECARRE CETTE INHIEITICN.

Examinons les travaux de DATTA, 3EST et 3EGAL à ce propos: (1964) (réf. 30, 31).

1. L'Aspartokinase de Rhodospirillum rubrum est une enzyme unique, rétroinhibée complètement par la thréonine ( rappelons que celle-ci est le précurseur de l'isoleucine ).

Comment concilier cette inhibition drastique avec les besoins éventuels en méthionine et en lysine de la cellule ? N'y a-t-il pas là une régulation trop primitive par rapport aux systèmes où les étapes-clefs sont démultipliées ?

Il semble que non: l'isoleucine active fortement l'enzyme (la méthionine aussi) mais bien plus, l'isoleucine contrecarre com­ plètement l'inhibition par la thréonine. On devine dès lors que le correctif régulateur réside dans la balance intracellulaire thréo­ nine-! so le ucine .

Lorsqu'il y a un excès intracellulaire de thréonine, l'asparto- kinase est inhibée illico, mais la thréonine se transforme aussi en isoleucine qui renverse l'inhibition.

La balance thréonine-isoleucine assure ainsi les besoins en lysine et méthionine.

le même mécanisme élégant se retrouve dans la régulation de cette enzyme également unique; on retrouve l'inhibition totale par la thréonine contrecarrée par 1'isoleucine. En outre, DATTA, GEST, et SEGAL ont observé des variations moléculaires de l'enzyme selon l'aminoacide présent (31)•

En présence de l'inhibiteur, l'enzyme semble s'agréger en un polymère inactifo L'isoleucine et la méthionine contrecarrent cette agrégation (voir fig. n°38).

La régulation de cette enzyme présente encore d'autres aspects curieux (notamment: la méthionine et l'isoleucine qui sont aussi des ;rod’jits terminaux peuvent en l'absence de l'inhibiteur ( la thréonine) activer la réaction INVERSE de l'homoserine d^shydrogénase et ainsi exercer une forme de rétrocontrôle.

Retenons ici principalement pour notre sujet:

1. La variation de l'état d'agrégation moléculaire de ^'enzyme en fonction du rétrocontrôle.

2. La régulation balancée grâce aux effets antagonistes de 2 métabolites.

Revenons à la Carbamyl Phosphate s.ynthétase d' Escherichia coli où un phénomène semblable nous attend.

7o L'ORNITHINE ACTIVATEUR DE LA CPS ET ANTAGONISTE DE LA RETROINHIBITION PAR L'UKP.

23

-Aussi PIERARD, A., s'est-il demandé si cette retroxnhibition partielle n'était pas en fait due à la sommation d'un effet inhibi­ teur (celui de l'UKP) et d'un effet activateur.

Pourquoi un effet activateur et de quel coté le rechercher? L'idée d'un effet activateur découle d'une comparaison avec le Car- bamyl Phosphate synthétase des organismes uréotéliques. Cette en­ zyme qui participe au cycle de détoxication de l'ammonium (cycle de Krebs ou de l'urée) requiert absolument pour fonctionner un activa­

teur: l'acétyl glutamate qui ressort inchangé de la réaction ata- lytique. L'acetyl glutamate est aussi le premier intermédiaire formé

de la biosynthèse de l'arginine (voir fig.2.1). D'où PIERARD, A., rechercha-t-il l'effet activateur■de ce produit sur la CPS d'E.coli. Et pour ce faire, il étudia la réaction indépendamment du couplage CPS-OTC, suivi du dosage de la citrulline formée (voir méthodes chap. 4 section G 2).

N'ayant trouvé aucun effet de l'acétyl glutamate, il essaya d'autres intermédiaires de la synthèse de l'arginine et constata que l'activateur recherché était 1 'ornithine. ( PIERARD^ a., 19"'^)»

En effet, l'UMP rétroïnhibe complètement 1'enzyme sauvage en absence d'ornithine qui a un effet antagoniste de la rétroxnhibition (telle que celle-ci dans les conditions usuelles du couplage CPS-OTC ne soit que de 505 ) ( voir fig. 7.25).

est certainement un métabolite très indiqué pour activer l'enzyme et assxirer son fonctionnement constant face à une éventuelle rétro- ïnhibition due à une concentration intracellulaire saturante en pyrimidines. ^n outre une diminution de la concentration en arri- nine provoque un afflux d'ornithine activatrice, par le relèvement de la répression des enzymes de l'arginine et de la rétroïnhibition de la 1ère enzyme de sa biosynthèse (fig. 2.6).

