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Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository
Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:
Onnockx, S. (2008). Caractérisation de l'interaction entre la phosphatidylinositol 5-phosphatase SHIP2 et la protéine adaptatrice APS et étude du rôle de ce complexe protéique dans la régulation de la cascade de signalisation de l'insuline (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté de Médecine – Sciences biomédicales, Bruxelles.
Disponible à / Available at permalink : https://dipot.ulb.ac.be/dspace/bitstream/2013/210594/9/584af5f2-4e82-47ee-b81f-537ca47501c9.txt
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ec/n -THoir:
UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES Faculté de Médecine
Institut de Recherche Interdisciplinaire en Biologie Humaine et Moléculaire
Caractérisation de l'interaction entre
la phosphatidylinositol 5-phosphatase SHIP2 et la protéine adaptatrice APS
et étude du rôle de ce complexe protéique dans la régulation de la cascade
de signalisation de l'insuline.
Thèse présentée en vue de l'obtention du grade de Docteur en Sciences Biomédicales
Promoteur de thèse : Isabelle Pirson
Sheela Onnockx
Décembre 2007
Faculté de Médecine
Institut de Recherche interdisciplinaire en Biologie Humaine et Moléculaire
Caractérisation de l'interaction entre
la phosphatidylinositol 5-phosphatase SHIP2 et la protéine adaptatrice APS
et étude du rôle de ce complexe protéique dans la régulation de la cascade
de signalisation de l'insuline.
Thèse présentée en vue de l'obtention du grade de Docteur en Sciences Biomédicales
Promoteur de thèse : Isabelle Pirson
Sheela Onnockx
Je tiens tout (CaSordà remercier Ces professeurs J.‘E. (Dumont et Ç. 'Passart pour m’avoir accueillie dans leur Caôoratoire. iMerci ^Monsieur (Dumont pour Cattention que vous avez portée à mon travaiC
Je voudrais remercier IsaSede pour m’avoir guidée, conseillée, aidée tout au Cong de ce travaiC avec Beaucoup de patience. CeCa n’aura pas toujours étéfaciCe pour toi, surtout lorsque f avais une idée en tête. Ta rigueur, ton regard critique sur mes résultats, tes questions et tes conseils scientifiques m ’auront aidée à progresser.
Christophe, merci pour ta disponihilité, ton aide et tes conseils scientifiques judicietoç, pour le Bon avancement de ce travail La passion avec hqueQe tu aBordes h recherche m’a permis de ne pas
Baisser les Bras pendant Ces moments diffciCes.
Je voudrais remercier Ce groupe (Pirson. Isamini, sans toi mon sujet JIPS n’aurait peut-être jamais ejQsté. Même si on n’a fait que se croiser quand je suis arrivée au hBo, je garderai un Bon souvenir des quelques moments passés avec toi Christine, Séverine et Tanja, grâce à vous je me suis très vite sentie Bien au laBo. Merci Christine pour toutes nos discussions, nos fous rires, du as mis de la Bonne humeur dans Ce groupe. Merci aussi pour nos virées à la mer. Séverine, tu es h première du groupe à qui fai fait connaissance. On avait un point en commun, le mémoire. Merci pour ta gentillesse, ton amitié, tes conseils et aussi pour toutes nos sorties. Tanja, merci pour tes discussions scientifiques et personnelles, merci de m’avoir écoutée et encouragée quand f avais un coup de Blues... dJhalie, tu n’es arrivée que plus tard au hBo, mais au cours de ces deu^ dernières années, on a eu Coccasion dapprendre à se connaître et fai découvert en toi une amie que j’espère ne pas perdre lorsque ms routes se sépareront. Jingwei, thanhs a lotforyour Help, your hindness and for adour discussions. Cindy, h «petite dernière». Ce temps dun mémoire, merci pour ces quelques mois passés en ta compagnie. Julie, merci à toi pour ton aide, tes conseils, ton soutien, ton écoute et surtout merci pour ton amitié qui m’est précieuse. Quand on est arrivée au hBo, on était dans h même galère et fai très vite su que je pouvais me confier à toi, aujourcChui encore... et ça compte énormément pour moi. Merci pour tout ça...
Je voudrais également remercier tous cetüçdu groupe sans qui ces années passées au hBo n’auraient jamais été aussi Bien Merci à vous tous pour ms midis, ms discussions, ms fous rires, ms sorties
du jeudi soir...
Jiline, toujours souriante et de Bonne humeur, f admire ton courage et ton énergie débordante, du es h première du groupe à t ’être hmée dans h grande aventure... merci de nous h faire partager (ça a Cair moins terriBle que je ne le pensais...). ‘Wilma, dan f je voor al je goeie adviezen zowel wetenschappelijfals personly\ voor het luisteren en voora! voor je vriendelijhheid. (Delphine, toujours pleine de peps, merci pour ta Bonne humeur et pour toutes ces Bonnes soirées passées tous ensemBh chez toi Laurent, comme tu Cas dit récemment, on a commemé ms thèses ensemBle et on les terminera presque ensemble. Ja sincérité, ton dynamisme et ta motivation m’ont toujours impressionnée. Sandra, même si on était moins proche, je n’oublierai pas les Bons moments passés en ta compagnie. Sandrine, merci pour notre super co-haBitation rue de Marteau et surtout un très grand merci à toi de m ’avoir présenté Erançois. Jücohs, h « petit » dernier au hBo, merci pour tes petites remarques toujours Bien pertinentes qui nous font à chaque fois Bien rire. Sara, de vrierudelijhfieidzelve, hoewelwe niet vaah^op hetzelfde moment in de Bureau vuaren, vomiih^het altijdkuh^om met jou te BaBBehn over van ades en mg wat zoals over dromerige vahanties. Çood lue f voor de cultuur van de adipocytes. Jfathalie, grâce à ms discussions peruhnt lefitness, fai trouvé le courage de me hncer dans h dernière ligne droite de ma thèse, merci à toi et merci aussi pour h concert mémorable au Sportpakis dJlnvers.
Je remercie également toute Céquipe de CBristophe. Merci Colette (pour ton aide et tes conseils), VaCérie (pour Cinitiation au dosage dactivité 5-pB.ospliatase), %atrien (pour Ca production de protéines), IKathaCie (ce n’est que vers la fin de ta thèse qu’on a appris à mieioise connaître mais ton aide et ton soutien m’on été dun grand secours. quand la prochaine sortie pita au cora ?), Jing (good luchjhr the end and thanhs a Cotforyour encouragements), JilêyaTidra (pour nos sorties, nos escapades à Ca mer, en Tunisie mais surtout merci pour ton amitié), ‘FaBrice (pour ces quelques passes de volants ainsi que pour ce voyage en Tunisie), (Daniel (pour la Bonne humeur que tu as apportée au d”^) ainsi que (Rpmana, Xavier, Jî/ëjc et Laurence pour votre aide, et vos conseils scientifiques. Merci aussi à tous pour les Bonnes crêpes et gaufres... mhhhhh
Ces quelques lignes me donnent Coccasion de remercier toutes les personnes qui ont participé au Bon déroulement de ce travail durant toutes ces années. Cathy, Joëlle, Marie-Jiimée, Danièle, Christian, Xves, Chude, Johan et Diana, merci pour tous les services que vous rerulez au laBo. Merci aussi à Jean-Marie F’anderwitufen pour ton aide lors de lutilisation du microscope confocal Je voudrais tout particulièrement remercier Chantal toujours à Caffût de travail toujours prête à rendre service, merci Beaucoup Chantal pour tes conseils scientifiques, ta dïsponiBilité mais surtout pour ton aide très précieuse.