Rappelons que l'arginine n'a absolument aucun effet sur la CPS.

8o LE P 678 MUTANT URA-S DONT L'ENZYME EST INHIBE COMPLETEMENT PAR L'ÜMP A,T-IL PERDU LE SITE DE L'ORNITHINE ?

La question semble évidente, et la réponse affirmative est attendue. LECLERCQ et PIERARD, 1969| en( préparation) ont étudié les propriétés des enzymes sauvage et mutée purifiées, en fonction de l'ornithine, de 1' DMP et d'un substrat: 1' ATP. Comme le lecteur le verra plus en détail dans le chapitre 3 qui étudie 1'enzymologie approfondie de la CPS, l'ornithine et l'ATP (sous la forme de son sel magnésien) sont des effecteurs allostériques activateurs et 1' UMP est l'effecteur al ostérique inhibiteur. Aussi la surprise fut-elle grande de voir que l'ornithine n'a pratiquement rien perdu de son pouvoir activateur (ni par conséquent de son effet antogo- niste de 1' UKP). Mais le Km apparent de 1' ATP, (effecteur substrat) a considérablement augmenté: 1 * ATP n'est pratiquement plus capable d'activer l'enzyme (fig. 7o3 et 7o4)o

. 25

-que *' l’hypersensibilté” à l'uracile peut être due uni-quement à la diminution de l'affinité pour 1® ATP de la forme active de la CPS,

L'activateur effectif de l'enzyme reste donc 1'ornithine;nous avons dès lors une voie d'approche immédiate pour comprendre l'effet de l'arginine©

L'arginine, par rétroïnhibition et répression, limite les quan­ tités disponibles de l'activateur; l'ornithine. L'arginine aurait donc bien un effet indirect confirmé dans la suite par l'étude de divers mutants sensibles à l'arginine©

Dans le chapitre 7 où le mutant P 678 sera évoqué, on mettra l'accent sur la valeur méthodologique de ce mutant pour aborder l'ex­ plication physiologique des divers phénotypes.

Tandis que parmi d'autres, ces données essentielles sur la CPS protéine allostérique étaient acquises, le front génétique se déve­ loppait lui aussi : extension en profondeur de la carte génétique, déter-!’ mination du caractère des mutations,analyse physiologique de nouveaux mutants aux phénotypes les plus divers, dans le but d'étudier leurs conséquences régulatrices.

Mais comme la Carbamyl Phosphate synthétase est constituée de sous-uni tés, 5LECLERCQ et PIERARD(en préparation^ ANDERSON et MARVIN, 1969), une question génétique se pose préalablement à toute autre.

9© LES SOÜS-UNITES DE LA CARBAMYL PHOSPHATE SYNTHETASE PROTEINE ALi.OSTERI^UF SONT-ELLES IDENTIQUES OU DIFFERENTES ? QUE DIT L' ANALYSE FONCTIONNIL- LE___?

On ret'ose donc le problème de l'analyse fonctionnelle en des termes très différents d'une duplication d'une étape sise à un bran­ chement métabolique. Le point de comparaison devient par exemple

l'as-\

Nous avons pour notre système mis au point deux méthodes de complémen tation.

La transduction abortive connue et utilisée jusqu'alors chez Salmonella Tyghimurium et dont l'application à notre cas a nécessité une mise au point.

2. L'usapie de mérodiploldes stables; (fabriqués sur des souches rec ).

Les essais de complémentation dans les deux méthodes se sont avérés négatifs (voie- tableau 11.0) et sur la base des mutations localisées, soit 75 nous pouvons conclure à l'unité fonctionnelle du locus pyr.arg qui serait donc monocistronique dans les limites connues. La CPS serait donc formée de sous-unités d'une seule espèce moléculaire.