Je tiens également à remercier toutes les personnes qui par leurs conseils ou leurs aides, ont participé de près ou de loin à la réalisation de ce travail: Stéphane S. (merci pour nos discussions SJUD2), Sarah (merci pour tes conseils rigoureujç^et scientifiques), Marianne (merci pour ton aide pour la manip kntivirus de mon article), ‘Civiane de Maerteher (merci pour les conseils en statistique) ainsi que toutes les personnes que j’ai croisées dans les couloirs de lI<^I(BJ{M.
J’en profite également pour remercier mes amis. Xasser, %entin, ‘Thomas, Mado, Lieve, ‘l^itto, Julie,
‘l’éro, Céline et Cqf, rnerci pour votre soutien, pour tous les Bons moments passés avec vous, pour nos vacances (à quand les prochaines ?), nos discussions, nos délires, nos fous rires... Vous êtes mes meilleurs amis.
J’aimerais remercier tout spécialement ma famille. Maman, Tapa, Deepa^ merci pour votre confiance en moi, vos encouragements, votre aide, votre soutien et votre patience... merci pour tout, et surtout merci du fond du cœur pour tout votre amour. Sans vous je ne serais jamais arrivée aussi loin... Je voudrais également remercier Marie-Taule, Marc, Sandrine, Olivier, X^lefia, ‘Eric ainsi que Thylia et Enguéran les petits derniers, pour tous les chouettes moments passés en votre compagnie et surtout pour m'avoir si vite intégrée dans votre famille.
Et finalement je voudrais remercier la personne qui compte le plus pour moi François, merci pour
Abréviations
ADN acide déoxyribonucléique
ADE2 phosphoribosylaminoimidazole carboxylase APS adapter protein with PH and SH2 domain ARNm acide ribonucléique messager
ATP adenosine triphosphate
BCR B-cell receptor
CAP c-Cbl associated protein c-Cbl casitas B-lineage lymphoma
CHO-IR chinese hamster ovary overexpressing the insulin receptor COS-7 cellules de rein de singe vert d’Afrique
C-terminal carboxy-terminal
C2C12 lignée de cellules myoblastiques de souris
DAG diacylglycérol
EGF epidermal growth factor
ERK extracellular signal regulated kinase
FcDRIIB réceptem" des fragments Fc des immunoglobulines G GAP GTPase activating protein
GDP/GTP guanosine diphosphate/triphosphate
GEF facteur d'échange de nucléotides guanyliques GLUT4 glucose transporter 4
GM-CSF granylocyte-macrophage colony-stimulating factor Grb2 growth factor receptor-bound protein 2
GSK-3 glycogen synthase kinase 3
GST glutathione-S-transferase
GTPase guanosine triphosphate phosphatase HGF hépatocyte growth factor
HIS3 imidazole glycerolphosphate deshydratase HPLC chromatographie liquide à haute performance IGF-1 insulin-like growth factor-1
IgG immunoglobuline G
IL-3 interleukine-3
Ins(l,4)P2 inositol 1,4-bisphosphate Ins(l,3,4)P3 inositol 1,3,4-trisphosphate Ins(l,3,4,5)P4 inositol 1,3,4,5-tretrakisphosphate
InsPs SPPasel inositol 1,4,5-trisphosphate 5-phosphatase de type I
INSr récepteur insuline
IPTG isopropylthio-D-D galactosidase 1RS insulin receptor substrate
ITAM immunoreceptor tyrosine based activation motif ITIM immunoreceptor tyrosine based inhibitor motif MAPK mitogen activated protein kinase
NGF nerve growth factor
PH pleckstrin Homology PI3K phosphoinositide 3 kinase
PKB protein kinase B
PKC protein kinase C
PLC phospholipase C
ppase phosphatase
PTB phospho-tyrosine binding
Ptdins phosphatidylinositol
PtdIns(3,4,5)P3 phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate PtdIns(3,4)P2 phosphatidylinositol 3,4-bisphosphate PtdIns(3)P phosphatidylinositol 3 -monophosphate
PTEN phosphatase and tensin homolog deleted on chromosomes 10
pTyr phospho-tyrosine
RAPTOR regulatory associated protein of mTOR RICTOR rapamycin insensitive companion of mTOR RTK récepteur à activité tyrosine kinase
SAM steril alpha motif
SCF stem cell factor
SDS/PAGE sodium dodecylsulfate/ polyacrylamide gel electrophoresis
SH2/3 Src Homology 2/3
Shc Src homology and related to collagen
SHIP Src Homology 2 containing inositol phosphatase
Sos son of sevenless
TAP tandem affinity purification TNT transcription and translation
wt wild type
Résumé
La liaison de l’insuline à son récepteur permet le recrutement de protéines adaptatrices, ce qui conduit notamment à l’activation de la voie mitogénique des MAPK et des voies impliquées dans le métabolisme du glucose. Deux voies complémentaires contribuent au recrutement du transporteur de glucose, GLUT4, à la membrane ; la voie de la PB-kinase qui implique la formation du messager secondaire PtdIns(3,4,5)P3 conduisant à l’activation de la PKB et la voie de la petite protéine G, TC 10, qui implique les protéines APS, CAP et c-Cbl.
La phosphatidylinositol 5-phosphatase 2 (SHIP2) contrôle négativement la voie des MAPK par interaction avec des acteurs de la cascade et la voie de la PB-kinase en hydrolysant le PtIns(3,4,5)P3 en PtIns(3,4)P2. De plus, il a été montré dans notre laboratoire que SHIP2 peut interagir directement avec la protéine CAP ainsi que co-immunoprécipiter avec le récepteur de l’insuline et c-Cbl, participant ainsi à un complexe multiprotéique formé des protéines CAP et c-Cbl et du récepteur. Au cours de ce travail, nous avons tenté de mieux comprendre l’implication moléculaire de SHIP2 dans la cascade TCIO. Comme APS est la première protéine de la cascade à être recrutée au récepteur suite à une stimulation par l’insuline et qu’elle peut interagir directement avec le récepteur et les protéines CAP et c-Cbl, nous avons regardé dans un premier temps le lien potentiel entre APS et SHIP2.
Nous avons montré que SHIP2 interagit de manière directe avec la protéine adaptatrice APS tant dans un système de sur-expression (CHO-IR) que dans un système endogène (3T3-L1).