Avant de faire le point et d'évoquer l'approfondissement de la structure du gène pyr.arg grâce à l'étude de 12? mutations, parcourons le règne vivant et voyons comment s'organise la synthèse du Carbamyl Phosphate et son contrôle dans divers organismes: procaryotes, plantes et animaux»

10. AILLEURS DANS LE MONDE VIVANT:

A. Autres syst mes capables de synthétiser le Carbamyl Phosph'te.

Outre la Carbamyl Phosphate synthétase fabriquant le CP au départ de glutamine pour la synthèse des pyrimidines et de l'arginine, il existe dans les êtres vivants trois autres types d'enzymes capables de fabriquer le CP à des fins différentes. Nous les citons pour mémoire et pour prévenir certaines confusions.

sur 27 sur

-tout la réaction inverse en dégradant le CP pour régénérer 1' ADP en ATP. La fonction est donc surtout catabolique » la stoechiométrie de sa réaction est différente de celle de la CPS.

!>• la CPSase des organismes uréotéliques: c’est l'une des en­ zymes du cycle de l'urée ( cycle de Krebs; ref. 153). Ce cycle a une fonction essentiellement de détoxication de l'ammonium. L'acquisition de ce cycle de l'urée est d'ailleurs un point essentiel de l'adapta­ tion des ttres vivants d'un milieu aquatique à un milieu terrestre (ref, 15^)• Le cycle de l'urée fut un outil très fécond de la bio­ chimie comparative mais aussi des études sur le contrôle hormonal. La CPS de ce cycle de l'urée est différente de l'enzyme d' E. coli en 2 aspects au moins,

- elle utilise l'ammonium comme principal donneur d’azote (d'où la détoxication est possible)

- elle exige un activateur essentiel qui ressort inchangé de la réaction: le N-acétyl-L. glutamate.

Cette enzyme est trouvée essentiellement dans le foie des vertèbres uréotéliques (elle est absente ou vestigiale chez les organismes ammonotéliques (ref.l4) et uricotéliques).

Sa très grande abondance dans le foie a masqué très longtemps la présence de la ÇPSase biosynthétique utilisant la glutamine comme donneur d'azote,

c. l'ornithine transcarbamylase catabolique: cette enzyme par­ ticipe au catabolisme de l'arginine: elle fabrique le Carbamyl Phos­ phate et l'ornithine au départ de citrulline et d'ATP.

Chez Lactobacillus Leichmannii, une OTC •'catabolique” semble aussi responsable de la synthèse du CP nécessaire à la biosynthèse des pyrimidines (ref.63; voir fig. 2.7).

B. Universalité de la CPSase consommant la glutamine et du rétrocontrôle par les pyrimidines:

Pratiquement, dans tous les systèmes vivants où une biosynthèse autonome des pyrimidines a pu Ôtre décelée, la CPSase fonctionnelle consommait la glutamine comme donneur d'azote: elle a été décelée chez les procaryotes, chez- quatre champignons: Agaricus Bisgorus (premier organisme ou elle fut trouvée,( LEVENBERG, 1962), Coprinus Radiatus et Neurosgora Crassa^Saccharom^ces Cerevisae: chez ces derniers au moins elle y est dédoublée pour les 2 biosynthèses auxquelles le CP participe.

On la retrouve dans une dizaine de plantes ( ref. 72) au moins, et parmi les cellules de vertébrés supérieurs, citons: les cellules hématopoïetiques de la rate de souris, les cellules ascitiques d'un carcinome d'Ehrlich chez la souris aussi, (68, 54), le foie de rat foetal, (55), adulte et en régénération (où l'enzyme a pwôtre immuno-

logiquerr.ent distinguée de l'enzyme uréotélique) et le foie de pigeon (55) , (animal uricotélique dépourvu des enzymes du cycle de l'urée).

Dans les cellules de certains organismes supérieurs, un rétro­ contrôle de 1' ÜKP ou de 1' UTP sur la CPSase a été observé ( réf.120) comme chez les bactéries et champignons.

29

-Le petit pois (Pisum Sativum) nous en fournit un bel exemple. La ÇPSase consomme la glutamine (ref.?2), est inhibée fortement par l'UMP comme chez E, coli mais l'ornithine aussi exerce un effet anta­ goniste sur cette inhibition (ref. 96). On retrouve donc de manière inattendue dans une plante la régulation observée dans une bactérie.