Bien qu’une stimulation à l’insuline ne semble pas modifier cette interaction, elle induit néanmoins le recrutement d’une fi'action des protéines APS et SHIP2 du cytoplasme vers la membrane plasmique. L’étude des domaines d’interaction a montré que la région centrale de SHIP2 qui comprend le domaine catalytique est nécessaire pour cette association.
Nous avons ensuite montré que cette association entre APS et SHIP2 peut moduler certaines de leurs propriétés biochimiques. D’une part, bien que la sur-expression de SHIP2 n’influence pas le recrutement d’APS au récepteur, SHIP2 diminue, indépendamment de son activité enzymatique, la phosphorylation sur tyrosine d’APS induite par l’insuline et l’interaction entre APS et c-Cbl, qui sont deux étapes cruciales dans la cascade TCIO. Ainsi, SHIP2 pourrait non seulement influencer la cascade de l’insuline par son activité enzymatique, mais également par interaction avec des acteurs de la cascade. D’autre part, APS augmente l’activité 5-phosphatase de SHIP2 dans un test in vitro. Elle pourrait ainsi, outre son rôle positif dans la cascade, participer au rétrocontrôle négatif de la voie de signalisation à l’insuline. Finalement, nous avons regardé comment ces deux protéines influencent les cascades de l’insuline. Alors qu’APS n’influence pas l’activation de la PKB, ni le taux de PtdIns(3,4,5)P3, la sur-expression d’APS et de SHIP2 induit une inhibition plus forte de l’activation de la PKB comparée à celle provoquée par SHIP2 seul. De plus, une sur
expression de SHIP2 abolit l’augmentation induite par APS de la phosphorylation des MAPK. Cette activation des MAPK par APS semble dépendre de sa liaison au récepteur car les domaines PH et essentiellement SH2 sont indispensables pour cet effet positif.
En conclusion, nous avons mis en évidence l’existence d’une association entre APS et SHIP2. Cette interaction modifie certaines de leurs propriétés biochimiques et fournit un nouveau mécanisme d’action pour ces protéines dans le contrôle négatif de la voie de signalisation à l’insuline.
Résumé
Chapitre I : Introduction...5
1.1. Le métabolisme des phosphoinositides... 5
1.1.1. Généralités... 5
1.1.2. Le métabolisme classique des phosphoinositides... 6
Le Ptdins... 6
Le PtdIns(4)P... 6
Le PtdIns(5)P... 6
Le PtdIns(4,5)P2...7
1.1.3. Le métabolisme des D3-phosphoinositides...7
1.1.3.1. Les D3-phosphoinositides... 7
Le PtdIns(3)P... 8
Le PtdIns(3,5)P2...8
Le PtdIns(3,4)P2...8
Le PtdIns(3,4,5)P3...9
1.1.3.2. La famille des phosphoinositides 3-kinases (PI3-kinases)... 10
1.2. Les domaines d’interaction...11
1.2.1. Les domaines d’interaction protéiques... 11
1.2.1.1. Le domaine SH2 (Src Homology domain 2)... 11
1.2.1.2. Le domaine PTB (Phospho-tyrosine binding domain)...11
1.2.1.3. Le domaine SH3 (Src Homology domain 3)... 12
1.2.1.4. Le domaine SAM (Steril Alpha Motif)...12
1.2.2. Les domaines protéiques reconnaissant les phosphoinositides... 12
1.2.2.1. Les domaines PH...13
1.2.2.2. Le domaine FYVE... 14
1.2.2.3. Le domaine PX...15
1.2.2.4. Le domaine ENTH... 15
1.2.2.5. Le domaine FERM... 16
1.2.2.6. Le domaine Tubby... 16
1.2.2.7. Le domaine C2...16
1.3. La famille des inositol et phosphoinositol phosphatases... 17
1.3.1. Les inositol 3-phosphatases... 17
1.3.1.1. PTEN... 17
1.3.2. Les inositol 5-phosphatases... 18
1.3.2.1. Généralités... 18
1.3.2.2. Les inositol 5-phosphatases de type 1... 18
1.3.2.3. Les inositol 5-phoshatases de type II...19
1.3.2.3.1. GIPs (GAP domain-containing inositol 5-phosphatases)...19
1.3.2.3.2. SCIPs (Saclp-containing inositol 5-phosphatases)...20
1.3.2.3.3. SKIPs (Skeletal muscle and kidney-enriched 5’ inositol phosphatases) 21 1.3.2.3.4. PIPs (Proline-rich containing 5-phosphatases)...21
1.3.2.3.5. SHIPs (SH2-containing inositol polyphosphate 5-phosphatases)...21
SHIPl... 22
A. Structure... 22
B. Expression... 22
SHIP2...24
A. Structure... 24
B. Expression... 25
C. Activité catalytique...25
D. Régulation... 26
E. Fonctions biologiques...26
Rôle dans la voie de signalisation de l’insuline...26
Rôle dans la voie de signalisation de l’EGF... 27
Rôle dans le système immunitaire... 28
Rôle dans la prolifération cellulaire... 28
Rôle dans le système nerveux...29
Rôle dans l’organisation du cytosquelette... 29
1.4. Les voies de signalisation intracellulaire induites par l’insuline... 30
1.4.1. Généralités...30
1.4.2. Activation du récepteur... 30
1.4.3. La voie de signalisation des MAP kinases... 31
1.4.4. La voie de signalisation de la P13-kinase... 31
1.4.4.1. La protéine Akt/PKB... 32
L4.4.2. Les protéinse p70S6 kinases (p70S6K)... 34
I.4.4.3. Les protéines kinases C atypiques, PKC Ç et A,... 34
1.4.5. La voie de signalisation de la petite protéine G, TCIO...35
1.5. La protéine adaptatrice APS... 36
1.5.1. Structure primaire... 36
1.5.2. Expression tissulaire d’APS... 37
1.5.3. Fonctions biologiques d’APS...37
A. Dans le système immunitaire... 37
B. Dans l’organisation du cytosquelette...38
C. Dans la voie de signalisation de l’insuline... 38
1.5.4. Les autres membres de la famille...39
1.6. Le diabète... 40
Chapitre 11 : But du travail... 43
Chapitre 111 : Méthodes expérimentales...45
111. 1. Matériel... 45
111.1.1. Les vecteurs d’expression utilisés pour la transfection...45
111.1.2. Les anticorps utilisés... 45
111. 2. Méthodes... 46
111.2.1. Techniques de manipulation de l’ADN... 46
111.2.1.1. Réactions de polymérisation en chaîne (PCR)...46
111.2.1.2. Mutagénèse dirigée... 46
111.2.1.3. Clonage d’un fragment d’ADN ou d’un produit PCR dans im vecteur... 47
111.2.1.4. Transformation de bactéries par électroporation...47
111.2.1.5. Mini- et maxi-préparations d’ADN... 47
111.2.1.6. Electrophorèse d'ADN...48
111.2.1.7. Séquençage d’ADN... 49
111.2.2. Cultures cellulaires et introduction transitoire d’ADN dans les cellules... 49
111.2.2.1. Les cellules CHO-IR... 49
A. La culture des CHO-IR... 49
B. Transfection transitoire des cellules par le FuGENE-6...49
111.2.2.2. Les cellules de muscle C2C12...50
A. La culture des C2C12... 50
B. Les milieux de culture... 51
C. Infection virale... 51
111.2.3. Techniques de manipulation de protéines...52
111.2.3.1. La lyse cellulaire... 52
111.2.3.2. Electrophorèse en présence de SDS (SDS-PAGE) et immunodétection des protéines (Western blotting)... 52
A. Détection ECL... 52
B. Détection Odyssey (ODC)...52
111.2.3.3. Immunoprécipitation des complexes protéiques... 53
A. Immunoprécipitation classique...53
B. Immunoprécipitation DMP (dimethyl pimelimidate)... 53
111.2.3.4. GST pulldown... 54
111.2.3.5. Double-hybride... 54
111.2.3.6. Immunofluorescence confocale...55
111.2.4. Mesure de l’activité 5-phosphatase de SHIP2... 56
111.2.5. Mesure de l’activité enzymatique InPs 5-phosphatase... 56
111.2.6. Dosage du taux de PtIns(3,4,5)P3 en cellules intactes... 57
Chapitre IV : Résultats...58
IV. 1. Caractérisation de l’interaction entre les protéines SHIP2 et APS et conséquences de cette interaction sur leurs propriétés biochimiques respectives...58
IV. 1.1. “The adaptor protein APS and the SH2-containing inositol polyphosphate 5- phosphatase 2 (SHIP2) association modifies biochemical function properties of both partners.’’... 58
IV. 1.2. Complément sur l’étude de cette interaction...60
IV. 1.2.1. Etudes des domaines impliqués dans cette interaction... 60
A. Co-immunoprécipitation... 60
B. GST-pulldown... 61
C. Double-hybride... 62
D. Conclusions...63
IV. 1.2.2. Les contrôles négatifs... 64
A. Protéines irrelevantes... 64
B. La protéine CrkII... 65
C. Conclusions...65
IV. 1.3. Recherche d’un facteur pouvant moduler cette interaction... 65
IV.1.3.1. Influence de l’insuline à plusieurs temps de stimulation... 65
IV. 1.3.2. Influence d’une stimulation par l’EGF...66
IV. 1.3.3. Influence de la latrunculine B...66
IV. 1.3.4. Conclusions...67
IV. 1.4. APS peut-il lier d’autres phosphatases de lipides?... 67
IV. 1.4.1. Parmi les inositol polyphosphates 5-phosphatases...67
IV. 1.4.2. Parmi les inositol polyphosphates 3-phosphatases...68
IV. 1.4.3. Conclusions...68
IV. 1.5. APS peut-elle influencer l’activité enzymatique des 5-phosphatases de lipides ? ... 69
IV. 1.5.1. SHIP2... 69
IV. 2. Influence d’APS sur les réponses induites par l’insuline...71
IV.2.1. “TTie adaptor protein APS differentially régulâtes the insulin-induced PB kinase and MAP kinase signaling pathways."... 72
IV. 2.2. Conclusions et Perspectives...73
Chapitre V : Discussion et perspectives...74
V. 1. SHIP2 régule négativement la cascade de l’insuline par son activité 5-phosphatase 74 V. 1.1. Données in vitro...74
V. 1.2. Données in vivo...74
V. 1.2.1. Clément et collaborateurs... 74
V. 1.2.2. Sleeman et collaborateurs... 75
V.1.2.3. Fukui et collaborateurs... 76
V. 1.2.4. Autres études in vivo... 76
V.2. SHIP2 peut interagir avec des acteurs de la cascade de l’insuline... 77
V.3. Caractérisation de l’association entre SHIP2 et APS... 78
V.4. Influence de ce complexe sur les propriétés biochimiques de chacun des partenaires ... 80
V.4.1. APS influence positivement l’activité catalytique de SHIP2...80
V.4.2. SHIP2 influence négativement la phosphorylation sur tyrosine d’APS...81
V.5. Influence de ces deux protéines sur des cascades activées par l’insuline...83
V.5.1. La voie de la PI3-kinase... 83
V.5.2. La voie des MAPK... 85
V.6. Conclusions générales... 86
V.7. Modèle... 87
membrane
cytosol
acide gras
glycérol
OH O = P — O
Phosphatidylinositol (Ptdins)
Figure 1.1 : Structure d’un phosphatidylinositol ancré dans la membrane cellulaire. Il est composé d’une molécule d’inositol-1-phosphate liée via son groupement phosphate à un diacylglycérol formé de deux acides gras estérifiés sur une molécule de glycérol.
Chapitre I : Introduction
1.1. Le métabolisme des phosphoinositides
1.1.1. Généralités
Les phosphoinositides sont des glycérophospholipides anioniques trouvés en faible abondance dans les membranes des cellules eucaryotes. Le phosphatidylinositol (Ptdins), précurseur de tous les phosphoinositides, est constitué d’un inositol-1-phosphate lié via son groupement phosphate à un diacylglycérol (DAG) (figure I.l). Le noyau inositol du Ptdins présente cinq groupements hydroxyles libres pouvant être spécifiquement phosphorylés pour donner différents phosphoinositides (exceptés ceux au voisinage direct du phosphatidyl qui ne peuvent être phosphorylés à cause de l’eneombrement stérique).
Il existe sept molécules produites par phosphorylation sur un ou plusieurs sites du noyau inositol qui peuvent être classées en trois catégories :
a) les mono-phosphorylées : PtdIns(3)P, PtdIns(4)P, PtdIns(5)P b) les bi-phosphorylées : PtdIns(3,4)P2, PtdIns(3,5)P2, PtdIns(4,5)P2 c) la tri-phosphorylée : PtdIns(3,4,5)P3
Bien que le Ptdins, le PtdIns(4)P et le PtdIns(4,5)P2 représentent la majorité des phosphoinositides, ils ne comptent que pour 10% des lipides totaux dans les membranes cellulaires eucaryotes^^^.
Ces phosphoinositides joue un rôle crucial dans une variété de processus physiologiques tels que la prolifération, l’apoptose, la motilité, l’organisation du cytosquelette, le trafic vésiculaire et le métabolisme cellulaire^*^. Etant donné la diversité des fonctions cellulaires impliquant ces phosphoinositides, un contrôle rigoureux et constant de leur métabolisme est capital pour la cellule. En effet, un dysfonctionnement dans le contrôle du taux intracellulaire de ces phosphoinositides conduit souvent à des pathologies sévères. C’est pourquoi, ce métabolisme est finement régulé par l’intervention de kinases, de phosphatases et de phospholipases. Il comprend deux voies majeures : la voie du métabolisme dit « classique » qui conduit à la synthèse de PtdIns(4,5)P2 et la voie de synthèse des D3-phosphoinositides qui dépend des phosphoinositides 3-kinases (PB- kinases) (figure 1.2).