En outre, plusieurs nucléotides puriques ( AKP, ADP, GTP) in­ hibent la CPS du petit pois. ITP l*active un peu mais les autres mono- nucléotides ( GMP, XMP et IMP surtout) n'ont pas été essayés ( 0' NEAL et NAYLOR, I969). _

Ainsi sur la même enzyme d'un organisme supérieur on retrouve: 1. la relation régulatrice entre les biosynthèsesde l'arginine et des pyrimidines qui ont le CP comme précurseur commun:

2. la relation régulatrice entre les biosynthèes des pyrimidines et des purines dont la cellule a besoin en quantités égales.

"toutefois, nous ne connaissons pratiquement rien ni des autres enzymes de l'arginine chez le petit pois, ni de la régulation de 1' ATC, ni de l'unicité éventuelle de la CPS, qu'il est légitime de supposer de par l'antagonisme ornithine - UMP.

Aussi, terminons cette rapide incursion à travers les phyla du règne vivant, par les procaryotes où se range Escherichia coli, la bactérie dont nous étudions la CPS.

C. Coup d'oeil chez les Procaryotes;

Outre E^coli,chez quatre procaryotes au moins, on a pu observer des mutations ponctuelles et localisées provoquant l'exigence simultanée d'arginine et de pyrimidines, soit 2 entérobactériacées comme Eocoli, Salmonella T^ghimurium (37) (aussi S. Montevideo) (37) et Proteus

Nous avons l'indication d'une CPS unique dans 3 groupes très distincts de procaryotes, au moinsjBacillus Subtilis est le seul de ces procaryotes où la régulation de la synthèse du CP a été un peu étudiée: on y observe la répression cumulative de la synthèse de la CPSase p.-o* l'arginine et les pyrimidines (comme chez E.coli)mais aussi la ré- troînhibition cumulative de l'activité par les produits finauxo En effet, REISSIu et alo I968, ont observé que l'arginine pouvait aussi bien que les nucléotides pyrimidiques inhiber l'enzyme à 50'/- environ et l'ornithine n'a ^cun effet sur l'enzymeo

L'homéostasie y semble donc assurée mais d'une autre manière que chez E. colio

II0 LA REGULATION DE LA SYNTHESE DU CARBAKYL PHOSPHATE CHEZ ESCHERICHIA COLI; ARMATURE GENERALE.

Faisons à présent le point au départ des expériences que nous venons de décrire et de quelques données physicochimiques complémen­ taires acquises entre-temps grâce aux travaux de PIERARD et LECLERCîJ, d' ANDERSON, MEISTER et de leurs collaborateurs ( 6, 7, 8, 9, 71)•

La CPSase d' E. coli est une enzyme gouvernée par un seul gène de structure de localisation connue.

Elle utilise cinq substrats: 1' ATP intervenant par deux fois, le CO^ et la glutamine comme donneur préférentiel du groupe rjniné. Elle peut utiliser aussi l'ammonium. La synthèse globale du Carbamyl Phosphate requiert par molécule de CP formée 2 molécules d' ATF, une des 2 autres substrats. Trois étapes réactionnelles semblent requises

(ref

.9).

- 31

mettre en évidence trois effecteurs allostériques: un effecteur inhi­ biteur: 1* UMPjdeux effecteurs activateurs: 1' ATP (substrat) et l'ornithine (cosubstrat avec le CP de l*ornithine transcarbamylase).

Par ailleurs; les nucléotides puniques sont également des

effecteurs activateurs en particulier 1’ Inosine 5‘ monophosphate (IKP). L'enzyme semble exister sous des formes polymériques différen­ tes. L'ornithine, 1* IMF et le sel magnésien de 1' ATP (effecteurs activateurs) semblent avoir de l'affinité pour une forme multimérique

L'

Nous aurions donc une protéine allostérique dont les transitions affecteraient l'agrégation des sous unités de l'enzyme.

Au départ de ces éléments, nous pouvons procéder à l'approfon­ dissement de la structure du gène pyr.arg d* Escherichia coli et à l"examen des nombreuses modifications régulatrices induites par voie mutagénique.

Ces travaux sont résumés dans la seconde partie de ce chapitre et détaillés dans les chapitres 5 à 11.

III. DEVELOPPEMENT DES ETUDES GENETIQUES ET PHYSIOLOGIQUES;

REFLETS DU GENE PYR. A.