Figure 1.2 : Représentation simplifiée du métabolisme des phosphoinositides chez les mammifères. Les phosphoinositides représentés en jaune appartiennent au métabolisme classique et ceux en bleu au métabolisme des D3-phosphoinositides.
(Figure adaptée de Emeux et al, 1998)
1.1.2. Le métabolisme classique des phosphoinositides
Ce métabolisme des phosphoinositides mène à la synthèse de PtdIns(4,5)P2, qui sous l’action d’une phospholipase C (PLC) produit deux messagers secondaires, le diacylglycérol (DAG) et l’inositol 1,4,5-trisphosphate soluble. Le DAG active les protéines kinases C (PKC) tandis que l’inositol 1,4,5-trisphosphate, en se fixant à des récepteurs du réticulum endoplasmique, provoque la libération de calcium dans le cytoplasme .
Le Ptdins
Le Ptdins est formé dans le réticulum endoplasmique et est transporté vers les autres membranes par trafic vésiculaire ou par une protéine transporteur de phosphoinositides (PITP). Son taux reste constant par l’action de kinases et de phosphatases spécifiques.
Le PtdIns(4)P
Le Ptdlns(4)P est obtenu par phosphorylation du Ptdins par une PI4-kinase. Il peut également être obtenu par la déphosphorylation du PtdIns(3,4)P2 ou du PtdIns(4,5)P2 par
217 192
une phosphatidylinositol 3-phosphatase ou une phosphatidyinositol 5-phosphatase respectivement. Il est présent dans les cellules au repos et sa concentration ne varie pas sous activation. Il est principalement présent au niveau de l’appareil de Golgi où il assurerait un ciblage correct des protéines cytosoliques^^’^®^.
Le PtdIns(5)P
Le Ptdlns(5)P n’a été mis en évidence que récemment en raison de sa faible concentration cellulaire (50 fois moins que le PtdIns(4)P) et de la difficulté à le séparer du Ptdlns(4)P . 11 est principalement produit par phosphorylation du Ptdins par une PI5- kinase, appelée PYKfyve^^^. Le PtdIns(5)P est également produit par une inositol 4- phosphatase, l’IpgD, présente dans les bactéries Shigella flexneri, qui hydrolyse spécifiquement le Ptdlns(4,5)P2 en PtdIns(5)P^°*. L’expression de l’IpgD dans les cellules de mammifères provoque des changements dramatiques du cytosquelette d’actine, de la morphologie et de l’adhésion cellulaire^*. Une diminution du taux de PtdIns(5)P est observée suite à un choc hypo-osmotique dans les fibroblastes 3T3-L1 et dans les
ECM
Figure 1.3 : Exemples de processus cellulaires régulés par le PtdIns(4,5)P2 à la membrane plasmique. ECM = matrice extracellulaire; PLC = phospholipases C ; PI3K = PI3-kinase.
(Figure issue de la revue de Di Paolo dans Nature, 2006)
adipocytes, suggérant une implication du PtdIns(5)P dans la régulation de la réponse osmotique^^’. Le groupe de Sbrissa a également montré que le taux de PtdIns(5)P est augmenté sous une stimulation par l’insuline dans les fibroblastes 3T3-L1 et les CHO-IR.
La microinjection de PtdIns(5)P dans ces cellules non stimulées conduit à un rapide désassemblage des fibres d’actine et à une translocation de GLUT4 à la membrane. Ces effets sont comparables à ceux obtenus lors d’une stimulation par l’insuline^^^.
Le PtdIns(4,5)P2
Trois voies différentes mènent à la synthèse du PtdIns(4,5)P2. La voie majoritaire consiste en la phosphorylation par une phosphatidylinositol(4)P 5-kinase du PtdIns(4)P^^^, la deuxième voie implique la phosphorylation par une phosphatidylinositol(5)P 4-kinase du PtdIns(5)P^^^ et la troisième voie correspond à la déphosphorylation du PtdIns(3,4,5)P3 par une phosphatidylinositol trisphosphate 3-phosphatase, appelée PTEN'*'. Dans les cellules au repos, il existe un cycle permanent de phosphorylation/déphosphorylation du PtdIns(4)P et du PtdIns(4,5)P2 régulé par des kinases et des phosphatases qui agissent de manière continue. Outre son rôle essentiel de précurseur de trois messagers secondaires différents (le DAG, TIns(l,4,5)P3 et le PtdIns(3,4,5)P3), le PtdIns(4,5)P2 participe, par interaction avec des protéines du cytosquelette, à de nombreux événements qui se déroulent à la membrane plasmique ou qui impliquent la membrane tels que les réarrangements et la polymérisation des filaments d’actine du cytosquelette, la motilité et l’adhésion cellulaires et les événements qui participent au trafic vésiculaire tels que l’endocytose, l’exocytose, la phagocytose et la sécrétion^'^ (figure 1.3).
1.1.3. Le métabolisme des D3-phosphoinositides
1.1.3.1. Les D3-phosphoinositides
Les D3-phosphoinositides, découverts à la fin des années représentent moins de 1% des phosphoinositides totaux dans la cellule au repos, suggérant que ces phosphoinositides exercent des fonctions régulatrices spécifiques plutôt que des fonctions structurelles. Ils ne sont hydrolysés par aucune isoforme connue des PLCs. Ce sont des messagers secondaires importants car ils interviennent dans de nombreuses voies de transduction de signaux.
Introduction
Le PtdIns(3)P
Contrairement aux autres D3-phosphoinositides, le PtdIns(3)P est constitutivement présent dans les cellules eucaryotes et ce en faible quantité (5 à 15% de tous les Ptdins).
Bien qu’il soit généré in vitro par la phosphorylation du Ptdins par n’importe quelle PB
kinase, la voie de synthèse majoritaire chez les mammifères implique la PI3-kinase de type III15,16 JJ également être obtenu par déphosphorylation du PtdIns(3,4)P2 par une Ptdins 4-phosphatase^'’^. Dans les cellules de mammifères, le PtdIns(3)P est présent majoritairement dans les endosomes précoces où il peut lier la protéine EEAl (Early Endosomal Antigen 1) qui est composée d’un domaine FYVE et qui est impliquée dans la fusion des endosomes précoces^^’'^^’^^*. Récemment, il a été montré que du PtdIns(3)P produit à la membrane plasmique suite à une stimulation par l’insuline agirait en aval de l’activation de la petite protéine G, TCIO, comme messager secondaire impliqué dans la translocation du transporteur de glucose, GLUT4, à la membrane**^.
Le PtdIns(3,5)P2
Initialement isolé chez la levure et dans des fibroblastes de mammifères, le PtdIns(3,5)P2 résulte de la phosphorylation en position D5 du PtdIns(3)P par une PI5-kinase appelée Fab-1 chez la levure et PIKfyve chez les mammifères^^’^*®. Il peut également être obtenu par phosphorylation du PtdIns(5)P en position D3 par une PB-kinase de type I^^^.
Un stress hyperosmotique tant chez la levure que dans les fibroblastes 3T3 ou une exposition des cellules de mammifères aux rayonnements ultraviolets entraînent une production aiguë de PtdIns(3,5)P2 ’ ’ . Ces données suggèrent que ce phosphoinositide agit comme un messager secondaire impliqué dans le stress cellulaire induit par ces stimuli.
De plus, une mutation dans la protéine Fab-1, qui est l’unique kinase produisant du PtdIns(3,5)P2 chez la levure, provoque un agrandissement anormal des vacuoles intracytoplasmiques suggérant également un rôle de ce Ptdins dans le trafic vésiculaire^^^.
Le PtdIns(3,4)P2
La production de PtdIns(3,4)P2 est stimulée par les agonistes qui induisent la production de PtdIns(3,4,5)P3. En raison de sa production retardée par rapport à celle du
8
Vav Organisation du cytosquelette Homstein et al, 2004 Rac Croissance et différenciation cellulaires
Organisation du cytosquelette
Burridge et Wennerberg, 2004
Btk Maturation des lymphocytes B Maas et Hendriks, 2001
GRP-1 Trafic vésiculaire Kim et al, 1999
cytohesin-1
Etalement et adhésion cellulaires;
organisation du cytosquelette;
chemotaxie; trafic protéique
Pacheco-Rodriguez et al, 2005
Spectrin Intégrité de la membrane plasmique Organisation du cytosquelette
Dubreuil, 2006
Pleckstrin Activation des plaquettes sanguines Organisation du cytosquelette
Hamaguchi et al, 2007
mSOS Croissance et différenciation cellulaires Egan et al, 1993
Akt/PKB
Métabolisme du glucose; transcription;
apoptose; prolifération cellulaire;
angiogénese; motilité cellulaire...
Manning et Cantley, 2007
PDKl Métabolisme du glucose; prolifération;
différenciation cellulaire; apoptose
Mora et al, 2004
ARNO Motilité cellulaire et endocytose Shmuel et al, 2006 Turner et Brown, 2001
Tableau I.l : Exemples de protéines à domaine PH liant le PtdIns(3,4,5)P3 et description de leurs principales fonctions biologiques.
Introduction
PtdIns(3,4,5)P3, on a d’abord pensé que sa synthèse découlait uniquement de la déphosphorylation du PtdIns(3,4,5)P3 par une 5-phosphatase^^^. Plus tard, il a été montré que le Ptdlns(3,4)P2 peut également être produit indépendamment du Ptdlns(3,4,5)P3. En effet, une production de PtdIns(3,4)P2 a été observée sous l’induction d’un stress oxydatif par 1’H202 dans des cellules de mammifères^^’^^® ou lors de l’engagement des intégrines dans les plaquettes^^’^°. Le PtdIns(3,4)P2 peut alors être généré par phosphorylation du Ptdlns(3)P par une P14-kinase non identifiée jusqu’à présent*^’^® ou par phosphorylation du Ptdlns(4)P par une PB-kinase de type 1 et 11^’^^^.
Le Ptdlns(3,4)P2 peut interagir directement avec différentes protéines et affecter leur localisation et/ou activité. L’effecteur le mieux caractérisé du PtdIns(3,4)P2 est la protéine kinase B (PKB ou Akt), qui est également la cible du PtdIns(3,4,5)P3^^^. Les protéines kinases C -ô, -s et -r|, recrutées à la membrane par interaction de leur domaine Cl avec le diacylglycérol, sont directement activées par ces deux phosphoinositides^*"^. Récemment, il a été montré que le domaine PH des protéines TAPP-1 et TAPP-2 (Tandem PH domain- containing protein 1 and 2) lie préférentiellement le Ptdlns(3,4)P2, ce qui suggère que ce phosphoinositide peut avoir une signalisation qui lui est propre’*.
Le PtdIns(3,4,5)P3
Le Ptdlns(3,4,5)P3 n’est presque pas détectable dans les cellules au repos et sa concentration augmente rapidement après une stimulation des cellules par des facteurs de croissance ou des cytokines. Ce phosphoinositide est un messager secondaire crucial pour les fonctions physiologiques de la cellule car il contrôle de nombreuses voies de signalisation intracellulaire conduisant entre autre à la prolifération, la différenciation, la survie, la motilité cellulaire, l’internalisation de récepteurs et le métabolisme cellulaire^^^.
La voie majeure de synthèse du Ptdlns(3,4,5)P3 en réponse à des signaux extracellulaires est la phosphorylation du PtdIns(4,5)P2 par les PI3-kinases de type
Une deuxième voie de synthèse, indépendante du Ptdlns(4,5)P2, implique les enzymes P15- kinases a et p qui utilisent le Ptdlns(3)P comme substrat pour produire du PtdIns(3,4,5)P3 par phosphorylations successives des positions D4 et D5 de l’inositol^*^’*^^.
Plusieurs phosphatases sont capables de dégrader le Ptdlns(3,4,5)P3. Parmi celles-ci, on trouve le produit du gène suppresseur de tumeur, PTEN (voir paragraphe 1.3.1.1) qui déphosphoryle le noyau inositol du Ptdlns(3,4,5)P3 en position ainsi que diverses inositol polyphosphates 5-phosphatases dont SHIPI et SH1P2 (voir chapitre 1.3.2.3.5).
9
B
<X>
O
p110a,p,ô
p110y
p85a,p p55y p50a p101
RTK Ras R-GaPy
PI
PI4P PI(4,5)P2
PI(4,5)P2
O
RTK PI3K-C2a,p,y
PI PI4P
III Vps34p p150 T rafle
vésiculaire PI PI
Domaine de liaison à la sous- unité régulatrice
1 Domaine de Domaine catalytique liaison à Ras lipide kinase (PIK)
Domaine catalytique Domaine C2 de liaison protéine kinase (PK) ^ aux phospholipides
Figure 1.4 : Classifîcation des différentes PI3-kinases. Les PI3-kinases forment une famille de 9 isoformes différentes qui sont réparties en trois classes selon leur structure, leur régulation et leur substrat lipidique. RTK = récepteur à activité tyrosine kinase.
Introduction
Le PtdIns(3,4,5)P3, une fois produit à la membrane, exerce son rôle crucial de messager secondaire en recrutant différentes protéines capables de le lier par un domaine PH (Pleckstrin Homology). Parmi ces protéines, nous avons des sérine/thréonine kinases, des phospholipases, des protéines adaptatrices ainsi que des facteurs d’échange pour les petites protéines Quelques cibles protéiques du PtdIns(3,4,5)P3 ainsi que leur fonction biologique sont exposées dans le tableau 1.1.