Nous avions localisé au sein du gène pyr.arg de nombreuses mutations obtenues après sélection à la pénicilline. Parmi ces muta­ tions plusieurs s'expriment par des phénotypes ne provoquant pas l'exigence complète d'arginine et de pyriraidines. La plupart même s'expriment par une croissance aisée en milieu minimal.

sensibilité à l'uracile. Mais avant tout, ce qui frappe le plus dans tous les organismes mutants, révertis ou supprimés s'exprimant par tine phénotype autre que l'exigence simultanée des 2 produits terminaux (arginine et pyrimidines) c'est leur extrême variabilité qualitative (réponse à divers métabolites) et aussi quantitative (vitesse de crois sance, activité spécifique de l'enzyme, taux d'inhibition, etc... )

Dans ce sens, la multiplicité phénotypique n'est pas un argument en faveur d'une région pyroarg polycistronique,.

Comment s'est développée cette analyse phénotypique, dont le domaine ne paraissait pas si varié au départ ?

Une observation était à la base: le premier mutant non auxotroph obtenu ( le P 678 M^) semblait assez différent et du réverti ura-s de NOVICK et MAAS, et du mutant ura-s de GORINI, I963. En effet, il était assez sensible à l'arginine, tandis que ces deux organismes croissaient fort bien sur un milieu pourvu d'arginine et mieux que sur milieu minimal.

I0 QUATRE NOUVEAUX MUTANTS SENSIBLES A L'URACILE SONT OBTENUS. LEURS MUTATIONS SE GROUPENT COMME CELLE DU PREMIER MUTANT URA-S AU CENTRE DU GENE PYR. ARG MAIS ILS NE SONT PAS SENSIBLES A L'ARGINII.i: ;-,T LT CO^ PEUT LEVER LEUR SENSI^'ILT^ A L' URACILE.

33

-Un de ces mutants, le X ÜT3 ( n® 803) ne montrait aucune sensibilité à l’uracile lorsque ce métabolite était ajouté à une cul­ ture agitée en milieu minimal et en croissance exponentielle ( voir figures n® 7»6 et 7o7 ) mais si on striait des cellules de cette cul­ ture sur boîtes,leur sensibilté à l'uracile était aussitôt retrouvée. Aussi, avons-nous attribué à l*agitation et à la capacité ainsi accrue d'utiliser le CO^ atmosphérique la différence phénotypique entre milieu liquide et le milieu solide (boîtes).

Effectivement, si on met les boîtes dans un dessicateur où la quantité de CO^ est réglée à environ la sensibilté à l'uracile peut-être levée sur boîtes de Pétri aussi (fig.7.7).

Ainsi donc, après 1' ATP (voir le mutant P678 ) c'est un nouveau substrat de la CPSase dont l'action peut-être mise en évi­ dence .

De fait, dans les extraits enzymatiques de ces mutants, ( 801, 803, 902 et 1001), il semble que l'affinité du CO2 pour l'enzyme ait diminué. De plus, dams les conditions de dosage utilisées, la sensi­ bilité de l'enzyme à 1' ÜMP n'apparaissait nullement augmentée et les courbes de saturation en fonction de la concentration en KH CO^'

étaient insolites (fig. 7.8, 7«9 et 7.10) et d'interprétation ma­ laisée (la CPS h'a jamais montré vis à vis du CO2 aucune propriété allostérique, tellè que la coopérativité positive^homotrope ou

hétéro-trope . D'autre pamt, les extraits enzymatiques de ces mutants n'avaient pas une activité spécifique très élevée au contraire du mutant

P 678 . Nous discuterons du rôle du CO2 dans ces mutants dans la section III du chapitre 7.

ce phénotype décrite ( CHARLES, K.P.,et ROBERTS, I968). Avec Mrs. QRAINGER-ROBlRTS, qui séjourna dans notre laboratoire, nous

avons localisé ces mutations dans le gène pyr.arg ( mutations 221 et 222) ( CHARLES, H,P. et EROADBENT avaient déjà obtenu chez Neurospora Crassa plusieurs mutants affectés dans la synthèse du Cirbamyl Phos­ phate et que stimulait le CO^ ( 155t ”156 et 157).