1.1.3.2. La famille des phosphoinositides 3-kinases (PI3-kinases)
Les PI3-kinases catalysent l’addition d’une molécule de phosphate en position D3 du noyau inositol des phosphoinositides. Les PI3-kinases peuvent phosphoryler le Ptdins, le Ptdlns(4)P et le PtdIns(4,5)P2 respectivement en PtdIns(3)P, PtdIns(3,4)P2 et Ptdlns(3,4,5)P3.
Neuf isoformes différentes de PB-kinases ont été identifiées dans les cellules de mammifères et sont divisées en trois classes (figure 1.4) sur base de leur spécificité de substrat, de leur structure et de leur mécanisme de régulation^^^.
• Les PI3-kinases de classe I sont des hétérodimères constitués d’une sous-unité catalytique de 110 à 130 kDa et d’une sous-unité régulatrice de 50 à 100 kDa. In vitro, elles phosphorylent en position D3 le noyau inositol du Ptdins, du PtdIns(4)P et du PtdIns(4,5)P2. Cependant, in vivo, leur substrat préférentiel semble être le Ptdlns(4,5)P2"^’^^'. Ces kinases sont subdivisées en deux sous-classes: les PB
kinase IA qui sont principalement activées par des récepteurs à activité tyrosine kinase (RTK) et des récepteurs des immunoglobulines G (FcyR) et les PB-kinases IB qui sont essentiellement activées par des récepteurs couplés à des protéines G.
• Les PB-kinases de classe II présentent les sous-unités catalytiques les plus grandes (entre 170 et 200 kDa). Elles phosphorylent in vitro le Ptdins, le PtdIns(4)P mais pas le PtdIns(4,5)P2^^. La particularité de cette classe est la présence d’un domaine C2 à 1 ’ extrémité carboxy-terminale^’^^’'*°.
Les PB-kinases de classe III phosphorylent uniquement le Ptdlns^^^. Ces enzymes jouent un rôle essentiel dans le trafic vésiculaire^'*. Les seules enzymes connues de ce groupe sont la protéine vps34 (vacuolar protein sorting 34) de levure et son homologue humain, h-vps34"^. Par association de la protéine de levure vps34 à la protéine kinase vpsl5 à activité sérine/thréonine kinase, vps34 est recrutée et activée
10
C
Figure 1.5 : Modélisation de la structure de domaine d’interaction protéique. (A) Le domaine SH2 de v-src lié à un peptide ligand pYRLV, (B) le domaine PTB de Shc lié au peptide HIIENPQPYFSDA, (C) le domaine SH3 de Sem5 lié à la séquence PPPVGPRRR dérivée de mSos et (D) le domaine SAM d’Eph4A.
(http://pawsonlab.mshri.on.ca/index.php)
Introduction
à la membrane. De manière similaire, la protéine humaine h-vsp34 forme un complexe avec l’homologue humain de la protéine vpsl5, pl50 ’ .
1.2. Les domaines d’interaction
La communication entre cellules peut être schématisée par deux étapes successives.
D’une part, un signal extracellulaire se fixe sur un récepteur situé à la surface de la cellule et active le récepteur. Ensuite, ce dernier stimule une série de signaux intracellulaires en cascade qui constituent la réponse cellulaire. Parmi les acteurs de la transduction du signal on retrouve les récepteurs qui reçoivent le signal, les adaptateurs qui transmettent le signal et les effecteurs qui induisent la réponse cellulaire. Les protéines adaptatrices n’ont pas d’activité enzymatique propre mais sont constituées de plusieurs domaines d’interaction protéique, tels que les domaines SH2, SH3, PTB... qui sont essentiels dans la transmission du signal au sein de la cellule (figure 1.5).
1.2.1. Les domaines d’interaction protéiques
1.2.1.1. Le domaine SH2 (Src Homology domain 2)
Le domaine SH2 reconnaît uniquement des peptides contenant une tyrosine phosphorylée. Il est constitué d’une centaine d’acides aminés et est formé de deux hélices a qui encadrent un feuillet P formé de 5 brins P anti-parallèles Le domaine SH2 est formé d’une poche de fixation, composée d’acides aminés hydrophobes très conservés parmi les différents domaines SH2, où une arginine située dans le fond de la poche assure l’interaction avec la tyrosine phosphorylée et d’une poche de composition plus variahle qui lie des acides aminés situés en aval de la tyrosine phosphorylée et qui assure la spécificité d’interaction''^^.
1.2.1.2. Le domaine PTB (Phospho-tyrosine binding domain)
Le domaine PTB reconnaît une tyrosine qui peut être phosphorylée ou non et présente dans une séquence consensus NPxY (où x représente un acide aminé quelconque).
Il est composé d’environ 200 acides aminés^*^ et est formé de 7 brins P et de 3 hélices a qui forment un sandwich de 3 et 4 feuillets avec une hélice carboxy-terminale. Comme pour le
11
PH PLCÔ1 Ptlns(4,5)P2
p-ARK Ptlns(3,4,5)P3, Ptlns(4,5)P2 Spectrin Ptlns(3,4,5)P3, Ptlns(4,5)P2 Pleckstrin(N) Ptlns(3,4,5)P3, Ptlns(4,5)P2
GRP-1 Ptlns(3,4,5)P3
Btk Ptlns(3,4,5)P3
mSOS Ptlns(3,4,5)P3, Ptlns(4,5)P2 Akt/PKB Ptlns(3,4)P2, Ptlns(3,4,5)P3 PDK1 Ptlns(3,4)P2, Ptlns(3,4,5)P3
Gab1 Ptlns(3,4,5)P3
ARNO Ptlns(3,4,5)P3
FYVE EEA1 Ptlns3P
Hrs Ptlns3P
Vadp Ptlns3P
Pib1p Ptlns3P
Fab1p Ptlns3P
PX p4Qphox Ptlns3P
p47phox Ptlns(3,4)P2, Ptlns3P, Ptlns(3,5)P2, Ptlns(3,4,5)P3
SNX3, 7 Ptlns3P
Vam7p Ptlns3P
PI3K C2 a Ptlns(4,5)P2
CISK Ptlns(3,5)P2, Ptlns(3,4,5)P3
ENTH Epsini, 2b Ptlns(4,5)P2
AP180 Ptlns(4,5)P2
Hip1 Ptlns(4,5)P2
FERM 4.1 Ptlns(4,5)P2
Ezrin Ptlns(4,5)P2
Radixin Ptlns(4,5)P2
moesin Ptlns(4,5)P2
Tubby Tubby Ptlns(4,5)P2
TULP Ptlns(4,5)P2
C2 Synaptotagmine Ptlns(4,5)P2, Ptlns(3,4,5)P3 Rabphiline3A Ptlns(4,5)P2, Ptlns(3,4,5)P3
Introduction
domaine SH2, il est eomposé d’un site principal où des résidus arginines sont impliqués dans l’interaction avec la phosphotyrosine et d’un site secondaire qui, par interaction avec des acides aminés situés en amont de la tyrosine phosphorylée, assure une spécificité d’interaction.