Notre attention était de nouveau attirée sur la multiplicité phénotypique. De nouvelles mutagénèses seraient donc utiles pour compléter !•éventail^des phénotypes et rechercher des mutations, affectant d’autres propriétés de l'enzymco

Mais la recherche systématique de nouveaux mutants avait une autre motivation;

2. LA LOCALISATION EN APPARENCE DE 3 MUTATIONS PROVOQUANT LA SENSIBI­ LITE A L» URACTLE, AU CENTRE DU GEJÆ PYR. AHG,N' INDi;üE-T- LL" PAS UNE SOÜS-REGION AU SEIN PU GENE ?

Le problème est assez délicat; en voici les données;

a. sur 17 mutations déjà localisées, 6 auxotrophes se situaient à gauche, 5 s’exprimant par une bonne croissance en milieu minimal ett^.r la sensibilité à l’uracile formaient un groupe au centre borné sur

la droite par un deuxième groupe de 6 auxotrophes complets.

b. de ces 5 non auxotrophes, 4 répondent au CC^ mais présen­ tent entre eux des différences quantitatives appréciables.

La localisation de mutations répondant grosso modo au même phénotype pourrait mettre en évidence certains sites de la protéine, les mutations affectant ces sites ne s'exprimant pas nécessairement par une auxotrophie radicale.

Redéfinissons dès lors notre observation:

3. LE QENE PYP, ARG CONTIENT DES REGIONS OU LES MUTATIONS PAR SUBSTITU­ TION D' ACIDES AMINES ( MUTATIONS MAL-SIGNIFIANTES OU » NIS~SENS£» S' EXPRIMENT LE PLDS SOUVENT PAR DES PHENOTYPES NON AUXOTROPHES:

Autrement dit, dans ces régions, les mutations provoquant une auxotrophie stricte seraient essentiellement soit non-sinifiantes ou "non-sense” (triplets d'arrêt de lecture) soit déphasées. En effet, dans le cas des mutations non signifiantes "non-sense", l'auxotrophie résulte de l'arrêt de la lecture et de la libération prématurée d'une protéine formée à peine sur la moitié de sa longueur, et forcément non fonctionnelle. Dans les mutations de déphasage, la partie de pro­ téine formée après le déphasage 'addition ou délétion d'une base) est lue de façon complètement incorrecte. La lecture s'arrête d'ailleurs rapidement car des triplets non-signifiants apparaissent dans la phase. Nous avons d'abord recherché les mutations déphasées dans deux rautagénèses:

Une mutagénèse sponteinée et l'autre induite à 1' ICR 19I

acridine substituée,réputée pour provoquer des additions ou délétions de bases. De nombreux déphasés sortirent de ces mutagénèses et se sont effectivement localisés dans toutes les régions du locus pyr.arg

Dans le même esprit, une importante mutagénèse à la No méthyl N'nitro nitrosoguanidine a fourni des mutations non-signifiantes localisées dans cette région centrale»

1 ® en mutations mal-si;?:nifiantes non auxotrophes de phénot.ypes variés.

2° en mutations auxotrophes soit non-Ei;rniliantes

soit déphasées (voir carte n® 8.2 et 8.4)

Les mutations"mis-senEe” auxotrophes semblent donc très rares dans cette région centrale. Ces mutagénèses ont également fourni des délé­ tions fort utiles pour l'analyse génétique par transductions.

Des phénotypes variés et nombreux ont été découverts dans les mutants issus de ces 5 mutagénèses spontanée, à 1' ICR A et à la NGo

La carte génétique s'est considérablement étendue,, le nombre des mutations localisées est passé de 1? à 80.

Voici les principales observations que nous avons fair au départ de la carte génétique»

4. LA REGION CENTRALE CONTIENT LA MAJORITF DES MUTATIONS URA-S-CO^* DONT LA SENSIBILITE EST LEVEE PAR LE CO^.

Ce phénotype se retrouve ailleurs mais en peu d'exemplaires. Sans que le sens réel de la modification induite par la mutation apparaisse vraiment, on peut penser que dans ces mutants ura-s—Co^^, la diminution de 1' affinité d'un substrat» le C02 pour l'enzyme provoque une plus grande sensibilité de l'enzyme à l'effecteur in­ hibiteur; 1' UMP. La grandeur de la région où l'on trouve le plus grand groupe de ces mutants est voisine de 1.5 unité de recombinai­ son mais nous ne pouvons en définir le nombre de sites.