1.2.1.3. Le domaine SH3 (Src Homology domain 3)
Le domaine SH3 lie des peptides riches en proline. Il est composé d’environ 60 acides aminés et présente un grand sillon dont le fond et les parois sont tapissés de résidus aromatiques conservés parmi les différents domaines SH3. Les peptides riches en proline présents dans un consensus général, PxxP, s’insèrent dans le grand sillon. Il existe deux classes de domaines SH3 ; la première lie les peptides dans le sens «+» (RxxPxxP avec l’arginine en amont) et la deuxième lie les peptides dans le sens «-» (xPxxPxR avec l’arginine en aval). Cette arginine semble être cruciale pour l’interaction entre le peptide et le domaine SH3.
1.2.1.4. Le domaine SAM (Steril Alpha Motif)
Il est composé d’approximativement 70 acides aminés et est formé d’une succession de 4-5 hélices a et d’un bras N-terminal flexible qui forment deux interfaces permettant aux protéines d’homodimériser. Les domaines SAM sont donc capables de former des homo- oligomères mais également des hétéro-oligomères. Ces domaines peuvent également interagir avec des protéines ne présentant pas de domaines SAM Récemment, il a été montré que le domaine SAM de la protéine Smaug, impliquée dans la répression transcriptionnelle, peut lier I’ARN'^’^^’*®®.
1.2.2. Les domaines protéiques reconnaissant les phosphoinositides
Outre leur rôle de précurseurs dans la production de messagers secondaires, les phosphoinositides sont également des régulateurs spatiaux et temporels des protéines cibles.
Cette régulation est rendue possible grâce à leur interaction avec des domaines protéiques capables de reconnaître directement et spécifiquement les différents phosphoinositides (tableau 2). Par interaction avec des phosphoinositides, ces domaines recrutent les protéines dans des compartiments cellulaires spécifiques où, par interaction protéique ou par
12
(E) domaine FERM de Radixin, (F) domaine Tubby de Tubby, (G) domaine C2 de Sytl.
(Figure adaptée de celle de C. Vollert (Karlsruhe)).
Introduction
modulation de leur activité enzymatique, elles peuvent intervenir dans diverses réponses physiologiques telles que la transduction de signaux, le réarrangement du cytosquelette et le trafic membranaire. Le nombre de domaines connus pour interagir avec des phosphoinositides a fortement augmenté ces dernières années. On retrouve entre autre les domaines PH (Pleckstrin Homology), FYVE, PX (Phox Homology), ENTH, FERM, Tubby et C2 (figure 1.6).
1.2.2.1. Les domaines PH
Le domaine PH (Pleckstrin Homology) fut initialement découvert dans la pleckstrin, protéine substrat de la protéine kinase C abondamment exprimée dans les plaquettes ’ . On retrouve ce domaine dans un grand nombre de protéines (plus de 250 domaines PH dans le protéome humain) telles que des protéines adaptatrices (IRSl, Grbl-14, APS...), des kinases (PKB, PDKl...), des phospholipases (PLCô et y, PLD), des protéines régulatrices de petites protéines G (Vav, ARNO, SOS...), des protéines du cytosquelette (Dynamin, Cytohésine)'^^.
Les domaines PH sont composés de 100 à 120 acides aminés. Ils présentent tous une structure commune malgré le peu d’identité de séquence entre les différents domaines (de 7% à un maximum de seulement 23%). Le domaine PH présente une structure en
« sandwich » composée de 7 brins P organisés en deux feuillets P anti-parallèles quasi orthogonaux composés de 4 et 3 brins P respectivement. Une hélice a C-terminale ferme une des extrémités du sandwich, tandis que l’autre extrémité est fermée par trois boucles de séquence très variable parmi les différents domaines PH qui constituent le site de liaison aux phosphoinositides. Ces deux régions sont responsables de la forte polarisation électrostatique du domaine ; la région comprenant les trois boucles variables, riches en lysines, arginines et histidines, est chargée positivement tandis que la région comprenant l’hélice a, riche en acides aminés acides, est chargée négativement. Le phosphoinositide interagit avec cette poche et l’interaction se fait par formation de liaisons ioniques entre les résidus basiques chargés positivement des boucles variables et les groupements phosphates chargés négativement des phosphoinositides'^^’*^^.
13
Les domaines PH lient les phosphoinositides ou les inositols phosphates avec une affinité et une spécificité d’interaction variables dépendant principalement de la longueur et de la séquence des boucles variables. La majorité des domaines PH ne présente qu’une faible affinité relativement non spécifique avec les phosphoinositides (Pleckstrin, Dynaminl, IRSl...). En effet, seulement 10% des domaines PH (et pourtant les plus étudiés) lient les phosphoinositides avec une forte affinité et une grande spécificité. C’est par exemple le cas du domaine de la phospholipase PLCô qui lie le PtIns(4,5)P2 et le Ins(l,4,5)P3^'*’^^* ou des domaines PH reconnaissant spécifiquement des produits de la PB
kinase tels que ceux des protéines PKB^^ et PDKl^’^^ qui lient spécifiquement les PtdIns(3,4)P2 et PtIns(3,4,5)P3, ou Btk'^®’^^^ qui lie le PtIns(3,4,5)P3.
Pour les domaines PH à forte affinité pour des phospholipides spécifiques, l’interaction directe avec le phosphoinositide est suffisante pour le recrutement de la protéine à la membrane. Pour les domaines PH à faible affinité, l’interaction à elle seule avec le phosphoinositide n’est pas suffisante pour amener la protéine à la membrane. Dans ce cas, ces protéines ont développé différentes stratégies pour stabiliser l’interaction*^^’*^'^.
Soit l’interaction faible entre le phosphoinositide et le domaine PH est augmentée par liaison de ce même domaine PH avec une autre protéine. C’est le cas pour les protéines PARK, PLCP et Dbl. Soit cette faible interaction est stabilisée par interaction avec des protéines de la membrane via un autre domaine de la protéine, comme observé pour les protéines IRSl, PLCy ou Tiam. Finalement, certaines protéines vont former des oligomères capables d’aller à la membrane (Dynaminl).
L2.2.2. Le domaine FYVE
L’acronyme FYVE dérive des premières lettres des quatre protéines au sein desquelles ce domaine a initialement été identifié ; Fablp, YOTB, Vaclp et EEAl^^*^. Les domaines FYVE, composés d’environ 80 acides aminés, lient spécifiquement et uniquement le PtIns(3)P. Malgré la grande spécificité d’interaction du domaine FYVE pour le PtIns(3)P, cette liaison est très faible : l’affinité de liaison du domaine FYVE de la protéine EEAl pour le PtIns(3)P est mille fois plus faible que celle du domaine PH de Grpl pour le PtIns(3,4,5)P3 . Par conséquent, la liaison du domaine FYVE au phosphoinositide n’est pas suffisante pour amener la protéine à la membrane. Pour pallier à ce manque d’affinité, le
